CN101928677B - 一种脂肽类化合物a21978c的产生菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种脂肽类化合物A21978C的产生菌株。本发明提供的脂肽类化合物A21978C的产生菌株的保藏号为CGMCC No.2346。本发明提供的菌株发酵生产脂肽类化合物A21978C，其生产能力较出发菌株提高了185％，且其遗传稳定性较好。

Description

一种脂肽类化合物A21978C的产生菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体地说，涉及一种脂肽类化合物A21978C的产生菌株及其应用。
背景技术
二十世纪80年代初美国礼莱公司的科学家从玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)提取出一组具有强烈抑制革兰阳性菌的脂肽类化合物，命名为A21978C，其结构如图1所示。
A21978C化合物主要包括6个组分，依次为：C0、C1、C2、C3、C4和C5，其中，C1、C2、C3的含量通常较高，C0、C4、C5的含量相对较低。A21978C化合物具有共同的母核。A21978C化合物的基本结构由13个氨基酸组成，其中的十个氨基酸组成一个环肽，另有3个氨基酸排列成线状，这三个氨基酸末端的L-色氨酸接着一个长度不等的脂肪酸链。
发明内容
本申请的发明人利用氯化锂作为助变剂，对玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)ATCC 31568进行紫外诱变，获得了玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)突变株。对该突变株进行发酵培养，获得的发酵液中，A21978C化合物的产量较出发菌株玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)ATCC 31568有明显提高。
因此，本发明的目的在于，提供一种脂肽类化合物A21978C的产生菌株，以用于生产A21978C化合物。
本发明的另一个目的在于，提供所述菌株的应用，即用于发酵生产A21978C化合物。
本发明提供的脂肽类化合物A21978C的产生菌株，其保藏号为CGMCCNo 2346。
本发明提供的菌株发酵生产脂肽类化合物A21978C，其生产能力较玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)ATCC 31568提高了185％，且遗传稳定性也较好。
附图说明
图1是A21978C化合物母核及三个主要组份的结构式。
本发明的脂肽类化合物A21978C的产生菌株已于2008年1月16日提交位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.2346.
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
发明人利用氯化锂作为助变剂，对玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)ATCC 31568进行紫外诱变，获得了玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)突变株。对该突变株进行发酵培养，获得的发酵液中，A21978C化合物的产量较出发菌株玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)ATCC 31568有显著提高。
在本发明的下述实施例中，使用的培养基配方如下：
斜面培养基：硝酸钾0.1％，可溶性淀粉2.0％，磷酸氢二钾0.05％，七水硫酸镁0.05％，氯化钠0.05％，硫酸铁0.001％，琼脂2.0％，pH7.2-7.4。
固体平板培养基配方同斜面培养基。
种子培养基：葡萄糖2.0％，甘油2.0％，淀粉6.0％，黄豆粉5.0％，磷酸二氢钾0.02％，硫酸镁0.02％，pH7.5。
发酵培养基：黄豆饼粉2.2％，糊精3.6％，葡萄糖0.825％，硫酸亚铁铵0.066％，pH7.5。
在本发明的下述实施例中，HPLC检测条件如下：
分析系统：Agilentl100型液相色谱仪，自动进样器，VWD检测器；
色谱柱：十八烷基硅烷键和反相柱；
检测波长：210nm；
流动相：乙腈和水混合液为洗脱液，其中加有0.5％磷酸二氢铵。
采用梯度洗脱，洗脱方式如表1所示。
表1、HPLC洗脱方案
  0min   15min   17min
  乙腈∶水＝10∶90   25％   0％   0％
  乙腈∶水＝45∶55   75％   100％   100％
流速：1.5ml/min；
柱温：35℃；
进样量：20μl。
实施例1、菌株诱变
在菌株ATCC 31568斜面上加入灭菌的4％的LiCl溶液，然后，用无菌接种铲刮取培养物表面的孢子，制成粗制的孢子悬液；再将此悬液倒入装有玻璃珠的三角摇瓶中振荡，以打散孢子，然后用装有脱脂棉的漏斗过滤悬液，振荡摇匀，获得单孢子悬液。
将单孢子悬液放在28℃摇床间震荡培养4h后，用灭菌的4％的LiCl溶液调整孢子数量至108个/ml，加5ml于直径为6cm的无菌平皿中，于15W紫外灯下30cm处照射，其中，辐射波长260nm，恒速搅拌下照射30s，避光修复1h后，经适当稀释后，涂布于装有固体平板培养基的平皿上，于28℃避光培养5～7d，获得单菌落生长平皿。
用灭菌后的接种铲从单菌落生长的平皿上挑取孢子，涂布到装有斜面培养基的试管中，28℃恒温培养5～7d，获得孢子固体斜面。
实施例2、菌株筛选
2.1、菌株培养
取实施例1获得的孢子固体斜面，铲取1cm2左右的培养物，接种至灭菌后的种子培养基中进行培养，其中，摇床转速为220rpm，培养温度为28℃，培养时间为48h。
然后，以4％的比例吸取生长良好的种子培养液至灭菌后的发酵培养基中，于220rpm、28℃，培养时间6d。
2.2、菌株筛选
将步骤2.1中获得的发酵液离心，离心上清与甲醇以适当的比例混合，振荡摇匀并静置30min后，于12000rpm离心10分钟，取上清液，HPLC检测A21978C化合物产量(以C1、C2、C3三个主要产物峰的积分面积计)，同时，以ATCC 31568为对照。
根据HPLC检测结果，选取发酵液中A21978C化合物产量最高的菌株，重复实施例1和实施例2的步骤，经过多次菌株诱变和菌株筛选，得到了一株A21978C化合物的高产菌株HCCB10108，经发酵培养获得发酵液，并使用HPLC对发酵液进行了检测，其中，C1、C2、C3组分含量及三个组分的总含量分别如表2所示。
表2、HCCB10108与ATCC31568发酵检测结果
  产物峰面积   C1   C2   C3   总计
  ATCC 31568   109   249   166   524
  HCCB10108   272   789   433   1494
表2的结果显示，HCCB10108较原始菌株ATCC 31568产量提高了185％。
菌株HCCB10108已于2008年1月16日提交位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.2346。
实施例3、稳定性检测
为考察CGMCC No.2346的遗传稳定性，将CGMCC No.2346在斜面上连续传五代。并取每一代斜面培养获得的菌株进行摇瓶二级发酵和效价测定，并计算每代菌株的平均效价，结果如表3所示，其中，以CGMCC No.2346F0代的平均效价为100％。
表3、菌株CGMCC No.2346的传代稳定性检测结果
  传代次数   相对生产能力(％)
  F0   100
  F1   100
  F2   108
  F3   103
  F4   99
  F5   97
表3结果显示，菌株CGMCC No.2346经过连续五代斜面传接后，F1-F5代的相对生产能力为F0代的相对生产能力的97％-108％，波动很小。
根据表3结果，菌株CGMCC No.2346基本没有出现退化现象，在提高产能的同时其遗传稳定性也较好。
综上所述，本发明提供的菌株发酵生产脂肽类化合物A21978C，其生产能力较玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)ATCC 31568提高了185％，且其遗传稳定性也较好。

Claims (2)

1.一种脂肽类化合物A21978C的产生菌株，其特征在于：所述菌株为玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)，保藏号为CGMCC No.2346。
2.权利要求1所述的菌株的应用，其特征在于：用于生产脂肽类化合物A21978C。
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