CN101899498A - 一种检测食品中过敏原杏仁成分所使用的标准品 - Google Patents

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高旗利
张霞
陈颖
刘培
张莹
张海滨
张海英
吴冬雪
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Tianjin Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Animals Plants and Food Inspection Center
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Abstract

本发明公开了一种检测食品中过敏原杏仁成分所使用的标准品，该标准品是通过分子生物学技术检测食品中过敏原杏仁成分所必需的参照物，属于检测方法的配套产品，特别是运用荧光PCR反应来检测过敏原杏仁成分的参照物。其技术方案是通过对检测目标中的Pru du1基因的扩增得到目的片段。然后将目的片段连接进入质粒载体，克隆转化进入大肠杆菌细胞，再经过培养后提取质粒载体，对载体进行定量分析，制备成标准品，并且利用该标准品绘制标准曲线。本研究所建立的标准品可以用于检测食品中过敏原杏仁成分的定量分析和作为检测的阳性对照使用，对提高检测的准确性和特异性具有实际意义。

Description

一种检测食品中过敏原杏仁成分所使用的标准品
技术领域
本发明属于一种检测用标准品，具体的说是一种检测食品中过敏原杏仁成分所使用的标准品，该标准品是通过分子生物学技术检测食品中过敏原杏仁成分所必需的参照物，属于检测方法的配套产品，特别是运用荧光PCR反应来检测过敏原杏仁成分的参照物。
背景技术
食物过敏是人们对食物产生的一种不良反应，属于机体对外源性物质的一种变态反应。近二十年来，食物过敏逐渐被重视，已被认为是严重的公共卫生问题，而且WHO预测食物过敏可能成为今后最常见的流行病之一。根据美国FDA资料统计，在美国，2％的成年人和5％的婴幼儿患有食物过敏症，每年大约30000人需要临床紧急治疗，150人死于食物引起的过敏反应。在所有过敏反应中，花生和树坚果过敏占10-47％。
目前已经建立了针对杏仁成分Pru du 1.06B DNA的荧光PCR检测方法，本研究即建立了和该方法配套的标准品，该标准品可以用于检测食品中过敏原杏仁成分的定量分析和作为检测的阳性对照使用，对提高检测的准确性和特异性具有实际意义。
发明内容
针对上述情况，本发明提供了可以用于检测食品中过敏原杏仁成分的定量分析和作为检测的阳性对照使用的标准品，具体的讲就是，通过对标准品的定量稀释，得到稀释液，将稀释液作为模板进行荧光PCR反应得到荧光PCR的CT，应用数学方法计算标准曲线，得到目标片段浓度和荧光PCR反应的CT值之间的关系。以此来折算，在同一反应体系条件下未知样品的浓度。
其技术内容包括：标准品的有效序列、以及未知浓度样品的浓度折算方法。
使用该方法所使用的引物、探针的全部序列如下：
引物：
所用引物序列一：TTTGGTTGAAGGAGATGCTC
所用引物序列二：TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG
探针：
所用探针序列：TCCATCAGCAGATGCCACCAAC
本发明是通过以下技术方案实现的：
1.PCR扩增及产物的回收纯化
应用引物扩增杏仁成分样品基因组，目的片段长度为108bp。
PCR反应总体积为50μL，PCR反应体系中各组分构成比例如下：
PCR体系预混合物         2倍          25μL
探针法所用引物序列一    10μmol/L    2μL
探针法所用引物序列二    10μmol/L    2μL
DNA样品                   2μL
双蒸水                    19μL
总体积                    50μL
PCR扩增程序如下
(1)94℃  2分钟
(2)95℃  30秒
(3)50℃  30秒
(4)72℃  30秒
(5)回到第2步，重复35次
(6)72℃10分钟
将上述PCR产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶回收试剂盒按说明书回收目的条带。该条带的序列进行测序，测序结果为TTTTGGTTGAAGGAGATGCTCTTTCAGACAAGGTTGAGAAAATCACTTATGAGATTAAGTTGGTGGCATCTGCTGATGGAGGTTCCATCATAAAGAGCACCAGCAACTA。
2.目的片段与载体的连接
应用TA Cloing试剂盒，在10μL总反应体系中按下述条件进行：2μL PCR 2.1线性载体DNA，纯化的目的片段4μL，10×T4DNA连接缓冲液1μL，T4DNA连接酶1μL，无菌水2μL，轻轻混匀，短暂离心，14℃保温24h。
3.感受态细胞转化
从-70℃冰箱中取100μL感受态细胞E.coli JM109，室温下解冻后立即置冰上。加入连接产物溶液5μL，轻轻摇匀，冰上放置5min。42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3到5分钟。向管中加入1mL LB液体培养基(不含氨苄青霉素)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态。将上述菌液摇匀后取100μL涂布于经2％X-gal和20％IPTG处理的含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养16小时至24小时。
4.含重组质粒菌株的筛选及鉴定
用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含氨苄青霉素50μg/mL的5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养12小时。应用质粒提取试剂盒提取PCR2.1/目的片段质粒。通过PCR鉴定阳性重组子，PCR所用引物为当初扩增目的片断的引物。将PCR初步确定的阳性重组子进一步测序以确证。
5.梯度浓度参考标准的制备
DNA/RNA/蛋白分析仪测定重组质粒的浓度及A260/A280值。计算其拷贝数后做连续梯度稀释。拷贝数＝质粒质量×阿佛加德罗常数/质粒分子量，其中阿氏常数为6.02×1023，质粒分子量＝一个碱基对的平均分子量×重组质粒的总长度。用超纯水将重组质粒溶液作10倍梯度连续稀释，-20℃保存备用。
6.标准曲线的建立
反应在美国ABI公司的7000型荧光定量PCR仪上进行，根据不同浓度的质粒标准品的扩增曲线，反应数据被ABI 7000型PCR仪收集并储存于计算机中，反应结束后该电脑根据定量标准模板的扩增情况自动绘制标准曲线。通过标准曲线方程和样品的CT值便可计算出样品中所测基因的含量。
荧光PCR反应体系中各组分构成比例如下：
成分                    浓度         加样量
PCR体系预混合物         2倍          25μL
探针法所用引物序列一    10μmol/L    2μL
探针法所用引物序列二    10μmol/L    2μL
探针法所用探针序列一    10μmol/L    1.5μL
DNA样品                              5μL
双蒸水                               14.5μL
总体积                              50μL
荧光PCR扩增程序如下
(1)50℃  2分钟
(2)95℃  10分钟
(3)95℃  15秒
(4)60℃  1分钟
(5)回到第3步，重复45次
当选用反应体系中含2.08×101～2.08×108拷贝个目的基因片段的系列稀释液时，扩增反应CT值与拷贝数的对数呈线性关系R2为0.99，标准曲线回归方程y＝-2.840lx+40.800，其中y为CT，x为该体系下对应的样品中的目的基因片段的拷贝数。
附图说明
图1本发明所建立的标准品得到的标准曲线。
图2样品中参考物质DNA，荧光信号强度扩增曲线。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
实施例1
样本：使购买的国际杏仁过敏原参考物质DNA，作为模板。
1.样品处理
取1μL样品，放入1.5mL离心管中，加入200μL TE溶解，用DNA分析仪检测其纯度及浓度。
2.PCR扩增
成分                    浓度         加样量
PCR体系预混合物         2倍          25μL
探针法所用引物序列一    10μmol/L    2μL
探针法所用引物序列二    10μmol/L    2μL
探针法所用探针序列一    10μmol/L    1.5μL
DNA样品                              5μL
双蒸水                               14.5μL
总体积                               50μL
荧光PCR扩增程序如下
(1)50℃  2分钟
(2)95℃  10分钟
(3)95℃  15秒
(4)60℃  1分钟
(5)回到第3步，重复45次
3.被检测样品荧光PCR图谱观察
荧光PCR过程中可以观察到样品在25.2(CT)循环产生了明显的FAM荧光，结果如图2。
根据所产生荧光的CT值换算原DNA样品中约含有1.7×106个基因组拷贝。和样品中表明的拷贝数相同。

Claims (4)

1.一种检测食品中过敏原杏仁成分所使用的标准品，其特征在于，一种检测食品中过敏原杏仁成分所使用的标准品是指在通过PCR技术或荧光PCR技术检测食品中过敏原杏仁成分的时候所使用的标准品。
2.根据权利要求1所述的一种检测食品中过敏原杏仁成分所使用的标准品，其特征在于，该标准品为一环状封闭的DNA分子，该DNA分子序列由以下部分构成：
TA载体质粒的序列，该序列至少包括质粒复制和转录起始的位点；
PCR扩增的特异产物。
3.根据权利要求2所述的一环状封闭的DNA分子，该PCR扩增的特异产物的DNA序列为：
TTTTGGTTGAAGGAGATGCTCTTTCAGACAAGGTTGAGAAAATCACTTATGAGATTAAGTTGGTGGCATCTGCTGATGGAGGTTCCATCATAAAGAGCACCAGCAACTA。
4.根据权利要求2所述的一环状封闭的DNA分子，使用该分子构建标准曲线，作为标准品进行食品中过敏原杏仁成分的检测。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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