CN114748469A

CN114748469A - 天然香豆素类化合物在制备atp柠檬酸裂解酶抑制剂中的用途

Info

Publication number: CN114748469A
Application number: CN202210450461.3A
Authority: CN
Inventors: 周戚; 吴寿远; 姜春筱; 梅迪
Original assignee: Taizhou University
Current assignee: Taizhou University
Priority date: 2022-04-26
Filing date: 2022-04-26
Publication date: 2022-07-15

Abstract

本申请公开一种天然香豆素类化合物在制备ATP柠檬酸裂解酶抑制剂中的用途，天然香豆素类化合物的结构式如式(1)所示：

Description

天然香豆素类化合物在制备ATP柠檬酸裂解酶抑制剂中的用途

技术领域

本申请属于医药技术邻域，具体涉及化合物fraxidin在制备预防或防治ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)介导的糖脂代谢紊乱相关疾病(如高脂血症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝、II型糖尿病和肥胖症等)的药物或该类药物先导化合物中的用途。

背景技术

ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)是糖代谢与脂肪酸和胆固醇生物合成的关键酶，其作用底物和产物是糖代谢中的关键中间产物，并可作为脂肪酸合成的底物。人体ACL酶蛋白是由4个相同的120KDa亚基组成的同源四聚体，每个多肽链含有1101个氨基残基(Singh et al,J.Biol.Chem.1976,251,5254-5250)。ACL是一种胞质酶，催化柠檬酸和辅酶A转化为乙酰辅酶A和草酰乙酸，同时伴随着ATP的水解。ACL在肝脏、肾脏、胰腺等生脂细胞和胆碱能神经细胞中高度表达(Beigneux et al.,J.Biol.Chem.2004,279,9557-9564)，其催化衍生的乙酰辅酶A也被用于胆固醇的生物合成。作为胞质乙酰辅酶A的主要来源，ACL与脂肪酸和胆固醇的合成密切相关。

高脂血症是由于脂肪代谢异常而导致一种或多种血脂高于正常值的一种代谢紊乱症，是导致心脑血管疾病(Cardiovascular disease,CDV)的主要高危因素(Mendis etal.,Prog.Cardiovasc.Dis.2010,53,10-14)。美国心脏病协会(American HeartAssociation)报道，CDVs是全球致死的首位原因，其发病率和死亡率在全球范围内仍逐年递增，目前已成为全球重要的公共卫生问题之一。

近几年科研人员开展了大量降脂药物的研究，以提升其对高血脂引起的相关疾病的治疗能力。研究表明，ATP依赖的柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase，ACL)有望成为抗高胆固醇血症的药物新靶标(Wang et al.,Hepatology,2009,49,1166-1175)。乙酰辅酶A是内源性脂肪酸和胆固醇生物合成的重要基础材料，而ACL作为胞质乙酰辅酶A的主要来源，在偶联三羧酸循环(TCA cycle)及胆固醇从头合成中起到极其关键的作用，其作用底物和产物是糖代谢中的关键中间产物，并可作为脂肪酸合成的底物。

研究表明，ACL抑制剂能够有效阻断脂肪酸和胆固醇的从头合成，并降低血脂。因此，寻找有效的ACL抑制剂，通过抑制ACL的活性来降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的浓度，对于治疗血脂异常，减少动脉粥样硬化等心血管疾病的发生，有非常重要的应用前景。随着高通量筛选技术的广泛运用，目前已经发现较多种类的ACL小分子抑制剂，例如：ETC-1002(Bempedoic acid)已于2020年被美国FDA批准上市，单独或者与依折麦布联用可用于治疗患者高胆固醇血症(Powell et al,Clinical Therapeutics,2021.43,410-420)。除ECT-1002外，其他ACL抑制剂，由于其细胞穿透力低、与ACL的亲和力弱以及特异性不强等原因，临床应用受到限制。因此寻找高效、高选择性，同时兼具良好药代动力学性质的小分子ACL抑制剂，对于治疗高脂血症有着广阔的应用前景和重要意义。

天然产物具有结构复杂性和结构多样性的特点，是新药发现的重要来源。天然产物及其衍生物独特的化学结构，使其具有高药效和对特定靶点高选择性的优点以及潜在的独特的作用机制等优点(Newman et al.,Nat.Prod.Rep.2000,17,215–34；Newman et al.,J.Nat.Prod.2016,79:629–661；Tiago et al.,Nat.Chem.2016,8,531-541)。因此从天然活性成分中寻找开发新型、高效的ACL抑制剂具有重要的研究价值。

发明内容

毛山小橘(Glycosmis craibii var.craibii)是芸香科，山小橘属植物常见于云南南部(元江等地)，生于坡地林中，在泰国东北部也有分布。其高约3米的小乔木。本属药用植物在民间用于治疗多种疾病，如印度民间G.arborea用作降体温、肝部不适及其他疾病，G.citrifolia用作治疗皮肤瘙痒、疥疮和皮肤溃疡。但是关于毛山小橘植物化学成分研究尚未见文献报道。本申请首次从毛山小橘枝叶的95％乙醇提取物中分离得到化合物fraxidin。经多次药理试验研究表明，该类化合物具有显著的ACL抑制活性。

基于此，本申请提供结构式如式(1)所示的香豆素类化合物在制备ATP柠檬酸裂解酶抑制剂中的用途，

本申请还提供结构式如式(1)所示的香豆素类化合物在制备用于预防、延缓或治疗由ATP柠檬酸裂解酶介导疾病的药物中的用途，

ATP柠檬酸裂解酶(ACL)的作用机制为三羧酸循环，而三羧酸循环是三大营养素(糖类、脂类、氨基酸)的最终代谢通路，又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。所以ACL为高脂血症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝、II型糖尿病或肥胖症的药物靶点。近年来，ACL的高分辨率晶体结构已得到了解决，其构象可塑性、底物结合和催化过程得到了表征。这些研究结果将为ACL抑制剂的研究提供重要线索，并为ACL的治疗提供新的线索，并阐明了ACL抑制剂在高脂血症和各种癌症中的治疗潜力。(Wei et al.,Nature.2019,568(7753),566–570；Verschueren et al.,Nature.2019,568(7753),571–575)。

因此，本申请还提供结构式如式(1)所示的香豆素类化合物在制备用于预防、延缓或治疗高脂血症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝、II型糖尿病或肥胖症的药物中的用途，

可选的，所述药物的剂型为片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂。

可选的，所述药物包括药物有效量的结构式如式(1)所示的香豆素类化合物和药学上可接受的载体。

本申请所述的化合物可单独应用或者合用，亦可与药学上可接受的载体或赋形剂结合，按照常规方法制成口服或者非口服剂型。

药学上可接受的载体为本领域内公知的各种载体，按照本领域公知的方法制备。所述药物可制成多种剂型的制剂，例如，片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂。

所述药物中还可以包括本领域内常规使用的各种辅料，例如甜味剂、缓冲剂、助溶剂、着色剂香料或其他材料。

本申请对所得化合物fraxidin进行了ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)抑制活性实验，表明该化合物具有明显的ACL抑制活性，可用于制备由ACL所介导疾病的药物或是作为该类药物的先导化合物。

本申请还提供一种ATP柠檬酸裂解酶抑制剂，包括药物有效量的结构式如式(1)所示的香豆素类化合物和药学上可接受的载体，

本申请所述的化合物可通过从植物中分离纯化得到；也可经本领域技术人员熟知的化学方法合成获得。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

毛山小橘采自云南省西双版纳傣族自治州，经阴干后粉碎制成粉末；紫外和红外光谱数据分别由Shimadzu UV-1800型紫外光谱仪和Affinity-1型红外光谱仪测试获得；高分辨质谱(HR-ESI-MS)由UPLC-Q-Orbitrap-MS型质谱仪获得，使用ESI离子源同时获得正负离子模式；NMR从Bruker Advance III HD 400MHz型核磁共振仪获得，化学位移参照未氘代的残余溶剂峰，用δ(ppm)表示；分析所用的薄层层析板(TLC)购自烟台江友硅胶开发有限公司，使用UV(λ:254nm,365nm)和硫酸-香草醛溶液显色；柱色谱主要使用MCI微孔树脂CHP20P(Mitsubishi Chemical Industries,75-150μm)，凝胶Sephadex LH-20(GE HealthcareBioSciences AB)；半制备型液相Shimadzu CBMA-20A配备Photodiode Array Detector(PDA)和Evaporative Light-Scattering Detector(ELSD)检测器以及Waters X-BridgeC₁₈柱(250×10mm,5μm)。

实施例1：化合物fraxidin的制备

取10.0kg毛山小橘新鲜枝叶晾干，粉碎成粗粉，用95％乙醇浸泡3次，溶剂体积依次为20.0、15.0和15.0L，每次浸泡1周，合并浸泡液，减压浓缩得总浸膏。将总浸膏分散于温水混悬后依次分别用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，减压回收溶剂后得石油醚萃取部位(69.0g)和乙酸乙酯萃取部位(90.0g)。石油醚部位，首先采用硅胶柱层析，经石油醚-乙酸乙酯梯度(80:20→70:30→60:40→50:50→0:100)，经TLC分析后合并为5个组分(Fr.1-Fr.5)。组分Fr.4(Petroleum ether-EtOAc,50:50)经Sephadex LH-20(CHCl₃-MeOH)和半制备HPLC(MeOH-H₂O,45:55,v/v；flow rate,3mL/min,t_R＝12.1min)纯化后得到化合物fraxidin。

化合物的理化数据如下：

¹H NMR(400MHz,CD₃OD):δ_H:7.86(1H,d,J＝9.5Hz,H-4),6.90(1H,s,H-5),6.30(1H,d,J＝9.5Hz,H-3),3.95(6-OMe),3.88(7-OMe).

实施例2：本申请中化合物的ACL抑制活性测试

实验方法：本实验中ATP依赖的柠檬酸裂解酶ACL能将柠檬酸催化转变为乙酰辅酶A，进而产生脂肪酸合成的前体分子－丙二酸单酰辅酶A。该反应伴随ATP的消耗，因此可以使用ADP-Glo和激酶检测试剂盒检测ATP的变化，当抑制剂存在时，ACL催化反应不能发生，可根据ATP的变化来间接反应化合物对ACL的酶活性抑制作用。

具体来说，初筛选择化合物浓度为20μg/ml时对ACL酶活性的百分抑制率进行考察，试验结果表明fraxidin的抑制率为85.7％。

进一步测定IC₅₀值：样品临用前溶于DMSO配成合适浓度，3倍稀释，7个稀释度，三复孔，取2μL样品溶液加入到标准的测活体系(40mM Tris,pH 8.0,10mM MgCl₂,5mM DTT,ATP,CoA,柠檬酸钠和ACL)，37℃下孵育30min；而后，体系内加入25μL ADP-Glo试剂，室温下孵育30min，以终止反应，并消耗完剩余的ATP；再加入激酶检测试剂孵育30min后，其荧光信号由EnVision读出，其动力学曲线一级反应的斜率作为酶的活性指标。

以相对活性对化合物浓度作图，经公式v/v₀＝100/(1+b*[I]/IC₅₀)拟合得到IC₅₀值(不加抑制剂时的反应速率为v₀、加入抑制剂后的反应速率为v、抑制剂浓度为[I])。实验重复三次，结果取三次的平均值，阳性对照BMS303141的IC₅₀值为0.46μM。

表1.化合物fraxidin的ACL抑制活性数据

所述香豆素类化合物抑制ACL的IC₅₀值见表1，测试结果表明上述化合物对ACL表现出显著的抑制活性，表明本申请所述化合物可用于制备治疗高脂血症的药物或是作为该类药物的先导化合物。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.结构式如式(1)所示的香豆素类化合物在制备ATP柠檬酸裂解酶抑制剂中的用途，

2.结构式如式(1)所示的香豆素类化合物在制备用于预防、延缓或治疗由ATP柠檬酸裂解酶介导疾病的药物中的用途，

3.结构式如式(1)所示的香豆素类化合物在制备用于预防、延缓或治疗高脂血症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝、II型糖尿病或肥胖症的药物中的用途，

4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释制剂或控释制剂。

5.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述药物包括药物有效量的结构式如式(1)所示的香豆素类化合物和药学上可接受的载体。

6.一种ATP柠檬酸裂解酶抑制剂，其特征在于，包括药物有效量的结构式如式(1)所示的香豆素类化合物和药学上可接受的载体，