CN104569171A - 杏仁质谱检测特征序列组及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杏仁质谱特征序列组和检测试剂盒，属于食品检验领域。本发明为一种杏仁质谱检测特征组，以及一种杏仁过敏原检测用试剂及杏仁过敏原检测方法。本发明灵敏度高、精确度好，适合于面包、雪糕等含有杏仁的加工产品中杏仁的检测，以及杏仁的真伪鉴别，便于在各检测机构推广应用。

Description

杏仁质谱检测特征序列组及检测试剂盒

技术领域

      本发明提供一种杏仁的检测方法，属于食品检测领域，具体地讲，涉及用质谱方法来检测杏仁中特征序列组的技术。

背景技术

食物过敏症是越来越被重视的健康问题，坚果属于八大食物过敏原之一，涉及食物过敏症的90％。树坚果过敏原对于食品加工和消化是稳定的。在一些种子中，类似的稳定过敏原已经被确定，因为它们的独特口味，种子和坚果经常用于食品工业。自90年代以来，由于食品产品的多样化，导致与坚果和种子相关的食谱越来越多。不包含坚果或种子的产品也许会利用加工过坚果和种子的设备，形成了潜在的风险交叉接触。对于目前假设的含有丰富坚果或种子成分的产品中过敏原的探索发现，这些过敏原已导致一些严重的过敏反应。这表明，检测坚果和种子过敏原的方法是食品工业控制制造和处理程序的重要手段。由于杏仁利用了很长一段时间，尤其是在西欧，许多的努力是投入于杏仁的检测。

1996年，Tariq等发表了一篇关于流行的树坚果过敏症的调查研究，其中包括英国的怀特岛的1218新生儿。经过皮肤反应测试，其中1.2％是树坚果Ig E阳性，临床反应0.16％。这与Sicherer等人的研究相一致，利用随机数字拨号电话调查超过12 000在美国的个体，评估出树坚果过敏症患者在0.5％。坚果诱导的过敏性反应有所不同，有的是轻微的局部反应如口腔过敏综合征，有的是严重的全身过敏性反应，有些甚至是致命和近乎致命的过敏反应。由于美国和欧洲坚果消费量的不同，导致对过敏原的感受度不同。在欧洲，杏仁过敏十分普遍，经常与桦树花粉过敏相结合，而在美国过敏反应主要由胡桃导致，腰果，杏仁，山核桃，开心果次之。欧盟在 2007/68/EC中要求的14种必须标注的过敏原中包含杏仁，同样加拿大的CODEX STAN118-1979中同样对过敏原的标注做出了明确的要求。为了满足监管的要求及过敏人群的需求，需要开发相应的检测方法。目前杏仁的检测方法有酶联免疫法，由于抗体特异性问题很容易导致假阳性结果。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供用于质谱检测的杏仁特征序列。

本发明是通过以下技术方案实现的：

1. 杏仁过敏原Prunin氨基酸序列

2.特征序列的筛选：通过PinPoint软件针对杏仁过敏原Prunin找到适合的氨基酸序列作为检测标签。

杏仁过敏原Prunin氨基酸序列uniprot：Q43607

经过筛选确认适合的杏仁质谱检测标签组为：

1. GNLDFVPPR

         2. ALPDEVLANAYQISR

表1  杏仁过敏蛋白特征性肽段及SRM离子对

本发明的杏仁检测试剂试剂盒，其特征在于，其为用于通过质谱法检测杏仁过敏原的试剂，含有上述本发明的杏仁质谱检测特征序列组。

本发明的一种杏仁过敏原的检测方法，其特征在于，其为通过酶解的方法制备杏仁质谱检测特征序列组的方法，含有下述步骤：以试剂盒中的提取缓冲液提取试样中的蛋白质，进行修饰后，通过酶解的方法进行杏仁质谱检测特征序列组的制备，溶于溶解缓冲液，在质谱仪上进行离子化及检测。

试样可以是面包、蛋糕、冰激淋、饼干等可能含有杏仁的产品，通过检测杏仁质谱检测特征序列组来判断其是否有杏仁成分。如果杏仁质谱检测特征序列组检测结果同时为阳性，则试样中含有杏仁成分，如果杏仁过敏原标签检测结果为阴性，则试样中不含杏仁成分。

此外，根据常规方法，将该杏仁检测标签可以应用于不同仪器公司的质谱仪。根据常识，各组分的体积可根据条件不同而变化，每次不同批次试剂的最佳组合均可能会不同。

3．检测方法

检测程序：（1）取待测样品2 g，加入提取缓冲液10ml，60℃振荡3h，14000g离心10min，取上清；

（2）加入溶液1M DTT 1μl，37度2h，再加入1M IAA 5μl 室温40min。

（3）反应后，直接加入2 μL trypsin (200 ng/μL)，并于37 °C振荡酶解1.5小时。

（4）酶解完成后，于20,000 g离心5分钟，取上清，直接进样分析。

（5）液相色谱条件：

色谱柱：Hypersil GOLD aQ柱(100 x 2.1 mm, 1.9 μm)；上样量：10 μL；A相：0.1%甲酸水溶液；B相：0.1%甲酸乙腈溶液；流速：300 μL/min；分析梯度：0 – 2 min 5% B，2 – 12 min 5%–95% B, 12–17 min 95% B, 17–18 min, 95%–5% B, 18–23 min 5% B。

（6）串联质谱条件：

扫描模式：正离子，SRM；喷雾电压：3000 V；气化温度：300 °C 鞘气压：30 psi；辅助气压(arbitrary units)：10；离子传输管温度：350 °C；碰撞气体(Ar)：1.5 mTorr； Q1/Q3分辨率(FWHM)：0.7；驻留时间：0.04 s；SRM扫描离子对及碰撞能量见表1。

（7）杏仁过敏原蛋白序列来自Swiss-Prot数据库；专一性肽段与特征性碎片的选择及碰撞能量优化由PinPoint软件(Thermo)分析，结合LTQ-Orbitrap高分辨质谱(Thermo)全扫描确证获得；质谱数据由Xcalibur Qual Browser软件(Thermo)进行定性分析，由Xcalibur Quan Browser软件(Thermo)进行定量分析。

（8）以峰面积及质谱检测特征序列组浓度进行线性回归处理，计算样品中的杏仁过敏原的有无及浓度。

应当理解的是，方法用到的分离器可以是碳18柱，也可以是离子交换柱和碳18柱的串接或者离子交换柱和碳18柱的二维一体柱。其检测方法可以是质谱检测方法，可以是三重四级杆，或复合型电场轨道阱回旋共振质谱，或串联质谱。

酶可以是胰酶，也可以是其他具有相同功能的酶。

本发明的第二个目的是提供根据上述检测方法的检测试剂盒，包括：

（1）提取缓冲液0.2M Tris-HCl pH8.1~8.3；和

（2）胰酶 10ng/μl，溶剂为50mM 碳酸氢氨；和

（3）DTT 1M，溶剂为100mM 碳酸氢氨；和

（4）IAA 1M，溶剂为100mM 碳酸氢氨；

（5）质谱检测特征序列组的标肽。

与现有技术相比，本发明涉具有以下优点：

1. 本发明的质谱检测特征序列组能够特异地鉴定出杏仁过敏原prunin；

2. 能够在现有的质谱实验室开展杏仁过敏原检测工作，不需要添置任何的设备，能够满足大量筛查和确证工作的需要；

3. 当使用本发明的检测标签时，能够有效缩短检测时间；

4. 由于方法中同时用到了两个检测标签，即能满足定性检测的需要，同时还能满足定量检测的需要；

5. 适用范围更加广泛，不仅能够进行过敏原鉴别，而且能够对深加工食品进行检测；

6. 本方法可以适合杏仁的真伪鉴别。

总之，本发明的质谱检测特征序列组、提取缓冲液以及使用它们检测标签的制备方法，能够迅速而简单地检测杏仁，在检验检疫系统等是非常有效。

具体实施方式

现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。除非有其它说明，本发明的实施例使用本领域中的质谱技术。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。

实施例1  

样品：面包的包装上标注申明其中含有杏仁成分，用质谱的方法进行检测。

取面包基质2 g，加入提取缓冲液10ml，60℃振荡3h，14000g离心10min，取上清，加入溶液1M DTT 1μl，37度2h，再加入1M IAA 5μl 室温40min。反应后，直接加入2 μL trypsin (200 ng/μL)，并于37 °C振荡酶解1.5小时。

酶解完成后，于20,000 g离心5分钟，取上清，直接进样分析。

液相色谱条件：

色谱柱：Hypersil GOLD aQ柱(100 x 2.1 mm, 1.9 μm)；上样量：10 μL；A相：0.1%甲酸水溶液；B相：0.1%甲酸乙腈溶液；流速：300 μL/min；分析梯度：0 – 2 min 5% B，2 – 12 min 5%–95% B, 12–17 min 95% B, 17–18 min, 95%–5% B, 18–23 min 5% B。

串联质谱条件：

扫描模式：正离子，SRM；喷雾电压：3000 V；气化温度：300 °C 鞘气压：30 psi；辅助气压(arbitrary units)：10；离子传输管温度：350 °C；碰撞气体(Ar)：1.5 mTorr； Q1/Q3分辨率(FWHM)：0.7；驻留时间：0.04 s；SRM扫描离子对及碰撞能量见表1。

杏仁过敏原蛋白序列来自Swiss-Prot数据库；专一性肽段与特征性碎片的选择及碰撞能量优化由PinPoint软件(Thermo)分析，结合LTQ-Orbitrap高分辨质谱(Thermo)全扫描确证获得；质谱数据由Xcalibur Qual Browser软件(Thermo)进行定性分析，由Xcalibur Quan Browser软件(Thermo)进行定量分析。检测时用到的检测标签为：1. GNLDFVQPPR和2. ALPDEVLANAYQISR。

<110>  天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心

 

<120>  杏仁质谱检测特征序列组和检测试剂盒

 

<130>  20140731

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  10

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  1

 

Gly Asn Leu Asp Phe Val Gln Pro Pro Arg

1                         5                              10 

 

 

<210>  2

<211>  15

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  2

 

Ala Leu Pro Asp Glu Val Leu Ala Asn Ala Tyr Gln Ile Ser Arg

1                       5                             10                             15 

Claims (8)

1.一种杏仁质谱检测特征序列组，其特征在于，其为用于通过质谱法检测杏仁过敏原的检测标签组，含有以下特征序列：

   特征序列1：GNLDFVPPR

   特征序列2：ALPDEVLANAYQISR。

2.根据权利要求2所述的杏仁质谱检测特征序列组，所述试样可以是面包、蛋糕、冰激淋、饼干含有杏仁的加工产品。

3.权利要求1至2中所述的质谱检测特征序列组需要用杏仁成分检测试剂盒处理试样，其特征在于包括：

（1）提取缓冲液0.2M Tris-HCl pH8.1~8.3；和

（2）胰酶 10ng/μl，溶剂为50mM 碳酸氢氨；和

（3）质谱检测特征序列组的标肽。

4.权利要求1至3中一种杏仁的检测方法，其中步骤包括：以试剂盒中的提取缓冲液提取试样中的蛋白质，进行酶解，溶于溶解缓冲液，通过分离器分离肽段，在质谱仪上进行离子化及检测，以峰面积及标签浓度进行线性回归处理，计算样品中的杏仁过敏原的有无及浓度。

5.根据权利要求4所述的杏仁质谱检测特征序列组的检测方法，其在所述步骤中，用到的分离器可以是碳18柱，也可以是离子交换柱和碳18柱的串接或者离子交换柱和碳18柱的二维一体柱。

6.根据权利要求4所述的杏仁质谱检测特征序列组的检测器可以是三重四级杆，或复合型电场轨道阱回旋共振质谱，或串联质谱。

7.一种检测结果的判断方法，其特征在于，如果同时出现杏仁质谱检测特征序列组的阳性结果则试样中含有杏仁，如果出现杏仁质谱检测特征序列组阴性结果则试样中不含杏仁成分。

8.一种检测结果的判断方法，其特征在于，通过线性回归的方法可以对试样中的杏仁含量进行定量检测。