CN105440101B - 一种富含多酚荞麦浓缩蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种富含多酚荞麦浓缩蛋白的制备方法。该制备方法为：以苦荞皮层粉为原料，经过均质分散预处理；依次利用α‐淀粉酶以及糖化酶对苦荞皮层粉进行酶解；利用膜分离方法有效除去料液中的小分子杂质，冷冻干燥后获得富含多酚的荞麦浓缩蛋白。本发明产品的蛋白提取率57.93％、总多酚含量11.35％，均显著高于传统的碱溶酸沉法。本发明工艺流程简单可行、时间短，可应用于研制具有特殊功能(如降血脂、降血压等)的专用蛋白及相关制品。

Description

一种富含多酚荞麦浓缩蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白浓缩方法，特别是涉及一种富含多酚荞麦浓缩蛋白的制备方法，属于荞麦谷物深加工技术领域。

背景技术

荞麦(buckwheat)在分类上属于Polygonaceae属禾谷类谷物，在全世界广泛种植，尤其是北半球(如中国、俄罗斯)。由于荞麦，尤其是苦荞麦，富含高生物营养价值的蛋白质(8.51‐18.87％)、可食纤维(3‐15％)、丰富的多酚(1.97‐3.03％)以及优质的多聚不饱和脂肪酸等，近年作为独特的食药两用粮食在美国、加拿大，日本和欧洲备受欢迎。荞麦蛋白生理价值高，具有良好的氨基酸组成，尤其是富含其他植物蛋白缺乏的赖氨酸，生理作用甚至优于大豆蛋白。长期食用荞麦蛋白可增加体蛋白、抑制体脂肪蓄积、降血压、改善便秘、抗衰老、抑制结石形成，降低乳腺癌和结肠癌的发病率，并能降低慢性疾病的风险，这归因于它高含量的多酚化合物(如芦丁、槲皮素、阿魏酸等)与之结合存在。且由于其本身对蛋白酶降解作用的敏感性，荞麦蛋白还是天然的抗消化蛋白，类似于膳食纤维。可应用于功能性食品配料，可降低胆固醇，抑制脂肪蓄积，改善便秘，预防肿瘤发生以及改善肠道内短链脂肪酸的发酵过程等。由于荞麦中富含多酚，而多酚多与蛋白以结合态形式存在，因此通过提取富含多酚的荞麦浓缩蛋白，能够很大程度上增加荞麦蛋白的利用价值，带来较高的经济效益。

近年来，对荞麦的研究一直是一个热点问题，主要集中在蛋白或多酚成分的提取和理化性质研究等方面。其中，国外对荞麦蛋白的利用主要针对产品配料方面，改善食品的组织结构，增加营养保健价值。而荞麦蛋白的制备方法有多种，常用的有碱溶酸沉法、盐提法、蛋白酶酶解法等，其中碱溶酸沉法因其操作简单、成本低廉等优点在工业生产中应用最多。然而，传统的制备方法存在荞麦蛋白色泽深、纯度低、回收率低以及多酚含量低等缺点，未能使荞麦的功能性成分得以充分保留，这大大阻碍了荞麦蛋白产业的发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种荞麦蛋白色泽浅，纯度高，回收率高，富含多酚的荞麦浓缩蛋白的制备方法；该方法工艺简单，易实现工业化生产。

本发明利用淀粉酶及糖化酶水解荞麦淀粉，并结合超滤膜分离法，有效保留荞麦全蛋白组分，实现荞麦蛋白的充分利用；实现小分子功能性物质与大分子蛋白的结合提取，并提供富含多酚荞麦浓缩蛋白。

利用双酶酶解技术使荞麦中的淀粉与蛋白分离，该方法是通过从天然物质中除去杂质而有效保留目标组分的一种技术。相比其它分离方法，如碱溶酸沉法，盐提法，具有无毒、无害，环保、无污染，非热加工、不会氧化破坏提取物的活性，并且产能大，可工业化大规模生产等优点。淀粉酶和糖化酶共同酶解后采用膜分离技术截留蛋白，脱除分离单糖、离子等小分子物质。因此，将酶解技术和膜分离技术相结合应用于富含活性物质的蛋白提取和精制具有很好的应用前景。荞麦，其淀粉含量与禾谷类粮食含量相当，而蛋白则附着于淀粉表面并与淀粉紧密结合，传统的荞麦蛋白提取方法常采用碱溶酸沉手法使蛋白溶解并与淀粉分离，目前，利用双酶法酶解淀粉而提取荞麦蛋白的技术尚未报道。而本发明则针对荞麦高淀粉高蛋白含量的特点，创新性地将淀粉酶解技术应用于荞麦蛋白的制备当中，并采用淀粉酶与糖化酶结合使用的手段，大大增强了酶解效果，实现淀粉与蛋白的高效分离，蛋白回收率显著高于碱溶酸沉法，且生产过程更环保、无污染，所获得的荞麦浓缩蛋白具有良好的功能特性。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一种富含多酚的荞麦浓缩蛋白的制备方法，包括如下步骤：以苦荞皮层粉为原料，经过均质分散预处理；依次利用α‐淀粉酶以及糖化酶对苦荞皮层粉进行酶解；利用膜分离方法有效除去料液中的小分子杂质，冷冻干燥后获得富含多酚的荞麦浓缩蛋白。

为进一步实现本发明目的，优选地，所述均质分散预处理是以千克和升分别为质量与体积单位，将苦荞皮层粉与蒸馏水以料液质量体积比1:5‐1:30混合，均质处理5‐40min。

优选地，所述依次利用α‐淀粉酶以及糖化酶对苦荞皮层粉进行酶解是先调节均质分散预处理后混合物的pH值至5.5‐6.5，添加α‐淀粉酶，并放置于65‐75℃水浴搅拌酶解1‐5h；随后样液冷却至室温并调节pH值至4.0‐5.0，添加糖化酶，于55‐65℃水浴并搅拌酶解0.5‐3h，并于90‐130℃保温5‐15min灭酶处理。

优选地，所述的α‐淀粉酶为诺维信480Lα‐淀粉酶，添加相对于原料中淀粉质量含量的1‐8％。

优选地，所述的糖化酶为阿拉丁糖化酶，添加相对于原料中淀粉质量含量的1‐8‰。

优选地，所述利用膜分离方法有效除去料液中的小分子杂质是将料液冷却至室温后，采用10‐500KDa的聚砜膜进行超滤渗滤，截留液经冷冻干燥后，得富含多酚荞麦浓缩蛋白。

优选地，所述的超滤渗滤的流速为500‐2,000mL/min，渗滤体积为上样体积的1‐6倍。

优选地，所述的苦荞皮层粉为苦荞粒脱壳研磨得到的表层粉状物，其蛋白质量含量在8‐20％，总多酚质量含量在0.5‐5％。

优选地，所述的均质处理为高速剪切机分散或胶体磨均质。

本发明蛋白质回收率达到55‐75％，总酚质量含量为10‐15％，多酚回收率60‐80％，该富含多酚的荞麦浓缩蛋白产品呈淡黄色粉末状，并且该蛋白保留了荞麦的全蛋白组分。

上述富含多酚荞麦浓缩蛋白，根据多酚与蛋白紧密结合的原理，通过除杂的方法，把多酚与蛋白结合提取，既保留了优质的全组分蛋白质，又最大程度地截留了结合态的多酚。为蛋白多酚类结合物在食品、保健品、化妆品等领域的应用提供了参考。可在制备降低心脑血管、糖尿病、抗氧化清除自由基、抗菌消炎等疾病的风险性的食品、保健品和化妆品中应用。

本发明的有益效果在于：

1、本发明在利用酶法提取荞麦浓缩蛋白的机理主要是利用淀粉酶与糖化酶的双重作用使得大分子淀粉颗粒充分水解为小分子糖类。淀粉酶只能作用于α‐1,4‐糖苷键，能水解直链和支链淀粉，但是不能水解直链淀粉分支处的α‐1,6‐糖苷键，而糖化酶能进一步彻底的将淀粉酶酶解的寡糖水解成葡糖糖单糖，因此二者的协同作用使反应加速进行并大大增进了淀粉酶解的效率，从而使得原本与淀粉颗粒紧密结合的蛋白质分子得到更彻底的暴露，并通过超滤渗滤技术，使得大分子蛋白与结合态多酚截留下来。不同于单纯的提取方法，该法获得的荞麦浓缩蛋白保留了全蛋白组分，且多酚含量显著高于传统的碱溶酸沉法、盐提法。

2、本发明涉及一种双酶结合膜分离的方法制备荞麦浓缩蛋白，其操作过程和设备简单，安全无毒，制备过程对环境友好，易于实现工业化大批量生产，能够有效提荞麦蛋白的附加值，以此推进荞麦生产和深加工，开发新型功能性食品配料，形成新的经济增长点。

3、本发明制备的荞麦浓缩蛋白，抗消化性好，富含多酚，生理活性强，营养价值丰富。作为植物蛋白，与动物蛋白相比，不存在受病毒污染等安全问题，可用于研制具有特殊功能(如降胆固醇、改善肠道菌群等)的专用蛋白及相关制品。

附图说明

图1为实施例1以及对比例荞麦浓缩蛋白SDS‐PAGE电泳图谱；

图2为实施例1以及对比例荞麦浓缩蛋白的多酚质量含量测定；

图3为实施例2C18反相高效液相色谱分析得出的富含多酚荞麦浓缩蛋白的多酚色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的保护范围。

以下各实施例中，蛋白质回收率、蛋白质纯度、多酚质量含量及多酚回收率的测定方法如下：

采用杜马斯定氮法测定样品中蛋白含量(×5.83)。根据所得蛋白提取物的质量及蛋白质纯度、原料的质量及蛋白质纯度，可得蛋白提取物的蛋白质回收率，即：蛋白回收率(％)＝(蛋白提取物质量×蛋白提取物蛋白质含量)/(原料质量×原料蛋白质含量)×100％。

多酚质量含量测定方法：适量样品溶于0.1M NaOH碱液中，10,000r/min离心15min，取两份上清液：一份上清液于紫外波长328nm处检测，测定总酚吸光度A₁；另一份加入等体积10％质量分数的三氯乙酸(TCA)，沉淀蛋白质，10,000r/min离心15min，上清液于328nm处测定游离多酚吸光度A₂；并以芦丁标品为参照品做标准曲线。结合酚质量含量＝总酚质量含量‐游离酚质量含量。

多酚回收率(％)＝(蛋白提取物质量×蛋白提取物多酚含量)/(原料质量×原料多酚含量)×100％。

实施例1

取40g苦荞皮层粉与蒸馏水以料液比1:15(w/v，质量单位为kg，体积单位为L)混合，分散机6,000r/min处理10min后用2mol/L HCl溶液调节pH至6.0，添加相对于原料中淀粉质量含量的5％480Lα‐淀粉酶，并放置于70℃水浴搅拌(300r/min)酶解3h；随后样液冷却至室温并用2mol/L HCl溶液调节pH至4.0，添加相对于原料中淀粉质量含量的5‰糖化酶，于60℃水浴并搅拌(300r/min)酶解1h，并于100℃保温5min灭酶处理；冷却至室温后采用80KDa的聚砜膜进行超滤渗滤，控制流速为1,500mL/min，渗滤体积为上样体积4倍，滤液经冷冻干燥得富含多酚荞麦浓缩蛋白。

该实施例的蛋白质回收率为57.93％，总酚质量含量为11.35％，其中结合酚质量含量为6.64％，多酚回收率70.89％。该蛋白样品呈淡黄色粉末状。

对比例1

取40g苦荞皮层粉1:20(w/v，质量单位为kg，体积单位为L)充分分散于蒸馏中，用2mol/L NaOH溶液调节pH值至8.0，磁力搅拌90min，8,500r/min离心20min，取上清液，用2mol/L HCl溶液调节pH值至4.6，随后8,500r/min离心20min，得到蛋白沉淀物；二次水洗沉淀物，用2mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0复溶，经透析、冷冻干燥后得到碱溶酸沉荞麦蛋白。

该对比例的蛋白质回收率为33.35％，总酚质量含量为3.65％，其中结合酚质量含量为2.83％，多酚回收率8.57％。该蛋白样品呈淡褐色粉末状。

对比例2

40g苦荞皮层粉与含0.033M NaHCO₃的0.086M NaCl盐溶液以料液比1:10(w/v，质量单位为kg，体积单位为L)混合，室温搅拌过夜，之后胶体磨4,000r/min均质分散处理15min，液料10,000r/min离心30min，取上清液经透析、冷冻干燥，即得盐提荞麦蛋白。

该对比例的蛋白质回收率为38.40％，总酚质量含量为2.67％，其中结合酚质量含量为2.06％，多酚回收率7.99％。该蛋白样品色泽乳白略带紫色。

对原料、实施例1以及对比例1、2的荞麦浓缩蛋白进行SDS‐PAGE分析，凝胶电泳采用Laemmli系统，在不连续缓冲系统上进行SDS‐PAGE电泳分析，分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％。取适量样品，添加电泳缓冲液配置成4mg/mL溶液，沸水煮3min，上样量为2.5μL；测定结果如附图1所示，实施例1的蛋白与原料的分子量分布基本一致，其蛋白质分子量主要集中在36kDa以及26kDa附近，而对比例1和对比例2制备的蛋白缺少60kDa以上的条带。说明实施例1的制备方法可以实现原料蛋白的全组分保留。

测定原料、实施例1以及对比例1、2的荞麦浓缩蛋白总多酚、游离多酚和结合多酚的质量含量，结果如附图2所示，实施例1得到荞麦浓缩蛋白多酚质量含量显著(p<0.05)高于对比例1、2，说明本发明的工艺有效地提高荞麦浓缩蛋白的多酚含量，可用于制备富含多酚的荞麦浓缩蛋白。实施例1的反应条件不仅较为温和，且采用去除法酶解脱除淀粉成分而保留下蛋白，相比于对比例能更有效地保护蛋白质原有成分和的性质。此外，荞麦中大部分多酚与蛋白质以结合形式存在，更有利于去除法制备高多酚含量的蛋白产品，因此实施例得到的蛋白质组分齐全，蛋白质回收率高，且高效保留了多酚成分，制备得到富含多酚的荞麦浓缩蛋白。

实施例2

取500g苦荞皮层粉与蒸馏水以料液比1:30(w/v，质量单位为kg，体积单位为L)混合，胶体磨4,000r/min处理40min后用2mol/L NaOH溶液调节pH至6.0，添加相对于原料中淀粉质量含量的8％480Lα‐淀粉酶，并放置于70℃水浴搅拌(300r/min)酶解5h；随后样液冷却至室温并用2mol/L HCl溶液调节pH至4.0，添加相对于原料中淀粉质量含量的5‰糖化酶，于60℃水浴并搅拌(300r/min)酶解3h，并于100℃保温5min灭酶处理；冷却至室温后采用100KDa的聚砜膜进行超滤渗滤，流速为2,000mL/min，渗滤体积为上样体积6倍，滤液经冷冻干燥得富含多酚荞麦浓缩蛋白。

该实施例的蛋白质回收率为58.59％，总酚质量含量为10.95％，多酚回收率64.31％。该蛋白样品呈淡黄色粉末状。样品采用70％甲醇超声水浴提取，并经过0.45μm滤膜后，C18高效液相色谱检测，色谱图见附图3。图中的1表示芦丁对应的吸光强度，2表示槲皮素对应的吸光强度。由该色谱可知，从苦荞麦皮层粉制备得到的荞麦浓缩蛋白中主要含有槲皮素、芦丁两种多酚，其中槲皮素含量比较丰富。

实施例3

取500g苦荞皮层粉与蒸馏水以料液比1:5(w/v，质量单位为kg，体积单位为L)混合，胶体磨8,000r/min处理5min后用2mol/L NaOH溶液调节pH至6.0，添加相对于原料中淀粉质量含量的1％480Lα‐淀粉酶，并放置于70℃水浴搅拌(300r/min)酶解1h；随后样液冷却至室温并用2mol/L HCl溶液调节pH至4.0，添加相对于原料中淀粉质量含量的1‰糖化酶，于60℃水浴并搅拌(300r/min)酶解5h，并于100℃保温5min灭酶处理；冷却至室温后采用10KDa的聚砜膜进行超滤渗滤，流速为500mL/min，渗滤体积为上样体积1倍，滤液经冷冻干燥得富含多酚荞麦浓缩蛋白。

该实施例的蛋白质回收率为62.32％，总酚质量含量为11.11％，多酚回收率71.34％。该蛋白样品呈淡黄色粉末状。

实施例仅仅为进一步说明本发明，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种富含多酚的荞麦浓缩蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：以苦荞皮层粉为原料，经过均质分散预处理；依次利用α‐淀粉酶以及糖化酶对苦荞皮层粉进行酶解；利用膜分离方法有效除去料液中的小分子杂质，冷冻干燥后获得富含多酚的荞麦浓缩蛋白；

所述依次利用α‐淀粉酶以及糖化酶对苦荞皮层粉进行酶解是先调节均质分散预处理后混合物的pH值至5.5‐6.5，添加α‐淀粉酶，并放置于65‐75℃水浴搅拌酶解1‐5h；随后样液冷却至室温并调节pH值至4.0‐5.0，添加糖化酶，于55‐65℃水浴并搅拌酶解0.5‐3h，并于90‐130℃保温5‐15min灭酶处理；

所述的α‐淀粉酶为诺维信480Lα‐淀粉酶，添加相对于原料中淀粉质量含量的1‐8％；所述的糖化酶为阿拉丁糖化酶，添加相对于原料中淀粉质量含量的1‐8‰。

2.根据权利要求1中所述的富含多酚荞麦浓缩蛋白的制备方法，其特征在于，所述均质分散预处理是以千克和升分别为质量与体积单位，将苦荞皮层粉与蒸馏水以料液质量体积比1:5‐1:30混合，均质处理5‐40min。

3.根据权利要求1所述富含多酚荞麦浓缩蛋白的制备方法，其特征是：所述利用膜分离方法有效除去料液中的小分子杂质是将料液冷却至室温后，采用10‐500KDa的聚砜膜进行超滤渗滤，截留液经冷冻干燥后，得富含多酚荞麦浓缩蛋白。

4.根据权利要求3所述富含多酚荞麦浓缩蛋白的制备方法，其特征是：所述的超滤渗滤的流速为500‐2,000mL/min，渗滤体积为上样体积的1‐6倍。

5.根据权利要求1所述富含多酚荞麦浓缩蛋白的制备方法，其特征是：所述的苦荞皮层粉为苦荞粒脱壳研磨得到的表层粉状物，其蛋白质量含量在8‐20％，总多酚质量含量在0.5‐5％。

6.根据权利要求1所述富含多酚荞麦浓缩蛋白的制备方法，其特征是：所述的均质处理为高速剪切机分散或胶体磨均质。