CN101820950B - 作为刺猬蛋白信号通路调节剂的联苯基甲酰胺类化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了调节刺猬蛋白信号通路活性的方法。特别的是，本发明提供了抑制由表型例如Ptc功能丧失、刺猬蛋白功能获得、smoothened功能获得或Gli功能获得所导致的异常生长状态的方法，所述方法包括使细胞与足量的式I化合物接触。

Description

作为刺猬蛋白信号通路调节剂的联苯基甲酰胺类化合物
相关申请的交叉参考
本申请要求于2007年6月7日提交的美国临时专利申请号60/942,654的优先权的权益。该申请的全部公开内容全文引用并为了全部目的并入本文作为参考。
技术领域
本发明提供了调节刺猬蛋白信号通路活性的方法。特别的是，本发明提供了抑制由表型Ptc功能丧失、刺猬蛋白功能(hedgehog)获得、smoothened功能获得、Gli功能获得或刺猬蛋白配体过度表达所导致的异常生长状态的方法，所述方法包括使细胞与足量的式I化合物接触。
背景技术
在胚胎发育中，刺猬蛋白信号通路对于多种过程而言是至关重要的，例如细胞增生、分化和组织排列的控制。然而，刺猬蛋白信号通路的异常活性(例如由于激活增加而导致的)可能产生病理学后果。因此，成人组织中刺猬蛋白信号通路的激活可能导致疾病，例如银屑病和特定类型的癌症，包括但不限于恶性淋巴瘤(LM)、多发性骨髓瘤(MM)、脑癌、肌肉和皮肤癌、前列腺癌、髓母细胞瘤、胰腺癌和小细胞肺癌。刺猬蛋白信号通路的活化增强导致多种疾病的病理学和/或征候学。因此，能够调节刺猬蛋白信号通路活性的分子可以用作治疗此类疾病的治疗药物。
发明内容
第一方面，本发明提供了诱导淋巴瘤或骨髓瘤细胞凋亡的方法。这些方法包括使得细胞与能够抑制刺猬蛋白信号通路的成分接触。某些方法涉及诱导个体中存在的肿瘤细胞凋亡。某些方法涉及诱导不能表达Gli3的淋巴瘤或骨髓瘤细胞凋亡。某些方法采用式I化合物特异性地抑制刺猬蛋白信号通路：
其中：
Y1和Y2独立选自N和CR10；其中R10选自氢、卤素、C1-6烷基、卤素取代的-C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的-C1-6烷氧基和-OXNR10aR10b；其中R10a和R10b独立选自氢和C1-6烷基；
R1选自氰基、卤素、C1-6烷基、卤素取代的-C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的-C1-6烷氧基、C6-10芳基、二甲基-氨基、C1-6烷基-硫烷基和任选被至多2个C1-6烷基取代的C3-8杂环烷基；
R2和R5独立选自氢、氰基、卤素、C1-6烷基、卤素取代的-C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的-C1-6烷氧基和二甲基氨基；
R3和R4独立选自氢、卤素、氰基、C1-6烷基、卤素取代的-C1-6烷基、C1-6烷氧基和卤素取代的-C1-6烷氧基；或者R1和R2或R1和R5与它们所连接的苯基一起形成C5-10杂芳基；
R6和R7独立选自氢、C1-6烷基、卤素取代的-C1-6烷基、C1-6烷氧基和卤素取代的-C1-6烷氧基；前提是R6和R7不同时为氢；
R8选自氢、卤素、C1-6烷基、卤素取代的-C1-6烷基、C1-6烷氧基和卤素取代的-C1-6烷氧基；
R9选自-S(O)2R11、-C(O)R11、-OR11、-NR12aR12b和-R11；其中R11选自芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基；R12a和R12b独立选自C1-6烷基和羟基-取代的-C1-6烷基；
其中所述R9的芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基可任选被1-3个独立选自下列的基团所取代：C1-6烷基、卤素取代的-C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的-C1-6烷氧基、C6-10芳基-C0-4烷基、C5-10杂芳基-C0-4烷基、C3-12环烷基和C3-8杂环烷基；
其中所述R9的芳基-烷基取代基任选被1-3个独立选自下列的基团所取代：卤素、C1-6烷基、卤素取代的-C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素取代的-C1-6烷氧基和甲基-哌嗪基；包括所述化合物的N-氧化物衍生物、前药衍生物、被保护的衍生物、单一异构体及其异构体混合物和此类化合物的可药用盐和溶剂化物(例如水合物)。本发明化合物也包括此类化合物的所有适当的同位素变体及其可药用的盐、溶剂化物、N-氧化物、前药和异构体，还包括药用组合物。本发明化合物的同位素变体或其可药用盐是指其中至少一个原子被具有相同原子序数但是原子质量与自然界中通常存在的原子质量不同的原子所代替。可以在本发明化合物及其可药用盐中使用的同位素的实例包括但不限于氢、碳、氮和氧的同位素，例如2H、3H、11C、13C、14C、15N、17O、18O、35S、18F、36Cl和123I。本发明化合物及其可药用盐的某些同位素变体，例如那些其中采用放射性同位素例如3H或14C的变体，可以用于药物和/或底物组织分布研究。在特别的实例中，3H和14C同位素可以用于使得其制备和检测更容易。在其它实例中，由于代谢稳定性更好，所以采用同位素例如2H的取代可以提供某些治疗优势，例如增加体内半衰期或者减少需要的剂量。本文中提供的化合物的同位素变体及其可药用的盐、溶剂化物、N-氧化物、前药和异构体以及药用组合物可以通过常规方法采用适当试剂的适当同位素变体加以制备。
第二方面，本发明提供了药用组合物，它包含式I化合物或其N-氧化物衍生物、单一异构体及其异构体混合物或其药学上可接受的盐，还包含一或多种适当的赋形剂。
第三方面，本发明提供了在个体中治疗或改善银屑病、淋巴瘤或骨髓瘤的方法，其中刺猬蛋白通路活性的调节可以预防、抑制或改善银屑病、淋巴瘤或骨髓瘤的病理学和/或征候学，所述方法包括给予动物治疗有效量的式I化合物或其N-氧化物衍生物、单一异构体及其异构体混合物或其药学上可接受的盐。
第四方面，本发明提供了式I化合物在生产用于在动物中治疗银屑病、淋巴瘤或骨髓瘤的药物中的用途，其中刺猬蛋白通路活性导致了疾病的病理学和/或征候学。
第五方面，本发明提供了制备式I化合物及其N-氧化物衍生物、前药衍生物、被保护的衍生物、单一异构体及其异构体混合物和其药学上可接受的盐的方法。
定义
除非另外说明，本文中所使用的所有的技术和科学术语具有与本发明相关领域技术人员通常所理解的相同意义。下列参考文献为技术人员提供了本发明中所使用的多种术语的通用定义：《牛津生物化学和分子生物学词典(Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology)》，Smith等(编辑)，牛津大学出版社(Oxford University Press)(修订于2000)；《微生物学和分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)》，Singleton等(编辑)，John Wiley & Sons(第三版，2002)；《生物学词典(A Dictionary ofBiology)》(Oxford Paperback Reference)，Martin和Hine(编辑)，牛津大学出版社(Oxford University Press)(第四版，2000)。另外，下列定义有助于读者实施本发明。
术语“成分”或“实验成分”包括任何物质、分子、元素、化合物、实体或其组合。它包括但不限于例如蛋白质、多肽、小有机分子、多糖、多聚核苷酸等。它可以是天然产物、合成的化合物或化学化合物或两种或多种物质的组合。除非另外说明，术语“成分”、“物质”和“化合物”可以彼此交换使用。
作为基团和作为其它基团(例如卤素-取代的-烷基和烷氧基)结构元素的“烷基”可以是直链或支链的。C1-4-烷氧基包括甲氧基、乙氧基等。卤素-取代的烷基包括三氟甲基、五氟乙基等。
“芳基”是指含有6-10个环碳原子的单环或稠合双环芳族环基团。例如，芳基可以是苯基或萘基，优选苯基。“亚芳基“是指衍生自芳基的二价基团。
本文中使用的“癌症”包括实体哺乳动物肿瘤以及血液系统恶性肿瘤。“实体哺乳动物肿瘤”包括头颈癌、肺癌、间皮瘤、纵膈癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆系统癌、小肠癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、肛门癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、妇产科器官癌、卵巢癌、乳癌、内分泌系统癌、皮肤癌、中枢神经系统癌(包括脑癌)、软组织和骨癌、皮肤和眼内来源的黑素瘤。“血液系统恶性肿瘤”包括儿童白血病和淋巴瘤、霍奇金病、淋巴细胞和皮肤来源的淋巴瘤、急性和慢性白血病、浆细胞瘤和与AIDS有关的癌症。另外，可以治疗处于任何发展阶段(例如原发期、转移期和复发期)的癌症。关于各类癌症的信息可以参见例如AmericanCancer Society，或者参见例如Wilson等(1991)Harrison’s Principles ofInternal Medicine，第12版，McGraw-Hill，Inc。应当可以用于人类和兽类。可以通过本发明化合物和方法治疗而加以处理的癌症包括但不限于神经胶质瘤、髓母细胞瘤、原发性外胚层肿瘤(PNETS)、基底细胞癌(BCC)、小细胞肺癌、大细胞肺癌、胃肠道肿瘤、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、胰腺肿瘤、膀胱肿瘤和前列腺肿瘤。本文中使用的术语“恶性高增生性疾病”包括但不限于癌症、神经增生性疾病、骨髓增生性疾病和白血病。本文中使用的术语“非恶性高增生性疾病”包括但不限于非恶性和非瘤性增生性疾病，例如血管壁中平滑肌增生、皮肤疤痕形成和肺纤维化。
本文中所使用的“接触”具有其正常意义，是指使得两种或多种分子(例如小分子有机化合物和多肽)的混合，或者使得分子和细胞(例如化合物和细胞)的混合。接触可以在体外进行，例如，在试管或其它容器中使得两种或多种成分混合，或者使得化合物与细胞或细胞溶解产物混合。接触也可以在细胞内或在位进行，例如，通过在编码两种多肽的重组多聚核苷酸的细胞中共同表达，使得两种多肽在细胞中混合，或者在细胞裂解产物中混合。
“环烷基”是指含有指定数目环原子的饱和的或部分不饱和的单环、稠合双环或桥联的多元环基团。例如，C3-10环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
本文中使用的“与刺猬蛋白相关的疾病”包括与刺猬蛋白通路的破坏或异常相关的疾病以及与刺猬蛋白通路的激活有关的正常但不受欢迎的生长状态相关的疾病。“与刺猬蛋白相关的疾病”包括但不限于肿瘤形成、癌症、肿瘤、恶性高增生性疾病和非恶性增生性疾病。“与刺猬蛋白相关的疾病”也包括良性前列腺增生、银屑病、湿性黄斑变性、骨骼石化症和无用的毛发生长。
“杂芳基”为其中一或多个环成员为杂原子的如上面所定义的芳基。例如C5-10杂芳基为碳原子所代表的成员最小为5，但是这些碳原子可以被杂原子代替。因此，C5-10杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并[1，3]间二氧杂环戊烯基、咪唑基、苯并-咪唑基、嘧啶基、呋喃基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、噻吩基等。
“杂环烷基”是指如本申请中所定义的环烷基，其中一或多个指定的环碳原子被选自下列的基团代替：-O-、-N＝、-NR-、-C(O)-、-S-、-S(O)-或-S(O)2-，其中R为氢、C1-4烷基或氮保护基团。例如，本申请中用于表述本发明化合物的C3-8杂环烷基包括吗啉代、吡咯烷基、吡咯烷基-2-酮、哌嗪基、哌啶基、哌啶基酮、1，4-二氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-8-基、硫代吗啉代、硫代吗啉代-S-一氧化物(sulfanomorpholino)、硫代吗啉代-S，S-二氧化物(sulfonomorpholino)等。
“卤素”(或卤代)优选代表氯或氟，但也可以是溴或碘。
术语“刺猬蛋白”泛指刺猬蛋白家族的任何成员，包括sonic、indian、desert和tiggy winkle。该术语可以用于表示蛋白质或基因。该术语也用于表示不同动物种属的同系/直系同源序列。
术语“刺猬蛋白(Hh)信号通路”和“刺猬蛋白(Hh)信号”可以互换使用，是指由信号级联的各个成员(例如刺猬蛋白、patched(Ptch)、smoothened(Smo)和Gli)正常介导的事件链。即使在刺猬蛋白不存在的情况下，刺猬蛋白通路也可以通过激活下游成分而被激活。例如，刺猬蛋白不存在的情况下，Smo的过度表达可以激活该通路。
Hh信号通路的Hh信号成分或成员是指参与Hh信号通路的基因产物。Hh信号成分通常显著地或充分地影响Hh信号在细胞/组织中的传导，通常导致下游基因表达水平的程度改变和/或表型改变。根据其生物学功能和对下游基因激活/表达最终结果的作用，Hh信号成分可以分为正性和负性调节剂。正性调节剂为能够正面影响Hh信号传导的Hh信号成分，即当Hh存在时，能够刺激下游生物学事件。实例包括刺猬蛋白、Smo和Gli。负性调节剂为能够负面影响Hh信号传导的Hh信号成分，即当Hh存在时，能够抑制下游生物学事件。实例包括(但不限于)Ptch和SuFu。
刺猬蛋白信号拮抗剂、Hh信号拮抗剂或Hh信号通路抑制剂是指能够抑制正性Hh信号成分(例如刺猬蛋白、Ptch或Gli)的生物活性或者能够下调Hh信号成分表达的成分。它们也包括能够上调Hh信号成分的负性调节剂的成分。刺猬蛋白信号拮抗剂可以靶向在刺猬蛋白通路中由任何基因编码的蛋白质，包括(但不限于)sonic、indian或desert刺猬蛋白、smoothened、ptch-1、ptch-2、gli-1、gli-2、gli-3等。
“刺猬蛋白功能获得”是指Ptc基因、刺猬蛋白基因或smoothened基因的异常修饰或突变，或此类基因表达水平的降低(或丧失)，它导致了与使细胞接触刺猬蛋白相似的表型，例如刺猬蛋白通路的异常激活。所述功能获得可以包括Ptc基因产物调节Gli基因(例如Gli1、Gli2和Gli3)表达水平的能力丧失。在本文中术语“刺猬蛋白功能获得”还指任何相似的细胞表型(例如呈现出过度增殖)，这类表型的出现是由于刺猬蛋白信号转导通路中任何位置的改变，包括但不限于刺猬蛋白自身的修饰或突变。例如，由于刺猬蛋白信号通路的活化而具有异常的高增殖速率的肿瘤细胞具有“刺猬蛋白功能获得”的表型，即使刺猬蛋白在该细胞中并未发生突变。
“Patched功能丧失”是指Ptc基因的异常修饰或突变，或该基因表达水平的降低，它导致了与使细胞接触刺猬蛋白相似的表型，例如刺猬蛋白通路的异常活化。所述功能丧失可以包括Ptc基因产物调控Gli基因(例如Gli1、Gli2和Gli3)的表达水平的能力丧失。
“Gli功能获得”是指Gli基因的异常修饰或突变，或该基因表达水平升高，它导致了与使细胞接触刺猬蛋白相似的表型，例如刺猬蛋白通路的异常活化。
在肿瘤生长或肿瘤细胞生长中，术语“抑制”是指延迟原发性或继发性肿瘤的出现，使得原发性或继发性肿瘤的生长延缓，原发性或继发性肿瘤的发生率降低，疾病的继发作用的严重程度减缓或降低，或者终止肿瘤生长并使得肿瘤消退。术语“预防”是指原发性或继发性肿瘤或疾病的任何继发性作用的发展完全被抑制。在酶活性的调节中，抑制是指酶活性的可逆性抑制或降低，包括竞争性、无竞争性和非竞争性抑制。它可以通过抑制剂对酶的反应动力学的作用而通过实验学方法进行区分，该酶可以根据基本Michaelis-Menten速率方程进行分析。当抑制剂以与正常底物竞争结合活性位点的方式与游离酶结合时，产生了竞争性抑制。竞争性抑制剂与酶可逆性地反应以形成酶-抑制剂复合物[EI]，类似于酶-底物复合物。
“Smoothened功能获得”是指Smo基因的异常修饰或突变，或该基因表达水平升高，它导致了与使细胞接触刺猬蛋白相似的表型，例如刺猬蛋白通路的异常活化。
术语“患者”或“个体”包括哺乳动物，特别是人类。它也包括其它非人类动物，例如牛、马、羊、猪、猫、犬、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴。
术语“治疗”是指阻止肿瘤生长，使肿瘤部分或全部消退。术语“治疗”包括给予化合物或成分以预防或延迟疾病(例如淋巴瘤和骨髓瘤)的症状、并发症或生化指标的出现，缓解症状，或者终止或抑制疾病、病症或不适的进一步发展。治疗可以是在疾病的表象出现后预防性(预防或延迟疾病的发作，或者预防其症状的临床或亚临床表现)或治疗性地压制或缓解症状。
本发明涉及下列发现：由刺猬蛋白、patched(Ptc)、gli和/或smoothened调节的信号转导通路可以通过式I化合物予以调节。
优选实施方案的表述
本发明的治疗方法采用刺猬蛋白信号通路拮抗剂抑制银屑病、淋巴瘤细胞、白血病细胞或骨髓瘤细胞的生长和增生。这些方法包括使得此类肿瘤细胞(在体外或体内)与Hh信号通路抑制剂(式I化合物)接触。在一个实施方案中，所述式I化合物具有如下定义：Y1和Y2选自N和CR10；其中R10选自氢、甲基、氟、氯、溴、二甲基氨基-乙氧基和三氟甲基；R6和R7独立选自氢、甲基、氯、氟、溴、三氟甲基和甲氧基；前提是R6和R7不同时为氢；且R8选自氢、氟、氯、甲基和三氟甲基。
在另一个实施方案中，R1为选自氰基、氯、氟、甲基、乙基、叔-丁基、丙基、异丁基、异丙基、异丙氧基、丁氧基、甲氧基、二甲基-氨基、乙氧基、甲基-硫烷基、苯基、三氟甲基、三氟甲氧基和任选被至多2个甲基取代的哌嗪基；R2和R5独立选自氢、氯、氟、氰基、甲基、三氟甲基、异丙氧基、甲氧基、乙氧基、三氟甲氧基和二甲基氨基；R3和R4独立选自氢、氯、甲基、甲氧基和氰基；或者，R1和R2或R1和R5与它们所连接的苯基一起形成喹喔啉基。
在另一个实施方案中，R9选自-S(O)2R11、-OR11、-C(O)R11、-NR12aR12b和-R11；其中R11选自硫代吗啉代、硫代吗啉代-S-一氧化物、硫代吗啉代-S，S-二氧化物、吗啉代、环己基、苯基、氮杂环庚-1-基、2-氧代哌嗪-1-基、1，4-氧杂氮杂环庚-4-基、哌啶-1-基、四氢-2H-吡喃-4-基、哌啶-3-基、哌嗪基、吡咯烷基和1，4-二氮杂环庚-1-基；R12a和R12b独立选自异丁基和羟基-乙基；其中所述R9的硫代吗啉代、硫代吗啉代-S-一氧化物、硫代吗啉代-S，S-二氧化物、吗啉代、环己基、苯基、氮杂环庚-1-基、2-氧代哌嗪-1-基、1，4-氧杂氮杂环庚-4-基、哌啶-1-基、四氢-2H-吡喃-4-基、哌啶-3-基、哌嗪基、吡咯烷基或1，4-二氮杂环庚-1-基可以被1-3个独立选自下列的基团所取代：甲基、乙基、甲氧基、苄基、噻吩基-甲基、吡啶基-甲基、苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-6-基和2，3-二氢苯并[b][1，4]二氧杂环己烯-7-基；其中所述R9的苯基或苄基取代基任选被1-3个独立选自下列的基团所取代：甲氧基、乙氧基、甲基-哌嗪基、甲基、三氟甲氧基、氯、氟和三氟甲基。
优选的式I化合物选自4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[4-(吗啉-4-磺酰基)-苯基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(2，6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-2-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-甲氧基-2-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-甲氧基-2-甲基-联苯基-3-甲酸(4-环己基-苯基)-酰胺、4′-甲氧基-2-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(2-甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-二甲基氨基-2-甲基-联苯基-3-甲酸(4-环己基-苯基)-酰胺、4′-二甲基氨基-2-甲基-联苯基-3-甲酸(4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、6-氯代-4′-二甲基氨基-联苯基-3-甲酸(6-[1，4]氧杂氮杂环庚-4-基-吡啶-3-基)-酰胺、6-氯代-4′-二甲基氨基-联苯基-3-甲酸(6-吗啉-4-基-吡啶-3-基)-酰胺、6-氯代-4′-二甲基氨基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、6-氯代-4′-甲氧基-联苯基-3-甲酸[6-(2-甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺、6-氯代-4′-甲氧基-联苯基-3-甲酸(6-[1，4]氧杂氮杂环庚-4-基-吡啶-3-基)-酰胺、6-氯代-4′-甲氧基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、6-氯代-4′-甲氧基-联苯基-3-甲酸(6-吗啉-4-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-甲氧基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-吗啉-4-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-甲氧基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-[1，4]氧杂氮杂环庚-4-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-甲氧基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(2-甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-二甲基氨基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(2-甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-二甲基氨基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-[1，4]氧杂氮杂环庚-4-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-二甲基氨基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-吗啉-4-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-甲氧基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-乙氧基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、6-甲基-4′-甲基硫烷基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-二甲基氨基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、6-甲基-[1，1′；4′，1″]三苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、3′-氯代-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、2′，4’-二氯代-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、2′-氯代-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、3′-氯代-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、3′，4’-二氯代-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、3′-氯代-6-甲基-4′-三氟甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、6，4′-二甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-乙基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-叔-丁基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、6-甲基-4′-丙基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-异丁基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-异丙基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、6，2′，6′-三甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、6，2′，3′-三甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、6-甲基-4′-三氟甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、6-甲基-3′-三氟甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、6-甲基-3′，5’-二三氟甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、3′-异丙氧基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、3′-乙氧基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、2′，6’-二甲氧基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、6-甲基-4′-三氟甲氧基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、6-甲基-3′-三氟甲氧基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、6-甲基-联苯基-3-甲酸(4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、4′-甲氧基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、3′-甲氧基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、4′-(2-二甲基氨基-乙氧基)-6-甲基-联苯基-3-甲酸(4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、3′-二甲基氨基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、4′-氟-6-甲基-联苯基-3-甲酸(4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、3′-氟-6-甲基-联苯基-3-甲酸(4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、2′-氟-6-甲基-联苯基-3-甲酸(4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、4-甲基-N-(4-吗啉-4-基-苯基)-3-喹喔啉-6-基-苯甲酰胺、6-甲基-4′-(4-甲基-哌嗪-1-基)-联苯基-3-甲酸(4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、2′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、3′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-[1，4]氧杂氮杂环庚-4-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(2-甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(3，4，5，6-四氢-2H-[1，2′]联吡啶基-5′-基)-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-吗啉-4-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(3-氟-4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(3-氯代-4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(3-溴-4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(3-甲基-4-吗啉-4-基-苯基)-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(4-吗啉-4-基-3-三氟甲基-苯基)-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(4-环己基-苯基)-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸联苯基-4-基酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(4′-甲氧基-联苯基-4-基)-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[4-(4-苄基-哌嗪-1-基)-苯基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[4-(哌啶-1-磺酰基)-苯基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[4-(吡咯烷-1-磺酰基)-苯基]-酰胺、4′-氰基-6-甲氧基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-氰基-2-甲氧基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-氰基-2-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、3′-氟-4′-甲氧基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-异丙氧基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-丁氧基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、3′-氯代-4′-甲氧基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-甲氧基-6，3′-二甲基-联苯基-3-甲酸(6-氮杂环庚-1-基-吡啶-3-基)-酰胺、4′-氰基-2-甲基-联苯基-3-甲酸[4-(哌啶-1-磺酰基)-苯基]-酰胺、4′-氰基-6-氟-联苯基-3-甲酸[4-(哌啶-1-磺酰基)-苯基]-酰胺、6-溴-4′-氰基-联苯基-3-甲酸[4-(哌啶-1-磺酰基)-苯基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(4-苄基-[1，4]二氮杂环庚-1-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(4-噻吩-3-基甲基-[1，4]二氮杂环庚-1-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-2-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(2，6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-甲氧基-2-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(2，6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺、2-甲基-4′-三氟甲基-联苯基-3-甲酸[6-(2，6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺、2-甲基-4′-三氟甲氧基-联苯基-3-甲酸[6-(2，6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-2-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(2-甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-2-氟-联苯基-3-甲酸[4-(哌啶-1-磺酰基)-苯基]-酰胺、4′-氰基-6-三氟甲基-联苯基-3-甲酸[4-(哌啶-1-磺酰基)-苯基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(4-吡啶-4-基甲基-[1，4]二氮杂环庚-1-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(4-吡啶-3-基甲基-[1，4]二氮杂环庚-1-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(2，6-二甲氧基-苄基)-[1，4]二氮杂环庚-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(2-乙氧基-苄基)-[1，4]二氮杂环庚-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸(6-{4-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苄基]-[1，4]二氮杂环庚-1-基}-吡啶-3-基)-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(4-甲氧基-2，3-二甲基-苄基)-[1，4]二氮杂环庚-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(2，3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烯-6-基甲基)-[1，4]二氮杂环庚-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(4-吡啶-2-基甲基-[1，4]二氮杂环庚-1-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(4-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-4-基甲基-[1，4]二氮杂环庚-1-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(2-三氟甲氧基-苄基)-[1，4]二氮杂环庚-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(2-二甲基氨基-苄基)-[1，4]二氮杂环庚-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(2-氯代-5-三氟甲基-苄基)-[1，4]二氮杂环庚-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(2，3-二氟-苄基)-[1，4]二氮杂环庚-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(2-氯代-4-氟-苄基)-[1，4]二氮杂环庚-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(2，6-二氟-苄基)-[1，4]二氮杂环庚-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、2-氯代-4′-氰基-联苯基-3-甲酸[4-(哌啶-1-磺酰基)-苯基]-酰胺、4′-氰基-6-三氟甲基-联苯基-3-甲酸[6-(2，6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺、2-氯代-4′-氰基-联苯基-3-甲酸[6-(2，6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-6-乙基-联苯基-3-甲酸[6-(2，6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(3-氟-苄基)-哌嗪-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(2-三氟甲氧基-苄基)-哌嗪-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(3-氯代-苄基)-哌嗪-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(4-异丁基-苄基)-哌嗪-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(4-叔-丁基-苄基)-哌嗪-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(7-甲氧基-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基甲基)-哌嗪-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(4-苄基-哌嗪-1-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(4-吡啶-3-基甲基-哌嗪-1-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(4-二氟甲氧基-苄基)-哌嗪-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(4-氰基-苄基)-哌嗪-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(4-喹啉-5-基甲基-哌嗪-1-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(4-吡啶-4-基甲基-哌嗪-1-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(4-吡啶-2-基甲基-哌嗪-1-基)-吡啶-3-基]-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(4-咪唑-1-基-苄基)-哌嗪-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸{6-[4-(3-氰基-苄基)-哌嗪-1-基]-吡啶-3-基}-酰胺、4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(4-异喹啉-5-基甲基-哌嗪-1-基)-吡啶-3-基]-酰胺、(R)-2-甲基-N-(6-(2-甲基吗啉代)吡啶-3-基)-4′-(三氟甲氧基)联苯基-3-甲酰胺、4′-氰基-2-甲基-N-(6-磺酰基吗啉代吡啶-3-基)联苯基-3-甲酰胺、(S)-4′-氰基-2-甲基-N-(6-(2-甲基吗啉代)吡啶-3-基)联苯基-3-甲酰胺、(R)-6-氯代-N-(6-(2-甲基吗啉代)吡啶-3-基)-4′-(三氟甲氧基)联苯基-3-甲酰胺、4′-氰基-2-甲基-N-(6-亚磺酰基吗啉代吡啶-3-基)联苯基-3-甲酰胺、4′-氰基-N-(6-(二异丁基氨基)吡啶-3-基)-2-甲基联苯基-3-甲酰胺、4′-氰基-N-(2-((2S，6R)-2，6-二甲基吗啉代)嘧啶-5-基)-2-甲基联苯基-3-甲酰胺、N-(2-((2S，6R)-2，6-二甲基吗啉代)嘧啶-5-基)-2-甲基-4′-(三氟甲基)联苯基-3-甲酰胺、N-(2-((2S，6R)-2，6-二甲基吗啉代)嘧啶-5-基)-2-甲基-4′-(三氟甲氧基)联苯基-3-甲酰胺、N-(2-(二(2-羟基乙基)氨基)嘧啶-5-基)-2-甲基-4′-(三氟甲氧基)联苯基-3-甲酰胺、2-甲基-N-(6-(四氢-2H-吡喃-4-基氧基)吡啶-3-基)-4′-(三氟甲氧基)联苯基-3-甲酰胺、N-(5-氯代-6-((2S，6R)-2，6-二甲基吗啉代)吡啶-3-基)-2-甲基-4′-(三氟甲氧基)联苯基-3-甲酰胺、N-(6-((2R，6S)-2，6-二甲基四氢-2H-吡喃-4-基)吡啶-3-基)-2-甲基-4′-(三氟甲氧基)联苯基-3-甲酰胺、N-(6-(4-乙基哌嗪-1-羰基)吡啶-3-基)-2-甲基-4′-(三氟甲氧基)联苯基-3-甲酰胺、2-甲基-N-(6-(2-氧代哌嗪-1-基)吡啶-3-基)-4′-(三氟甲氧基)联苯基-3-甲酰胺、2-甲基-N-(6-(1-(吡啶-4-基甲基)哌啶-4-基)吡啶-3-基)-4′-(三氟甲氧基)联苯基-3-甲酰胺、2-甲基-N-(6-(2-氧代-4-(吡啶-4-基甲基)哌嗪-1-基)吡啶-3-基)-4′-(三氟甲氧基)联苯基-3-甲酰胺、2-甲基-N-(6-(1-(吡啶-4-基甲基)哌啶-3-基)吡啶-3-基)-4′-(三氟甲氧基)联苯基-3-甲酰胺、N-(6-(1-乙基哌啶-3-基)吡啶-3-基)-2-甲基-4′-(三氟甲氧基)联苯基-3-甲酰胺和N-(6-((2R，6S)-2，6-二甲基吗啉代)吡啶-3-基)-2-甲基-4′-(三氟甲氧基)联苯基-3-甲酰胺。
因此，它特别涉及能够干扰刺猬蛋白、Ptc或smoothened信号转导活性的式I化合物，该化合物同样能够抑制正常细胞和/或具有patched功能丧失表型、刺猬蛋白功能获得表型、smoothened功能获得表型、Gli功能获得表型或刺猬蛋白配体表型过度表达的细胞中的增生(或其它生物学结果)。因此，在某些实施方案中，它涉及这些化合物用于抑制正常细胞中刺猬蛋白活性，例如，所述细胞没有能够激活刺猬蛋白通路的基因突变。在优选的实施方案中，化合物能够抑制刺猬蛋白的至少某些生物学活性，优选特别是在靶细胞中的刺猬蛋白。
因此，本发明方法包括式I化合物的用途，在对多种细胞、组织和器官(包括正常细胞、组织和器官)以及具有Ptc功能丧失、刺猬蛋白功能获得、smoothened功能获得或Gli功能获得表型的细胞、组织和器官的修复和/或功能表现的调节中，通过例如抑制smoothened或信号通路下游成分的激活，它能够激动刺猬蛋白信号的Ptc抑制。例如，所述方法具有治疗和美容用途，用途范围包括神经组织的调节，骨和软骨的形成和修复，精子生成调节，平滑肌调节，肺、肝以及其它原肠器官的调节，造血功能调节，皮肤和毛发生长的调节等。而且，所述方法可以在培养的细胞(体外)中进行，或者在机体细胞(体内)中进行。
在另一个实施方案中，所述方法可以治疗具有Ptc功能丧失表型、刺猬蛋白功能获得表型、smoothened功能获得表型或Gli功能获得表型的上皮细胞。例如，所述方法可以用于治疗或预防基底细胞癌或其它与刺猬蛋白通路相关的疾病。
在某些实施方案中，式I化合物可以通过与smoothened或其下游蛋白结合而抑制刺猬蛋白通路的激活。在某些实施方案中，所述拮抗剂可以通过与patched结合而抑制刺猬蛋白通路的激活。
在另一个优选的实施方案中，所述方法可以作为恶性髓母细胞瘤和其它原发性CNS恶性神经外胚瘤治疗方案的一部分。
另一方面，本发明提供了药物制剂，它含有作为活性成分的例如本文中所述的刺猬蛋白信号调节剂(例如式I化合物)、Ptc激动剂、smoothened拮抗剂或下游刺猬蛋白通路蛋白拮抗剂，该制剂的量应足以抑制体内Ptc功能丧失、刺猬蛋白功能获得、smoothened功能获得或Gli功能获得的增生或其它生物学结果。
采用式I化合物、patched激动剂、smoothened拮抗剂或下游刺猬蛋白通路蛋白拮抗剂的所述治疗对人类或动物患者均有效。本发明可适用的动物患者包括作为宠物或商业目的的驯养动物和家畜。实例包括犬、猫、牛、马、绵羊、猪和山羊。
药理学和效用
本发明发明了抑制刺猬蛋白信号通路激活的有用的方法和化合物，例如，抑制由表型例如Ptc功能丧失、刺猬蛋白功能获得、smoothened功能获得或Gli功能获得而导致的异常生长状态，所述方法包括使得细胞与式I化合物接触，所述化合物的量应足以激动正常Ptc活性，拮抗正常刺猬蛋白活性，拮抗smoothened活性或者拮抗Gli活性，例如以逆转或控制异常生长状态。
信号分子的刺猬蛋白家族成员能够介导脊椎动物发育过程中的多种重要的短程和长程模式过程。模式形成是一种活动，胚胎细胞通过它来形成分化组织的有序空间排列。在胚胎形成过程中，通过细胞自身的谱系和细胞外信号的相互作用产生了高等有机体的机体复杂性。诱导性的相互作用对于脊椎动物发育中的胚胎模式形成是必需的，包括从早期身体架构的构建到器官系统模式形成以及在组织分化期间不同的细胞类型的产生。发育细胞相互作用的效果是不同的：应答细胞被诱导细胞从一种细胞分化途径转换到另一种途径，所述的诱导细胞不同于未诱导和诱导阶段的应答细胞(诱导作用)。有些情况下，细胞诱导其邻近的细胞象其自身一样分化(同源诱导)；在其它情况下，细胞抑制其邻近的细胞象其自身一样分化。在早期发育中，细胞相互作用可以是相继的，以便两种细胞类型间的初期诱导作用引起差异的递增放大。此外，诱导性的相互作用不仅发生在胚胎，也发生在成熟细胞中，可以用于建立和维持形态形成模式以及诱导分化。
刺猬蛋白基因的脊椎动物家族包括存在于哺乳动物中的三种成员，称为Desert(Dhh)、Sonic(Shh)和Indian(Ihh)刺猬蛋白，它们均能够编码分泌的蛋白质。这些不同的刺猬蛋白由信号肽、高度保存的N末端区域和差异较大的C末端区域组成。生物化学研究已经显示Hh前体蛋白的自身蛋白酶解通过自身的硫酯中间体来进行，所述的中间体随后在亲核取代反应中裂解。很有可能的是，亲核体是较小的亲脂性分子，它共价结合在N-肽的C末端，将其束缚于细胞表面。该生物学含意是很深奥的。由于这种束缚，在产生刺猬蛋白的细胞表面上产生了局部高浓度的N-末端刺猬蛋白肽。这种N-末端肽对于短程或长程的刺猬蛋白信号活性而言是必要的和充分的。
刺猬蛋白信号通路失活是指其中跨膜蛋白受体Patched(Ptc)抑制了Smoothened(Smo)(一种七跨膜蛋白)的活性的情况。转录因子Gli是一种Hh信号的下游组分，它通过与细胞质蛋白(包括Fused和fused的抑制物(Sufu))的相互作用被阻止进入细胞核。因此，刺猬蛋白靶基因的转录活化被抑制。通过三种哺乳动物配体(Dhh、Shh或Ihh)中的任何一种与Ptc结合来启动该通路的活化。配体结合导致了Smo抑制的逆转，因而激活了产生转录因子Gli的活化形式向细胞核易位的级联。细胞核Gli激活了靶基因表达，包括Ptc和Gli自身。
刺猬蛋白信号水平的升高足以启动癌症形成，并且是肿瘤存活所必需。这些癌症包括但不限于：前列腺癌(“在前列腺再生、瘤形成和转移中的刺猬蛋白信号(Hedgehog signaling in prostate regeneration，neoplasia andmetastasis)”，Karhadkar SS，Bova GS，Abdallah N，Dhara S，Gardner D，Maitra A，Isaacs JT，Berman DM，Beachy PA.，Nature.2004年10月7日；431(7009)：707-12；“通过干扰SONIC刺猬蛋白-GLI1信号而抑制前列腺癌增生(Inhibition of prostate cancer proliferation by interference with SONICHedgehog-GLI1 signaling)”，Sanchez P，Hernandez AM，Stecca B，Kahler AJ，DeGueme AM，Barrett A，Beyna M，Datta MW，Datta S，Ruizi Altaba A.，Proc Natl Acad Sci U S A.2004年8月24日；101(34)：12561-6)，(“环巴胺和吉非替尼(选择性刺猬蛋白和表皮生长因子受体信号抑制剂)的组合产品在前列腺癌细胞中所引起的细胞毒作用(Cytotoxic effects induced by a combinationof Cyclopamine and gefitinib，the selective Hdegehog and epidermal growthfactor receptor signaling inhibitors，in prostate cancer cells)，”Mimeault M，Moore E，Moniaux N，等(2006)，International Journal of Cancer；118(4)：1022-31)，乳癌(“刺猬蛋白信号通路是乳癌患者的新的治疗靶点(Hedgehog signaling pathway is a new therapeutic target for patients withbreast cancer)”，Kubo M，Nakamura M，Tasaki A，Yamanaka N，NakashimaH，Nomura M，Kuroki S，Katano M.，Cancer Res.2004年9月1日；64(17)：6071-4)，(“刺猬蛋白信号和Bmi-1调节正常和恶性人类乳腺干细胞的自我更新(Hedgehog signaling和regulate self-renewal of normal andmalignant human mammary stem cells)，”Liu S，Dontu G，Mantle ID，等(2006)Cancer Res；66(12)：6063-71)，(“smoothened(SMO)在转基因小鼠乳腺中的构成性激活导致增生提高、分化改变和导管发育不良(Constitutiveactivation of in mammary glands of transgenic mice leads to increasedproliferation，altered differentiation and ductal dysplasia)，”Moraes RC，Zhang XM，Harrington N，等(2007)，Development；134(6)：1231-42)，母细胞瘤(“通过刺猬蛋白通路阻断抑制髓母细胞瘤生长(Medulloblastoma growthinhibition by Hedgehog pathway blockade)”，Berman DM，Karhadkar SS，Hallahan AR，Pritchard JI，Eberhart CG，Watkins DN，Chen JK，CooperMK，Taipale J，Olson JM，Beachy PA.，Science.2002年8月30日；297(5586)：1559-61)，非-黑素瘤皮肤癌(即鳞状细胞癌(SCC)和基底细胞癌(BCC))(“刺猬蛋白信号通路的小分子抑制剂的鉴别：对基底细胞癌样病变的作用(Identification of a small molecule inhibitor of the hedgehog signalingpathway：effects on basal cell carcinoma-like lesions)”，Williams JA，Guicherit OM，Zaharian BI，Xu Y，Chai L，Wichterle H，Kon C，GatchalianC，Porter JA，Rubin LL，Wang FY.，Proc Natl Acad Sci U S A.2003年4月15日；100(8)：4616-21；“激活偶发性基底细胞癌中的Smoothened突变(Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma)”，Xie J，Murone M，Luoh SM，Ryan A，Gu Q，Zhang C，Bonifas JM，Lam CW，HynesM，Goddard A，Rosenthal A，Epstein EH Jr，de Sauvage FJ.，Nature.1998年1月1日；391(6662)：90-2)，胰腺癌、食道癌、胃癌和胆管癌(“刺猬蛋白为胰腺癌肿瘤形成的早期和晚期递质(Hedgehog is an early and late mediator ofpancreatic cancer tumorigenesis)”，Thayer SP，di Magliano MP，Heiser PW，Nielsen CM，Roberts DJ，Lauwers G Y，Qi Y P，Gysin S，Fernandez-delCastillo C，Yajnik V，Antoniu B，McMahon M，Warshaw AL，Hebrok M.，Nature.2003年10月23日；425(6960)：851-6；“在消化道肿瘤生长中普遍存在的刺猬蛋白配体刺激需要(Widespread requirement for Hedgehog ligandstimulation in growth of digestive tract tumours)”，Berman DM，KarhadkarSS，Maitra A，Montes De Oca R，Gerstenblith MR，Briggs K，Parker AR，Shimada Y，Eshleman JR，Watlins DN，Beachy PA.，Nature.2003年10月23日；425(6960)：846-51)，(“核因子-κB在胰腺癌中通过sonic刺猬蛋白诱导作用促进刺猬蛋白信号通路的激活(Nuclear factor-kappa B contributes tohedgehog signaling pathway activation through sonic hedgehog induction inpancreatic cancer)，”Nakashima H，Nakamura M，Yamaguchi H，等(2006)，Cancer Research；66(14)：7041-9)，(“刺猬信号的阻断抑制了胰腺癌侵入和转移：用于实体癌联合疗法的新模式(Blockade of hedgehog signaling inhibitspancreatic cancer invasion and metastases：A new paradigm for combinationtherapy in solid cancers)，”Feldmann G，Dhara S，Fendrich V，等(2007)Cancer Research；67(5)：2187-96)，(“致癌性KRAS在胰腺癌细胞中抑制Gli1降解并激活刺猬蛋白信号通路(Oncogenic KRAS suppressesdegradation和activates Hedgehog signaling pathway in pancreatic cancercells)，”Ji Z，Mei FC，Xie J，等(2007)，J Biol Chem；282(19)：14048-55)，小细胞肺癌(“在呼吸道上皮祖细胞和小细胞肺癌中的刺猬蛋白信号(Hedgehogsignaling within airway epithelial progenitors and in small-cell lung cancer)”，Watkins DN，Berman DM，Burkholder SG，Wang B，Beachy PA，Baylin SB.，Nature.2003年3月20日；422(6929)：313-7)，(“小细胞肺癌中的刺猬蛋白信号：体内常见但是体外罕见事件(Hedgehog signaling in small-cell lung cancer：Frequent in vivo but a rare event in vitro)，”Vestergaard J，Pedersen MW，Pedersen N，等(2006)，Lung Cancer；52(3)：281-90)。
其中刺猬蛋白信号的升高足以启动癌症形成并且是肿瘤存活所必需的其它癌症包括但不限于结肠癌(“多个大肠癌患者中Sonic刺猬蛋白依赖性增生(Sonic Hedgehog-dependent proliferation in a series of patients withcolorectal cancer)，”Douard R，Moutereau S，Pernet P，等(2006)Surgery；139(5)：665-70)，(“结直肠肿瘤细胞中的刺猬蛋白信号：采用环巴胺治疗诱导细胞凋亡(Hedgehog signalling in colorectal tumour cells：Induction ofapoptosis with cyclopamine treatment)，”Qualtrough D，Buda A，Gaffield W，等(2004)，International Journal of Cancer；110(6)：831-7)，神经胶质瘤(“环巴胺介导的刺猬蛋白通路抑制在成胶质细胞瘤中大大减少干细胞样癌细胞(Cyclopamine-mediated Hedgehog pathway inhibition depletes stem-likecancer cells in glioblastoma)，”Bar EE，Chaudhry A，Lin A，等，Neuro-Oncology；2007，9(4)：594)，(“刺猬蛋白-GLI1信号调节人类神经胶质瘤生长、癌干细胞自我更新和肿瘤生成(Hedgehog-GLI1 signaling regulateshuman glioma growth，cancer stem cell self-renewal，and tumorigenicity)，”Clement V，Sanchez P，de Tribolet N，等，(2007)Current Biology17(2)：165-72)，(“神经胶质瘤干细胞中刺猬蛋白通路的配体依赖性激活(Ligand-dependent activation of the hedgehog pathway in glioma progenitorcells)，”Ehteshan M，Sarangi A，Valadez JG，等(2007)Oncogene；2007年3月12日，Epub ahead of print)，黑素瘤(“黑素瘤有赖于通过GLI1和RAS-MEK/AKT通路之间相互作用而调节的HEDGEHOG-GLI信号(Melanomas require HEDGEHOG-GLI signaling reaulated by interactionsbetween GLI1and the RAS-MEK/AKT pathways)，”Stecca B，Mas C，Clement V，等(2007)，Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America；104(14)：5895-900)，非小细胞肺癌(NSCLC)(“非小细胞肺癌中刺猬蛋白信号的频繁需要(Frequent requirement of hedgehogsignaling in non-small cell lung carcinoma)，”Yuan Z，Goetz JA，Singh S，等(2007)，Oncogene；26(7)：1046-55)，卵巢癌(“卵巢癌中刺猬蛋白信号通路的激活与细胞增生有关：它的抑制导致了生长抑制和细胞凋亡(Hedgehog signalpathway is activated in ovarian carcinomas，correlating with cell proliferation：It′s inhibition leads to growth suppression and apoptosis)，”Chen XJ，Horiuchi A，Kikuchi N，等，Cancer Science；(2007)98(1)：68-76)，肝癌(“人类肝细胞肝癌中刺猬蛋白通路的激活(Activation ofthe hedgehog pathway inhuman hepatocellular carcinomas)，”Huang SH，He J，Zhang XL，等(2006)，Carcinogenesis；27(7)：1334-40)，(“在人类肝癌形成中刺猬蛋白信号通路的失调(Dysregulation of the Hedgehog signalling pathway in humanhepatocarcinogenesis)，”Sicklick JK，Li YX，Jayaraman A，等(2006)，Carcinogenesis；27(4)：748-57)，肾癌(“肾透明细胞肉瘤：采用sonic hedgehog和Akt通路激活的神经标记的上调(Clear cell sarcoma of the kidney：Up-regulation of neural markers with activation of the sonic hedgehog andAkt pathways)，”Cutcliffe C，Kersey D，Huang CC，等(2005)，Clinical CancerResearch；11(22)：7986-94)，横纹肌肉瘤(“在Gorlin综合征小鼠模型中的横纹肌肉瘤和放射超敏性(Rhabdomyosarcomas and radiation hypersensitivity ina mouse model of Gorlin syndrome)，”Hahn H，Wojnowski L，Zimmer AM，等(1998)，Nature Medicine；4(5)：619-22)，(“刺猬蛋白信号通路的失调：PTCH和SUFU基因在人类横纹肌瘤和横纹肌肉瘤发展中的可能的作用(Deregulation of the hedgehog signalling pathway：a possible role for thePTCH and SUFU genes in human rhabdomyoma and rhabdomyosarcomadevelopment)，”Tostar U，Malm CJ，Meis-Kindblom JM，等(2006)，Journalof Pathology；208(1)：17-25)，软骨肉瘤(“在软骨肉瘤中的构成性刺猬蛋白信号上调肿瘤细胞增生(Constitutive hedgehog signaling in chondrosarcomaup-regulates tumor cell proliferation)，”Tiet TD，Hopyan S，Nadesan P，等(2006)，American Journal of Pathology；168(1)：321-30)。
刺猬蛋白通路抑制剂(例如环巴胺)已经被证实可以用于治疗银屑病(“环巴胺：在银屑病的治疗中抑制刺猬蛋白(Cyclopamine：inhibiting hedgehog inthe treatment of psoriasis)”，Cutis，2006，78(3)：185-8；Br.J.Dermatology，2006年4月；154(4)：619-23，“牛皮癣皮肤表达转录因子Gli1：神经纤维蛋白表达降低的可能的贡献(Psoriatic skin expresses the transcription factor Gli1：possible contribution of decreased neurofibromin expression)”，Endo H，Momota Y，Oikawa A，Shinkai H.)。
恶性淋巴瘤(ML)涉及淋巴系统细胞，在美国为第五种主要癌症。ML包括霍奇金病和非霍奇金病，它们属于淋巴增生性疾病的多样化群组。霍奇金病约占所有恶性淋巴瘤的14％。非霍奇金淋巴瘤为不同的恶性组别，主要源自B细胞。在实施制剂分类方案时，根据其固有的历史特征，这些淋巴瘤被分为低、中和高等级种类(参见“非霍奇金淋巴瘤病理学分类方案(TheNon-Hodgkin’s Lymphoma Pathologic Classification Project)”Cancer49：2112-2135，1982)。低级别淋巴瘤无痛，平均生存5-10年(Horning和Rosenberg，N.Engl.J.Med.311：1471-1475，1984)。尽管化疗可以使得绝大多数无痛淋巴瘤的缓解，但罕见治愈，大多数患者最终会复发，需要进一步治疗。中度级别和高级别淋巴瘤为更具侵略性的肿瘤，但是它们采用化疗治愈的机会较大。然而，这些患者中相当大的比例会复发，需要进一步治疗。
多发性骨髓瘤(MM)是由在骨髓中正常发现的血浆细胞类型组成的恶性肿瘤。这些恶性血浆细胞在骨髓中聚集，通常产生单克隆IgG或IgA分子。所述恶性血浆细胞在骨髓中栖息并扩张，由于正常造血作用的不足引起贫血症和免疫抑制。患有多发性骨髓瘤的个体通常会产生贫血、溶骨性病变、肾衰、高钙血症和复发性细菌感染。MM代表第二种最常见的恶性血液病(hematopoietic malignancy)。
根据本发明者的发现，本发明可以基本断定淋巴瘤和多发性骨髓瘤疾病依赖于刺猬蛋白(Hh)信号通路，它利用分离自转基因Eμ-Myc小鼠和Cdkn2a敲除小鼠的淋巴瘤细胞和血浆细胞瘤细胞，发现刺猬蛋白配体介导了间质和淋巴瘤细胞之间的相互作用。同样的作用也发现于淋巴瘤和多发性骨髓瘤样品，所述样品分离自患者样本的骨(多发性骨髓瘤)或分离自非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者的淋巴结、骨髓或脾脏以及慢性淋巴细胞白血病(CLL)样本。另外发现，Hh信号通路的抑制诱导了基质依赖性淋巴瘤细胞的凋亡，刺猬蛋白通路成员的过度表达抑制了环巴胺诱导的淋巴瘤细胞的体外凋亡。另外，本发明者发现采用刺猬蛋白通路抑制剂对小鼠进行治疗能够使得淋巴瘤在体内的扩张终止。最后，本发明者发现在脾B-细胞中以及大多数环巴胺应答淋巴瘤中没有Gli3的表达，但是在所有的环巴胺对抗淋巴瘤中均能够优势表达。
这些数据表明，Hh信号提供了对于通过c-Myc转化的最初阶段的重要的抗凋亡信号，对于淋巴瘤维持起到了重要的作用。因此，破坏Hh信号通路提供了治疗淋巴瘤(例如NHL)、多发性骨髓瘤、CLL和其它恶性血液病的新方法。另外，Gli3在淋巴瘤中的表达提供了Hh抑制的响应性的负面预测因素，并提供了患者分类的重要方法。
根据这些发现，本发明提供了抑制肿瘤细胞生长的方法，例如淋巴瘤和骨髓瘤细胞。本发明提供了在患者中通过抑制肿瘤细胞生长而治疗淋巴瘤或骨髓瘤的方法和组合物。该方法也用于预防患者的肿瘤形成。其中某些方法涉及治疗相对于脾B细胞而言Gli3的表达没有显著增加的淋巴瘤。该方法包括给予需要治疗的患者药用组合物，该组合物含有Hh信号拮抗成分(例如式I化合物)。本发明化合物下调Hh信号通路成员的细胞水平或抑制其生物学活性。
本发明提供了预防或治疗血液癌症以及淋巴系统癌症的方法，包括淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。该方法采用刺猬蛋白信号通路拮抗剂抑制淋巴瘤细胞、白血病细胞或骨髓瘤细胞的生长和增生。淋巴瘤是衍生自B淋巴细胞的淋巴母细胞的恶性肿瘤。骨髓瘤为由通常发现于骨髓中的血浆细胞类组成的恶性肿瘤。白血病为与造血器官有关的急性或慢性疾病。NHLs的特征在于机体组织中白细胞数量的异常增加，伴有或不伴有循环血液中白细胞相应的增加，它可以根据其中占绝对优势的白细胞的类型进行分类。
例如，患有淋巴瘤(例如，B-细胞淋巴瘤、血浆母细胞瘤(plasmoblastoma)、血浆细胞瘤或CLL)或者具有上述肿瘤发生风险的患者可以采用本发明方法治疗。优选，所述患者为人类。该方法需要给予所述患者药用组合物，该组合物含有能够抑制刺猬蛋白信号通路的有效量的式I化合物。所述患者可以是被诊断为淋巴瘤并伴有转移或没有转移的患者，可以处于该疾病的任何阶段(例如，阶段I-IV，Ann Arbor Staging System)。适合采用本发明方法治疗的淋巴瘤包括但不限于霍奇金病和非霍奇金病。霍奇金病是人类淋巴组织恶性疾病(淋巴瘤)，它最初主要起源于淋巴结，后来扩散到脾脏、肝脏和骨髓。它主要发生在年龄为15-35之间的个体。其特征在于淋巴结、脾脏和普通淋巴组织的进行性无痛肿大。典型的霍奇金病分为四种亚型：(1)结节硬化型霍奇金病(NSHD)；(2)混合细胞型霍奇金病(MCHD)；(3)淋巴细胞耗竭型霍奇金病(LDHD)；和(4)富含淋巴细胞的经典型霍奇金病(cLRHD)。
在某些优选的实施方案中，本发明方法用于治疗非霍奇金病淋巴瘤(NHL)。非霍奇金病也称为淋巴肉瘤，它是指与霍奇金病在某些重要方面不同的一组淋巴瘤，根据癌症细胞的显微特征而分类。非霍奇金病包括但不限于：(1)缓慢生长性淋巴瘤和淋巴性白血病(例如，慢性淋巴细胞白血病、小淋巴细胞白血病、淋巴血浆细胞样淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤、滤泡性小裂细胞淋巴瘤、滤泡性混合细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、血浆细胞瘤、骨髓瘤、大颗粒淋巴细胞白血病、蕈样真菌病、szary综合征)；(2)中度侵略性淋巴瘤和淋巴性白血病(例如，幼淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤、滤泡性小裂细胞淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/幼淋巴细胞白血病、血管中心性淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴瘤)；(3)侵略性淋巴瘤(例如，大B细胞淋巴瘤、外周T-细胞淋巴瘤、肠道T-细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤)；和(4)高侵略性淋巴瘤和淋巴细胞白血病(例如，B-细胞前体B-淋巴细胞性白血病/淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、高级别B-细胞淋巴瘤、伯基特(Burkitt)样T-细胞前体T-淋巴细胞白血病/淋巴瘤)。本发明的方法可以用于成人或儿童型淋巴瘤，也可以用于淋巴瘤的任何阶段，例如阶段I、II、III或IV。本文中所述的方法也可以用于治疗其它类型的白血病，例如急性淋巴细胞白血病(ALL)。
本发明的某些治疗方法特别涉及用于治疗不能表达Gli3的淋巴瘤或骨髓瘤。根据下面实施例中所公开，可以观察到，尽管Gli1和Gli2在所有的淋巴瘤中均有表达，但是可检测的Gli3表达主要存在于对通过环巴胺进行的Hh通路的抑制具有抗性的淋巴瘤中。在正常的脾B细胞中和大多数环巴胺应答型淋巴瘤中没有Gli3的表达。因此，在采用Hh拮抗剂治疗前，患有淋巴瘤的患者可以首先在获自患者的淋巴瘤细胞样本中进行Gli3表达的检查。样本中的Gli3表达水平可以与正常脾B细胞(获自患者)中的Gli3表达水平进行比较。在淋巴瘤或骨髓瘤样本中和在对照细胞中的Gli3表达可以采用本领域中已知的方法测定，例如采用下面实施例中所述的方法。如果在淋巴瘤或骨髓瘤样本中没有可检测的Gli3表达或者表达水平较正常B细胞中Gli3表达水平没有明显的提高(例如，不高于25％、50％或100％)，则说明采用本文中所述的Hh拮抗剂治疗有可能产生响应。除了作为本发明治疗方法的其它步骤外，对于Gli3表达匮乏的前期筛选也可以独立用作患者分类的方法。
除了淋巴瘤外，上述方法和组合物也适用于治疗骨髓瘤。多发性骨髓瘤为致命性肿瘤，其特征在于一簇(a clone)血浆细胞的积聚，通常伴有Ig链的分泌。肿瘤的骨髓侵入与伴有细菌感染的贫血、低丙种球蛋白血症(hypogammaglobinemia)和粒细胞减少有关。异常的细胞因子环境(主要是IL-6和IL-1β水平升高)经常会导致破骨增加，产生骨痛、骨折和高钙血症。尽管可以进行侵入性化疗和移植，但多发性骨髓瘤仍然是普遍存在的致命性血浆增生性疾病。
本发明化合物用于治疗与刺猬蛋白相关的疾病，例如基底细胞痣综合征(也称为Gorlin综合征和/或痣样基底细胞癌)，它是一种罕见的常染色体显性癌样遗传综合征。
本发明化合物用于治疗基底细胞癌(BCC或啮齿类动物溃疡)、源自皮层或肾上腺髓质的髓质部的肾上腺肿瘤和卵巢肿瘤。
本发明化合物用于治疗骨过度生长疾病，包括但不限于肢端肥大症、巨头畸形、Sotos综合征、进行性骨干发育异常(PDD或Camurati-Engelmann疾病)、颅骨骨干发育异常(craniodiaphyseal dysplasia)和骨内膜骨质增生(endosteal hyperostosis)疾病，包括Van Buchem疾病(I型和II型)和硬化性骨化病(sclerosteosis)。
本发明化合物用于治疗不受欢迎的毛发生长(例如毛痣)以及脱毛后毛发再生长的美容预防。
本发明化合物用于治疗肝纤维化。
因此，本发明方法包括本发明化合物在调节各类细胞、组织和器官的修复和/或功能表现中拮抗刺猬蛋白信号的Ptc抑制中的用途，例如抑制信号通路的smoothened或下游成分的激活，所述细胞、组织和器官包括正常细胞、组织和器官以及那些具有表型Ptc功能丧失、刺猬蛋白功能获得、smoothened功能获得或Gli功能获得的细胞、组织和器官。例如，所述方法为治疗和化妆品应用，包括神经组织的调节，骨和软骨的形成和修复，精子生成调节，良性前列腺增生调节，在湿性黄斑变性中的血管壁调节，银屑病调节，平滑肌调节，肺、肝和其它主要内脏器官的调节、造血功能的调节、皮肤和毛发生长的调节等。另外，所述方法可以在细胞上进行，可以是培养中的细胞(体外)或整个机体中的细胞(体内)。
综上所述，本发明还提供了在需要此类治疗的患者中预防或治疗上述任何疾病或病症的方法，该方法包括给予所述患者治疗有效量的(参见下文“给药和药用组合物”)式I化合物或其药学上可接受的盐。对于任何上述用途而言，需要的剂量取决于给药的模式、待治疗的特定疾病以及预期的效果。
给药和药用组合物
一般而言，通过任何本领域常用的和可接受的方法，本发明化合物可以以治疗有效量单独进行给药，或者与一种或多种治疗药物组合给药。治疗有效量可以在很大程度上进行变化，这取决于疾病的严重性、个体的年龄和相对健康状况、所用化合物的效能以及其它因素。一般情况下，日剂量约0.03-2.5mg/kg体重的全身给药可获得令人满意的结果。在大型哺乳动物例如人类中，推荐的日剂量范围为约0.5mg至约100mg，例如以最多每日四次的分剂量或以缓释形式方便地给药。用于口服给药的合适的单位剂型包含约1-50mg活性成分。
本发明的化合物可以作为药物组合物通过任何常规途径给药，特别是胃肠内(例如口服)途径，例如以片剂或胶囊剂形式给药；或者通过胃肠外途径，例如以可注射的溶液剂或混悬液形式给药；通过局部给途径，例如以洗剂、凝胶剂、软膏剂或霜剂的形式给药；或者以经鼻形式或栓剂形式给药。含有游离形式或可药用盐形式的本发明化合物以及至少一种可药用的载体或稀释剂的药物组合物可以按常规方式通过混合、制粒或包衣的方法制备。例如，口服组合物可以是片剂或明胶胶囊，它包含活性成分与a)稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如硅胶、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁或钙盐和/或聚乙二醇；对于片剂而言，还包含c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯酮；如果需要的话，还可以包含d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻酸及其钠盐或泡腾混合物；和/或e)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。可注射的组合物可以是等渗的水溶液或混悬液，栓剂可以自脂肪乳剂或混悬剂制备。该组合物可以灭菌和/或包含辅助剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、溶液促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可以包含其它有治疗价值的物质。用于透皮给药的合适制剂包含有效量的本发明化合物和载体。载体可以包含可吸收的药理学可接受的溶剂以有助于通过宿主皮肤。例如，透皮装置为绷带形式，它包括背衬、含有化合物以及任选载体的贮库、任选的速率控制屏障(它以可控的和预设的速率在延长的时期内向宿主皮肤传递所述化合物)以及将该装置固定于皮肤的工具。还可以采用基质型透皮制剂。用于局部使用(例如用于皮肤和眼睛)的合适的制剂优选本领域内众所周知的水溶液、软膏剂、霜剂或凝胶剂。此类制剂可以含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
本发明化合物可以以治疗有效量与其它治疗方法联合应用，其它方法例如放疗、骨髓移植或激素治疗。
本发明的化合物可以以治疗有效量与一种或多种治疗药物组合给药(药物组合产品)。例如，与用于治疗淋巴瘤或骨髓瘤的免疫调节剂、抗炎物质、其它抗肿瘤治疗剂、化疗剂、切除术(ablation)或其它治疗激素类、抗肿瘤剂和/或单克隆抗体联合应用可以产生协同作用。某些众所周知的抗癌药物在本领域中已有报道，例如，《癌症治疗：实验和临床药物(Cancer Therapeutics：Experimental and clinical Agents)》，Teicher(编辑)，Humana Press(第一版，1997)；和《Goodman和Gilman的治疗药理学基础(Goodman and Gilman’sThe Pharmacolgical Basis of Therapeutics)》，Hardman等(编辑)，McGraw-Hill Professional(第10版，2001)。适当的抗癌药物的实例包括5-氟尿嘧啶、硫酸长春碱、磷酸雌氮芥、苏拉明和锶-89。适当的化疗药物的实例包括天门冬酰胺酶、硫酸博来霉素、顺铂、阿糖胞苷、磷酸氟达拉滨、丝裂霉素和链脲霉素。
当本发明化合物与其它治疗方法联合应用时，联合给药的化合物的剂量当然取决于采用的联合给药的类型、采用的特定药物、待治疗的疾病等等。
本发明还提供了药物组合产品，例如药盒，它包含a)第一种药物，为游离形式或可药用盐形式的如本文所公开的本发明化合物，以及b)至少一种联合药物。该药盒可以包含用于其给药的说明书。
本文所用的术语“联合给药”或“组合给药”等的含义包括向单个患者给药所选择的治疗药物的给药，还包括其中所述药物不是必须在相同时间或通过相同给药途径给药的治疗方案。
本文所用的术语“药物组合产品”的含义是将一种以上的活性成分混合或组合所获得的产品，包括活性成分的固定组合和非固定组合。术语“固定组合”是指活性成分(例如式I化合物)和联合药物以单一实体或剂型的形式同时给予患者。术语“非固定组合”是指活性成分(例如式I化合物)和联合药物作为分离的实体同时或在没有特别时间限制下共同或先后给药于患者，其中此类给药方式在患者体内提供了这两种化合物的治疗有效水平。后者还应用于鸡尾酒疗法，例如用于3种或更多种活性成分的给药。
制备本发明化合物的方法
本发明也包括本发明化合物的制备方法。在所述反应中，如果在终产物中需要反应性官能团(例如羟基、氨基、亚氨基、硫代基团或羧基)的存在，则有必要对其加以保护以避免其参与不需要的反应。根据标准实践，可以采用常规的保护基团，例如，参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts的《有机化学中的保护基团(Protective Groups in Organic Chemistry)》，John Wiley andSons，1991。
式I化合物可以根据下列反应流程I中的方法制备：
反应流程I
其中Y1、Y2、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9如发明内容中式I所定义。在约-20至约100℃的温度范围内，在适当的溶剂(例如，二氯甲烷，N，N--二甲基甲酰胺甲酰胺等)存在下，通过使得式2(或2’)化合物与式3式化合物反应，可以制备I化合物。反应可以进行至多约20小时直到完成。
式I化合物合成的详细实例可以参见下文中的实施例。
制备本发明化合物的其它方法
通过将游离碱形式的所述化合物与可药用的无机或有机酸反应，可以将本发明化合物制备为可药用的酸加成盐。或者，通过将游离酸形式的所述化合物与可药用的无机或有机碱反应，可以制备本发明化合物的可药用的碱加成盐。
或者，可以使用原料或中间体的盐制备本发明化合物的盐形式。
可以分别从相应的碱加成盐或酸加成盐形式制备本发明化合物的游离酸或游离碱形式。例如可以通过用合适的碱(例如氢氧化铵溶液、氢氧化钠等)处理，使酸加成盐形式的本发明化合物转化为对应的游离碱。可以通过采用适当的酸(例如盐酸等)处理，使碱加成盐形式的本发明化合物转化为对应的游离酸。
在适当的惰性有机溶剂(例如乙腈、乙醇、二氧六环水溶液等)中，于0℃至80℃，通过用还原剂(例如，硫、二氧化硫、三苯基膦、硼氢化锂、硼氢化钠、三氯化磷、三溴化磷等)处理，可以自本发明化合物的N-氧化物制备本发明化合物的未氧化形式。
可以通过那些本领域普通技术人员公知的方法来制备本发明化合物的前药衍生物(例如，进一步的细节参见Saulnier等，(1994)，Bioorganic andMedicinal Chemistry Letters，第4卷，1985页)。例如，通过使得非衍生化的本发明化合物与适当的氨甲酰化试剂(例如，1，1-酰氧基烷基氯甲酸酯(1，1-acyloxyalkylcarbanochloridate)，对-硝基苯基碳酸酯等)反应，可以制备适当的前药。
可以通过那些本领域普通技术人员已知的方法来制备本发明化合物的被保护的衍生物。保护基团的产生及其去除的应用技术的详细描述可以参见T.W.Greene，“有机化学中的保护基团(Protecting Groups in OrganicChemistry)”，第3版，John Wiley and Sons公司，1999。
可以在本发明的反应过程中方便地制成或形成本发明化合物的溶剂合物(例如水合物)。可以采用有机溶剂例如二噁英、四氢呋喃或甲醇，通过自水/有机溶剂混合物中重结晶来方便地制备本发明化合物的水合物。
可以将所述化合物的外消旋混合物与光学活性的拆分试剂反应来形成一对非对映异构体化合物，然后分离非对映异构体并回收光学纯的对映异构体，制备作为其单一立体异构体的本发明化合物。虽然可以使用本发明化合物的共价非对映异构的衍生物来进行对映异构体的拆分，但优选可解离的复合物(例如结晶的非对映异构的盐)。非对映异构体具有不同的物理性质(例如熔点、沸点、溶解度、反应性等)，可以利用这些不同点容易地进行分离。可以通过色谱法或优选通过基于不同溶解度的分离/拆分技术来分离非对映异构体。然后通过不会导致外消旋化的任何实用方法回收光学纯的对映异构体与拆分试剂。用于将化合物的立体异构体从其外消旋混合物中拆分的技术的更加详细描述可以参见Jean Jacques，Andre Collet，Samuel H.Wilen，“对映体、外消旋体及拆分(Enantiomers，Racemates and Resolutions)，”John Wiley And Sons，Inc.，1981。
综上所述，式I化合物可以通过包括下列步骤的方法制备：
(a)反应流程I的方法；和
(b)任选将本发明化合物转化为药学上可接受的盐；
(c)任选将盐形式的本发明化合物转化为非盐形式；
(d)任选将非氧化形式的本发明化合物转化为药学上可接受的N-氧化物；
(e)任选将N-氧化物形式的本发明化合物转化为其非氧化形式；
(f)任选自异构体的混合物拆分本发明化合物的单一异构体；
(g)任选将非衍生化的本发明化合物转化为药学上可接受的前药衍生物；和
(h)任选将本发明化合物的前药衍生物转化为其非衍生化形式。
对于没有特别描述的原料的制备而言，所述化合物为已知的，或者可以根据本领域已知的方法制备，或者根据下文实施例中所公开的方法制备。
本领域技术人员可以理解，上述转化并非制备本发明化合物的唯一的代表性方法，也同样可以采用其它众所周知的方法。
具体实施方式
实施例
通过下列说明本发明式I化合物的制备方法的实施例进一步阐述了本发明，并非对其加以限定。
实施例1
4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[4-(吗啉-4-磺酰基)-苯基]-酰胺
步骤1：向3-碘-4-甲基-苯甲酸(10.0g，38.2mmol)的甲醇(70ml)溶液中加入浓硫酸(0.5ml)。将反应混合物于70℃加热48小时，冷却至室温，然后浓缩。然后，向残留物中加入乙酸乙酯(100ml)和NaHCO3(饱和的，100ml)水溶液。分离有机层，再次用NaHCO3(饱和的，100ml)水溶液洗涤。分离有机层，无水硫酸钠干燥并浓缩，得到3-碘-4-甲基-苯甲酸甲酯1。它无需进一步纯化可以直接用于下一步骤。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.31(s，1H)，7.87(d，1H，J＝8.4Hz)，7.48(d，1H，J＝8.4Hz)，3.85(s，3H)，3.35(s，3H)；LC-MS m/z：277.0(M+1)。
步骤2：向含有3-碘-4-甲基-苯甲酸甲酯(1.38g，5.00mmol)、4-氰基苯基硼酸(1.10g，7.48mmol)、乙酸钯(168mg，0.748mmol)、2-(二环己基膦基)联苯(0.526g，1.50mmol)和氟化钾(0.870g，15.0mmol)的圆底烧瓶中加入无水1，4-二氧六环(15ml)。向烧瓶中充入氩气并密封。将混合物于130℃搅拌18小时，冷却至室温，然后加入水(20ml)和乙酸乙酯(20ml)。真空过滤除去固体。滤液采用EtOAc(20ml×2)萃取。合并有机层，用HCl(5％，20ml)和饱和的NaHCO3(20ml)水溶液洗涤。将其经硫酸镁干燥并浓缩。残留物经硅胶柱色谱纯化(EtOAc/己烷，梯度洗脱)，获得4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸甲酯2；LC-MS m/z：252.1(M+1)。
步骤3：向4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸甲酯2(2.56g，10.3mmol)的1，4-二氧六环-H2O(1∶1混合物，20ml)溶液中加入NaOH(1.22g，30.2mmol))。将反应物于室温下搅拌24小时。向反应物中加入HCl(1N，36ml)水溶液，然后将其采用乙酸乙酯(40ml×3)萃取。合并有机层，无水硫酸钠过滤。除去溶剂(solver)。获得的固体采用少量的乙腈洗涤，空气干燥，获得4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸3：1H NMR(DMSO-d6)δ7.94(d，2H，J＝8.0Hz)，7.84(dd，1H，J1＝8.4Hz，J2＝1.2Hz)，7.75(d，1H，J＝1.2Hz)，7.61(d，2H，J＝8.0Hz)，7.48(d，1H，J＝8.4Hz)，2.29(s，3H)；LC-MS m/z 238.1(M+1)。
步骤4：向4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸3(40mg，0.17mmol)的无水二氯甲烷(5ml)混悬液中加入2滴DMF。然后加入草酰氯(32mg，22μl，0.25mmol)。将混合物于室温下搅拌直到其变得澄清。然后，将其浓缩，再溶于无水二氯甲烷(3ml)，加入4-(吗啉-4-磺酰基)-苯基胺(61mg，0.25mmol)和三乙胺(34mg，47μl，0.33mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液。将混合物搅拌2小时，浓缩，残留物经制备性质谱-HPLC(preparative mass triggered HPLC)纯化(C18柱，采用含有0.05％TFA的CH3CN-H2O洗脱)，获得4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[4-(吗啉-4-磺酰基)-苯基]-酰胺：1H NMR(DMSO-d6)δ10.64(s，1H)，8.07(d，2H，J＝8.8Hz)，7.97(d，2H，J＝8.4Hz)，7.95(d，1H，J＝8.8Hz)，7.89(s，1H)，7.43(d，2H，J＝8.4Hz)，7.67(d，2H，J＝8.8Hz)，7.53(d，2H，J＝8.8Hz)，3.63(m，4H)，2.84(m，4H)2.32(s，3H)；LC-MS m/z：462.1(M+1)。
实施例2
4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(2，6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺
步骤1：向2-氯代-5-硝基-吡啶4(2.38g，15mmoL)和cis-2，6-二甲基吗啉(1.73g，15mmoL)的溶液中加入K2CO3(4.14g，30mmoL)。将混合物于50℃加热过夜。浓缩后，将残留物在EtOAc和水之间分配。EtOAc层经无水硫酸钠干燥并浓缩，获得为黄色固体的粗品产物6。粗品产物无需进一步纯化可以直接用于下一步骤。LC-MS m/z：238.1(M+1)。
步骤2：在氢气环境下，在MeOH(100mL)中，在Pd-C(0.2g)存在下，将上述粗品产物6氢化。将混悬液通过硅藻土过滤，滤液浓缩，获得为深棕色油状物的粗品产物7，它无需进一步纯化可以直接用于下一步骤。LC-MSm/z：208.1(M+1)。
步骤3：向3-溴-4-甲基苯甲酸(108mg，0.5mmoL)、6-(2，6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基胺7(104mg，0.5mmoL)和HATU(190mg，0.5mmoL)的无水DMF(5mL)溶液中滴加三乙胺(139μL，1.0mmoL)。将获得的混合物于室温下搅拌2小时。浓缩后，将残留物在EtOAc和水之间分配。将有机层干燥并浓缩，获得粗品产物。终产物经快速柱色谱纯化，采用50％EtOAc的己烷溶液作为洗脱剂，获得为白色固体的8。LC-MS m/z：404.1(M+1)。
步骤4：在微波照射下，将4-氰基苯基硼酸(18mg，0.12mmol)、3-溴-N-[6-(2，6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-4-甲基-苯甲酰胺8(40mg，0.1mmol)、Pd(PPh3)4(11mg，0.01mmol)和Na2CO3(42mg，0.4mmol)在甲苯(0.2mL)、水(0.2mL)和乙醇(0.05mL)的混合溶剂系统中于140℃加热30分钟。反应混合物用EtOAc和水稀释。水层用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，浓缩，获得粗品产物，将其经制备性质谱-HPLC纯化(C18柱，采用含有0.05％TFA的CH3CN-H2O洗脱)，获得4′-氰基-6-甲基-联苯基-3-甲酸[6-(2，6-二甲基-吗啉-4-基)-吡啶-3-基]-酰胺。LC-MS m/z：427.2(M+1)。
通过重复上述实施例中所述方法，采用适当的原料，获得如表1中所鉴定的下列式I化合物。
表1
用于分析本发明化合物的通用材料和方法公开于PCT申请号PCT/US2007/038171“用于治疗淋巴瘤和骨髓瘤的化合物和组合物(Compounds and Compositions for Treating Lymphoma and Myeloma)”；Dierks和Warmuth。该申请的全部公开以其全部内容和所有的目的引入本文作为参考。对本发明化合物进行分析以评价其抑制刺猬蛋白信号通路的能力。
用于Hh通路抑制的Gli-Luc报道分子分析
于37℃、5％CO2的空气环境中，将小鼠TM3细胞(获自美国典型物保藏中心(American Type Culture Collection)，ATCC，Manassas，VA)在DMEM/F12培养基(Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养，所述培养基补充有5％热灭活马血清和2.5％FBS(Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA)、50单位/mL青霉素和50μg/mL链霉素(Gibco/Invitrogen，Carlsbad，CA)。将TM3细胞采用pTA-8xGli-Luc报告质粒转染。选择稳定转染的克隆TMHh-12。TMHh-12克隆对Shh-N刺激显示良好的应答。为了评价拮抗剂的IC50，将8000个TMHh-12细胞涂布于含有50％DMEM/F12培养基(补充有2％FBS)的384孔的每一个孔中。12小时后，通过加入重组小鼠Shh蛋白(在E.coli中表达，8μg/mL)或通过加入Smo激动剂激活Hh通路。向各个板中加入不同浓度的实验化合物。48小时后，采用Bright-GloTM荧光素酶分析系统(Promega，Madison，WI)分析萤火虫荧光素酶的活性。当所述化合物的作用将荧光信号降低达50％时测定IC50。这些化合物的毒性在TM3细胞中采用CellTiter Glo分析测定，或者通过TM3-Luc细胞系(采用构成性荧光素酶表达载体稳定转染的TM3细胞)评价。
式I化合物优选具有EC50小于500nM，更优选小于200nM。
抑制Hh通路终止淋巴瘤的体内扩张
间质组织产生的刺猬蛋白配体是在体外培养条件下原发性淋巴瘤细胞的重要的生长和生存因子。淋巴瘤细胞在体内的生长和扩张也依赖于Hh信号。将表达荧光素酶的1e6淋巴瘤细胞注射到同源C57BL/6小鼠中。注射后的第2天，通过口服给药，将小鼠分别采用载体对照或本发明化合物(50、25、10和5mg/kg/bid)治疗10天。每周三次，通过生物发光成像测定荧光素酶水平。注射后10天，对照组在所有注射小鼠的淋巴结和脾脏中均显示较高的荧光。与对照组相比，采用本发明化合物以50、25和10mg/kg/bid治疗的小鼠显示荧光信号降低至小于10％(T/C低于10％)。5mg/kg bid剂量组显示部分响应，T/C 40％(T/C from 40％)。因此，断定刺猬蛋白通路抑制降低了淋巴瘤在小鼠中的生长。
例如，表1中的化合物153达到充分的疗效，也就是说，当剂量为50mg/kg/日时，化合物153的存在完全阻断了淋巴瘤细胞的扩张。
胚胎皮肤穿孔(Punch)分析
采用皮肤穿孔分析，测定本发明化合物治疗非黑素瘤皮肤癌即基底细胞癌损害的能力。自Ptch+/--LacZ小鼠采集小鼠胚，在妊娠后期(胚胎天数为第17.5天)将其处死并剥离皮肤。将圆形穿孔(4mm直径)置于骨胶原包被的Transwell(BIOCOAT cell Culture Insert，Becton Dickinson Labware，Bedford，MA)中，于空气-液体界面处培养，表皮一侧向上。培养介质含有5％FBS的DMEM/F12(3∶1)溶液，其中加有表皮生长因子、胰岛素和氢化可的松。为了诱导基底细胞样巢(basaloid nests)的形成，在1-2μg/ml Shh存在下，使得穿孔生长4天或以上。加入Shh的同时或者采用Shh预处理6天后，测定本发明化合物的作用。本发明化合物在浓度为1μM或更低的情况下显示完全抑制(预防了损害的形成)。
为阻断基底细胞样形成，式I化合物优选的EC50小于500nM，更优选小于200nM。例如，表1中的化合物153完全阻断基地血样细胞形成，EC50小于200nM。
银屑病分析
根据Tas & Avci，Pharmacology and Treatment，Dermatology 2004；209：126-131中所述的分析方法，测定本发明化合物治疗银屑病皮肤损害的能力。
应当理解，本文所描述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，本领域技术人员可对其进行各种修饰或改变，这些修饰或改变均包含在本申请的主旨和范围内以及权利要求书的范围之内。本文所引用的全部出版物、专利和专利申请均以其全部目的引入本文作为参考。

Claims (8)

1.治疗有效量的由以下结构
表示的N-(6-((2R，6S)-2，6-二甲基吗啉代)吡啶-3-基)-2-甲基-4′-(三氟甲氧基)联苯基-3-甲酰胺制备用于治疗血液癌症的药物的应用。
2.如权利要求1的应用，其中所述癌症是浆细胞瘤。
3.如权利要求1的应用，其中所述癌症是白血病。
4.如权利要求3的应用，其中所述癌症是儿童白血病。
5.权利要求1的应用，其中所述癌症是淋巴瘤。
6.权利要求5的应用，其中所述癌症是恶性淋巴瘤。
7.权利要求5的应用，其中所述癌症是霍奇金淋巴瘤。
8.权利要求1的应用，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
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