CN101928721A - 一种新的载脂蛋白c-ⅰ的制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及重组蛋白质及其生产、纯化、鉴定方法，特别是涉及在巴斯德酵母中表达重组人载脂蛋白C-I(rhApoC-I)，以及优化的高密度发酵生产和纯化重组人载脂蛋C-I的方法。其今后的可能用途在于生产重组人载脂蛋白C-I，可在临床上用于调节血脂代谢。

Description

一种新的载脂蛋白C-Ⅰ的制备

发明领域

本发明涉及蛋白质的生产、纯化和鉴定方法，特别是涉及在巴斯德酵母中表达重组人载脂蛋白C-I(rhApoC-I)，以及优化的大规模工业化发酵生产重组人载脂蛋白C-I的方法。

发明背景

载脂蛋白C-I主要分布在乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白中(HDL)，在血浆中的浓度为0.06～0.07g/L(Polz E，Kotite L，Havel RJ，et al.Human apolipoprotein C-I：concentration in blood serum and lipoproteins[J].Biochem Med，1980，24(3)：229-237)。人ApoC-I为含57个氨基酸残基的单链多肽，相对分子质量为6.6kD，不含半胱氨酸、组氨酸和酪氨酸。二级结构中有55％a-螺旋结构，极易与磷脂结合。ApoC-I基因位于第19号染色体上长约48kb的载脂蛋白E/C-I/C-II基因簇内，ApoE基因下游，长约4.7kb，主要在肝脏中表达，也有少量在肺、皮肤、睾丸和脾脏中表达。人ApoC-I和ApoE基因处于同一个转录区。ApoE基因下游约18kb，即ApoC-I基因下游约9kb处有一长约764bp的顺式作用元件，其功能区长319bp，可调控肝脏ApoC-I和ApoE基因的表达，称之为肝脏调控域1。在ApoE/C-I/C-II基因簇ApoE基因下游27kb，即肝脏调控域1下游约10kb处确定了第二个肝脏调控域，即肝脏调控域2。核酸序列分析表明，肝脏调控域2与肝脏调控域1功能区的同源性高达85％。最近的研究发现，所有肝脏调控域均可单独调节载脂蛋白E/C-I/C-II基因簇所含基因的表达，而且只要有一个肝脏调控域存在，就可调控上述任一基因在肝脏的表达(Allan CM，Walker D，Taylor JM.Evolutionary duplication of a hepatic control region in the human apolipoprotein E gene locus.Identification of a second region that confers high level and liver-specific expression of the human apolipoprotein E gene in transgenic mice[J].J Biol Chem，1995，270(44)：26278-26281)。

载脂蛋白C-I具有多种生理功能：①抑制肝脏脂蛋白受体对富含TG脂蛋白的摄取：ApoC-I通过置换β-VLDL中的ApoE或掩盖、改变ApoE结构而抑制ApoE介导的β-VLDL与LDL受体及LDL受体相关蛋白的结合，使富含TG的脂蛋白延时清除(Kowal RC，Herz J，Weisgraber KH，et al.Opposing effects of apolipoproteins E and C on lipoprotein binding to low density lipoprotein receptor-related protein[J].J Biol Chem，1990，265(18)：10771-10779)。②激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)，促进胆固醇酯化。ApoA-I是LCAT最强的激活剂，ApoC-I亦可激活LCAT，激活能力约为ApoA-I的78％(Knott TJ，Robertson ME，Priestley LM.Characterisation of mRNAs encoding the precursor for human apolipoprotein C-I[J].Nucleic Acids Res，1984，12(9)：3909-3915)。③抑制胆固醇酯转移蛋白(CETP)。体外实验表明，按ApoC-I N-末端的38个氨基酸序列合成的多肽能抑制CETP的活性(Gautier T，Masson D，de Barros JP，et a1.Human apolipoprotein C-I accounts for the ability of plasma high density lipoproteins to inhibit the cholesteryl ester transfer protein activity[J].J Biol Chem，2000，275(48)：37504-37509)。因此，ApoC-I在脂质代谢调控中起着十分重要的作用。目前，ApoC-I多是从血浆中分离并纯化得到的，成本高而产量低。因此，有必要建立和发展重组表达和纯化ApoC-I的方法，以便满足实验室研究的需求。

甲基营养酵母，特别是巴斯德毕赤酵母是已被深入研究的真核表达系统，并已被用于表达许多有用的蛋白质。例如，美国专利5,324,639公开了在甲基营养酵母特别是巴斯德毕赤酵母细胞中生产胰岛素样生长因子1的方法；美国专利5,330,901公开了使用巴斯德毕赤酵母系统表达人血清白蛋白的方法；美国专利5,965,389提供了在甲基营养酵母中表达L-谷氨酸脱羧酶(GAD65)的DNA构建体以及由之制备纯的GAD65的方法；美国专利公开了在巴斯德毕赤酵母中表达血小板衍生的细胞因子(PDGF)的方法；美国专利6,780,615描述了使用重组巴斯德毕赤酵母生产应乐果甜蛋白的方法。然而，迄今尚未见关于使用巴斯德毕赤酵母生产人ApoC-I的报道。

发明目的

本发明的一个目的是提供一种使用甲基营养酵母生产重组人载脂蛋白C-I(rhApoC-I)多肽的方法，该方法包括在以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母，其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作地连接的元件的DNA构建体转化的：(1)甲基可诱导的转录启动子；(2)编码载脂蛋白C-I的DNA片段；(3)转录终止子和(4)可选择标志，从而以至少80mg/L培养基的浓度产生载脂蛋白C-I多肽。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。

本发明的另一个目的是提供用于表达重组人载脂蛋白C-I的甲基营养酵母，该酵母能够依靠作为碳源和能源的甲醇生长，并且是被包括甲基可诱导的转录启动子、编码载脂蛋白C-I的DNA片段、转录终止子和可选择标志的DNA构建体转化的。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。

本发明的再一个目的是提供用于在巴斯德毕赤酵母中表达重组人载脂蛋白C-I多肽的DNA构建体，该构建体包括可操作地连接的元件：甲基可诱导的转录启动子、编码载脂蛋白C-I的DNA片段、转录终止子和可选择标志。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。

本发明的再一个目的是提供使用巴斯德毕赤酵母大规模生产重组人载脂蛋白C-I多肽的优化的发酵培养条件，特征在于其中发酵温度维持在28℃～30℃、所使用的pH值为5.8～6.0，并且培养基中添加有0.5％(W/V)的蛋白胨。

发明内容

本发明涉及蛋白质生产、纯化和鉴定方法，特别是涉及在巴斯德酵母中表达载脂蛋白C-I的方法。

巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)是20世纪80-90年代发展起来的极具潜力的酵母表达系统，由于其在蛋白质表达方面具有其它系统不可比拟的优点而得到越来越广泛的应用。

作为真核表达系统，巴斯德毕赤酵母具有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点：①属于单细胞生物，故保留了易于操作和生长速度快的特点；②营养要求低，培养基成分简单，生产成本低，特别适用于工业化大规模生产；③通过同源重组，可将表达载体稳定地整合到宿主染色体中，连续传代中不易丢失；④具有强有力的乙醇氧化酶基因(AOX)启动子，可严格调控外源基因的表达；⑤表达量高，许多蛋白的产率可达到每升克以上水平；⑥表达的蛋白质既可存在于胞内又可分泌至胞外，巴斯德毕赤酵母自身蛋白质的分泌量很低，十分有利于目的产物纯化；⑦作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的正确加工和修饰；⑧糖基化程度低。

毕赤酵母表达系统由一个外源基因表达框和AOX1启动子、多克隆位点(MCS)和一个从AOX1基因上拷贝下来的终止序列(TT)组成。同时，大多数载体都包含作为筛选标记的HIS4基因和为拷贝增殖而存在的序列(如ColEI复制起始点和抗氨苄青霉素基因)。另外，还含有使外源基因能以替代或插入方式整合到染色体的AOX1部位的AOX13’非编码区序列。本发明所使用的载体是由启动子、终止子、选择标记、报告基因、复制起点等元件构成。另外分泌型载体还需要有信号序列。

最常用的启动子是A′OX1启动子，它的甲醇诱导性很强，因而它控制下的外源基因能得到较高的表达。细胞中绝大多数乙醇氧化酶活力是由AOX1提供的。当在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时，AOX1转录受到抑制；而在以甲醇为唯一生长碳源时，则可诱导AOX1基因的转录和蛋白质表达。选择标记(HIS4)一般是对应于营养缺陷型受体的野生型基因。

巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白质很少，所以分泌表达是一种理想的表达方式。同时，胞外表达更有利于蛋白质的提取和纯化。本发明优选的信号肽是a因子(aMF)。a因子信号序列由87个氨基酸组成，来自于啤酒酵母(S.cerevsia)的a性成熟因子前导序列，并且已将这段序列编码的信号肽插人到巴斯德毕赤酵母的表达载体中。

本发明的巴斯德毕赤酵母表达载体可以是胞内表达的，也可以是分泌表达的。这些载体都包括一个由0.9kb的5′AOX1序列片段和约0.3kb的转录终止基因的3′序列组成的表达盒。分泌型表达载体可以是pPIC9、pPIC9k、pHIL-Sl、pPICZa、pYAM75P6E6等；胞内表达的载体可以是pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10E121、pGAPZ、pGAPZa等。本发明优选的是pPICZa。

一般用于外源基因表达的巴斯德毕赤酵母菌株包括Y-11430、M-6100-3、GS115、KM71、SMD1168等，本发明优选的是巴斯德毕赤酵母X-33菌株。

得到携带ApoC-I基因的重组表达载体后，可使用锂盐法、PEG法、原生质球法和电穿孔法等方法转化巴斯德毕赤酵母宿主细胞。其中，本发明优选的转化方法是电穿孔法(Sambrook，ed.Molecular Cloning：A Laboratory Manul(2nd.ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，1998)。

导入酵母体内的重组表达载体只有与酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在并得以表达。本发明中，为了稳定地表达目的基因，可以在His或5′AOX1的单酶切位点将质粒载体线性化(Sac I)，使之通过单交换整合到酵母细胞染色体中，从而得到表型为Mut⁺并具有高甲醇利用能力的转化子。

用于本发明的巴斯德毕赤酵母含有典型高等真核生物的许多翻译后修饰功能。这些功能包括信号肽的加工、蛋白质折叠、二硫键的形成、O-及N-型糖基化和酰化等。其中，最重要和研究最多的是糖基化作用。蛋白质的糖基化链参与细胞识别、激素受体结合、蛋白质定位及宿主一微生物间相互作用。糖基化过程是经一系列剪接并产生由Mans-6-G1uNAC2(高甘露糖型)组成的寡核糖的反应。巴斯德毕赤酵母能够将碳水化合物连接到分泌表达的外源蛋白质上。巴斯德毕赤酵母修饰糖链的平均长度为8～14甘露糖，而且外链不含a-1，3甘露糖，所以其表达的糖蛋白特别适于治疗应用。

由于本发明中充分优化了发酵pH值、搅拌速率、营养补给等培养条件，所以可使酵母菌高密度生长，从而导致产物的高效表达。例如，在5L摇瓶培养条件下，本发明的重组人载脂蛋白C-I多肽表达产率可达到80mg/L。

绝大多数情况下，巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)中整合多拷贝外源基因会提高重组蛋白表达产量，所以本发明优先选择分泌型、高拷贝标记和易操作的穿梭载体，特别是pPICZa作为ApoC-I多肽的表达载体。

另外，由于在His位点整合时，染色体突变的His位点可与表达盒的HIS4基因位点之间发生基因交换会导致表达盒的丢失，故一般优先选择AOX1位点。

本发明中，发酵培养所使用的培养基可以是BMGY/BMMY，BMG/BMM，MGY/MM等培养基，但优选的是成分中含有缓冲液的BMGY/BMMY或BMG/BMM培养基。

作为唯一的碳源和能源，甲醇的加入量一般为培养体积的0.5-1.0％(V/V)。

发酵培养过程中，可使用已知的方法检测由被转化细胞分离物所产生的ApoC-I多肽含量，并从中选择有高产率的细胞分离物，用于放大生产。

可使用离子交换层析、亲合层析、超滤等方法分离并纯化所需的ApoC-I多肽。

本发明首次在酵母(毕赤酵母X-33)中高效分泌表达了hApoC-I，建立了稳定的rhApoC-I毕赤酵母高效表达体系。与在大肠杆菌中的表达相比，本发明的方法具有如下特点：①表达体系稳定，含目的基因的表达盒通过同源重组整合进入酵母的染色体中，菌种稳定，不存在质粒丢失的问题；②有效的分泌表达，目的蛋白质的表达受醇氧化酶启动子的严格控制，可在甲醇诱导下启动表达并将表达产物分泌到培养基中，而且毕赤酵母本身的蛋白很少分泌到培养基中，使目的蛋白更易于纯化；③表达产量高，rhApoC-I在毕赤酵母中的摇瓶规模表达量可高达80mg/L；④不存在内毒素污染问题；⑤大规模发酵生产成本低。

在ApoC-I纯化方面，本发明采用pH4.0条件下进行阳离子交换层析可很好的避免核酸和内毒素的污染，并且有利于保持rhApoC-I的稳定，防止其降解。

本发明建立了在酵母中高效分泌表达hApoC-I的方法，同时建立了联合使用阳离子交换层析、超滤和疏水层析技术纯化hApoC-I产物的方法。使用SDS-PAGE、Western blot分析，证实按照本发明方法生产的rhApoC-I具有与天然hApoC-I相同的序列和理化性质，从而为进一步检测其体内外生物学活性提供了必要条件。

结果显示，本发明建立的毕赤酵母工程菌高密度发酵生产重组人载脂蛋白C-I的产量约为80mg/L发酵液，经阳离子交换层析、超滤、反向疏水层析纯化后产物回收率约为65.6％，纯度高达95.6％。本发明的这些研究结果无疑将为重组人载脂蛋白C-I的工业化生产和临床应用提供必要的基础。

附图说明

图1显示重组质粒pPICZa/hApoC-I转化酵母菌的PCR鉴定电泳图谱。其中泳道6是DNA分子量标志物(DL2000)；泳道3是空白质粒pPICZa转化的酵母菌基因组DNA的PCR产物；泳道1～2、4～5和7～11是不同酵母菌转化子基因组DNA的PCR扩增产物。

图2显示纯化前后rhApoC-I蛋白的SDS-PAGE图谱(考马斯亮蓝染色)。其中泳道1是商品化抑肽酶(相对分子质量6.5kD)；泳道2是Takara蛋白质分子量标志物；泳道3是是甲醇诱导表达120h发酵上清；泳道4是经SP Sepharose XL阳离子层析、10kD滤膜超滤和Source 30疏水层析纯化的rhApoC-I。

图3显示纯化的rhApoC-I的Western blot分析结果。其中泳道1～3是纯化的rhApoC-I；泳道4是甲醇诱导前发酵上清。

图4显示pH对rhApoC-I表达的影响(SDS-PAGE分析)。其中泳道1是：甲醇诱导表达0h发酵上清；泳道2～9分别为pH3.4、3.8、4.2、4.6、5.0、5.4、5.8、6.2条件下，诱导表达120h上清；泳道10是Takara蛋白质分子量标志物。

具体实施方式

以下借助实施例描述本发明的最佳实施方式。这些实施例旨在进一步举例阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。

实施例1：人载脂蛋白C-I基因(hApo C-I)的克隆和扩增

(1)Trizol法从人肝组织中提取总RNA

将新鲜分离的人肝组织切成100mg的大小，立即放入液氮中速冻。按下列方法从组织中提取总RNA。取出冰冻的组织300mg放入盛有液氮的研钵中，将组织碾碎。将碾碎的组织移入50ml离心管中，加入约5ml Trizol，于室温用匀浆器高速匀浆15～30s。加入1.0ml氯仿(200μl/ml Trizol)，充分振荡摇匀，室温下放置5min。4℃离心(12000r/min)15min后将上层水相移至另一离心管中。加入等体积异丙醇，振荡摇匀，室温沉淀10min，4℃离心(12000r/min)15min，弃上清。加入75％乙醇1ml洗涤沉淀2次，4℃离心(12000r/min)5min，室温下空气蒸发残存乙醇。将总RNA沉淀溶于50μl DEPC处理过的水中，-80℃保存备用。

取1μl样品稀释100倍后经紫外分光光度计测定A260和A280，计算其浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整性。

RNA含量按下面公式计算：

RNA浓度(μg/μl)＝A260×40×稀释倍数/1000

A260/A280＝1.8～2.0表示纯度合格

(2)hApoC-I基因的克隆(RT-PCR法)

RT反应：

在0.2ml EP管中加入上述提取的总RNA 1μg，1μl OligodT，70℃变性10min，冰浴1min，然后加入下列反应液：

MgCl₂                            4μl

10×RNA PCR缓冲液                2μl

RNA酶抑制剂                      0.5μl

dNTP(10mmol/L)                   2μl

AMV逆转录酶                      1μl

无RNA酶灭菌超纯水     加至终体积20μl

于PCR仪上42℃反应60min，然后99℃5min灭活逆转录酶，合成cDNA用于下一步PCR反应。

PCR反应：

向上述0.2ml EP管中加入以下反应体系：

10×LA PCR缓冲液                 8μl

LATaq                            1μl

上游引物                         1μl

下游引物                         1μl

灭菌超纯水           加至终体积100μl

在PCR仪上进行循环扩增。扩增程序为：

①94℃2min

②94℃30s，57℃30s，72℃1min，30个循环

③72℃10min

此PCR反应引物序列如下：

上游引物：5’-TCCAGCAAGGATTCAGAGTGCC-3’(SEQ ID NO：1)

下游引物：5’-TGGGATGTCACCCTTCAGGTC-3’(SEQ ID NO：2)

扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察片段大小是否与预期结果吻合，确定是否得到正确目的基因。

(3)克隆载体的构建、转化与扩增

回收PCR扩增的hApo C-I基因片段进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。回收后，将hApoC-I基因片段与T载体16℃连接30分钟。连接反应体系包括：hApoC-I基因片段0.1～0.3pmol；T载体0.03pmol；溶液I(含DNA连接酶和连接缓冲液，见Takara公司T载体试剂盒)5μl；灭菌超纯水至终体积10μl。

按照常规方法，从37℃培养16小时的XL₁-Blue阴性培养板上(不含抗生素的LB琼脂平板)挑取单个菌落(直径2～3mm)，接种于含有100ml LB培养基的1L培养瓶中，以制备感受态大肠杆菌细胞，并于-80℃冻存备用。

取一份冻存的感受态细胞融化后，加入上述连接产物，进行常规转化。然后取200μl已转化的感受态细胞涂布于含X-Gal、IPTG(二者可在涂菌前半小时涂于LB琼脂平板表面)和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，37℃培养箱中培养12～16小时。

(4)重组载体的鉴定

随机挑取转化后的白色单菌落(“蓝白筛选”)，接种于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中，37℃强烈震荡培养过夜，然后常规提取质粒DNA。取1μl溶解的DNA沉淀物进行琼脂糖凝胶电泳定量分析和酶切鉴定。37℃Pst I、EcoR I双酶消化2小时，1％琼脂糖凝胶电泳后根据内切酶谱鉴定正确克隆。挑选酶切鉴定正确的克隆，提取质粒，用于DNA测序。

实施例2：hApoC-I毕赤酵母分泌型表达载体pPICZa/hApoC-I的构建和宿主细胞转化

取上述测序鉴定正确的携带hApoC-I基因的质粒50ng，按上述比例在0.2ml EP管中建立PCR反应体系。利用上述PCR反应体系和条件，借助上游引物5’-ATACTCGAGAAGAGAACCCCAGACGTCTCCA-3’(SEQ ID NO：3)引入酵母a因子信号肽的部分序列和XhoI位点，并利用下游引物：5’-GCCGAATTCTCATGAGTCAATCTTGAGTTTCTCC-3’(SEQ ID NO：4)引入EcoRI位点。PCR引入上述序列和酶切位点后，回收目的片段。用相应酶切后，连入用同样酶切后的质粒pPICZa，构建毕赤酵母表达载体pPICZa/hApoC-I，然后转化大肠杆菌，提取质粒并进行酶切鉴定和DNA序列测定分析。

取测序正确的培养菌液，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA并用琼脂糖凝胶电泳法进行定量分析。取10～15μg pPICZa/hApoC-I重组质粒经Sac I酶消化(线性化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。线性化的质粒用10μl超纯水溶解后置冰上备用。

从毕赤酵母X-33的YPD阴性培养板上(不含抗生素的YPD琼脂平板)挑取单个菌落，接种于5ml YPD培养基中，250rpm，30℃震荡培养8小时，以常规制备酵母感受态细胞。

然后取80μl上述感受态菌，与10～15μg线性化的重组表达质粒混合，移入0.2cm电转化杯内进行电转化。取50～100μl转化后的菌液涂布于含Zeocin(100μg/ml)的YPD平板上，30℃培养箱培养2～3天，观察转化子的生长状况。PCR方法筛选转化酵母菌。离心回收菌体后，提取酵母基因组DNA并进行PCR鉴定，鉴定结果如附图1所示。

实施例3：ApoA-II多肽的表达和纯化

(1)重组人载脂蛋白C-I(rhApoC-I)的表达

取上述鉴定结果阳性的克隆接种于10ml BMGY(pH6.0)培养基中，30℃震荡培养24小时，至OD₆₀₀达到2.0～6.0时收集细胞。用等体积(10ml)BMMY(pH6.0)重悬细胞沉淀，30℃震荡培养，诱导表达。诱导过程中，每24小时补充一次甲醇至终浓度0.5％，同时补充灭菌超纯水，使发酵液总体积保持不变。在培养的第0、24、48、72、96、120、144、168小时等时间点各取0.5ml发酵液，离心取上清用于蛋白质分析(SDS-PAGE分析，Western Blot分析)。

(2)rhApoC-I的纯化

发酵液经高速大容量离心机(5000r/min)连续离心分离发酵液上清。上清经SPSepharose XL阳离子柱层析(缓冲液为20mmol·L^-1 HAc-NaAc缓冲液，洗脱液为含0.5mol·L^-1 NaCl的20mmol·L^-1 HAc-NaAc缓冲液)以及10kD滤膜超滤和Source 30 RPC反相疏水柱层析(洗脱液为含0.1％TFA的50％甲醇)后用升降恒温浴锅37℃减压蒸馏甲醇洗脱液，脱甲醇浓缩，获得纯化的rhApoC-I。

SDS-PAGE分析结果显示，如此纯化的rhApoC-I至少达到电泳纯，且产物的的收率和纯度分别达到65.6％和95.6％(参见附图2)。

实施例4：ApoC-I多肽的理化性质鉴定

(1)Tricine-SDS-PAGE分析

用Tricine-SDS-PAGE进行蛋白质分子量的测定和粗略定量分析。方法如下：

1)制胶：按如下比例灌制分离胶和浓缩胶。

①15％分离胶的配制：

超纯水                        0.34ml

30％丙烯酰胺                  4.7ml

3.0mol·L^-1Tris-HCl(pH8.45)   3.0ml

甘油                          0.95ml

10％过硫酸铵                  0.03ml

TEMED                         0.006ml

②浓缩胶的配制：

超纯水                        3.12ml

30％丙烯酰胺                  0.64ml

3mol·L^-1Tris-HCl(pH8.45)     1.24ml

10％过硫酸铵                  0.03ml

TEMED                         0.006ml

2)分别取24h、48h、72h、96h、120h培养上清按4∶1比例加入5×SDS样品缓冲液，混匀后，煮沸5min。

3)取出上述样品，冷却至室温后，离心(10000r/min)30s，取上清每孔加样50μl。

4)50V电泳至浓缩胶与分离胶交界处，调整电压到100V，恒压电泳分离。

5)考马斯亮蓝染色、脱色后，观察分析结果。

(2)表达产物的Western blot分析

按照常规方法将发酵液上清经SDS-PAGE后，转印到硝酸纤维素(NC)膜上，室温干燥30～60分钟。将上述NC膜置于平皿中，加入20ml封闭液(含0.2％BSA的TTBS)，室温轻轻振荡2～3小时或4℃封闭过夜。封闭结束后，将NC膜放入杂交袋中按0.1ml抗体溶液/cm²膜加入小鼠抗人ApoC-I抗体，室温振荡1～4小时。膜用TTBS漂洗3～5次后，用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体至1∶200～1∶1000，加入杂交袋中，与NC膜一起室温振荡2～4小时。加入1ml 0.3％(W/V)NiCl或CoCl₂及10μl30％H₂O₂溶液。洗膜后，将膜移入显色液中，室温下轻轻摇动并观察显色反应。结果如附图3所示。

实施例5：rhApoC-I发酵最佳pH的确定

毕赤酵母对培养基的pH适应范围很广，在pH 3.0～6.0都能很好地生长，但是在发酵表达外源蛋白的过程中，发酵液pH对外源蛋白的表达有很大的影响，在大规模发酵细胞高密度培养时尤为明显。因此，在进行大规模发酵前，在摇床水平进行了发酵表达rhApoC-I的pH优化，为rhApoC-I的大规模发酵表达提供必要参数。

选取表达量高的rhApoC-I毕赤酵母工程菌接种于10ml YPD培养基中，30℃、250r/min震荡培养24～36h。取上述培养的菌液1ml接种于100ml BMGY培养基中30℃、250r/min震荡培养24～36h。分别取上述菌液10ml置于50ml离心管中，室温离心(3000r/min)10min，弃上清。各管分别加入未加缓冲液的BMMY9ml，加入1mol·L^-1 Na₂HPO₄和0.5mol·L^-1柠檬酸配制成不同pH的BMMY诱导表达(rhApoC-IT程菌分别在pH为3.4、3.8、4.2、4.6、5.0、5.4、5.8、6.2的条件下诱导表达，确定rhApoC-I发酵的最适pH)，30℃、250r/min震荡培养，诱导过程中每24h补充甲醇至终浓度为0.5％，同时补充灭菌去离子水，使发酵液总体积保持不变。在培养72、96、120、144、168小时等时间点各取0.5ml发酵液，离心取上清进行蛋白质定量分析(Tricine-SDS-PAGE法)。

结果显示在pH值5.4～6.2条件下，rhApoC-I表达量最高，确定pH 5.8为rhApoC-I发酵的最佳pH条件(参见附图4)。

序列表

<110>吉林圣元科技有限责任公司

<120>一种新的载脂蛋白C-I的制备

<140>

<141>

<160>4

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。

<400>1

TCCAGCAAGG ATTCAGAGTG CC

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。

<400>2

TGGGATGTCA CCCTTCAGGT C

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。

<400>3

ATACTCGAGA AGAGAACCCC AGACGTCTCC A

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。

<400>4

GCCGAATTCT CATGAGTCAA TCTTGAGTTT CTCC

Claims (6)

1.一种使用甲基营养酵母生产重组人载脂蛋白C-I多肽的方法，该方法包括：在以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母，其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作连接的元件的DNA构建体转化的：(1)甲基可诱导的转录启动子；(2)编码人载脂蛋白C-I的DNA片段；(3)转录终止子和(4)可选择标志，从而以至少80mg/L培养基的浓度得到重组人载脂蛋白C-I多肽。

2.根据权利要求1的方法，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵AOX1基因。

3.根据权利要求1的方法，用于表达重组人载脂蛋白C-I的甲基营养酵母能够依靠作为碳源和能源的甲醇生长，并且该酵母是被包括甲基可诱导的转录启动子、编码人载脂蛋白C-I的DNA片段、转录终止子和可选择标志的DNA构建体转化的。

4.用于在甲基营养酵母中表达重组人载脂蛋白C-I的DNA构建体，该构建体包括可操作连接的元件：甲基可诱导的转录启动子、编码人载脂蛋白C-I的DNA片段、转录终止子和可选择标志。

5.根据权利要求4的构建体，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。

6.纯化载脂蛋白C-I的方法，特征在于依次使用阳离子交换层析、超滤和疏水层析技术分离。

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