CN101865855B - 药品、保健食品中掺杂硝西泮的快速测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种药品、保健食品中掺杂硝西泮的快速测定方法。该方法由以下步骤组成：(1)将药品和保健食品中的硝西泮水解；(2)加入重氮化试剂；(3)中和干扰物质；(4)加入检测剂。本发明检验方法快速、简便，专属性强、准确率高，反应灵敏，适用范围广，适用于现场检验药品、保健食品是否掺入了硝西泮。根据本发明制成硝西泮快速检验试剂盒，将能满足广大农村地区和检验技术条件落后的中小城市开展药品、保健食品监督检验的需要。

Description

药品、保健食品中掺杂硝西泮的快速测定方法

技术领域

本发明涉及一种硝西泮成分的检测方法，具体是检测药品和保健食品中，尤其是用于检测镇静安神类中药制剂和养心安神功能保健食品中是否添加硝西泮成分的方法。

背景技术

硝西泮是苯二氮杂卓类镇静催眠药，化学名称为1，3-二氢-7-硝基-5-苯基-2H-1，4-苯并二氮卓-2-酮。主要治疗失眠以及抗惊厥、婴儿痉挛、肌阵挛癫痫。临床药理学研究表明，此药物在镇静、催眠方面的药效优于巴比妥类及其它类镇静、催眠药，药物过量一般不致引起生命危险，因此硝西泮临床应用广泛。

硝西泮为中枢神经抑制药，可引起中枢神经系统不同部位的抑制，作用机制与其选择性作用于大脑边缘系统的杏仁核、海马等苯二氮卓受体，促进γ-氨基丁酸抑制性神经递质的释放，从而引起突触前和突触后的抑制作用有关，具有镇静、催眠、抗焦虑作用。但是长期使用可产生耐受性和依赖性，常见嗜睡、运动失调、头痛，甚至皮疹、白细胞减少、肝损伤、骨髓移植等不良反应。

作为中枢神经抑制药物，硝西泮属于处方药，患者必须在医生的指导下方能使用，国家药监部门对其生产、经营及使用进行了严格的规定。但是，一些不法分子利用硝西泮药物的镇静、催眠、抗焦虑的良好作用和中成药、保健食品成分复杂、毒副作用小的特点，在镇静催眠类中药制剂和保健食品中擅自添加硝西泮化学成分，夸大宣传功效，抬高价格；有人甚至把它作为动物饲料添加剂，使动物嗜睡少动而生长加快，动物体内蓄积的药物通过食物链进入人体，给人民群众的身体健康造成了严重危害。特别在广大的农村和经济欠发达的中小城市，由于这些地区缺乏必要的检验仪器，加上技术监管能力薄弱，给了不法分子更多的造假和添加之机，导致大量假药劣药出现，造成了中药制剂和保健食品市场的混乱。

检验镇静安神类中药制剂、保健食品中是否添加硝西泮成分的现有方法主要有以下四种：

1、薄层色谱法

样品中的待测成分经过甲醇提取，所得的供试品溶液与对照品溶液点在硅胶薄层板上，用展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯254nm下检视。在展开剂的作用下，由于不同物质的迁移速度不同，不同物质在薄层色谱板的不同位置以斑点的形式出现，根据待测样品是否在与对照品相应的位置上出现斑点这一实验所得的现象来判断待测样品是否含有目标成分。如果供试品溶液薄层色谱图与硝西泮对照品相应的位置上出现斑点，则提示样品中可能含有硝西泮成分。

薄层色谱法的优点是不需要昂贵的分析仪器。该法缺点是：(1)色谱分辨率较低，中药制剂成分复杂，干扰因素多，易将某些共存成分误判为硝西泮成分，某些共存成分如果量较大且色谱迁移值与待测成分接近，则会干扰目标成分的检出。(2)色谱展开和晾干的时间长，不足以满足快速测定的要求。(3)薄层色谱板需要烘干并干燥存放，环境温度和湿度对分离效果的影响较大。(4)需要有固定的场所，不适合作流动性大的现场检测。(5)要求实验人员有较好的经验。

2、高效液相色谱法

高效液相色谱法是常用的现代分析方法，在相同的色谱条件下，不同的物质有不同的色谱保留时间。在相同的色谱条件下硝西泮对照品溶液与样品提取所得供试品溶液分别进样，根据色谱峰保留时间可判断待测样品是否含有硝西泮成分。

高效液相色谱法的优点是色谱分离效率高、灵敏度高。缺点是：(1)仪器价格昂贵，样品前处理时间长，色谱柱易受污染，分析成本高；(2)当共存的色谱峰保留时间与硝西泮色谱峰保留时间接近时容易做出错误的判断；(3)仪器对使用环境的要求高，需要固定放置，不适合流动性大的现场检测。

3、高效液相色谱-质谱联用法

以高效液相色谱仪作为分离器、质谱仪作为分析器的高效液相色谱-质谱联用法适合于成分复杂、背景干扰严重的样品分析，这种分析方法可提高检测结果的可靠性。

高效液相色谱-质谱联用法是一种分析成本比高效液相色谱更高、操作更加复杂的分析方法。仪器对使用环境的要求更高，需要固定放置，不适合做流动性大的现场检测。这些检验只能在少数实验室中进行，不易推广使用。

4、免疫层析色谱检测法

硝西泮胶体金检测试纸是由样品垫、结合释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和塑料底板组成。其检测原理是利用样品垫形成的毛细管虹吸效应，使被测物质首先与胶体金标记的硝西泮多抗发生竞争形式的结合，当胶体金标记的抗硝西泮多抗过量时，多余的多抗漂移到检测线，与硝西泮偶联抗原结合而显色。

免疫层析色谱检测法的试纸制备过程耗时至少3个小时，且需要专业人员制备硝西泮偶联多抗和抗硝西泮多抗，并且商品化的胶体金试纸造价不菲，实际推广应用存在很大难度。

目前药品和保健食品行业尚无利用理化反应快速筛查硝西泮的方法发布，对于药店和基层药检单位，开发中成药和保健食品中擅自添加硝西泮的快速筛查方法，在监管现场对样品进行快速分析，为药品监管及时提供证据，打击不法分子的造假行为和保障人民群众的用药安全是非常必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种克服现有检测技术的缺陷，分析成本低、不需要使用贵重分析仪器、专属性强、灵敏度高、适用于现场检验药品和保健食品中是否添加硝西泮的快速检验方法。

本发明的另一目的在于提供上述方法在制备硝西泮快速试验试剂盒的应用。

本发明的另一目的在于提供上述方法在检验药品、保健食品中是否添加硝西泮的筛查检验中的应用。

本发明药品、保健食品中掺杂硝西泮的快速测定方法，依次由以下步骤组成：

(1)将药品和保健食品中的硝西泮水解；

(2)加入重氮化试剂；

(3)中和干扰物质；

(4)加入检测剂。

硝西泮化学名称为1，3-二氢-7-硝基-5-苯基-2H-1，4-苯并二氮卓-2-酮，属于苯二氮杂卓类镇静催眠药。当加入盐酸溶液时，硝西泮在盐酸溶液中水解成具有芳伯胺结构的化合物：

重氮化试剂选用亚硝酸钠，向水解产物中加入亚硝酸钠溶液，使芳伯胺结构的化合物与亚硝酸进行重氮化反应，生成重氮化产物。

滴加脲，中和过量的亚硝酸，否则多余的亚硝酸会硝化显色剂碱性β-萘酚，生成1-硝基-2-萘酚，使溶液变成猩红色而干扰偶合化显色反应的观察。

滴加碱性β-萘酚试液，与重氮化产物发生偶合化显色反应，生成红色沉淀。

具体的技术方案如下：

1、取固态的药品或保健食品，研细或剪碎，加入2～4ml质量分数为15％～25％的盐酸溶液，涡旋3～5min，使之分散，作为供试液；或量取液态的药品或保健食品，加入2～4ml质量分数为25％～38％的盐酸溶液，涡旋3～5min，使之分散，作为供试液。涡旋操作可在涡旋仪中进行，涡旋操作也可用超声或振摇替代。

针对目前市场上的大多数药品或保健食品，推荐取样量如下：

剂型	取样量
		胶囊	1粒内容物
片剂	1片
		蜜丸	1/2丸
颗粒剂	1/2包
		口服液	1/2支

2、往供试液中滴入摩尔浓度为0.05～0.2mol/L的亚硝酸钠溶液0.1～0.3ml(2～6滴)，涡旋、超声或振摇1～3min。

3、往供试液中滴加摩尔浓度为0.1～0.3mol/L脲0.5～1.5ml，涡旋、超声或振摇2～4min。反应后的供试液也可进一步过滤处理，取滤液进行显色反应。对于胶囊剂、蜜丸、颗粒剂等剂型，过滤处理可减少对显色反应的干扰；对于片剂和口服液等剂型，可不经过滤，直接进行下一步骤的显色反应。

4、向供试液中滴加0.25～0.5ml(5～10滴)碱性β-萘酚试液，如果溶液逐渐出现红色絮状沉淀(有红色不溶物析出)，则可判断样品含有硝西泮；如果静置3min后仍未见到红色不溶物析出，则可判断样品不含有硝西泮。

碱性β-萘酚试液的配制：取β-萘酚0.25g，加入NaOH溶液(1→10)10ml使之溶解，即得。应注意避光保存。

根据本发明，可以制成硝西泮快速检验试剂盒。

根据本发明，可以应用于药品、保健食品是否掺入硝西泮的筛选检验中。

同现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)快速、简便：整个操作过程包括盐酸水解3分钟、重氮化反应1分钟、中和亚硝酸2分钟、然后加入显色剂，整个操作过程在6分钟完成。相比于液相色谱、液质联用方法(至少2-3个小时)简便快捷得多，并且无需对照品。

(2)专属性强、准确率高：根据方法验证结果，片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服剂等剂型的常用辅料对硝西泮物质的检出均无干扰。

(3)反应灵敏：本实验待检物质的最低检出限达到临床最低有效剂量的五十分之一，因此用该方法检查药品、保健食品中是否添加硝西泮成分具有足够的灵敏度。

(4)适用范围广：该方法可以用于液体样品和固体样品，无论是中药制剂、保健食品均可使用本方法。

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1

天行健晚安胶囊(胶囊剂，标示服用量为每次2粒，高效液相色谱-质谱法检测结果本品每粒含硝西泮0.567mg)

取一粒量内容物，置于10ml样品管中，加入盐酸溶液3ml，涡旋3分钟；向盐酸溶液中滴加0.1mol/L的亚硝酸钠溶液5滴，涡旋1分钟；滴加0.2mol/L脲1ml涡旋2分钟；滴加碱性β-萘酚试液5滴，溶液在3min内逐渐出现红色絮状沉淀，由此可判断样品中含有非法添加硝西泮成分。

实施例2

脑力宝丸(丸剂，标示服用量为每次4丸，每丸(素丸)重约0.2g，高效液相色谱-质谱法检测结果本品不含硝西泮成分，模拟添加硝西泮对照品0.25mg)

取脑力宝丸5丸，约1.0g，添加硝西泮对照品0.25mg，置于10ml样品管中，加入盐酸溶液2ml，涡旋5分钟；向盐酸溶液中滴加0.05mol/L的亚硝酸钠溶液6滴，涡旋2分钟；滴加0.1mol/L脲1.5ml涡旋4分钟；滴加碱性β-萘酚试液5滴，溶液在3min内逐渐出现红色絮状沉淀，由此可判断样品中含有非法添加硝西泮成分。

实施例3

安神补脑液(口服液，标示服用量为每次10ml，高效液相色谱-质谱法检测结果本品不含硝西泮成分，模拟添加硝西泮对照品0.20mg)

取安神补脑液5ml，添加硝西泮对照品0.20mg，置于10ml样品管中，加入盐酸溶液4ml，涡旋4分钟；向盐酸溶液中滴加0.2mol/L的亚硝酸钠溶液2滴，涡旋1分钟；滴加0.3mol/L脲0.5ml涡旋3分钟；滴加碱性β-萘酚试液5滴，溶液在3min内逐渐出现红色絮状沉淀，由此可判断样品中含有非法添加硝西泮成分。

实施例4

养血安神片(片剂，标示服用量为每次2片，高效液相色谱-质谱法检测结果本品不含硝西泮成分，模拟添加硝西泮对照品0.15mg)

取养血安神片1片，添加硝西泮对照品0.15mg，置于10ml样品管中，加入盐酸溶液3ml，涡旋4分钟；向盐酸溶液中滴加0.1mol/L的亚硝酸钠溶液5滴，涡旋1分钟；滴加0.2mol/L脲1ml涡旋2分钟；滴加碱性β-萘酚试液5滴，溶液在3min内逐渐出现红色絮状沉淀，由此可判断样品中含有非法添加硝西泮成分。

实施例5

睡吧褪黑素片(片剂，标示服用量为每次2片，高效液相色谱-质谱法检测结果本品不含硝西泮成分，作为阴性对照试验用)

取睡吧褪黑素片1片，置于10ml样品管中，加入盐酸溶液3ml，涡旋3分钟；向盐酸溶液中滴加0.1mol/L的亚硝酸钠溶液5滴，涡旋1分钟；滴加0.2mol/L脲1ml涡旋2分钟；滴加碱性β-萘酚试液5滴，溶液颜色无变化，由此可判断样品中未添加硝西泮成分。

实施例6

复方枣仁胶囊(胶囊剂，标示服用量为每次2粒，高效液相色谱-质谱法检测结果本品不含硝西泮成分，作为阴性对照试验用)

取复方枣仁胶囊1粒，置于10ml样品管中，加入盐酸溶液3ml，涡旋3分钟；向盐酸溶液中滴加0.1mol/L的亚硝酸钠溶液5滴，涡旋1分钟；滴加0.2mol/L脲1ml涡旋2分钟；滴加碱性β-萘酚试液5滴，溶液颜色无变化，由此可判断样品中未添加硝西泮成分。

实施例7

脑心舒口服液(口服液，标示服用量为每次10ml，高效液相色谱-质谱法检测结果本品不含硝西泮成分，作为阴性对照试验用)

取脑心舒口服液5ml，置于10ml样品管中，加入盐酸溶液3ml，涡旋3分钟；向盐酸溶液中滴加0.1mol/L的亚硝酸钠溶液5滴，涡旋1分钟；滴加0.2mol/L脲1ml涡旋2分钟；滴加碱性β-萘酚试液5滴，溶液颜色无变化，由此可判断样品中未添加硝西泮成分。

实施例8

解郁安神颗粒(颗粒剂，标示服用量为每次5g，高效液相色谱-质谱法检测结果本品不含硝西泮成分，作为阴性对照试验用)

取解郁安神颗粒2.5g，置于10ml样品管中，加入盐酸溶液3ml，涡旋3分钟；向盐酸溶液中滴加0.1mol/L的亚硝酸钠溶液5滴，涡旋1分钟；滴加0.2mol/L脲1ml涡旋2分钟；滴加碱性β-萘酚试液5滴，溶液颜色无变化，由此可判断样品中未添加硝西泮成分。

Claims (4)

1.一种药品、保健食品中掺杂硝西泮的快速测定方法，依次由以下步骤组成：

(1)将药品和保健食品中的硝西泮用盐酸溶液水解；

(2)加入重氮化试剂，所述重氮化试剂为0.05～0.2mol/L的亚硝酸钠溶液；

(3)用0.1～0.3mol/L的脲中和干扰物质；

(4)加入检测剂，所述检测剂为碱性β-萘酚试液。

2.如权利要求1所述的测定方法，依次由以下步骤组成：

(1)取药品或保健食品，加入盐酸溶液，涡旋，使硝西泮水解，作为供试液；

(2)往供试液中滴入0.05～0.2mol/L的亚硝酸钠溶液，涡旋；

(3)滴加0.1～0.3mol/L的脲，涡旋，中和干扰物质；

(4)滴入碱性β-萘酚试液。

3.权利要求1所述的测定方法在制备硝西泮快速检验试剂盒中的应用。

4.权利要求1所述的测定方法在药品和保健食品是否掺入硝西泮的筛选检验中的应用。