具体实施方式
以下是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例一
证明有效添加剂量的乳果糖、水苏糖、棉籽糖、低聚甘露糖及抗性糊精在耗氧条件下对地衣芽孢杆菌CMCC63516增殖有显著促进作用,延长地衣芽孢杆菌对数生长期,缩短对数生长期地衣芽孢杆菌细菌倍增时间,降低菌体自溶率。其中部分低聚糖对地衣芽孢杆菌的增殖效果优于大豆低聚糖。
菌种:地衣芽孢杆菌CMCC63516(中国医学细菌保藏中心的菌株编号)
种子培养基(g/100ml):牛肉粉0.5,蛋白胨1.0,NaCl0.5,pH7.0-7.2。
基础培养基:同种子培养基。
寡聚糖培养基(g/100ml):牛肉粉0.5,蛋白胨1.0,NaCl0.5,pH7.0-7.2,加入不同浓度寡聚糖(0.01,0.05,0.10,0.50,1.00,5.00)。
方法:参照专利CN101537020A。
不同浓度寡聚糖培养基制备:按照不同浓度比例分别称取一定量的乳果糖、水苏糖、棉籽糖、低聚甘露糖、抗性糊精和大豆低聚糖干粉置于250ml锥形瓶中,经121℃灭菌15min,冷却后,分别于每个250ml锥形瓶中加入50ml无菌基础培养基,混匀既得寡聚糖培养基。
种子制备:无菌环境下接种一环斜面种子于种子培养基中,37℃,180rpm培养15hr。
不同浓度寡聚糖对地衣芽孢杆菌的生长影响:采用同样的接种量分别接种于基础培养基和对照培养基,置于37℃,180rpm振荡培养,取17hr和24hr菌液利用平板菌落计数方法测定菌浓,结果见表1。
表1耗氧条件下益生元对CMCC63516促增殖能力试验结果(活菌数单位:108CFU/ml)
由表1可以看出,培养17hr和24hr时,不同浓度每种益生元对地衣芽孢杆菌BL63516的增殖作用有所差别。培养基中添加0.01%-0.10%乳果糖,最适浓度为0.01%;0.10%-0.50%水苏糖,最适浓度为0.10%;0.01%-5.00%棉籽糖,最适浓度为0.50%;0.05%-1.00%抗性糊精,最适浓度为0.50%;0.01-0.50%低聚甘露糖,最适浓度为0.50%对CMCC63516都有不同程度的促增殖作用。0.01%乳果糖对CMCC63516的促增殖作用显著高于大豆低聚糖。
实施例二
证明有效剂量益生元在耗氧条件和厌氧条件下对地衣芽孢杆菌CMCC63516的促增殖作用不相同。
表2耗氧条件下益生元对CMCC63516促增殖能力试验结果(活菌数单位:108CFU/ml)
由表2可以看出,各种益生元在耗氧条件下和厌氧条件下对地衣芽孢杆菌CMCC63516的促增殖作用有显著区别。甚至在耗氧条件下有强烈促增殖作用的益生元在厌氧条件下出现了对CMCC63516的抑制作用。在厌氧条件下,培养基中添加0.01%-0.05%乳果糖,最适浓度为0.05%;0.01%-0.50%水苏糖,最适浓度为0.05%;0.05%-0.10%棉籽糖,最适浓度为0.05%;0.10%-0.50%抗性糊精,最适浓度为0.10%;0.01%-0.05%低聚甘露糖,最适浓度为0.01%,对CMCC63516都有不同程度的促增殖作用。
实施例三
用摇管法试验,证实在厌氧条件下不同益生元促进地衣芽孢杆菌CMCC63516抑制条件致病性金黄色葡萄球菌能力的影响。
指示菌:金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003购买自中国医学细菌保藏中心。
金黄色葡萄球菌培养基及培养条件:葡萄糖0.2%,蛋白胨1.0%,NaCl0.5%,牛肉膏0.5%,pH7.0。37℃,180r/min摇床振荡培养18h,将对数生长期菌液稀释,使活菌数约105-106CFU/ml,备用。
地衣芽孢杆菌CMCC63516种液制备:同实施例一。
试验方法:
1、种液制备:无菌接种一环斜面菌种至液体培养基,37℃,180rpm摇床振荡培养16hr,取对数生长期培养液稀释5倍,检测OD660在0.2-0.3之间,即菌浓在1.0-1.5×107之间,备用。
2、抑菌共培养:接种同样菌量的地衣芽孢杆菌种液和金黄色葡萄球菌种液混菌,在培养基中添加不同浓度的益生元,并且在同样的培养基中分别接种地衣芽孢杆菌种液和金黄色葡萄球菌种液,以对比不同浓度的益生元对二者的增殖影响,共培养24hr后,分别检测两种菌的菌浓。
表3益生元对CMCC63516抑菌能力影响试验结果
由表3可以看出,不同种类不同浓度的益生元对金黄色葡萄球菌的生长作用有显著差异,对CMCC63516抑制金黄色葡萄球菌生长的影响也有不同。在试验条件下,0.01%-0.05%乳果糖,0.05%-0.10%棉籽糖,0.05%-0.50%水苏糖,0.01%-0.05%低聚甘露糖及0.50%抗性糊精都能够促进CMCC63516抑制金黄色葡萄球菌生长。其中0.05%乳果糖对混菌培养中CMCC63516促增殖率为2.00,对金葡抑制率为99%以上。
下面实施例4-实施例23是地衣芽孢杆菌CMCC63516与寡糖类益生元组成的合生元组合物制剂。各例的组合物中含地衣芽孢杆菌5-20亿/克。
实施例四
取地衣芽孢杆菌活菌粉40kg,(每克活菌粉中含活菌400亿,下同),乳果糖50kg,磷酸氢钙70kg,可压性淀粉45kg,羧甲基淀粉钠15kg,粉碎过80目筛。混合均匀,加入13%淀粉浆适量制软材,20目筛制湿颗粒,45℃干燥,18目筛整粒,加入微粉硅胶1.5kg,混合均匀,压片,包装既得。每克组合物含地衣芽孢杆菌18.1亿。
实施例五
取地衣芽孢杆菌活菌粉40kg,乳果糖250kg,微晶纤维素160kg,淀粉30kg,糊精45kg,低取代羟丙基纤维素20kg,粉碎过80目筛。混合均匀,加入1.5%羧甲基纤维素钠适量制软材。20目筛制湿颗粒,45℃干燥,18目筛整粒,加入滑石粉10kg,混合均匀,压片,包装既得。每克组合物含地衣芽孢杆菌10.8亿。
实施例六
取地衣芽孢杆菌活菌粉40kg,乳果糖200kg,预胶化淀粉100kg,交联羧甲基淀粉钠23.5kg,粉碎过80目筛。混合均匀,加入1.5%羧丙基纤维素钠适量制软材。20目筛制湿颗粒,45℃干燥,18目筛整粒,加入硬脂酸镁3.5kg,混合均匀,压片,包装既得。每克组合物含地衣芽孢杆菌15.7亿。
实施例七
取地衣芽孢杆菌活菌粉20kg,乳果糖60kg,山梨醇53kg,硫酸钙45kg,交联聚维酮18kg,粉碎过80目筛。混合均匀,加入乙基纤维素适量制软材,40目筛制湿颗粒,45℃干燥,18目筛整粒,加入月桂醇硫酸镁3kg,混合均匀,压片,包装既得。每克组合物含地衣芽孢杆菌13.8亿。
实施例八
取地衣芽孢杆菌活菌粉40kg,棉籽粉250kg,可压性淀粉160kg,微晶纤维素45kg,山梨醇23kg,交联聚维酮10kg,粉碎过80目筛。混合均匀,加入硬脂酸镁2kg,混合均匀后直接压片。每克组合物含地衣芽孢杆菌16.2亿。
实施例九
取地衣芽孢杆菌活菌粉20kg,棉籽粉250kg,预胶化淀粉95kg,乳糖30kg,羧甲基淀粉钠9kg,粉碎过80目筛。混合均匀,加入2%羧丙基甲基纤维素适量制软材,40目筛制湿颗粒,45℃干燥,32目筛整粒,加入微粉硅胶1.5kg,混合均匀,压片,包装即得。每克组合物含地衣芽孢杆菌10.3亿。
实施例十
取地衣芽孢杆菌活菌粉20kg,棉籽粉200kg,磷酸氢钙60kg,淀粉25kg,糊精20kg,低取代羟丙基纤维素6kg,粉碎过80目筛。混合均匀,加入15%淀粉浆适量制软材,20目筛制湿颗粒,45℃干燥,18目筛整粒,加入滑石粉4.5kg,混合均匀,压片,包装即得。每克组合物含地衣芽孢杆菌14.8亿。
实施例十一
取地衣芽孢杆菌活菌粉40kg,水苏糖500kg,甘露醇170kg,微晶纤维素90kg,淀粉45kg,低取代羟丙基纤维素15kg,粉碎过80目筛。混合均匀,加入2%羟丙基甲基纤维素适量制软材,40目筛制湿颗粒,45℃干燥,18目筛整粒,加入微粉硅胶1.5kg,混合均匀,压片,包装即得。每克组合物含地衣芽孢杆菌12.6亿。
实施例十二
取地衣芽孢杆菌活菌粉2kg,水苏糖125kg,淀粉35g,糊精30.5kg,微粉硅胶0.8kg,粉碎过80目筛,混合均匀,装入胶囊,包装即得。每克组合物含地衣芽孢杆菌5.7亿。
实施例十三
取地衣芽孢杆菌活菌粉2kg,水苏糖40kg,微晶纤维素32kg,乳糖4.5kg,滑石粉0.5kg,粉碎过80目筛,混合均匀,装入胶囊,包装即得。每克组合物含地衣芽孢杆菌9.4亿。
实施例十四
取地衣芽孢杆菌菌粉2kg,抗性糊精25kg,磷酸氢钙14.6kg,乳糖12.5kg,羧甲基淀粉钠1.25kg,粉碎过80目筛混合均匀后,加入15%淀粉浆制软材,24目筛制湿颗粒,45℃干燥,24目筛整粒后,加入滑石粉0.05kg,混合均匀,装入胶囊,每克组合物含地衣芽孢杆菌15.3亿。
实施例十五
取地衣芽孢杆菌菌粉2kg,抗性糊精125kg,硫酸钙24kg,淀粉40kg,低取代羟丙级纤维素0.45kg,粉碎过80目筛混合均匀后,加入3%聚维酮制软材,24目筛制湿颗粒,45℃干燥,24目筛整粒,加入硬脂酸镁0.2kg,混合均匀,装入胶囊,每克组合物含地衣芽孢杆菌5.1亿。
实施例十六
取地衣芽孢杆菌菌粉2kg,低聚甘露糖10kg,微晶纤维素16.8kg,糊精3.2kg,羧甲基淀粉钠0.8kg,粉碎过80目筛混合均匀后,加乙基纤维素适量制软材,24目筛制湿颗粒,45℃干燥,24目筛整粒,加入微粉硅胶0.09kg,混合均匀,装入肠溶胶囊,每克组合物含地衣芽孢杆菌17.5亿。
实施例十七
取地衣芽孢杆菌菌粉2kg,低聚甘露糖12.5kg,淀粉16kg,乳糖3.7kg,低取代羟丙级纤维素1.1kg,粉碎过80目筛混合均匀,加入2%聚维酮制软材,24目筛制湿颗粒,45℃干燥,24目筛整粒,加入硬脂酸镁0.2Kg,混合均匀,装入肠溶胶囊,每克组合物含地衣芽孢杆菌16.6亿。
实施例十八
取地衣芽孢杆菌菌粉2kg,棉籽粉25kg,预胶化淀粉4.7kg,乳糖13.1kg,微粉硅胶0.15kg,粉碎过80目筛混合均匀,装入肠溶胶囊,每克组合物含地衣芽孢杆菌8.7亿。
实施例十九
取地衣芽孢杆菌菌粉2kg,低聚甘露糖6kg,微晶纤维素6.5kg,糊精3.4kg,硬脂酸镁0.6kg,粉碎过80目筛混合均匀,装入肠溶胶囊,每克组合物含地衣芽孢杆菌19.3亿。
实施例二十
取地衣芽孢杆菌活菌粉5kg,水苏糖100kg,山梨醇134.5kg,淀粉10.8kg,羧甲基纤维素钠1.8kg,阿司帕坦0.06kg,粉碎过80目筛,混合均匀,加入10%淀粉浆适量制软材,18目筛制湿颗粒,45℃干燥,18目筛整粒,加入硬脂酸镁1.2kg,混合均匀后,装袋即得。每克组合物含地衣芽孢杆菌7.3亿。
实施例二十一
取地衣芽孢杆菌活菌粉5kg,水苏糖225kg,蔗糖130.7kg,淀粉16.2kg,羧甲基淀粉钠3.1kg,甜菊苷0.02kg,粉碎过80目筛,混合均匀,加入2%聚维酮适量制软材,18目筛制湿颗粒,45℃干燥,18目筛整粒,加入微粉硅胶0.2kg,混合均匀,装袋即得。每克组合物含地衣芽孢杆菌5.1亿。
实施例二十二
取地衣芽孢杆菌活菌粉5kg,抗性糊精100kg,乳糖120.7kg,微晶纤维素27.5kg,低取代羟丙基纤维素2kg,阿司帕坦0.05kg,粉碎过80目筛,混合均匀,加入1%羧甲基纤维素钠适量制软材,18目筛制湿颗粒,45℃干燥,18目筛整粒,加入滑石粉1.2kg,混合均匀,装袋即得。每克组合物含地衣芽孢杆菌8.6亿。
实施例二十三
取地衣芽孢杆菌活菌粉5kg,抗性糊精125kg,甘露醇17.3kg,微晶纤维素160kg,羧甲基纤维素钠3.5kg,甜菊甙0.02kg,粉碎过80目筛,混合均匀,加入10%淀粉浆适量制软材,18目筛制湿颗粒,45℃干燥,18目筛整粒,加入硬脂酸镁1.4kg,混合均匀,装袋即得。每克组合物含地衣芽孢杆菌7.9亿。