CN103827288A - 藻类的培养方法与含有藻酸的组合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供工业上高效地培养具有藻酸产生能力的藻类的方法，以及工业上有利的制备含有藻酸的组合物的方法。根据本发明的藻类的培养方法，其包括将属于拟小球藻属(Parachlorella)且具有藻酸产生能力的藻类进行异养(Heterotrophic)培养的步骤。另外，根据本发明的含有藻酸的组合物的制备方法，其包括从根据所述培养方法所得到的藻类的培养物中取得含有藻酸的组合物的步骤。

Description

藻类的培养方法与含有藻酸的组合物的制备方法
技术领域
本发明涉及属于拟小球藻属(Parachlorella)，并且具有藻酸产生能力的藻类的培养方法。另外，本发明涉及工业上有利的制备含有藻酸的组合物的方法。进一步地本发明涉及：从根据该制备方法所得到的含有藻酸的组合物中得到的藻体干燥物、包含该含有藻酸的组合物的污泥减少剂、有害物质吸附剂、饲料、食品和医药品。
背景技术
藻酸是褐藻类或一部分红藻的细胞间及细胞壁中所含有的粘性多糖类，是2种糖醛酸(Uronic acid)，即D-甘露糖醛酸与L-古洛糖醛酸以各种比例进行结合的多糖醛酸苷(Polyuronides)多糖。藻酸或其盐，作为增稠稳定剂、胶凝剂，不仅广泛利用于食品添加物、医药品、化妆品、牙科用材料等，并且由于其为食物纤维中的一种，因而作为功能性食品也受到注目。进一步地，已报道藻酸中特别是被称作藻酸低聚物的低分子量藻酸具有各种生理活性(非专利文献1)。
现有技术中，藻酸或其盐是通过从海带、裙带菜等褐藻类中进行提取、精制来进行工业制备的。但是，在以上述等褐藻类为原料的制法中，存在原料的稳定供给的问题。另外，作为藻酸低聚物的制法，已知的有以从褐藻类中得到的高分子量的藻酸为原料，使具有藻酸分解能力的酶或者细菌进行作用从而使其低分子量化的方法(专利文献1、2)；在加压下对该高分子量的藻酸进行热处理后使其低分子量化的方法(专利文献3、4)等。但是，前者的方法由于使用酶或者细菌，不仅需要花费庞大的成本，而且需要在低浓度的水溶液中长时间进行反应，因此不利于工业化。此外，后者的加压热处理法也需要昂贵的压力容器，也存在设备上的问题。
最近，公开了具有藻酸、特别是具有较低分子量藻酸产生能力的新型拟小球藻属(Parachlorella)的藻类，通过培养该藻类，从其培养液中取得藻酸的方法(专利文献5)。进一步地，也公开了使用含有该藻酸的藻类的藻体干燥物减少污泥方法(专利文献6)。在上述专利文献中，记载了该新型藻类的光要求性，实际上，所公开的该藻类的培养方法中，每一个都是利用该藻类的光合性能的自养培养。
藻类通常都可以利用其光合性能进行自养培养。自养培养可以利用日光等自然光，具有不需要对培养基添加碳源、能量源等优点。另一方面，根据天气、季节等，光的照射量会产生变化，另外在设备方面也存在培养液容易受到微生物等污染的问题。为了解决上述的问题，虽然也有在完全封闭体系中用电照明等人工光进行照射培养的方法，但这不仅需要昂贵的设备，还需要大量的电能。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开平2-303468号公报
专利文献2:日本特开平5-15387号公报
专利文献3:日本特开平6-7093号公报
专利文献4:日本特开2006-320320号公报
专利文献5:WO2010-024367号公报
专利文献6:日本专利第4573187号公报
非专利文献
非专利文献1:日本食品化学学会志17卷27-35页(2010年)
发明内容
发明要解决的问题
鉴于上述状况，本发明的要解决的问题是提供工业上且有效地培养具有藻酸产生能力的藻类的方法。进一步地，要解决的问题是提供含有藻酸的组合物的工业上有利的制法。
解决问题的手段
本发明的发明人发现，现有技术中对具有藻酸产生能力的属于拟小球藻属(Parachlorella)的藻类只知道需要光的自养性培养方法。意外地，异养地培养可以以高效率进行培养，进一步地，进行异养性培养的该藻类的培养物还比自养培养时蓄积更大量的藻酸，进而完成了本发明。
本发明如以下所示。
[1]藻类的培养方法，其特征为包括将属于拟小球藻属(Parachlorella)且具有藻酸产生能力的藻类进行异养培养的步骤。
[2]根据上述[1]所述的方法，其中，属于拟小球藻属(Parachlorella)的藻类为Parachlorella sp.Binos FERM BP-10969。
[3]根据上述[1]或[2]所述的方法，其中，在平均照度为小于700Lux的暗黑条件下培养藻类。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，用液体培养基培养藻类，并且，相对于培养开始时的该液体培养基量1L，该液体培养基中的有机化合物的总使用量换算为碳原子的重量为2.5g以上。
[5]含有藻酸的组合物的制备方法，其包括从根据上述[1]～[4]中任一项所述的方法得到的藻类的培养物中取得含有藻酸的组合物的步骤。
[6]藻体干燥物，其为将根据上述[5]所述的制备方法所得到的含有藻酸的组合物进行干燥后的物质而得，且每1kg中的藻酸含量为40g以上。
[7]污泥减少剂，其中含有根据上述[5]所述的制备方法得到的含有藻酸的组合物。
[8]有害物质吸附剂，其中含有根据上述[5]所述的制备方法得到的含有藻酸的组合物。
[9]饲料，其含有根据上述[5]所述的制备方法得到的含有藻酸的组合物。
[10]食品，其含有根据上述[5]所述的制备方法得到的含有藻酸的组合物。
[11]药品，其含有根据上述[5]所述的制备方法所得到的含有藻酸的组合物。
发明效果
根据本发明，在培养中不供给光，而使用通用的微生物培养槽，使具有藻酸产生能力的藻类高效地增殖成为可能，进一步地，可以提供工业化的且高效地制备含有藻酸的组合物的方法。用本发明的方法得到的含有藻酸的组合物，含有大量藻酸，且作为污泥减少剂、有害物质吸附剂、饲料、食品或者医药品的原料是有用的。
具体实施方式
本发明的藻类的培养方法，其包括将具有藻酸产生能力的藻类进行异养培养的步骤。
本发明中所使用的藻类为具有藻酸产生能力，且属于拟小球藻属(Parachlorella)的藻类。
拟小球藻属(Parachlorella)藻类曾经被分类为共球藻纲(Trebouxiophyceae)的小球藻属，但根据利用了18S rDNA和16S rDNA的分子系统发生学的解析，其形成了属于共球藻纲且和其它小球藻属藻类相区别的组，因此其作为与小球藻属藻类不同的独立属而被认可。
作为属于拟小球藻属(Parachlorella)的藻类，列举例如Parachlorella sp.binos、凯氏拟小球藻属(Parachlorella kessleri)、拜氏拟小球藻属(Parachlorellabeijerinckii)等藻类，但不限定于此，即使对于生物学上种类未经鉴别的藻类，只要其属于拟小球藻属(Parachlorella)或其亲缘属且具有藻酸产生能力，都可以在本发明中使用。
在此，属于拟小球藻属(Parachlorella)的亲缘的藻类，是指在根据利用了18S rDNA和16S rDNA的分子系统发生学的解析所得到的分子系统树中，属于拟小球藻属(Parachlorella)的相邻属的藻类。即，只要其为具有藻酸产生能力且被分类为拟新月藻属(Closteriopsis)、双月藻属(Dicloster)、海水小球藻属(Marinichlorella)的藻类，都可以在本发明中使用。
另外，在本发明使用的藻类可以是能够进行异养培养藻类，但这一点目前为止不为人所知。即，具有光合性能，即使目前为止其为自养培养的藻类，但只要可以进行异养培养且具有藻酸产生能力，都可以在本发明中使用。
通常，拟小球藻属(Parachlorella)藻类可以通过以下方式获得：从野外采取的淡水样品中，使用通常的培养基通过传代培养分离藻类的群落，最终通过分子系统发生学进行解析从而确定种属。
本发明中所使用的藻类具有产生藻酸的能力。藻酸可以为从拟小球藻属(Parachlorella)藻类向细胞外分泌的藻酸，也可以为细胞内所蓄积的藻酸。在从拟小球藻属(Parachlorella)藻类的培养液或该培养液的均浆中检出藻酸的情况下，即判断该拟小球藻属(Parachlorella)藻类为具有藻酸产生能力的藻类。
藻酸为D-甘露糖醛酸与L-古洛糖醛酸任意进行聚合的物质。通常，其聚合度，即构成藻酸的单糖单元的数量为80以上，1100以下左右，分子量为15000以上，200000以下左右。但是，在本发明中，更低分子量的所谓藻酸低聚物也视为含有藻酸的物质。藻酸低聚物的聚合度为3以上，10以下左右，分子量为500以上，2000以下左右。
在本发明中，所谓藻酸，不仅包括游离的藻酸也包括其盐(钠盐、钙盐、镁盐、钾盐、铵盐等)。根据本发明的培养方法生产的藻酸可以利用例如间萘二酚显色反应法(食品卫生学杂志第39卷5号297页(1998年))进行定量。另外，在本发明中，作为藻酸的定量值，以换算为藻酸钠量的量来表示。
作为本发明中所使用的藻类，优选具体例可以列举Parachlorella sp.binosFERM BP-10969株。FERM BP-10969株保藏在下述保藏机构。
(i)保藏机构的名称和地址
名称：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心
地址：日本国茨城县筑波市1丁目1番地1中央第6
(ii)保藏日：2008年2月28日
(iii)保藏号：FERM P-21513
(iv)国际保藏号：FERM BP-10969
(v)从国内保藏到国际保藏的移交日：2008年5月23日
作为本发明中的具有藻酸产生能力且属于拟小球藻属(Parachlorella)的藻类，除了上述Parachlorella sp.binos FERM BP-10969株以外，还可以适当地利用其变异株或杂交株。
本发明中可以使用的FERM BP-10969株的变异株，是指表现出一些变异的FERM BP-10969株，但保持藻酸产生能力的株。另外，本发明中可以使用的FERM BP-10969株的杂交株，是指与FERM BP-10969株在分类上是同种，且为亲缘关系比较远的株与FERM BP-10969株进行交配而得到的，并保持藻酸产生能力的株。
需要说明的是，与通常的小球藻属藻类相比，FERM BP-10969株含有每干燥重量2倍以上的叶绿素，光合能力非常高，因此一直以来，当然是进行自养培养。但是本发明的发明人发现，通过对FERM BP-10969株特意地进行异养培养，可以极有效地产生藻酸。
在本发明中，所谓进行异养培养，是指在黑暗条件下，使用含有作为能量源和/或碳源有机化合物的培养基进行培养。但是，在培养基中含有作为能量源和/或碳源利用充分量的有机化合物，不需要光和作用的条件下，则可以在明亮条件下进行培养。
本发明中的所谓黑暗条件下，是指不对培养液照射对于藻类细胞的增殖所必须量的光的条件。具体而言，培养液中的平均照度为低于700Lux，优选低于300Lux，更优选为低于100Lux，进一步优选为低于10Lux，再进一步优选为低于1Lux以下的条件。另外，也可以通过利用通常所使用的避光手段、或使用异养培养中通常所使用的培养槽，在实质上满足上述平均照度的条件下实施培养。需要说明的是，由于培养基以及增殖的藻类细胞使光衰减，因此培养液中的照度根据光源的距离、藻类细胞的密度等而变化，培养液中的平均照度可以通过例如对放置在与培养中同样环境中的培养液中的多个位置的照度进行测定，并以其平均值来计算。照度的测定，优选通过至少包括培养基的表面与最深处的2个以上位置，且12个以下位置来进行测定。
在本发明中，在异养培养具有藻酸产生能力的藻类时，作为能量源和/或碳源所使用的有机化合物只要为使该藻类可以进行同化作用的有机化合物即可，没有特别限定，列举例如葡萄糖、半乳糖、蔗糖、木糖、麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、乳糖、甘露醇、各种低聚糖、淀粉等碳水化合物类；甲醇、乙醇、甘油、乙二醇、丙二醇等醇类；柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、丁酸、丙酸、乙酸等有机酸类；谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、色氨酸、苏氨酸、蛋氨酸等氨基酸类；其他植物油脂或脂肪酸等油脂类等。上述等有机化合物，可以单独使用也可以任意组合使用。另外，上述等的有机化合物不需要一定使用经精制后的物质，糖蜜、乳清、淀粉水解物等未精制原料也可以作为能量源和/或碳源来使用。
在本发明中，对具有藻酸产生能力的藻类进行异养培养时，作为能量源和/或碳源，向培养基添加的有机化合物的总量(在培养中对培养基进行补加或流加时为其合计量)，只要其为可以进行异养培养的量即可，没有特别限制，但换算为该有机化合物中所含有的碳原子的重量，相对于培养开始时刻的1L的培养基液量，有机化合物的总量例如为2.5g以上，优选3g以上，更优选5g以上，进一步优选8g以上，进一步更优选10g以上，特别优选50g以上。
在本发明中，对具有藻酸产生能力的藻类进行异养培养时所使用的培养基，只要其可以使具有藻酸产生能力的藻类进行异养增殖，则没有特别限制。但除了作为能量源和/或碳源所使用的上述有机化合物以外，也可以为例如由氮源、磷源、矿物质类等构成的物质，进一步可包含维生素类或消泡剂、pH调节剂等。作为上述氮源，例如可列举氨和其盐、尿素、硝酸和其盐、氨基酸类等。作为上述磷源，例如可列举磷酸和其盐、多聚磷酸等。作为上述矿物质类，可列举例如锰、锌、铜、钠、钾、铁、钙和钼等金属的盐，还有硼酸等。作为上述维生素类，例如可列举维生素A、B1、B2、B6、B12、C、Ｄ、E、K、烟酸、泛酸、叶酸、生物素以及上述物质的前体或衍生物。氮源、磷源、矿物质类、维生素类以及其他的培养基成分不需要一定使用经精制后的物质，也可以利用例如酵母提取物、蛋白胨等天然成分。另外，上述成分可以任意组合使用。
在本发明中，具有藻酸产生能力的藻类的异养培养，可以通过在加入包含上述成为能量源和/或碳源的有机化合物、氮源、矿物质类、维生素类、以及其它成分的培养基的容器中，对具有藻酸产生能力的藻类进行接种，优选地一边通气和/或搅拌一边培养来实施。培养温度优选10℃～50℃的范围，更优选20℃～40℃的范围，进一步优选25℃～30℃的范围。在培养温度为小于10℃或者超过50℃的条件下，具有藻酸产生能力的藻类的增殖速度显著降低，因此，作为工业化培养不适合。培养中的pH优选3.0～10.0的范围，更优选4.0～9.0的范围，进一步优选5.0～8.0的范围。在培养中的pH为小于3.0，或pH超过10.0的条件下，具有藻酸产生能力的藻类的增殖速度显著降低，因此，作为工业化培养不适合。
在本发明中，对具有藻酸产生能力的藻类进行异养培养时所用的上述培养基的成分，可以在培养开始前一次性添加，也可以在培养中分批和/或连续地进行添加。然而，为了提高培养液中的藻类细胞密度，需要大量的作为能量源和/或碳源的有机化合物，优选分批和/或连续地进行添加。此时，培养液中的作为能量源和/或碳源而使用的有机化合物的浓度，换算为该有机化合物中所包含的碳原子的重量，优选维持在32g/L以下，更优选为16g/L以下，进一步优选为8g/L以下，更进一步优选为4g/L以下。
按照本发明的方法所得到的具有藻酸产生能力的藻类的培养液，根据需要，也可以继续用不含有作为能量源和/或碳源的有机化合物的培养基进行培养。此时，在黑暗条件或在明亮条件任一条件下都可以进行。经过该2阶段培养的培养物，特别地，可以适宜用作污泥减少剂或者有害物质吸附剂的原料。
另外，为了确保本发明中所用的藻类的量，可以对该藻类进行前培养。相关的前培养在黑暗条件或在明亮条件任一条件下都可以进行。
根据本发明的培养方法，与现有的自养培养法相比，可以大幅提高每份培养液的藻体产量，也可以提高藻酸的产量。按照本发明的方法所得到的具有藻酸产生能力的藻类培养液，在培养结束时，每1L培养液能够含有的藻体干燥物优选2g以上，更优选3g以上，进一步优选5g以上，进一步更优选10g以上，特别优选50g以上。
需要说明的是，培养液中的藻体干燥物浓度，例如可以用以下的方法进行测定。采集一定量的培养液，进行离心分离且去除培养上清液。用与培养液等量的水将得到的藻体再混悬，再次进行离心分离后去除洗涤液。经水洗的藻体干燥至恒重，计算重量。干燥藻体的恒重重量除以采集了的培养液量，从而计算出藻体干燥物浓度。
此外，令人惊讶的是，根据本发明的培养方法，也可以提高每份藻体的藻酸生产性能。根据本发明的培养方法，每1kg藻体干燥物的生产性能换算为藻酸钠量通常为40g以上，优选50g以上，更优选100g以上，特别优选150g以上。
根据本发明的培养方法，上述每份培养液的藻体产量的提高与每份藻体的藻酸生产性能的提高是相辅相成的，与现有的自养培养法相比，显著地提高了每份培养液的藻酸生产性能。在本发明的培养方法中，在培养结束时，每1L培养液可以蓄积的藻酸，换算为藻酸钠量优选为10mg以上，更优选100mg以上，进一步优选500mg以上，进一步更优选1000mg以上，特别优选5000mg以上。
另外，本发明还包括含有藻酸的组合物的制备方法，其特征在于，从通过上述本发明的培养方法得到的培养物制得含有藻酸的组合物的步骤。换言之，对属于拟小球藻属(Parachlorella)且具有藻酸产生能力的藻类进行异养培养，利用所得到的培养物来制备含有藻酸的组合物的方法都属于本发明的范畴。
本发明中的含有藻酸的组合物，只要其为含有藻酸和/或其盐的组合物即可，没有特别限制，可以是除了藻酸以外还含有来自藻类的成分、以及藻体或其破碎物等的组合物，也可以是去除藻体等后含有高纯度藻酸本身的组合物。即，作为用本发明的制备方法得到的含有藻酸的组合物，以下任意物质都符合：例如培养具有藻酸产生能力的藻类而得到的培养液其本身、从该培养液中得到的藻体、提高了培养液中的藻体浓度的浓缩培养液、和/或从该培养液中去除藻体后的培养上清等。另外，根据需要通过对该培养液、藻体、浓缩培养液和/或培养上清进行干燥、纯化等处理，提高了藻酸和/或其盐的含有量，该处理物也包含在通过本发明的制备方法所得到的含有藻酸的组合物中。需要说明的是，作为后述的污泥减少剂或有害物质吸附剂利用含有藻酸的组合物时，作为含有藻酸的组合物，优选除了藻酸以外还含有藻体或其破碎物等的组合物。
在本发明中，从对具有藻酸产生能力的藻类进行异养培养所得到的培养物中取得含有藻酸的组合物的方法并没有特别限制，例如通过用上述本发明的培养方法进行培养，从而得到含有藻酸的培养液，通过对该培养液实施离心分离、过滤等操作可以分别分离出含有藻酸的培养上清液、浓缩培养液、和/或藻体。根据需要，也可以对上述等的培养液、培养上清液、浓缩培养液、和/或藻体通过冷冻干燥、喷雾干燥、转鼓式干燥、减压干燥等手法进行干燥。进一步地，通过单独或者组合使用公知的手法，可以从培养液、培养上清液、浓缩培养液、藻体、和/或上述等的干燥物中，制备更高浓度的含有藻酸的组合物。例如可以使用下列方法：向培养上清液中添加硫酸等酸，通过离心分离、过滤等手法分取不溶解的藻酸的方法；向培养上清液添加氯化钙等金属盐，通过离心分离、过滤等手法分取凝胶化的藻酸的方法；向培养上清液中添加乙醇、丙酮、异丙醇等水溶性有机溶剂，通过离心分离、过滤等手法分取不溶解的藻酸的方法等。另外，例如通过用碳酸钠水溶液等碱性水溶液对藻体进行洗涤和/或提取，并用离心分离、过滤等手法去除不溶物，可以从藻体中分取到藻酸钠等藻酸盐。进一步地，例如，对经分取的藻酸盐的水溶液进行与前述培养上清液相同的处理，可以制备更高浓度的含有藻酸的组合物。
进一步地，本发明也涉及含有通过上述本发明的制备方法所得到的含有藻酸的组合物的污泥减少剂或有害物质吸附剂。
在本发明中，所谓污泥减少剂是指组合物，其在通过活性污泥法对有机排水的处理中，通过向活性污泥添加的操作，具有降低最终产生的剩余污泥量效果。
根据本发明的污泥减少剂的使用条件可以适宜进行调整，例如，相对于1吨污泥，本发明的污泥减少剂换算为干燥状态可以以20g以上、200g以下左右进行添加。在添加后，为了确保充分的溶液含氧量可以对混合物进行搅拌或鼓泡。处理温度可以为常温。处理时间根据应处理的污泥的量等，可以设为10小时以上、10日以下。
所谓有害物质吸附剂，是指通过使其与污染物接触从而吸附污染物中的有害物质，之后，通过从污染物中进行分离，去除污染物中一部分或者全部的有害物质而使用的组合物。作为有害物质，可以列举例如铯-137、铯-134、锶-89、锶-90、锶-91、碘-131、碘-133等放射性元素；铅、铜、镉、砷等重金属类；含有上述的化合物等，但并不限定于此。本发明的有害物质吸附剂的使用条件，可以按照上述污泥减少剂的使用条件来调整。
在本发明中，制备包含有含有藻酸的组合物的污泥减少剂或有害物质吸附剂的方法并没有特别限制，例如对通过本发明的培养方法得到的培养物，根据需要进一步在不含有作为能量源和/或碳源的有机化合物的培养基中进行培养，之后通过浓缩、干燥，得到按照本发明的制备方法的含有藻酸的组合物，可以将上述组合物直接利用或者适宜进行加工后再利用。
另外，本发明也涉及包含有按照上述本发明的制备方法得到的含有藻酸的组合物的饲料、食品或药品。
在本发明中，所谓食品，是指人类以营养素的摄取、喜好为目的而摄取的物质，除了日常饮食的通常食品以外，还包括营养补充食品，例如营养辅助剂或特定保健用食品等，还包括食品添加物等。
本发明中的所谓饲料，是指除人类以外的生物以营养元素的摄取为主要目的而摄取的物质。例如指给予鱼类、甲壳类、贝类等水产动物；鸡、鹌鹑、鸭等家禽类；牛、猪、羊等畜产动物；狗、猫等玩赏动物等的饲料、饲料添加物、或者营养补充食品等，但并不限定于此。
本发明中的所谓医药品，是指用于预防或者治疗人或其他动物的疾病、症状的物品。
按照本发明的制备方法而得到的含有藻酸的组合物，可以适宜加工成粉末剂、片剂、胶囊剂等，或通过与食品原料、饲料原料混合，用作上述等的饲料、食品、医药品。本发明的包含有含有藻酸的组合物的饲料、食品或医药品利用藻酸的物理性质可以用于对食品、药剂增加粘性或增稠感，或作为含有食物纤维的组合物进行利用，此外，也可以以高血压的预防/治疗、血液中胆固醇的抑制作用或血糖值的上升抑制作用、消除便秘、动脉硬化的预防/治疗等为目的而进行利用。进一步地，对由于摄取藻酸而产生锶的体外排泄作用进行利用，从而可以作为锶-89、锶-90、锶-91等放射性锶的体内残留防止剂而进行利用。
本申请基于2011年9月9日所申请的第2011-197212号日本专利申请，要求优先权的利益。2011年9月9日所申请的第2011-197212号日本专利申请的说明书的全部内容，为参考援用于本发明。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行更详细说明。需要说明的是，在本实施例中，培养液的藻体干燥物含量以及藻酸浓度，没有特别说明时，如下测定。
培养液的藻体干燥物含量
对一定量的培养液以3000×G进行离心分离后去除上清液。接着，用5mL水将沉淀的藻体再混悬，同样进行离心分离后去除上清液。进一步地，使水洗后的藻体在110℃干燥8小时使其恒重后进行称量，计算出每1L培养液中所含有的藻体干燥物的重量。
培养液中的藻酸浓素
用水将培养液进行适度稀释，取该稀释培养液1mL加入铜-盐酸试剂2mL及间萘二酚试剂1mL，在沸腾水浴中加热65分钟。该铜-盐酸试剂为向40mL浓盐酸中加入2.5％硫酸铜水溶液1mL及9mL水配制而成。另外，该间萘二酚试剂为将1，3-二羟基萘100mg用25mL水进行溶解配制而成。将上述培养液在冰水混合液中冷却，加入4mL乙酸丁酯进行搅拌后，进行离心分离。乙酸丁酯层用孔径0.45μm的过滤器(Cosmonice Filter S；NACALAI TESQUE株式会社生产)过滤，在566nm下进行比色定量。使用以藻酸钠300～400cP(和光纯药工业株式会社生产)作为标准品制成的标准曲线，将样品中的藻酸浓度换算为藻酸钠来计算。
实施例1
将由葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾1g/L、七水合硫酸镁1g/L、氯化钙0.01g/L、尿素2g/L、七水合硫酸铁5mg/L、Arnon’s A5溶液1mL/L(Arnon’s A5溶液的组成：硼酸2.86g/L、四水合氯化锰1.81g/L、四水合硫酸铜0.08g/L、七水合硫酸锌0.22g/L、四水合钼酸铵0.171g/L)所组成的培养基(pH6.5)100mL放入摇瓶中杀菌后，接种Parachlorella sp.binos FERM BP-10969，用铝箔避光后，在30℃振荡培养72小时。培养结束后，测定该培养液的藻体干燥物含量为9.0g/L。另外，测定该培养液中的藻酸浓度时，换算为藻酸钠为0.52g/L。即，每1kg藻体干燥物的藻酸产量为58g。
实施例2
将与实施例1相同组成的培养基100mL放入摇瓶中杀菌后，接种Parachlorella sp.binos FERM BP-10969，用铝箔避光后，在暗处、30℃振荡72小时，进行前培养。接着，将由葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、七水合硫酸镁1.5g/L、氯化钙20mg/L、尿素3.5g/L、七水合硫酸铁10mg/L、柠檬酸0.1g/L、Arnon’s A5溶液(Arnon’s A5溶液的组成与实施例1相同)1mL/L、Adekanol LG109(株式会社ADEKA生产)0.1g/L所组成的培养基2000mL放入5L容量的发酵罐杀菌后，接种上述前培养液200mL，用铝箔避光后，在内温30℃、通气量2L/分、搅拌数450rpm、pH6～7下培养143小时。使用30％(w/w)的氢氧化钠水溶液控制pH下限，使用15％(w/w)的硫酸水溶液控制pH上限。另外，从培养开始的23小时后开始，将经杀菌的流加用培养基流加到培养液中。适宜调节流加用培养基的添加速度，以使培养液中的葡萄糖浓度不超过20g/L，到培养结束后共计添加了560mL培养液。流加用培养基的组成是：葡萄糖570g/L、磷酸二氢钾20g/L、七水合硫酸镁12g/L、氯化钙1.25g/L、尿素42g/L、七水合硫酸铁700mg/L、Arnon’s A5溶液10mL/L、柠檬酸4.5g/L。
培养结束后，测定该培养液的藻体干燥物含量为54.3g/L。另外，测定该培养液中的藻酸浓度时，换算为藻酸钠为3.4g/L。即，每1kg藻体干燥物的藻酸产量为63g。
实施例3
将由葡萄糖111mM(20g/L)、硝酸钾50mM、磷酸二氢钾9.2mM、磷酸氢二钾0.57mM、硫酸镁10mM、氯化钠31mM、EDTA0.14mM、硫酸铁0.11mM、Arnon’s A5溶液(Arnon’s A5溶液的组成与实施例1相同)1mL/L所组成的培养基100mL放入摇瓶进行杀菌后，接种Parachlorella sp.binos FERM BP-10969，用铝箔避光后，在30℃振荡培养72小时。离心分离该培养液，去除上清液后，加入无机盐培养基(硝酸钾2.5mM、磷酸二氢钾1.3mM、硫酸镁0.3mM、氯化钠0.43mM、氯化钙0.23mM、磷酸二氢铵1.7mM、氯化铁0.047mM、Arnon’sA5溶液2mL/L)100mL进行再混悬，进一步在30℃振荡16小时。培养结束后，测定该培养液的藻体干燥物含量为3.5g/L。另外，测定该培养液中的藻酸浓度时，换算为藻酸钠为0.14g/L。即，每1kg藻体干燥物的藻酸产量为40g。
比较例1：自养培养
将由硝酸钾2.5g/L、磷酸二氢钾17.5g/L、七水合硫酸镁7.5g/L、氯化钙2.5g/L、氯化钠2.5g/L、磷酸二氢铵20g/L、氯化铁6.5mg/L、Arnon’s A5溶液2mL/L(Arnon’s A5溶液的组成与实施例1相同)所组成的培养基(pH6.5)1000mL加入烧瓶进行杀菌后，接种Parachlorella sp.binos FERMBP-10969，在约7000Lux的照度下，于25℃振荡培养9天。培养结束后，测定该培养液的藻体干燥物含量为67mg/L。另外，测定该培养液中的藻酸浓度时，换算为藻酸钠为2.3mg/L。即，每1kg藻体干燥物的藻酸产量为34g。
实施例4
将由葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾1g/L、七水合硫酸镁1g/L、氯化钙0.01g/L、尿素2g/L、七水合硫酸铁5mg/L、Arnon’s A5溶液1mL/L(Arnon’s A5溶液的组成：硼酸2.86g/L、四水合氯化锰1.81g/L、四水合硫酸铜0.08g/L、七水合硫酸锌0.22g/L、四水合钼酸铵0.171g/L)所组成的培养基(pH6.5)400mL放入2L容量的摇瓶进行杀菌后，接种Parachlorella sp.binos FERM BP-10969，用铝箔避光后，在30℃振荡培养48小时，得到前培养液。
将由酵母提取液3g/L、磷酸二氢钾11.5g/L、七水合硫酸镁7.5g/L、氯化钙0.65g/L、柠檬酸2.4g/L、七水合硫酸铁0.36g/L、Arnon’s A5溶液1mL/L(Arnon’s A5溶液的组成：硼酸2.86g/L、四水合氯化锰1.81g/L、四水合硫酸铜0.08g/L、七水合硫酸锌0.22g/L、四水合钼酸铵0.171g/L)所组成的培养基(pH6.0)10L，放入30L容量的发酵罐中进行蒸煮杀菌。对该溶液接种上述前培养液，在通气量18Ｌ/分、30℃、pH6.0的条件下培养120小时。在培养中，连续地添加经杀菌的55重量％葡萄糖水溶液合计5.4kg，调整搅拌数以使培养液的溶解氧浓度为0.1ppm以上。另外，使用25重量％的氨水对培养液的pH进行调整。
培养结束后，测定该培养液的藻体干燥物含量时为93.0g/L。另外，测定该培养液中的藻酸浓度时，换算为藻酸钠为15.8g/L。即，每1kg藻体干燥物的藻酸产量为170g。
实施例5
对实施例2中得到的Parachlorella sp.binos FERM BP-10969的培养液进行冷冻干燥、喷雾干燥或转鼓式干燥，得到含有藻酸的组合物。冷冻干燥使用冷冻干燥机FD-1型(东京理化器械株式会社)，喷雾干燥使用Mini SprayDryer B-290型(Buchi公司)、转鼓式干燥使用Double drum型干燥机(φ400×L500mm；Katsuragi工业株式会社)分别实施。对得到的干燥物中的藻酸含量进行测定的结果是，冷冻干燥品为16.4重量％，喷雾干燥品为15.7重量％，转鼓式干燥品为15.2重量％。
比较例2：自养培养
将由磷酸二氢钾175mg/L、磷酸二氢铵200mg/L、七水合硫酸镁75mg/L、氯化钙25mg/L、氯化钠25mg/L、硝酸钾250mg/L、七水合硫酸铁5mg/L、Arnon’s A5溶液1mL/L(Arnon’s A5溶液的组成：硼酸2.86g/L、四水合氯化锰1.81g/L、四水合硫酸铜0.08g/L、七水合硫酸锌0.22g/L、四水合钼酸铵0.171g/L)所组成的培养基(pH7.0)500mL放入1L容量的三角烧瓶中，接种Parachlorellasp.binos FERM BP-10969后，在约7000Lux的照度、25℃，利用二氧化碳进行鼓泡从而进行培养10天。培养结束后，测定该培养液的藻体干燥物含量时为850mg/L。另外，测定该培养液中的藻酸浓度时，换算为藻酸钠为26.1mg/L。即，每1kg藻体干燥物的藻酸产量为31g。
根据以上实施例和参考例的结果，与具有藻酸产生能力的属于拟小球藻属(Parachlorella)的藻类进行自养培养时进行比较，可知通过异养培养具有藻酸产生能力的属于拟小球藻属的藻类，其每份培养容积的藻酸的产量大大地提高了。另外，同时也可知，相对于培养中所生产的藻体干燥物重量，藻酸的产量也提高了。

Claims (11)

1.藻类的培养方法，其包括将属于拟小球藻属(Parachlorella)且具有藻酸产生能力的藻类进行异养培养的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，属于拟小球藻属(Parachlorella)的藻类为Parachlorella sp.Binos FERM BP-10969。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在平均照度小于700Lux的黑暗条件下培养藻类。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，用液体培养基培养藻类，并且，相对于培养开始时的该液体培养基量1L，该液体培养基中的有机化合物的总使用量换算为碳原子的重量为2.5g以上。
5.含有藻酸的组合物的制备方法，其包括从根据权利要求1～4中任一项所述的方法得到的藻类的培养物中取得含有藻酸的组合物的步骤。
6.藻体干燥物，其为将根据权利要求5所述的制备方法得到的含有藻酸的组合物进行干燥而得，且每1kg中的藻酸含量为40g以上。
7.污泥减少剂，其含有根据权利要求5所述的制备方法得到的含有藻酸的组合物。
8.有害物质吸附剂，其含有根据权利要求5所述的制备方法得到的含有藻酸的组合物。
9.饲料，其含有根据权利要求5所述的制备方法得到的含有藻酸的组合物。
10.食品，其含有根据权利要求5所述的制备方法得到的含有藻酸的组合物。
11.药品，其含有根据权利要求5所述的制备方法得到的含有藻酸的组合物。
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