CN101921319A

CN101921319A - 茜草科类型环肽,以其为活性成分的药物组合物,其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101921319A
Application number: CN 201010232742
Authority: CN
Inventors: 谭宁华; 范君婷; 李艳; 苏佳; 李佳; 周宇波; 彭延敏; 彭涛; 朱钦昌; 曾广智
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Shanghai Institute of Materia Medica of CAS; Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Shanghai Institute of Materia Medica of CAS; Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2010-07-21
Filing date: 2010-07-21
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2030-07-21
Also published as: CN101921319B

Abstract

本发明提供茜草科类型环肽，以其为活性成分的药物组合物，其制备方法和应用。本发明的茜草科类型环肽，由1个D-α-丙氨酸，1个L-α-丙氨酸，3个取代的N-甲基-L-α-酪氨酸和一个其它种类的L-α-氨基酸经肽键缩合而成，且6个氨基酸缩合成为十八元环，其中2个邻位的酪氨酸之间的苯环经氧桥连接形成一个十四元环。优选结构式为(1-11)的茜草科类型环肽，为NF-κB信号通路的抑制剂。提供此类化合物的制备方法及在制备抗单纯疱疹病毒I型(HSV-1)药物中的应用。

Description

茜草科类型环肽，以其为活性成分的药物组合物，其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于药物技术领域，具体地，涉及一类茜草科类型环肽，作为NF-κB信号通路抑制剂，以其为有效成分的药物组合物，其制备方法及其在制备抗单纯疱疹病毒I型(HSV-1)药物中的应用。

背景技术：

NF-κB信号通路广泛参与多种生物学效应，包括免疫反应、炎症反应、病毒侵染、细胞生长、细胞凋亡和肿瘤发生发展等，是高等生物细胞中最重要的信号通路之一。核转录因子NF-κB是免疫应答、炎症反应和机体发育过程中的关键转录因子，它在细胞中的定位与活力受到严格的调控。活化的NF-κB参与调控多种因子的基因表达，如致炎症反应因子NO、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8，趋化因子MCP-1、RANTES，细胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1等。如果这些调节发生异常，就会导致微生物侵染、自身免疫疾病、发育异常和肿瘤等病理现象。NF-κB家族蛋白在体内各种类型细胞中普遍存在，在哺乳动物细胞中主要有5个成员，分别为RelA(P65)，RelB，c-Rel，NF-κB1(p50/p105)和NF-κB2(p52/p100)。各成员可形成同型或异型二聚体而存在，最常见的是p65/p50二聚体。NF-κB信号通路主要包括一条经典信号通路和两条非经典信号通路。

目前已有许多NF-κB信号通路抑制剂被发现，按来源主要分为天然产物、合成化合物、SiRNA、多肽以及蛋白(病毒、细菌、真菌)等。根据抑制剂在通路中的作用位置和作用机制不同可以分为作用于IKK复合体上游、直接针对IKK复合体、IKK与细胞核之间、细胞核内等四类。此外，NF-κB通路抑制剂已有被FDA批准上市作为临床药物的成功案例，例如用于治疗肿瘤的三氧化二砷(ATO)，Thalidomide，蛋白酶体抑制剂PS341(bortezomib)以及治疗内风湿性关节炎等炎症相关疾病的TNF-α单克隆抗体Remicade和Humira。但是，其他作用模式、结构新颖的小分子抑制剂的临床应用报道还较少，同时该通路在相关疾病发生发展中的作用机制和调控机制有待更加深入阐明。所以发现结构新颖的NF-κB信号通路小分子抑制剂用于治疗该通路相关疾病，或发现特异性的工具分子或探针分子去阐明该通路的信号转导作用机制，具有十分重要的学术意义和很好的应用前景。

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)属于疱疹病毒科(herpesviridae)中α-疱疹病毒亚科的胞膜DNA病毒。临床上，HSV具有两个血清型，分别为HSV-1和HSV-2。HSV-1主要引起人腰部以上的黏膜和神经系统感染，所致疾病有角膜炎、疱疹性脑炎、脑膜炎、唇疱疹和龈口炎等。HSV-2主要引起腰以下生殖器感染，是生殖器疱疹(GH)的主要病原体。HSV先天感染和新生儿感染，可引起胎儿先天畸形、流产、早产和新生儿疱疹性疾病。HSV对成人感染率高达60％～90％，其最显著的生物学特性是能在原发感染后在体内潜伏，并持续存在。高热、免疫抑制、手术等因素的刺激可激活潜伏的HSV，引起症状性发作，或无症状性的病毒播散。HSV还能够引起细胞癌变，其单独感染，或与人乳头瘤病毒(HPV)的共感染是宫颈癌发生的主要原因之一。

目前尚未有成功的HSV疫苗上市。用于治疗HSV感染的药物以核苷类衍生物为主，主要是通过与病毒DNA聚合酶正常底物竞争从而抑制病毒DNA合成而达到抗病毒目的，如阿昔洛伟(ACV)，泛昔洛伟(FCV)，贲昔洛伟(PCV)和更昔洛伟(GCV)等。这些药物对治疗HSV具有很好的疗效，但因作用机制单一，随着使用的频率和剂量的增加，耐药性和毒副作用的问题日益突出。药用植物是开发新药的重要来源，从广泛的天然产物中寻找新的抗疱疹病毒药物，尤其是具有不同作用机制的药物，具有极其重要的现实意义。

现有技术中未见有茜草科类型环肽作为NF-κB信号通路抑制剂的报道，此外，茜草科类型环肽对单纯疱疹病毒I型的活性抑制作用也未见报道；

茜草科类型环肽在茜草科植物中的分离纯化较为困难，最重要的原因是茜草属植物中富含蒽醌类色素，且色素极性范围广，从脂溶性色素到水溶性色素都有，很难使此类色素与环肽类成分分开。现有技术中，从茜草属植物中分离环肽类成分已公开发表如下方法：(1)70年代，茜草科寒丁子属寒丁子花、茎、叶依次用甲醇和乙腈提取，再用甲醇和异丙醚低温析出沉淀，之后用制备TLC分离得到环肽bouvardin和deoxybouvardin(RA-V)。参见：Jolad，S.D.et al，Bouvardinand deoxybouvardin，antitumor cyclic hexapeptides from Bouvardiaternifolia(Rubiaceae)，J.Am.Chem.Soc.，1977，99(24)，8040-8044。其缺点是乙腈溶剂作为提取溶剂价格较贵，不适于工业生产；低温沉淀技术可控性和重现性不好；仅用制备TLC技术难以得到微量环肽。(2)90年代，茜草科茜草属小红参的根茎用甲醇提取后，甲醇浸膏经活性碳、硅胶或烷基化硅胶柱色谱分离纯化，得到环肽RA-V、RA-XII和RY-II。参见：邹澄等，小红参的抗癌环己肽配糖体，云南植物研究，1993，15(4)，399-402。其缺点是活性碳对样品的吸附性强，容易损失样品，且难以得到微量环肽。(3)近年来，茜草科茜草属茜草的根用甲醇提取后，甲醇浸膏加水混悬后用氯仿萃取，氯仿部分依次用硅胶、氧化铝、氨丙基键和硅胶色谱柱层析得到环肽富集部分。此环肽富集部分用甲醇重结晶，再结合各种层析材料包括HPLC对结晶或母液进行分离纯化，得到一系列环肽，包括大量和微量环肽。参见：Lee，J.E.et al.Structures of cytotoxicbicyclic hexapeptides，RA-XIX，-XX，-XXI，and -XXII，from Rubiacordifolia L.Tetrahedron.，2008，64，4117-4125。其缺点在于氧化铝对样品的吸附性强，氨丙基键和硅胶材料价格较贵，实验室和工业上不常用，甲醇重结晶技术可控性和重现性不好。

发明内容：

针对现有技术存在的上述不足之处，本发明的目的在于提供一类茜草科类型环肽化合物；提供制备该类化合物的方法，该提取分离方法可控性和重现性好，样品损失少，成本较低，操作方便，可分离得到微量环肽，溶剂可以反复回收利用，也适用于工业生产；本发明的目的还在于提供以茜草科类型环肽化合物为有效成分的药物组合物；该类化合物作为新型NF-κB信号通路抑制剂，以及在制备抗单纯疱疹病毒I型的药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：

茜草科类型环肽化合物，由1个D-α-丙氨酸，1个L-α-丙氨酸，3个取代的N-甲基-L-α-酪氨酸和1个其它种类的L-α-氨基酸经肽键缩合而成，且6个氨基酸缩合成为十八元环，其中2个邻位的酪氨酸之间的苯环经氧桥连接形成一个十四元环。

本发明的环肽，优选具有下述结构式的化合物RA-V(1)、RA-I(2)、RA-XXIV(3)、RA-XII(4)、rubiyunnanin D(5)、rubiyunnanin C(6)、rubiyunnaninE(7)、rubiyunnanin F(8)、rubiyunnanin G(9)、rubiyunnanin H(10)和RY-II(11)。

制备本发明上述茜草科类型环肽化合物的方法，取茜草属植物的根茎，经干燥、粉碎后，用甲醇回流充分提取；将甲醇浸膏加水混悬后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取；乙酸乙酯部分和正丁醇部分反复用硅胶、Sephadex LH-20，RP-18，硅胶H，HPLC各种层析柱分离纯化，再结合环肽的TLC检测方法即得到茜草科类型环肽。

制备如下结构式所示茜草科类型环肽化合物RA-V(1)、RA-I(2)、RA-XXIV(3)、RA-XII(4)、rubiyunnanin D(5)、rubiyunnanin C(6)、rubiyunnaninE(7)、rubiyunnanin F(8)、rubiyunnanin G(9)和rubiyunnanin H(10)和RY-II(11)的方法，取小红参的根茎，经干燥、粉粹后，用甲醇回流提取3次，时间为每次1-4小时，提取液经减压浓缩得甲醇浸膏。将甲醇浸膏加水混悬后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取，等体积各萃取三次，回收溶剂得到乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分。将乙酸乙酯部分经硅胶柱层析，用100∶0，95∶5，9∶1，8∶2，0∶100的氯仿/甲醇梯度洗脱，薄层层析，结合环肽TLC检测方法合并其中的95∶5、9∶1和8∶1含有环肽的部分。以下的每一步骤都须结合环肽TLC检测方法来进行分离纯化。合并后的浸膏再次经硅胶柱层析，用70∶1-8∶2的氯仿/甲醇梯度洗脱，根据环肽点的不同合并为六个组分Fr.1-Fr.6。Fr.1组分经硅胶柱层析，用7∶3-0∶1石油醚/丙酮为洗脱剂分离得到五个亚组分Fr.1-1-Fr.1-5。其中Fr.1-4经Sephadex LH-20层析，1∶1的氯仿/甲醇为洗脱剂，所富集的含有环肽的部分再经硅胶H反复层析，用6∶4的石油醚/丙酮洗脱分离得到化合物RA-V(1)。Fr.2组分经硅胶柱层析，95∶5-9∶1的氯仿/甲醇梯度洗脱，合并得到七个亚组分Fr.2-1-Fr.2-7。Fr.2-4部分用反相RP-18硅胶拌样，经RP-18柱层析，用20∶80-90∶10的甲醇/水梯度洗脱，得到六个亚组分Fr.2-4-1-Fr.2-4-6。组分Fr.2-4-2经Sephadex LH-20层析，1∶1的氯仿/甲醇为洗脱剂，富集的环肽部分再次经RP-18柱层析，30∶70-50∶50的甲醇/水梯度洗脱得到化合物RA-I(2)。组分Fr.2-4-5同样经Sephadex LH-20层析，1∶1的氯仿/甲醇为洗脱剂，富集的环肽部分经反相RP-18柱层析，20∶80-40∶60的甲醇/水梯度洗脱，含有环肽部分再经硅胶H反复层析，用20∶1-10∶1氯仿/甲醇洗脱分离得到化合物rubiyunnanin C(6)。Fr.3组分经硅胶柱层析，70∶1-9∶1的氯仿/甲醇梯度洗脱，合并得到五个亚组分Fr.3-1-Fr.3-5；Fr.3-3组分再次经硅胶柱层析，1∶1-0∶1石油醚/丙酮梯度洗脱，含有环肽部分经Sephadex LH-20再富集，1∶1氯仿/甲醇为洗脱剂，所富集的环肽部分经硅胶H反复纯化，20∶1氯仿/甲醇为洗脱剂，分离得到化合物RA-XXIV(3)。Fr.4组分经硅胶柱层析，20∶1-8∶2乙酸乙酯/甲醇进行梯度洗脱，合并得到四个亚组分Fr.4-1-Fr.4-4。亚组分Fr.4-3直接经Sephadex LH-20进行环肽富集，1∶1氯仿/甲醇为洗脱剂。再经硅胶柱层析，95∶5-0∶1氯仿/甲醇梯度洗脱，合并得到七个亚组分Fr.4-3-1-Fr.4-3-7。其中Fr.4-3-5用反相RP-18硅胶拌样，经RP-18柱层析，40∶60-60∶40的甲醇/水梯度洗脱，得到化合物RA-XII(4)。Fr.4-3-7部分经ODSHPLC半制备柱纯化，33％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到化合物rubiyunnaninD(5)和rubiyunnanin E(7)。Fr.5组分经硅胶柱层析，95∶5-0∶1氯仿/甲醇梯度洗脱，合并得到四个亚组分Fr.5-1-Fr.5-4。亚组分Fr.5-3再经硅胶柱层析，20∶1-0∶1乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱，合并得到四个亚组分Fr.5-3-1-Fr.5-3-4。亚组分Fr.5-3-2和亚组分Fr.5-3-4分别经Sephadex LH-20进行环肽富集，1∶1氯仿/甲醇为洗脱剂。所得含有环肽部分再分别经反相RP-18柱层析，20∶80-50∶50的甲醇/水梯度洗脱进行富集。亚组分Fr.5-3-2所富集环肽部分经ODS HPLC半制备柱分离纯化，23％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到化合物RY-II(11)。亚组分Fr.5-3-4所富集环肽部分经ODS HPLC半制备柱分离纯化，40％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到化合物rubiyunnanin G(9)和rubiyunnanin H(10)。Fr.6组分经硅胶柱层析，9∶1∶0.1-8∶2∶0.2氯仿/甲醇/水梯度洗脱，合并得到四个亚组分Fr.6-1-Fr.6-4。亚组分Fr.6-3再经硅胶柱层析，20∶1-8∶2乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱，合并得到含有环肽的部分Fr.6-3-2。Fr.6-3-2经反相RP-18柱层析，10∶90-40∶60的甲醇/水梯度洗脱得到六个亚组分Fr.6-3-2-1-Fr.6-3-2-6。Fr.6-3-2-1经Sephadex LH-20层析，1∶1氯仿/甲醇为洗脱剂富集环肽，再经ODS HPLC半制备柱纯化，28％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到化合物rubiyunnanin F(8)。

以本发明的上述茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐为有效成分的NF-κB信号通路抑制剂。

用于治疗单纯疱疹病毒I型的药物组合物，其中含有治疗有效量的本发明的上述茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体。

本发明还提供了含有治疗有效量的上述结构式所示的茜草科类型环肽化合物RA-V(1)、RA-I(2)、RA-XXIV(3)、RA-XII(4)、rubiyunnanin D(5)、rubiyunnaninC(6)、rubiyunnanin E(7)、rubiyunnanin F(8)、rubiyunnanin G(9)、rubiyunnanin H(10)和RY-II(11)或其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体的药物组合物。

本发明同时提供了本发明的茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐在制备NF-κB信号通路抑制剂中的应用；以及茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐在制备治疗单纯疱疹病毒I型相关疾病的药物中的应用。

本发明对云南特有种茜草科茜草属植物小红参进行系统的环肽化学成分研究，利用多种分离纯化手段，包括正反相硅胶柱层析，Sephadex LH-20凝胶层析，HPLC半制备等，从中获得了一系列茜草科类型环肽。之后，对所有环肽类成分在LPS和IFN-γ诱导的小鼠腹腔巨噬细胞系RAW 264.7模型上检测NO生成抑制活性、用荧光素酶报告基因方法检测NF-κB通路抑制活性，以及在基于重组报告病毒HSV/Blue的体外评价模型上检测抗HSV-1活性。发现其中RA-V(1)、RA-I(2)、RA-XXIV(3)、RA-XII(4)、rubiyunnanin D(5)、rubiyunnanin C(6)、rubiyunnanin E(7)、rubiyunnanin F(8)、rubiyunnanin G(9)、rubiyunnanin H(10)和RY-II(11)为新型NF-κB信号通路抑制剂；而且还具有很好的体外抑制单纯疱疹病毒I型的活性，可用于制备抗单纯疱疹病毒I型的药物。

本发明的所述茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐，可以列举例如与盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸等无机酸，或者马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对-苯甲磺酸、己二酸、棕榈酸、单宁酸等有机酸，锂，钠、钾等碱金属，钙、镁等碱土金属，赖氨酸等碱性氨基酸成的盐。

本发明所述的治疗单纯疱疹病毒I型相关疾病的药物组合物，由茜草科类型环肽化合物与药学上可接受的载体制备的药物剂型包括片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等。由于茜草科类型环肽可从小红参以及同属植物中提取分离，而片剂、胶囊、口服液、针剂、注射用冻干剂或粉针剂等药物剂型的制备也是本领域的常规知识。因此。由茜草科类型环肽化合物与相应载体制备的各种药物剂型也能够由本领域技术人员实现。

上文中所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂黏土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和硬脂酸镁、以及聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1％～99.5％的活性成分，最优选含有重量比为0.5％～95％的活性成分。

本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01～10mg/kg体重，优选0.1～5mg/kg体重。可以一次或多次施用。

本发明茜草科类型环肽提取方法的优益性在于，首先提取分离思路具有新颖性，成功利用色谱层析技术将蒽醌色素和茜草科类型环肽分离。概括地说，利用Sephadex LH-20的分子筛原理，可分开一部分与环肽分子量相差很大的蒽醌类成分，再利用反相RP-18色谱柱的吸附层析原理，成功分离得到含色素较少的环肽部分，再结合各种层析材料包括HPLC分离纯化即得环肽纯品。其次，仅利用实验室或工业上常规的层析材料，包括正反相硅胶、Sephadex LH-20和HPLC等，不必运用特殊层析材料如氨丙基键和硅胶，也避免运用吸附性较强的活性碳和氧化铝等层析材料；没有使用可控性和重现性较差的沉淀析出或重结晶法，在实际操作中，发现因样品成分复杂，色素重，很难得到沉淀或结晶进行进一步分离；最后，环肽的分离过程中必须结合环肽的TLC检测方法(参见：周俊，谭宁华，科学通报，2000，45(10)，1047-1051)。总之，本发明提取分离方法可控性和重现性好，样品损失少，成本较低，操作方便，可分离得到微量环肽，溶剂可以反复回收利用，也适用于工业生产。

附图说明：

图1为本发明的茜草科类型环肽化合物的制备方法流程图；

图2为本发明的茜草科类型环肽化合物抗HSV-1活性实验；

图3为本发明的茜草科类型环肽化合物对vero细胞毒性实验。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的改进都属于本发明的范围。

实施例1：

茜草科类型环肽化合物RA-V(1)、RA-I(2)、RA-XXIV(3)、RA-XII(4)、rubiyunnanin D(5)、rubiyunnanin C(6)、rubiyunnanin E(7)、rubiyunnaninF(8)、rubiyunnanin G(9)、rubiyunnanin H(10)和RY-II(11)的制备方法及其结构鉴定：

取小红参的根茎100kg，经干燥、粉粹后，用甲醇回流提取3次(100L×3次)，时间为3h、3h、2h，提取液经减压浓缩得甲醇浸膏21kg。将甲醇浸膏加水混悬后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取，等体积各萃取三次(30L×3次)，回收溶剂得到乙酸乙酯部分6.4kg、正丁醇部分8kg和水部分5kg。将乙酸乙酯部分经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇梯度洗脱(100∶0，95∶5，9∶1，8∶2，0∶100)，薄层层析，结合环肽TLC检测方法合并其中的95∶5，9∶1和8∶1含有环肽的部分。以下的每一步骤都须结合环肽TLC检测方法来进行分离纯化。合并后的浸膏再次经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇(70∶1-8∶2)梯度洗脱，根据环肽点的不同合并为六个组分(Fr.1-Fr.6)。Fr.1(139g)组分经硅胶柱层析，石油醚/丙酮(7∶3-0∶1)为洗脱剂分离得到五个亚组分(Fr.1-1-Fr.1-5)。其中Fr.1-4(30g)经Sephadex LH-20层析，氯仿/甲醇(1∶1)为洗脱剂，所富集的含有环肽的部分再经硅胶H反复层析，用石油醚/丙酮(6∶4)洗脱分离得到RA-V(1)(4g)。Fr.2(257g)组分经硅胶柱层析，氯仿/甲醇(95∶5-9∶1)进行梯度洗脱，合并得到七个亚组分(Fr.2-1-Fr.2-7)。Fr.2-4(104g)部分用反相RP-18硅胶拌样，经RP-18柱层析，20∶80-90∶10的甲醇/水梯度洗脱，得到六个亚组分(Fr.2-4-1-Fr.2-4-6)。组分Fr.2-4-2(18g)经SephadexLH-20层析，氯仿/甲醇(1∶1)为洗脱剂，富集的环肽部分再次经RP-18柱层析，30∶70-50∶50的甲醇/水梯度洗脱得到RA-I(2)(145mg)。组分Fr.2-4-5(10g)同样经Sephadex LH-20层析，氯仿/甲醇(1∶1)为洗脱剂，富集的环肽部分经反相RP-18柱层析，20∶80-40∶60的甲醇/水梯度洗脱，含有环肽部分再经硅胶H反复层析，用氯仿/甲醇(20∶1-10∶1)洗脱分离得到rubiyunnanin C(6)(34mg)。Fr.3(94g)组分经硅胶柱层析，氯仿/甲醇(70∶1-9∶1)进行梯度洗脱，合并得到五个亚组分(Fr.3-1-Fr.3-5)。Fr.3-3(12g)再次经硅胶柱层析，石油醚/丙酮(1∶1-0∶1)梯度洗脱，含有环肽部分经Sephadex LH-20再富集，氯仿/甲醇(1∶1)为洗脱剂。所富集的环肽部分经硅胶H反复纯化，氯仿/甲醇(20∶1)为洗脱剂，分离得到RA-XXIV(3)(290mg)。Fr.4(365g)组分经硅胶柱层析，乙酸乙酯/甲醇(20∶1-8∶2)进行梯度洗脱，合并得到四个亚组分(Fr.4-1-Fr.4-4)。亚组分Fr.4-3(50g)直接经Sephadex LH-20进行环肽富集，氯仿/甲醇(1∶1)为洗脱剂。再经硅胶柱层析，氯仿/甲醇(95∶5-0∶1)进行梯度洗脱，合并得到七个亚组分(Fr.4-3-1-Fr.4-3-7)。其中Fr.4-3-5(21g)用反相RP-18硅胶拌样，经RP-18柱层析，40∶60-60∶40的甲醇/水梯度洗脱，得到RA-XII(4)(6g)。Fr.4-3-7(46mg)部分经ODS HPLC半制备柱纯化，33％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到rubiyunnanin D(5)(9mg)和rubiyunnanin E(7)(29mg)。Fr.5(87g)组分经硅胶柱层析，氯仿/甲醇(95∶5-0∶1)进行梯度洗脱，合并得到四个亚组分(Fr.5-1-Fr.5-4)。亚组分Fr.5-3(35g)再经硅胶柱层析，乙酸乙酯/甲醇(20∶1-0∶1)进行梯度洗脱，合并得到四个亚组分(Fr.5-3-1-Fr.5-3-4)。亚组分Fr.5-3-2(4.5g)和亚组分Fr.5-3-4(6g)分别经Sephadex LH-20进行环肽富集，氯仿/甲醇(1∶1)为洗脱剂。所得含有环肽部分再分别经反相RP-18柱层析，20∶80-50∶50的甲醇/水梯度洗脱进行富集。亚组分Fr.5-3-2所富集环肽部分经ODS HPLC半制备柱分离纯化，23％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到化合物RY-II(11)(57mg)。亚组分Fr.5-3-4所富集环肽部分经ODS HPLC半制备柱分离纯化，40％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到rubiyunnanin G(9)(6mg)和rubiyunnanin H(10)(8mg)。Fr.6(151g)组分经硅胶柱层析，氯仿/甲醇/水(9∶1∶0.1-8∶2∶0.2)进行梯度洗脱，合并得到四个亚组分(Fr.6-1-Fr.6-4)。亚组分Fr.6-3(27g)再经硅胶柱层析，乙酸乙酯/甲醇(20∶1-8∶2)进行梯度洗脱，合并得到含有环肽的部分Fr.6-3-2。Fr.6-3-2经反相RP-18柱层析，10∶90-40∶60的甲醇/水梯度洗脱得到六个亚组分(Fr.6-3-2-1-Fr.6-3-2-6)。Fr.6-3-2-1经Sephadex LH-20层析，氯仿/甲醇(1∶1)为洗脱剂富集环肽，再经ODS HPLC半制备柱纯化，28％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到rubiyunnanin F(8)(22mg)。

化合物rubiyunnanin D(5)、rubiyunnanin C(6)、rubiyunnanin E(7)、rubiyunnanin F(8)、rubiyunnanin G(9)和rubiyunnanin H(10)的结构式如下所示：

rubiyunnanin D(5)、rubiyunnanin C(6)、rubiyunnanin E(7)、rubiyunnaninF(8)、rubiyunnanin G(9)和rubiyunnanin H(10)的结构鉴定数据为：

rubiyunnanin D(5)：白色无定型粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)203(4.69)，276(3.70)nm；IR(KBr)v_max3421，2938，1659，1516，1448，1203，1138，838，722cm^-1；for ¹H and ¹³C NMR数据，见

表2；positive FABMS m/z 801(10)[M+H]⁺；positive HRESIMS m/z 823.3259[M+Na]⁺，cacld for C₄₁H₄₈N₆O₁₁Na，823.3278。

rubiyunnanin C(6)：白色晶体；mp 253-254℃；

UV(MeOH)λ_max(logε)203(4.80)，277(3.78)nm；IR(KBr)v_max3414，2937，1737，1660，1514，1445，1209，1096，838，803cm^-1；for ¹H and ¹³C NMR数据，见表2；positive FABMS m/z 829(100)[M+H]⁺；positiveHRFABMS m/z 828.3713[M]⁺，cacld for C₄₃H₅₂N₆O₁₁，828.3694。

rubiyunnanin E(7)：白色无定型粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)204(4.81)，280(3.87)nm；IR(KBr)v_max3426，2938，1664，1515，1446，1204，1134，839，801，722cm^-1；for ¹H and ¹³C NMR数据，见表2；positive FABMS m/z 831(50)[M+H]⁺；positive HRESIMS m/z 853.3391[M+Na]⁺，cacld for C₄₂H₅₀N₆O₁₂Na，853.3384。

rubiyunnanin F(8)：白色无定型粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)203(4.87)，276(3.80)nm；IR(KBr)v_max3423，2932，1663，1512，1447，1414，1248，1208，1075，839，803cm^-1；for ¹H and ¹³C NMR数据，见表3；positive FABMS m/z 976(92)[M+H]⁺；positive HRESIMS m/z976.4334[M+H]⁺，cacld for C₄₈H₆₂N₇O₁₅，976.4303。

rubiyunnanin G(9)：白色无定型粉末；UV(MeOH)λ_max(logε)203(4.57)，277(3.53)nm；IR(KBr)v_max3440，2936，1658，1640，1517，1449，1207，838，810cm^-1；for ¹H and ¹³C NMR数据，见表3；positive FABMS m/z 905(24)[M+H]⁺；positive HRESIMS m/z 927.3734[M+Na]⁺，cacld for C₄₅H₅₆N₆O₁₄Na，927.3752。

rubiyunnanin H(10)：白色无定型粉末；

UV(MeOH)λ_max(logε)203(4.81)，276(3.83)nm；IR(KBr)v_max3424，2933，1657，1640，1512，1248，1075cm^-1；for ¹H and ¹³C NMR数据，见表3；positiveFABMS m/z 935(95)[M+H]⁺；positive HRESIMS m/z 957.3882[M+Na]⁺，cacldfor C₄₆H₅₈N₆O₁₅Na，957.3857。

表1 rubiyunnanin D(5)、rubiyunnanin C(6)和rubiyunnanin E(7)的¹H NMR和¹³CNMR数据(C₅D₅N，δin ppm，J in Hz)

^aData were measured at 125MHz. ^bData were measured at 500MHz.

表2 rubiyunnanin F(8)、rubiyunnanin G(9)和rubiyunnanin H(10)的¹H NMR和¹³C NMR数据(CD₃OD，δ in ppm，J in Hz)

^aData were measured at 100MHz. ^bData were measured at 500MHz.^cData were measured at 400MHz.

实施例2：

本发明茜草科类型环肽化合物RA-V(1)、RA-I(2)、RA-XXIV(3)、RA-XII(4)、rubiyunnanin D(5)、rubiyunnanin C(6)、rubiyunnanin E(7)、rubiyunnaninF(8)、rubiyunnanin G(9)、rubiyunnanin H(10)和RY-II(11)在LPS和IFN-γ诱导的小鼠腹腔巨噬细胞系RAW 264.7模型上能够明显抑制NO生成。实验原理、方法和结果如下：

实验原理：编码一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)的基因是NF-κB信号通路的直接靶基因之一，当细胞遭受微生物内毒素、炎症介质等刺激时会激活NF-κB信号通路，从而生成大量的诱导型NOS，一氧化氮合酶通过催化其底物L-精氨酸，生成NO和L-瓜氨酸，NO在水溶液中以亚硝酸离子的形式存在。本实验应用LPS和IFN-γ刺激RAW 264.7细胞，然后应用Griess试剂测定细胞培养上清液中NO₂ ^-水平以反映诱导型NOS的总体酶活。

实验方法：(1)接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液将RAW 264.7细胞配成单个细胞悬液，以每孔2×10⁵个细胞接种到96孔板。(2)化合物处理：细胞贴壁后，加入LPS和IFN-γ诱导一氧化氮生成，同时加入待测化合物溶液，继续培养24小时。(3)显色：吸取细胞上清液并加入Griess试剂显色，570nm检测吸光度。同批细胞应用MTT法测定细胞存活量。(4)记录结果，以浓度为横坐标，细胞NO生成量和存活率为纵坐标绘制曲线，应用Reed and Muench法计算化合物的IC₅₀值。

实验结果：

表3茜草科类型环肽1-11对NO生成的半数抑制浓度

Compound	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	MG-132
													IC₅₀(μM)	0.05	0.25	2.22	0.32	7.22	5.16	11.25	1.77	12.64	12.68	1.99	0.35

实验结果表明，化合物1-11均具有抑制NO生成的活性，其中RA-V(1)，RA-I(2)和RA-XII(4)的活性强于阳性对照蛋白酶体抑制剂MG-132，RA-V(1)活性最强，IC₅₀值达到50nM。

实施例3：

本发明茜草科类型环肽化合物RA-V(1)、RA-I(2)、RA-XXIV(3)、RA-XII(4)、rubiyunnanin D(5)、rubiyunnanin C(6)、rubiyunnanin E(7)、rubiyunnanin F(8)、rubiyunnanin G(9)、rubiyunnanin H(10)和RY-II(11)用荧光素酶报告基因方法检测NF-κB通路抑制活性，进一步确证环肽分子确实作用于NF-κB通路。实验原理、方法和结果如下：

实验原理：NF-κB核转录因子有着保守的DNA结合序列，通过与其结合，调控下游基因的表达。pNF-κB-Luc报告质粒(Clontech)载有萤火虫荧光素酶报告基因，该基因的表达由合成的启动子所调控，其中包含基本的启动子元件(TATA box)，以及NF-κB转录因子的DNA结合序列，所以萤火虫荧光素酶报告基因的表达受NF-κB信号通路调控。通过考察化合物对荧光素酶报告基因表达变化可以反应出化合物对NF-κB信号通路的调控作用。

实验方法：(1)接种pNF-κB-Luc稳定转染的HEK293细胞：用含10％胎牛血清的HG-DMEM培养液将HEK293细胞配成单个细胞悬液，以每孔1×10⁴个细胞接种到96孔板。(2)化合物处理：细胞培养24h后，先加入待测化合物溶液(化合物从25μg/mL到0.1μg/mL，3倍稀释)，培养1h，然后加入10ng/mL TNF-α诱导NF-κB信号通路激活，继续培养2h。(3)荧光素酶活性检测：荧光素酶活性检测采用Promega公司的单底物荧光素酶检测试剂盒(Promega，E2510)，加入50μL单底物荧光素酶底物，避光孵育30min，在Envision多标记微孔板检测仪(Perkin-Elmer Life Sciences，Inc.，Boston，MA，USA)上读值分析。同批细胞应用MTT法测定细胞存活量。(4)记录结果，以单独TNF-α处理组为100％，对原始读值均一化处理，以浓度为横坐标，荧光素酶信号相对值为纵坐标绘制曲线，计算化合物的IC₅₀值。

实验结果：

表4茜草科类型环肽化合物1-11对NF-κB信号通路的抑制作用

Compound	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	PS-341
													IC₅₀(μM)	0.03	1.69	12.64	1.18	35.07	ND	ND	ND	ND	ND	ND	0.14

ND：no detected(＞25μg/mL)

实验结果表明，化合物1-11均具有NF-κB信号通路的抑制活性，其中RA-V(1)活性最强，IC₅₀为30nM，其活性强于阳性对照合成化合物PS341数量级相当，大大强于目前发现的大多数NF-κB信号通路天然抑制剂。所以茜草科类型环肽为一类结构新颖的NF-κB信号通路天然抑制剂。

实施例4：

本发明茜草科类型环肽化合物RA-V(1)、RA-I(2)、RA-XXIV(3)、RA-XII(4)、rubiyunnanin D(5)、rubiyunnanin C(6)、rubiyunnanin E(7)、rubiyunnanin F(8)、rubiyunnanin G(9)、rubiyunnanin H(10)和RY-II(11)都有一定的抗单纯疱疹病毒I型的活性，其中化合物RA-V(1)和RA-XII(4)具有较好的抗单纯疱疹病毒I型的活性。抗单纯疱疹病毒I型实验原理、方法和结果如下：

实验原理：所使用的抗HSV-1活性评价系统是一种基于重组报告病毒HSV/Blue的体外评价系统。重组病毒HSV/Blue感染后细胞内的病毒数量与报告基因lacZ表达的数量在一定范围内成正比，因此在其线性范围内检测lacZ表达产物β-Gal的活性则可间接检测到病毒的数量。实验中通过比较处理组和病毒对照组的报告基因活性，从而评价样品的抗HSV-1活性。

实验方法：

(1)样品的细胞毒性检测

Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)在96孔细胞培养板中培养形成单层后，加入不同浓度的样品液，继续培养48h后，更换含10％Alamarblue的培养液继续培养4h后检测其530/590nm处的荧光值，检测样品对Vero细胞的毒性，并计算半数细胞毒浓度(CC₅₀)。

(2)样品抗HSV-1病毒作用检测

Vero细胞在96孔细胞培养板中培养形成单层后，0.5M的病毒液和不超过20％细胞毒性的梯度浓度样品溶液同时加到Vero细胞上，继续培养24h后，检测报告基因lacZ的表达产物β-Gal，确定样品对HSV-1的抑制作用，并计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

实验结果：

表5茜草科类型环肽化合物1-11的抗HSV-1活性

实验结果表明，化合物1-11都具有一定的抗HSV-1活性。其中RA-V抗HSV-1活性显著，选择指数(SI)达22.9。

实施例5：

实施例1所得化合物1-11，加入4％的硫酸乙醇溶液，PH＝4，过滤，干燥，制成硫酸盐化合物1-11。

实施例6：

实施例1所得化合物1-11，加入4％的盐酸溶液，PH＝4，过滤，干燥，制成盐酸盐化合物1-11。

实施例7：

实施例1所得化合物1-11，加入4％的酒石酸溶液，PH＝4，过滤，干燥，制成酒石酸盐化合物1-11。

实施例8：

实施例1所得化合物1-11，加入4％的柠檬酸溶液，PH＝4，过滤，干燥，制成柠檬酸盐化合物1-11。

实施例9：

片剂：实施例1所得化合物1-11或实施例5-8所得的盐10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg。

制备方法：将化合物或其盐、乳糖和淀粉混和，用水均匀湿润、把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，化合物含量为10mg。

实施例10：

安瓿剂：实施例1所得化合物1-11或实施例5-8所得的盐2mg，氯化钠10mg。

制备方法：将化合物或其盐和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例11：

注射用冻干剂：实施例1所得化合物1-11或实施例5-8所得的盐10mg，碳酸氢钠2mg，甘露醇252mg。

制备方法：将碳酸氢钠、甘露醇，加注射用水溶解，加活性碳吸附30min除热原，过滤除去活性碳，在滤液中加入化合物或其盐，超声处理使溶解，用1N盐酸调节PH为5.0-7.0，微孔滤膜滤过，加注射用水，分装，冷冻干燥，上塞，轧盖，即得。

实施例12：

胶囊剂：实施例1所得化合物1-11或实施例5-8所得的盐10mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg。

制备方法：将化合物或其盐与助溶剂混和，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。

Claims

1.茜草科类型环肽化合物，由1个D-α-丙氨酸，1个L-α-丙氨酸，3个取代的N-甲基-L-α-酪氨酸和1个其它种类的L-α-氨基酸经肽键缩合而成，且6个氨基酸缩合成为十八元环，其中2个邻位的酪氨酸之间的苯环经氧桥连接形成一个十四元环。

2.如权利要求1所述的环肽，为具有下述结构式的化合物rubiyunnanin D(5)、rubiyunnanin C(6)、rubiyunnanin E(7)、rubiyunnanin F(8)、rubiyunnaninG(9)、rubiyunnanin H(10)，

3.制备权利要求1所述茜草科类型环肽化合物的方法，取茜草属植物的根茎，经干燥、粉碎后，用甲醇回流充分提取；将甲醇浸膏加水混悬后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取；乙酸乙酯部分和正丁醇部分反复用硅胶、SephadexLH-20、RP-18、硅胶H、HPLC各种层析柱分离纯化，再结合环肽的TLC检测方法即得到茜草科类型环肽。

4.制备如下结构式所示茜草科类型环肽化合物RA-V(1)、RA-I(2)、RA-XXIV(3)、RA-XII(4)、rubiyunnanin D(5)、rubiyunnanin C(6)、rubiyunnaninE(7)、rubiyunnanin F(8)、rubiyunnanin G(9)、rubiyunnanin H(10)和RY-II(11)的方法，取小红参的根茎，经干燥、粉粹后，用甲醇回流提取3次，时间为每次1-4小时，提取液经减压浓缩得甲醇浸膏；将甲醇浸膏加水混悬后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取，等体积各萃取三次，回收溶剂得到乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分；将乙酸乙酯部分经硅胶柱层析，用100∶0，95∶5，9∶1，8∶2，0∶100的氯仿/甲醇梯度洗脱，薄层层析，结合环肽TLC检测方法合并其中的95∶5、9∶1和8∶1含有环肽的部分；以下的每一步骤都须结合环肽TLC检测方法来进行分离纯化；合并后的浸膏再次经硅胶柱层析，用70∶1-8∶2的氯仿/甲醇梯度洗脱，根据环肽点的不同合并为六个组分Fr.1-Fr.6；Fr.1组分经硅胶柱层析，用7∶3-0∶1石油醚/丙酮为洗脱剂分离得到五个亚组分Fr.1-1-Fr.1-5；其中Fr.1-4经SephadexLH-20层析，1∶1的氯仿/甲醇为洗脱剂，所富集的含有环肽的部分再经硅胶H反复层析，用6∶4的石油醚/丙酮洗脱分离得到化合物RA-V(1)；Fr.2组分经硅胶柱层析，95∶5-9∶1的氯仿/甲醇梯度洗脱，合并得到七个亚组分Fr.2-1-Fr.2-7；Fr.2-4部分用反相RP-18硅胶拌样，经RP-18柱层析，用20∶80-90∶10的甲醇/水梯度洗脱，得到六个亚组分Fr.2-4-1-Fr.2-4-6；组分Fr.2-4-2经Sephadex LH-20层析，1∶1的氯仿/甲醇为洗脱剂，富集的环肽部分再次经RP-18柱层析，30∶70-50∶50的甲醇/水梯度洗脱得到化合物RA-I(2)；组分Fr.2-4-5同样经Sephadex LH-20层析，1∶1的氯仿/甲醇为洗脱剂，富集的环肽部分经反相RP-18柱层析，20∶80-40∶60的甲醇/水梯度洗脱，含有环肽部分再经硅胶H反复层析，用20∶1-10∶1氯仿/甲醇洗脱分离得到化合物rubiyunnanin C(6)；Fr.3组分经硅胶柱层析，70∶1-9∶1的氯仿/甲醇梯度洗脱，合并得到五个亚组分Fr.3-1-Fr.3-5；Fr.3-3组分再次经硅胶柱层析，1∶1-0∶1石油醚/丙酮梯度洗脱，含有环肽部分经Sephadex LH-20再富集，1∶1氯仿/甲醇为洗脱剂，所富集的环肽部分经硅胶H反复纯化，20∶1氯仿/甲醇为洗脱剂，分离得到化合物RA-XXIV(3)；Fr.4组分经硅胶柱层析，20∶1-8∶2乙酸乙酯/甲醇进行梯度洗脱，合并得到四个亚组分Fr.4-1-Fr.4-4；亚组分Fr.4-3直接经Sephadex LH-20进行环肽富集，1∶1氯仿/甲醇为洗脱剂；再经硅胶柱层析，95∶5-0∶1氯仿/甲醇梯度洗脱，合并得到七个亚组分Fr.4-3-1-Fr.4-3-7；其中Fr.4-3-5用反相RP-18硅胶拌样，经RP-18柱层析，40∶60-60∶40的甲醇/水梯度洗脱，得到化合物RA-XII(4)；Fr.4-3-7部分经ODSHPLC半制备柱纯化，33％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到化合物rubiyunnaninD(5)和rubiyunnanin E(7)；Fr.5组分经硅胶柱层析，95∶5-0∶1氯仿/甲醇梯度洗脱，合并得到四个亚组分Fr.5-1-Fr.5-4；亚组分Fr.5-3再经硅胶柱层析，20∶1-8∶2乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱，合并得到四个亚组分Fr.5-3-1-Fr.5-3-4；亚组分Fr.5-3-2和亚组分Fr.5-3-4分别经Sephadex LH-20进行环肽富集，1∶1氯仿/甲醇为洗脱剂；所得含有环肽部分再分别经反相RP-18柱层析，20∶80-50∶50的甲醇/水梯度洗脱进行富集；亚组分Fr.5-3-2所富集环肽部分经ODS HPLC半制备柱分离纯化，23％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到化合物RY-II(11)；亚组分Fr.5-3-4所富集环肽部分经ODS HPLC半制备柱分离纯化，40％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到化合物rubiyunnanin G(9)和rubiyunnanin H(10)；Fr.6组分经硅胶柱层析，9∶1∶0.1-8∶2∶0.2氯仿/甲醇/水梯度洗脱，合并得到四个亚组分Fr.6-1-Fr.6-4；亚组分Fr.6-3再经硅胶柱层析，20∶1-8∶2乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱，合并得到含有环肽的部分Fr.6-3-2；Fr.6-3-2经反相RP-18柱层析，10∶90-40∶60的甲醇/水梯度洗脱得到六个亚组分Fr.6-3-2-1-Fr.6-3-2-6；Fr.6-3-2-1经Sephadex LH-20层析，1∶1氯仿/甲醇为洗脱剂富集环肽，再经ODS HPLC半制备柱纯化，28％乙腈和4‰三氟乙酸为洗脱剂，得到化合物rubiyunnanin F(8)，

5.以权利要求1中的茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐为有效成分的NF-κB信号通路抑制剂。

6.用于治疗单纯疱疹病毒I型的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1的茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体。

7.药物组合物，其中含有治疗有效量的如下结构式所示的茜草科类型环肽化合物RA-V(1)、RA-I(2)、RA-XXIV(3)、RA-XII(4)、rubiyunnanin D(5)、rubiyunnanin C(6)、rubiyunnanin E(7)、rubiyunnanin F(8)、rubiyunnanin G(9)、rubiyunnanin H(10)和RY-II(11)或其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体，

8.权利要求1所述茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐为有效成分在制备NF-κB信号通路抑制剂中的应用。

9.权利要求1所述茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐在制备治疗单纯疱疹病毒I型相关疾病的药物中的应用。