CN101892204B - 玉米超氧化物歧化酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及玉米超氧化物歧化酶的制备方法，主要包括(1)消毒浸泡；(2)萌芽；(3)清洗；(4)磨浆；(5)一次酶解：将研磨完毕的玉米浆纤维素酶和果胶酶，混合均匀，加入氯化钙溶液进行沉淀；(6)一次分离：将沉淀分层的玉米浆粗滤然后用高速分离机离心，留取上清液；(7)超滤浓缩：将上清液用中空纤维超滤柱进行超滤，得滤液。用纳米过滤器进行精滤，得纯净滤液，将滤液浓缩至原体积的10％。(8)二次酶解；(9)二次分离：再次离心分离，超滤得超纯滤液，速冻得玉米sod冻干粉。本发明经过二次酶解和二次分离可以最大限度地去除杂蛋白，提高玉米SOD产品纯度，从而达到药用级的要求。
Description
技术领域
本发明涉及从植物中制备超氧化物歧化酶的方法，具体是以玉米为原料制备超氧化物歧化酶的方法。
背景技术
SOD(超氧化物歧化酶)是一种源于生命体的活性物质，是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成，因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要，已广泛应用于医药、保健品、化妆品和食品等诸多领域。
现有的生产超氧化物歧化酶的方法主要有两种，一种是从动物内脏和血液中提取，一种是从植物中提取。从动物血液中提取不但代价昂贵，而且动物性SOD的排他性、不易常温保存。从玉米中提取超氧化物歧化酶大都进行一次超滤提纯，不能有效去除杂蛋白，所提取的SOD产品纯度不高，活性蛋白含量低，难以达到药用级的要求。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足提供一种玉米超氧化物歧化酶的制备方法，以便有效去除杂蛋白，减少酶活损失，提高玉米SOD产品纯度，达到药用级要求。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：玉米超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于制备方法为：
(1)消毒浸泡：将玉米用浓度1-3％的氯化钠溶液清洗3-6次，进行杀菌消毒，用25℃-33℃的去离子水浸泡25-35小时，沥水；
(2)萌芽：控制萌芽室温度在25℃-33℃，每隔2小时对玉米进行一次水淋，水温保持25℃-33℃，随时查看萌芽情况，待萌芽长出1-3毫米，萌芽结束；
(3)清洗：将萌芽玉米用浓度1-3％氯化钠溶液清洗2-3遍；
(4)磨浆：将萌芽玉米按2-6L/kg加入50umol/L的磷酸盐缓冲溶液进行研磨，首先粗磨，然后精磨，充分磨细；
(5)一次酶解：将研磨完毕的玉米浆加入酶，混合均匀后，再后按50-100mL/kg加入浓度为15-30％的氯化钙溶液，静置1-2小时进行沉淀；
(6)一次分离：将沉淀分层的玉米浆粗滤得滤液，然后用转速8000-15000r/min高速管式分离机离心5-10分钟，留取上清液；
(7)超滤浓缩：将上清液进行超滤得滤液，用纳米过滤器进行精滤，得纯净滤液，将滤液浓缩至原体积的10％，得浓缩液，然后冷冻、干燥，即得玉米sod粗粉；
所述的玉米超氧化物歧化酶的制备方法，还包括：
(8)二次酶解：将浓缩液加入酶进行酶解，调pH至6.8-7.2；
(9)二次分离：用转速8000-15000r/min的高速管式分离机离心4-8分钟，得二次上清液，将二次上清液进行超滤，得超纯滤液，将超纯滤液浓缩至原体积的5％，然后冷冻、干燥，即得玉米sod冻干精粉。
所述的步骤(1)消毒浸泡步骤之前可增加拣选步骤，通过风选，玉米应为无霉烂、无杂质，苞粒饱满的优质玉米。
所述的步骤(5)一次酶解步骤中可先按0.1-0.4g/kg加入纤维素酶，搅拌均匀，再按0.1-0.4g/kg加入果胶酶，混合均匀，然后按50-100mL/kg加入浓度为15-30％的氯化钙溶液进行沉淀；
所述的步骤(6)一次分离步骤中的粗滤用的是150-200目的滤袋。
所述的步骤(7)和(9)超滤浓缩步骤中超滤用的是截留分子量3000-20000的中空纤维超滤柱。
所述的步骤(8)二次酶解步骤中，可先按0.09-0.35g/kg加入纤维素酶，搅拌均匀，再按0.09-0.35g/kg加入果胶酶混合均匀进行酶解。
本发明的有益效果是：经过二次酶解和二次分离可以有效去除杂蛋白，提高玉米SOD产品纯度，从而达到药用级的要求。经国家检测中心检测，产品比活性最高可达到3000U/mg。
下表是一次酶解分离和二次酶解分离所得产品比活的数据
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：
玉米超氧化物歧化酶的制备方法，具体步骤为：
(1)拣选，通过风选，选择无霉烂、无杂质，苞粒饱满的优质玉米。
(2)消毒浸泡：用浓度1％的氯化钠溶液清洗3-4次，进行杀菌消毒，用25℃-28℃的去离子水浸泡25小时，沥水；
(3)萌芽：控制萌芽室温度在25℃-28℃，每隔2小时对玉米进行一次水淋，水温保持25℃-28℃，随时查看萌芽情况，待萌芽长出1-2毫米，萌芽结束；
(4)清洗：将萌芽玉米用浓度2％氯化钠溶液清洗2-3遍；
(5)磨浆：将萌芽玉米按2L/kg加入50umol/L的磷酸盐缓冲溶液进行研磨，首先粗磨，然后精磨，充分磨细；
(6)一次酶解：将研磨完毕的玉米浆先按0.1g/kg加入纤维素酶，搅拌均匀，再按0.2g/kg加入果胶酶，混合均匀，然后按50mL/kg加入浓度为15％的氯化钙溶液，静置1小时进行沉淀；
(7)一次分离：将沉淀分层的玉米浆用150目的滤袋粗滤得滤液，然后用转速8000-10000r/min的高速管式分离机离心10分钟，留取上清液；
(8)超滤浓缩：将上清液用截留分子量8000的中空纤维超滤柱进行超滤得滤液，用纳米过滤器进行精滤，得纯净滤液，将滤液浓缩至原体积的10％，得浓缩液，然后冷冻、干燥，即得玉米sod粗粉；
(9)二次酶解：将浓缩液先按0.09g/kg加入纤维素酶，搅拌均匀，再按0.15g/kg加入果胶酶混合均匀进行酶解，调pH至6.8；
(10)二次分离：用转速8000r/min的高速管式分离机离心8分钟，得二次上清液，将二次上清液用截留分子量3000的中空纤维超滤柱进行超滤，得超纯滤液，将超纯滤液浓缩至原体积的5％，然后冷冻、干燥，即得玉米sod冻干精粉。
实施例2：
玉米超氧化物歧化酶的制备方法，具体步骤为：
(1)拣选，通过风选，选择无霉烂、无杂质，苞粒饱满的优质玉米。
(2)消毒浸泡：用浓度2％的氯化钠溶液清洗4-5次，进行杀菌消毒，用28℃-30℃的去离子水浸泡26-28小时，沥水；
(3)萌芽：控制萌芽室温度在28℃-30℃，每隔2小时对玉米进行一次水淋，水温保持28℃-30℃，随时查看萌芽情况，待萌芽长出2-3毫米，萌芽结束；
(4)清洗：将萌芽玉米用浓度3％氯化钠溶液清洗2-3遍；
(5)磨浆：将萌芽玉米按3-4L/kg加入50umol/L的磷酸盐缓冲溶液进行研磨，首先粗磨，然后精磨，充分磨细；
(6)一次酶解：将研磨完毕的玉米浆先按0.2g/kg加入纤维素酶，搅拌均匀，再按0.1g/kg加入果胶酶，混合均匀，然后按50mL/kg加入浓度为20％的氯化钙溶液，静置1.5小时进行沉淀；
(7)一次分离：将沉淀分层的玉米浆用200目的滤袋粗滤得滤液，然后用转速10000-13000r/min的高速管式分离机离心8分钟，留取上清液；
(8)超滤浓缩：将上清液用截留分子量10000的中空纤维超滤柱进行超滤得滤液，用纳米过滤器进行精滤，得纯净滤液，将滤液浓缩至原体积的10％，得浓缩液，然后冷冻、干燥，即得玉米sod粗粉；
(9)二次酶解：将浓缩液先按0.15g/kg加入纤维素酶，搅拌均匀，再按0.09g/kg加入果胶酶混合均匀进行酶解，调pH至6.9；
(10)二次分离：用转速10000r/min的高速管式分离机离心6-7分钟得二次上清液，将二次上清液用截留分子量8000的中空纤维超滤柱进行超滤，得超纯滤液，将超纯滤液浓缩至原体积的5％，然后冷冻、干燥，即得玉米sod冻干精粉。
实施例3：
玉米超氧化物歧化酶的制备方法，具体步骤为：
(1)拣选，通过风选，选择无霉烂、无杂质，苞粒饱满的优质玉米。
(2)消毒浸泡：用浓度3％的氯化钠溶液清洗5-6次，进行杀菌消毒，用30℃-33℃的去离子水浸泡28-32小时，沥水；
(3)萌芽：控制萌芽室温度在30℃-33℃，每隔2小时对玉米进行一次水淋，水温保持30℃-33℃，随时查看萌芽情况，待萌芽长出1-2毫米，萌芽结束；
(4)清洗：将萌芽玉米用浓度2.5％氯化钠溶液清洗3遍；
(5)磨浆：将萌芽玉米按5L/kg加入50umol/L的磷酸盐缓冲溶液进行研磨，首先粗磨，然后精磨，充分磨细；
(6)一次酶解：将研磨完毕的玉米浆先按0.3g/kg加入纤维素酶，搅拌均匀，再按0.4g/kg加入果胶酶，混合均匀，然后按50mL/kg加入浓度为25％的氯化钙溶液，静置2小时进行沉淀；
(7)一次分离：将沉淀分层的玉米浆用200目的滤袋粗滤得滤液，然后用转速13000-15000r/min的高速管式分离机离心6分钟，留取上清液；
(8)超滤浓缩：将上清液用截留分子量15000的中空纤维超滤柱进行超滤得滤液，用纳米过滤器进行精滤，得纯净滤液，将滤液浓缩至原体积的10％，得浓缩液，然后冷冻、干燥，即得玉米sod粗粉；
(9)二次酶解：将浓缩液先按0.25g/kg加入纤维素酶，搅拌均匀，再按0.35g/kg加入果胶酶混合均匀进行酶解，调pH至7；
(10)二次分离：用转速12000r/min的高速管式分离机离心5-6分钟得二次上清液，将二次上清液用截留分子量12000的中空纤维超滤柱进行超滤，得超纯滤液，将超纯滤液浓缩至原体积的5％，然后冷冻、干燥，即得玉米sod冻干精粉。
实施例4：
玉米超氧化物歧化酶的制备方法，具体步骤为：
(1)拣选，通过风选，选择无霉烂、无杂质，苞粒饱满的优质玉米。
(2)消毒浸泡：用浓度3％的氯化钠溶液清洗5-6次，进行杀菌消毒，用31℃-33℃的去离子水浸泡32小时，沥水；
(3)萌芽：控制萌芽室温度在31℃-33℃，每隔2小时对玉米进行一次水淋，水温保持31℃-32℃，随时查看萌芽情况，待萌芽长出2-3毫米，萌芽结束；
(4)清洗：将萌芽玉米用浓度3％氯化钠溶液清洗3遍；
(5)磨浆：将萌芽玉米按6L/kg加入50umol/L的磷酸盐缓冲溶液进行研磨，首先粗磨，然后精磨，充分磨细；
(6)一次酶解：将研磨完毕的玉米浆先按0.4g/kg加入纤维素酶，搅拌均匀，再按0.3g/kg加入果胶酶，混合均匀，然后按50mL/kg加入浓度为30％的氯化钙溶液，静置2小时进行沉淀；
(7)一次分离：将沉淀分层的玉米浆用180目的滤袋粗滤得滤液，然后用转速15000r/min的高速管式分离机离心5分钟，留取上清液；
(8)超滤浓缩：将上清液用截留分子量20000的中空纤维超滤柱进行超滤得滤液，用纳米过滤器进行精滤，得纯净滤液，将滤液浓缩至原体积的10％，得浓缩液，然后冷冻、干燥，即得玉米sod粗粉；
(9)二次酶解：将浓缩液先按0.35g/kg加入纤维素酶，搅拌均匀，再按0.25g/kg加入果胶酶混合均匀进行酶解，调pH至7.2；
(10)二次分离：用转速15000r/min的高速管式分离机离心4分钟得二次上清液，将二次上清液用截留分子量15000的中空纤维超滤柱进行超滤，得超纯滤液，将超纯滤液浓缩至原体积的5％，然后冷冻、干燥，即得玉米sod冻干精粉。
实施例5：
玉米超氧化物歧化酶的制备方法，具体步骤为：
(1)消毒浸泡：将风选优质玉米100kg，用浓度2％的氯化钠溶液清洗5次，进行杀菌消毒，用29℃的去离子水浸泡30小时，沥水；
(2)萌芽：控制萌芽室温度在29℃-31℃，每隔2小时对玉米进行一次水淋，水温保持29℃-31℃，随时查看萌芽情况，待萌芽长出2-3毫米，萌芽结束；
(3)清洗：将萌芽玉米用浓度2％氯化钠溶液清洗3遍；
(4)磨浆：将萌芽玉米加入400升50umol/L磷酸盐缓冲溶液进行研磨，首先粗磨，然后精磨，充分磨细，越细越好；
(5)一次酶解：将研磨完毕的玉米浆先加入280g纤维素酶，搅拌均匀，再加入320g果胶酶，混合均匀，然后加入5升浓度为20％的氯化钙溶液，静置2小时进行沉淀；
(6)一次分离：将沉淀分层的玉米浆用200目的滤袋粗滤得滤液，然后用转速8000r/min的高速管式分离机离心9分钟，弃沉淀物，可获取上清液约300升；
(7)超滤浓缩：将上清液用截留分子量13000的中空纤维超滤柱进行超滤，得滤液，用纳米过滤器进行精滤，得纯净滤液，将滤液浓缩至原体积的10％，约得30升浓缩液；
(8)二次酶解：将浓缩液先加入200g纤维素酶搅拌均匀，再加入280g果胶酶混合均匀后，调pH至7.1；
(9)二次分离：再次离心分离，用转速12000r/min的高速管式分离机离心7分钟，将所得上清液用截留分子量10000的中空纤维超滤柱进行超滤，得超纯滤液，将超纯滤液浓缩至原体积的5％，然后冷冻、干燥，即得玉米sod冻干精粉约40g。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种玉米超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于制备方法为：
(1)消毒浸泡：将玉米用浓度1-3％的氯化钠溶液清洗3-6次，进行杀菌消毒，用25℃-33℃的去离子水浸泡25-35小时，沥水；
(2)萌芽：控制萌芽室温度在25℃-33℃，每隔2小时对玉米进行一次水淋，水温保持25℃-33℃，随时查看萌芽情况，待萌芽长出1-3毫米，萌芽结束；
(3)清洗：将萌芽玉米用浓度1-3％氯化钠溶液清洗2-3遍；
(4)磨浆：将萌芽玉米按2-6L/kg加入50μmol/L的磷酸盐缓冲溶液进行研磨，首先粗磨，然后精磨，充分磨细；
(5)一次酶解：将研磨完毕的玉米浆加入酶，先按0.1-0.4g/kg加入纤维素酶，搅拌均匀，再按0.1-0.4g/kg加入果胶酶，混合均匀后，再后按50-100mL/kg加入浓度为15-30％的氯化钙溶液，静置1-2小时进行沉淀；
(6)一次分离：将沉淀分层的玉米浆用150-200目的滤袋粗滤得滤液，然后用转速8000-15000r/min高速管式分离机离心5-10分钟，留取上清液；
(7)超滤浓缩：将上清液用截留分子量3000-20000的中空纤维超滤柱进行超滤得滤液，用纳米过滤器进行精滤，得纯净滤液，将滤液浓缩至原体积的10％，得浓缩液，然后冷冻、干燥，即得玉米sod粗粉；
(8)二次酶解：将浓缩液先按0.09-0.35g/kg加入纤维素酶，搅拌均匀，再按0.09-0.35g/kg加入果胶酶混合均匀进行酶解，调pH至6.8-7.2；
(9)二次分离：用转速8000-15000r/min的高速管式分离机离心4-8分钟，得二次上清液，将二次上清液用截留分子量3000-20000的中空纤维超滤柱进行超滤，得超纯滤液，将超纯滤液浓缩至原体积的5％，然后冷冻、干燥，即得玉米sod冻干精粉。
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