CN1594582A - 一种制备人载脂蛋白a-ⅰ的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域,涉及一种制备人载脂蛋白A-I(ApoA-I)的方法。具体涉及利用毕赤酵母系统,通过构建重组工程菌株、表达、分离纯化获得高效生产人载脂蛋白A-I的方法。本发明通过基因工程手段将来源于天然的apoA-I基因重组至P.pastoris宿主菌,表达水平可高达200mg/L,表达产物经冷丙酮分级沉淀和-Sepharose分离纯化获得电泳纯的ApoA-I蛋白。经Western-blot鉴定、蛋白质谱检测、N端氨基酸测序、细胞结合活性测定均与人血来源的ApoA-I蛋白一致。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,涉及一种制备人载脂蛋白A-I的方法。具体涉及利用毕赤酵母系统,通过构建重组工程菌株、表达、分离纯化获得高效生产人载脂蛋白A-I的方法。
背景技术
高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)是血浆中重要的脂蛋白,HDL参与胆固醇的逆向转运,将肝外细胞的胆固醇转运至肝脏,并加以转化和清除,因而具有抗动脉粥样硬化作用。另外HDL还具有抗炎、抗内毒素、促进细胞分裂、连接脂多糖、改善动脉血管的异常收缩、减少血管内皮细胞分泌表皮因子、刺激内皮细胞合成前列环素并延长其半衰期等功能。
人载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I,ApoA-I)是HDL的主要载脂蛋白,是HDL功能的主要执行者。有研究表明,ApoA-I还具有抗内毒素、抗病毒、抗氧化、抗凝、和抗炎作用,以及调节细胞黏附因子的表达、介导细胞内信号传导等功能。因此ApoA-I在胆固醇的转运、代谢、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗病毒及抑制急性相炎症反应造成的组织损伤中起重要作用,目前其已成为脂类代谢研究的重点之一。
目前已从肝及周围组织细胞的细胞膜上相继分离到高亲和力的ApoA-I和HDL受体,并发现肝脏选择性摄取HDL胆固醇酯。因此游离的HDL和ApoA-I具有肝脏靶向的特点,这一特点使得ApoA-I在靶向药物研究中有着良好的应用前景。
从人血清提取的ApoA-I的蛋白分子量为28.3kD,由243个氨基酸组成,无糖基化修饰。目前HDL主要从人血清分离提取,但由于人血液供应短缺和难以解决的血液污染等问题,很难实现产业化,大大限制了其开发和应用。为进一步探索ApoA-I的结构与功能及其在新药开发中的应用,可利用基因工程技术制备,实现ApoA-I的高效表达。
已知用于重组ApoA-I的表达系统有大肠杆菌表达系统、P.pastoris甲醇酵母表达系统、昆虫表达系统等。应用较多的为大肠杆菌原核系统,但在大肠杆菌中,ApoA-I的mRNA极不稳定,表达的成熟蛋白易被降解,一般以融合蛋白的形式表达,难以获得成熟的ApoA-I,且表达水平低(20mg/L)。Robert O,Ryan等将ApoA-I的cDNA通过定点突变进行修饰,获得了突变修饰的ApoA-I cDNA编码序列,然后在大肠杆菌的BL21(DE)pLysS进行了表达,表达水平达100mg/L左右。有研究在昆虫杆状病毒表达系统表达了ApoA-I,表达水平接近100mg/L。由于是胞内表达,给分离纯化造成困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备人载脂蛋白A-I的方法。具体涉及一种是通过构建重组工程菌株获得高效、大批量生产ApoA-I的方法。
本发明采用DNA重组技术将来源于天然的ApoA-I基因在毕赤酵母中既实现了高效分泌表达,又可用新的分离方法快速地获得电泳纯度的ApoA-I。纯化的ApoA I经蛋白质谱检测、N端氨基酸测序和分子量测定与人血清提取的ApoA-I一致,竞争性结合试验显示毕赤酵母工程菌制备的ApoA-I保持天然血浆ApoA-I的细胞结合活性。
本发明通过下述方法和步骤进行
将apoA-I基因装入P.pastoris的分泌型表达载体上,线性化后转化P.pastoris甲醇酵母宿主菌,利用重组菌进行高效表达,用冷丙酮分级沉淀后经Q-Sepharose柱进一步分离,得到电泳纯的ApoA-I蛋白,包括下述步骤,
1,构建重组质粒
以昆虫表达系统的表达质粒DNA为模板通过PCR扩增获天然apoA-I基因片段,在apoA-I基因编码序列的5’端和3’端分别引入酶切位点Xhol I和EcoR I,双酶切后装入P.pastoris的分泌性表达载体pPIC9k上,获得重组表达质粒。
本发明将带有天然apoAI基因的质粒(钟江:生物工程学报,2003,19:692-697。)用定点突变法(TaKaRa公司)消除基因内的两个XhoI位点,并在基因地5’端添加XhoI位点,在基因的3’端添加EcoRI位点。并通过基因突变去除apoA-I基因片段内的两个XholI位点。
2,构建表达菌株,
上述apoA-I基因片段经Xhol I和EcoR I双酶切装入P.pastoris的分泌型表达载体(购自Invitrogen公司)上获得表达质粒。表达质粒经BglII酶切,电转化P.pastoris GS115(构自Invitrogen公司)电感受态细胞。转化子经抗性筛选、表达能力鉴定,获得高表达菌株,表达的蛋白经Western-blot鉴定,结果证实为ApoA-I蛋白。
3,发酵、培养、分离ApoA-I蛋白
将上述所得高产菌株在试管活化后接入优化的BMGY培养基(其中含蛋白胨20%,酵母粉10%,1M磷酸缓冲液10%,甘油10%,YNB 13.6g/L),28-30℃,220rpm培养24-28h,发酵液离心(6000rpm,6min),菌体用优化的BMMY(其中用5ml/L甲醇替代BMGY中的甘油)诱导培养基重悬,同样条件下培养84-96h,每24h补甲醇1%(V/V)。上清液经SDS-PAGE检测,表达水平达200mg/L。发酵上清液搅拌下加入-20℃丙酮,使丙酮浓度达20%,-4℃放置5h,离心,收集上清液。上清液中加丙酮至终浓度40%,-10℃。离心,收集上清液。上清液中加入丙酮至终浓度60%,并调pH至5.8,-10℃放置5h,离心收集沉淀。
Q-Sepharose离子交换柱平衡,上述沉淀用5mmol/L PBS的溶解后上柱,0-1.0M NaCl的PBS洗脱,用分布收集器收集洗脱液,280nm检测,收集主峰,透析后浓缩冻干。
4产物鉴定及蛋白活性检测
将纯化产物进行蛋白质谱检测和N末端测序分析蛋白质谱(上海基康生物技术有限公司,基康编号:S40520001),检测结果表明基因工程表达的ApoA-I分子量为28.06kD,人血清提取的ApoA-I分子量为28.165kD。N末端测序分析结果基因工程表达的ApoA-I与人血清提取的ApoA-I完全一致。所述基因工程表达ApoA-I N末端氨基酸序列:DEPPQ SPWDR VKDLA,人血清提取的ApoA-I人血清提取的ApoA-I:DEPPQ SPWDR VKDLA。
本发明通过FITC标记基因工程ApoA-I与天然血浆HDL竞争结合肝细胞实验进行蛋白活性测定,结果显示基因工程表达的ApoA-I保持天然血浆ApoA-I的细胞结合活性。
附图说明
图1是本发明的包含apoA-I基因的重组质粒构建图。
图2是本发明的基因工程表达的ApoA-I SDS-PAGE电泳图谱:其中1为阳性重组菌的胞内蛋白;2为空载体pPIC3.5k转化的重组菌表达的产物;3为低分子量标准蛋白。
图3是本发明Western-blot照片。其中,1为血清提取ApoA-I,2为摇瓶表达ApoA-I,3为发酵罐表达ApoA-I,4为阴性对照。
图4是本发明的毕赤酵母重组菌株表达ApoA-I蛋白量与时间关系,其中,A为摇瓶:1,2,3,4,5,分别表示摇瓶内诱导72,84,96,120,132h时ApoA I表达量,6为低分子量标准蛋白,
B为发酵罐:1,2,3,4,5,6,7,8,分别表示发酵罐内诱导24,36,48,60,72,84,96,108h时ApoA I表达量,9为低分子量标准蛋白。
图5是本发明纯化后ApoA-I的SDS-PAGE电泳图谱,其中,1为纯化后ApoA-I,2为低分子量标准蛋白。
图6是本发明纯化基因工程ApoA-I与天然血浆ApoA-I的质谱检测图谱比较,其中1为重组ApoA-I蛋白质谱图,2为人血来源ApoA-I蛋白质谱图。
图7是本发明纯化基因工程ApoA-I与天然血浆ApoA-I肝细胞竞争结合图谱。
具体实施方式
实施例1 获得重组apoA-I表达质粒
根据apoA-I基因序列,以昆虫表达系统的表达质粒DNA为模板通过PCR扩增获天然片段,并在N端和C端分别设置Xhol I和EcoR I酶切位点,上述apoA-I基因片段经Xhol I和EcoR I双酶切装入P.pastoris的分泌型表达载体获得表达质粒。
实施例2表达质粒电转化毕赤酵母GS115
所构建的表达质粒pPIC9k-apoA-I用BglII酶切线性化。宿主菌P.pastorisGS115(his mut+)培养至OD为1.6-1.8,制备电感受态细胞,与上述质粒混合,再以GIBCOL BRL电转化仪CELL-PORATOR电转化,其中电压1500V,电容50μF,电阻4kΩ,向转化杯中加入0.5ml 1mol/L冷山梨醇,取200μl涂于MD平板,30℃培养至单菌落出现,结果得到1000余个转化子。
实施例3 筛选高抗性毕赤酵母重组菌株
将1000余个转化子依次涂于含G418分别为1mg/ml,2mg/ml,3mg/ml,4mg/ml的YPD平板上,28-30℃培养,结果在含4mg/mlG418平板上获得22个转化子。
实施例4 筛选高表达能力菌株
将上述22株高抗性菌的单菌落分别接入含3ml BMGY的试管中,28-30℃,220rpm培养24h,分别吸取1.5ml接入含40ml BMGY的培养基,同样条件下培养24h,离心(6000rpm,6min),菌体重悬于15mlBMMY培养基,同样条件下培养96h(每24h补甲醇150ul)。发酵液离心,取上清液做SDS-PAGE电泳,结果有6株表达产物在28KD左右有明显的蛋白条带,选其中16号菌做实验菌。
实施例5 表达产物的Western-blot鉴定
将电泳后的SDS-PAGE凝胶剥离,浸入电转移缓冲液中漂洗1min.4℃电转移2h.取出转移膜,放入5%脱脂牛奶封闭液中,37℃缓慢摇动1h.用封闭液稀释一抗(兔抗人ApoA I抗体)1/1000,37℃缓慢摇动1h.用TBS缓冲液洗膜。用封闭液稀释二抗(anti-rabbit)1/30000,37℃缓慢摇动1h.用TBS洗膜一次,AP底物缓冲液洗膜两次。在10mlAP底物缓冲液中加入BCIP 33μl,NBT 66μl,将膜显色30min,条带清洗后漂洗,终止显色。
实施例6 重组甲醇酵母菌株表达ApoA-I
从YPD斜面培养基挑选单菌落,接入含3ml BMGY的试管,28-30℃,220r/min,培养24h,取1.5ml转入40ml BMG培养基生长24h,离心(6000rpm,6min),弃上清,菌体用15mlBMMY诱导培养基悬浮,同样条件下培养,每24h补甲醇15ul。从72h开始每12h取样做SDS-PAGE,。
实施例7 发酵罐中毕赤酵母重组菌株表达ApoA-I
发酵罐为美国NBS公司Bio F110自动控制发酵系统,含pH自动调节、温度自动控制、溶氧监测、搅拌、进气系统。
发酵参数设置 温度:30℃;pH:6.0;DO(溶氧浓度):35%;搅拌:200-800r/min.
种子液制备:从YPD斜面培养基挑选单菌落,接入含40ml BMGY的摇瓶,28-30℃,220r/min培养24h,作为一级种子液。再以5%的接种量接入BMGY 400ml,同样条件下培养12-14h,至A600约8左右,作为发酵罐种子液。
发酵培养:14L发酵罐装入4L基础盐培养液,种子液以8-10%的接种量接入发酵罐。当DO陡然上升至80-90%,表明培养及内甘油耗尽流加50%甘油,4h后停止。甘油耗完,开始流加甲醇,流加速度以维持DO 35%为宜。定时取样做SDS-PAGE电泳,适时放罐,最终菌体密度达150g/L(湿重),表达量达160mg/L。
实施例8 ApoA-I蛋白的分离纯化
发酵上清液搅拌下加入-20℃丙酮,使丙酮浓度达20%,-4℃放置5h,离心,收集上清液。上清液中加丙酮至终浓度40%,-10℃。离心,收集上清液。上清液中加入丙酮至终浓度60%,并调pH至5.8,-10℃放置5h,离心收集沉淀。
Q-Sepharose离子交换柱平衡,上述沉淀用5mmol/L PBS的溶解后上柱,0-1.0M NaCl的PBS洗脱,用分布收集器收集洗脱液,280nm检测,收集主峰,透析后浓缩冻干。
实施例9 ApoA-I蛋白活性测定(FITC标记基因工程ApoA-I与天然血浆HDL竞争结合肝细胞实验)
基因工程制备ApoA-I按50μg FITC/mg蛋白比例加入FITC-DMSO溶液。室温避光培养4h,进行蛋白荧光标记。经PBS(pH7.2,10mM)充分透析后得到FITC标记的基因工程ApoA-I,进行细胞实验。肝癌SMC7721细胞(1×106个/ml),37℃,5%CO2培养24h,吸弃培养夜后每孔加入FITC标记的基因工程ApoA-I 0.12mg及各种浓度天然HDL(蛋白浓度分别为0,0.21,0.9,2.22mg),。37℃,5%CO2温育3h.后分离细胞,经洗涤后分别测定细胞结合荧光强度(λex499nm,λem520nm)。
Claims (6)
1,一种制备人载脂蛋白A-I的方法,其特征是将apoA-I基因装入P.pastoris的分泌型表达载体上,线性化后转化P.pastoris甲醇酵母宿主菌,利用重组菌进行高效表达,用冷丙酮分级沉淀后经Q-Sepharose柱进一步分离,得到电泳纯的ApoA-I蛋白,包括下述步骤:
1)构建重组质粒
以昆虫表达系统的表达质粒DNA为模板通过PCR扩增获天然apoA-I基因片段,在apoA-I基因编码序列的5’端和3’端分别引入酶切位点Xhol I和EcoR I,双酶切后装入P.pastoris的分泌性表达载体上,获得重组表达质粒;
2)构建ApoA-I表达菌株
步骤1)的重组质粒用BglII线性化,电转化宿主细胞,转化液涂于MD平板,28-30℃培养至转化子长出;
3)筛选高表达菌株
步骤2)的转化子经G418抗性筛选,获得抗4mg/ml G418的高抗性菌株,经甲醇诱导获得高表达菌株;
4)发酵、培养、分离ApoA-I蛋白
步骤3)的高表达菌株发酵在优化后的BMGY内生长,诱导ApoA-I产生,上清液经丙酮分级沉淀、Q-Sepharose分离纯化,获纯的ApoA-I蛋白。
2,据权利要求1所述的制备人载脂蛋白A-I的方法,其中步骤1的P.pastoris的分泌性表达载体是pPIC9k。
3,根据权利要求1所述的制备人载脂蛋白A-I的方法,其中步骤1的P.pastoris分泌型表达载体其对应的重组菌为分泌表达。
4,根据权利要求1所述的制备人载脂蛋白A-I的方法,其中步骤2的电转化宿主细胞是GS115宿主细胞。
5,根据权利要求1所述的制备人载脂蛋白A-I的方法,其中步骤3的高抗性菌株是抗4mg/ml G418的高抗性菌株。
6,根据权利要求1所述的制备人载脂蛋白A-I的方法,其中步骤4的高表达菌株发酵采用优化的培养基BMGY,BMMY,其中含蛋白胨20%,酵母粉10%,1M磷酸缓冲液10%,5ml/L甲醇和YNB 13.6g/L。
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CN101092616B (zh) * | 2006-06-20 | 2011-09-21 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 嗜中性颗粒蛋白ngp的表达和纯化 |
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- 2004-06-30 CN CN 200410025581 patent/CN1594582A/zh active Pending
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101092616B (zh) * | 2006-06-20 | 2011-09-21 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 嗜中性颗粒蛋白ngp的表达和纯化 |
CN101082045B (zh) * | 2007-01-22 | 2010-12-08 | 耿永健 | 一种载脂蛋白-j的制备方法 |
CN101928721B (zh) * | 2009-06-22 | 2013-03-13 | 吉林圣元科技有限责任公司 | 一种新的载脂蛋白c-ⅰ的制备 |
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