CN101812491A - 一种发酵生产阿魏菇多糖及其口服液的方法 - Google Patents
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Abstract
一种发酵生产阿魏菇多糖及其口服液的方法,本发明的一个方面提供基于阿魏菇生物学特性的罐批发酵方法，该方法包括母种的斜面培养、原种的种瓶培养、种液的150L-1500L种子罐扩大培养和10m3发酵罐发酵培养。本发明的另一个方面提供基于阿魏菇多糖理化特性和阿魏菇菌体细胞结构组成特点的后提取方法，该方法包括包括发酵产物的预处理、阿魏菇多糖的连续提取及浓缩、低温醇析、两步脱溶的步骤。本发明的另一个方面还提供基于阿魏菇多糖营养保健功能的口服液生产方法，该方法包括配料、匀质、灌封、杀菌、抽检及包装的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵生产阿魏菇多糖及其口服液的方法，具体地涉及一种基于阿魏菇的生物学特性、通过液体深层发酵实现阿魏菇多糖及其口服液工业化生产的方法。
背景技术
阿魏菇(Pleurotus ferulae Lanzi)又名阿魏侧耳、阿魏蘑菇、白灵菇，是南欧、北非、中亚内陆地区春末夏初发生的品质极为优质的一种大型肉质珍稀食用真菌，是近几年发展起来的食用菌新秀之一。我国野生阿魏菇仅分布于新疆荒漠地区(木垒、托里、阿勒泰、伊犁、塔城等地)的阿魏滩上，因其生长于伞形花科植物阿魏(Ferula.asafoetide)的根上而得名。阿魏菇集食用、药用于一身，营养成份全面丰富且含量又高，被学者美誉为当今食用菌皇后，在食用菌族中独秀一枝，与另一种高档药食两用菌-羊肚菌并称为姊妹菌。阿魏菇生物活性有效组分食药用真菌多糖的含量很高，其子实体多糖和液态深层发酵培养过程中产生的真菌多糖入药有消积杀虫的作用，对腹部肿痛、腹部肿块、癌症等均有显著疗效。目前，阿魏菇多糖的药用价值及其应用已为世界各国重视。
近年来，国内的研究重点已经由阿魏菇的栽培及菌种的驯化转移到其多糖的深层发酵、提取、分离纯化及活性功能等方面。传统的阿魏菇多糖的生产方法是从阿魏菇子实体中提取，但该法生产受子实体生产的季节性限制且生产成本高，而经液态深层发酵培养获得的阿魏菇菌丝体和发酵液，其营养价值和有效成分与子实体相当，并且液态深层发酵法具有生产周期短、生长条件易控制、产量高等优点，相对传统方法而言更易实现大规模产业化、周年化生产，且降低了生产成本。阿魏菇多糖的提取要根据多糖的存在形式及提取部位不同而采用不同的提取方法。从近年来报道的阿魏菇多糖酸提、碱提、热水浸提的实验结果来看，热水浸提法时间长、效率低，酸碱法又极易导致多糖的立体结构破坏及生物活性改变。而采用有关酶类对阿魏菇子实体和菌丝体进行预处理，或者借助超声波、微波等辅助手段来提高其多糖的提取率，将会有利于其糖类物质的溶出和分离，还降低了生产成本。从近几年的研究成果综合来看，无论是通过何种方法制备的阿魏菇多糖都含有半乳糖和葡萄糖，但分子量差别很大，试验原料不同、提取方法不同，得到的真菌多糖种类也不尽相同。近年来阿魏菇多糖的活性功能主要集中在免疫、抗氧化和抗肿瘤等方面的研究，研究发现，阿魏菇子实体粗多糖具有非特异性免疫功能和特异性细胞免疫功能，其菌丝体水溶性粗多糖和子实体水溶性纯多糖免疫活性不明显；热提阿魏菇多糖对·OH-和·O2均能有效清除，且对连苯三酚自氧化速率有明显的抑制作用，说明具有较强的抗氧化作用；阿魏菇水提多糖对各类型肿瘤细胞株的生长及蛋白质合成均有明显抑制作用，且表现出剂量依赖关系。
阿魏菇是深受消费者欢迎的食药用真菌，对其真菌多糖的研究及开发是今后阿魏菇研究和应用的重点。液态深层发酵是获取大量阿魏菇活性多糖的有效途径，提高阿魏菇多糖的提取率是进行多糖产品开发首要解决的关键问题。因此，应基于阿魏菇的生物学特性，更加深入地研究阿魏菇深层发酵的工艺条件，建立发酵过程动力学模型应，并结合阿魏菇细胞结构组成的特点，对阿魏菇多糖的提取方式和工艺进行进一步的研究，尽可能地提高多糖得率，减少多糖破坏。
本申请的发明人经过近几年对发酵法生产阿魏菇多糖工艺的潜心研究和对阿魏菇多糖口服液生产经验的全面总结，设计了一种基于阿魏菇生物学特性、通过液体深层发酵实现阿魏菇多糖及其口服液生产的方法，并在新疆离子束生物工程中心(有限公司)得到了实践验证，结果表明该方法是一种适用于阿魏菇多糖及其口服液工业化生产的新方法。
发明内容
本发明的一个方面提供基于阿魏菇生物学特性的罐批发酵方法，该方法包括母种的斜面培养、原种的种瓶培养、种液的150L-1500L种子罐扩大培养和10m3发酵罐发酵培养。优选地，在阿魏菇的罐批发酵的步骤中还包括通过pH变化判断阿魏菇的生理周期和以pH骤降时间作为发酵终点结束的判据，以此为判据结束发酵，阿魏菇菌丝体多糖的产量达到900mg/L的最高水平。
其中，培养基是食用菌深层发酵过程中的关键因素之一，由于深层培养是在液体中培养菌丝体，培养液是菌丝体赖以生存的营养条件和进行物质、能量交换的场所，培养基的组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离纯化、乃至产品的质量和产量都有重要的影响。大量研究表明，碳氮比对阿魏菇的生长和产物形成有很大的影响，碳氮比不但会妨碍菌丝按比例吸收营养物；氮不足表现为菌丝繁殖慢，碳不足表现为菌体易衰老和自溶；同样速效性和迟效性的碳源或氮源，以及有机的和无机的氮源的比例也会影响其菌丝对营养物的均匀吸收。
pH值是食用菌菌丝体在一定环境条件下代谢活动的综合指标，它涉及各种酶系的活力，是一项重要的发酵参数，它对菌丝的生长和多糖的积累有很大的影响。阿魏菇以偏酸性环境中生长较快，在发酵过程中培养液逐渐变酸，在配制培养液时，一般接近6.5左右，发酵几天后即达到菌丝体的最适pH环境。
温度是影响食用菌生长和产物合成的重要因素之一，温度的变化对发酵过程可产生两方面的影响：一方面是影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质，另一方面是影响发酵液的物理性质；不同的菌株及同一菌株在不同的代谢阶段，其适宜的发酵温度也不同，因此选择控制适宜的发酵温度可以促使菌丝体增长。
接种量是影响食用菌发酵周期的重要因素。为了在尽量短的发酵时间内获得所需的菌丝体，发酵液接种一定量的壮年菌种是必需的，适宜的接种量可以缩短发酵阶段的菌体生长的延滞期，从而缩短发酵周期，最终提高发酵产物的生产强度。研究发现，阿魏菇每一级接种量为10％～15％时，菌丝生长较快，菌球小，菌液澄清，但以10％接种量菌丝产量最高。
搅拌转速也是发酵过程中较重要的参数之一，改变搅拌转速可改变供氧条件使菌体处于最佳溶解氧值，并使菌丝体处于均匀悬浮状态。大量实验表明，阿魏菇液体发酵转速以120r/min～160r/min为宜，生成的菌球均匀而稠密；低于此转速，生长较缓慢，菌丝球直径大小不一；进一步提高转速，虽菌丝球直径变小，发酵周期缩短，但最终菌丝体干重无显著差异。
本发明的另一个方面提供基于阿魏菇多糖理化特性和阿魏菇菌体细胞结构组成特点的后提取方法，该方法包括包括发酵产物的预处理、阿魏菇多糖的连续提取及浓缩、低温醇析、两步脱溶的步骤。优选地，在阿魏菇多糖后提取的步骤中还包括超声波辅助两次连续提取和两步脱溶的步骤，两次连续提取后阿魏菇多糖的提取率在95％以上，两步脱溶后阿魏菇多糖的溶剂残留量可控制在50ppm以内。
本发明的另一个方面还提供基于阿魏菇多糖营养保健功能的口服液生产方法，该方法包括配料、匀质、灌封、杀菌、抽检及包装的步骤。优选地，在阿魏菇多糖口服液生产的步骤中还包括高压匀质的步骤，高压匀质后灌封生产的阿魏菇多糖口服液呈浅棕黄色、澄清、无分层、无沉淀。
该方法已经在新疆离子束生物工程中心(有限公司)得到了实践验证，结果表明该方法是一种适用于阿魏菇多糖及其口服液工业化生产的新方法。
具体实施方式
实施例1、基于阿魏菇生物学特性的罐批发酵方法
基于阿魏菇生物学特性的罐批发酵方法包括母种的斜面培养、原种的种瓶培养、种液的150L-1500L种子罐扩大培养和10m3发酵罐发酵培养几个阶段。经过种瓶恒温培养菌丝体长满种瓶后，用无菌接种铲将菌丝块搅碎并瓶于装有1500mL无菌水的2000mL三角瓶中，加入适量广谱抗菌剂后接入一级种子罐，待菌丝体生物量最大化后，进行移种逐级扩培，发酵培养。
(1)、母种的斜面培养
用无菌接种钩刮取少量阿魏菇菌丝体，接种到PDA斜面培养基上，在28℃培养7d；
(2)、原种的种瓶培养
用无菌接种钩挑取一定量的斜面菌丝块，接种到装有350ml种瓶培养基的500ml广口瓶中，28℃恒温静置培养15d，其中，种瓶培养基的成分为(w/v)：木屑粉30％、麸皮粉7％、白砂糖0.5％、石膏0.5％、石灰2％，其余为无菌水；
(3)、种液的150L-1500L种子罐扩大培养
菌丝体长满种瓶后，用无菌接种铲将菌丝块搅碎并瓶于装有1500mL无菌水的2000mL三角瓶中，然后加入0.2％的土霉素等广谱抗菌素抑止杂菌污染，按1∶20的接种量接种于装有100L种液培养基一的150L气升式发酵罐中，通气充分搅拌培养，28℃发酵96小时；接着按10％的接种量接入装有1000L种液培养基二的1500L搅拌釜式发酵罐中扩培，25℃恒温培养96h；其中，150L、1500L搅拌釜式发酵罐的搅拌转速分别为200r/min和160r/min、空气流量分别为12m3/h和120m3/h，种液培养基一的成分为(w/v)：小麦粉1.5％、蔗糖1.0％、酵母膏0.4％、麸皮(煮汁)1.5％、KH2PO40.2％、MgSO40.15％，种液培养基二的成分为(w/v)：小麦粉0.7％、蔗糖0.7％、酵母膏0.28％、麸皮(煮汁)1.0％、KH2PO40.2％、MgSO40.15％，pH值灭菌前均自然，121℃灭菌30min。
(4)、10m3发酵罐发酵培养
将经过扩培的发酵液按1∶10的比例接种于装有7m3发酵培养基的10m3搅拌釜式发酵罐中，28℃恒温发酵120h后结束发酵；其中，搅拌转速为120r/min、空气流量为840m3/h，发酵培养基的成分为(w/v)：小麦粉0.5％、蔗糖0.5％、酵母膏0.2％、麸皮(煮汁)0.7％、KH2PO40.2％、MgSO40.15％，pH值灭菌前自然，121℃灭菌30min。
实施例2、基于阿魏菇多糖理化特性和阿魏菇菌体细胞结构组成特点的后提取方法
基于阿魏菇多糖理化特性和阿魏菇菌体细胞结构组成特点的后提取方法包括发酵产物的预处理、阿魏菇多糖的连续提取及浓缩、低温醇析、两步脱溶几个阶段。经过罐批发酵得到的发酵产物经过离心脱水、球磨破壁等预处理后，打入提取罐，两次充分连续提取后经过减压浓缩、低温醇析、两步脱溶等处理后，得到阿魏菇菌丝体粗多糖，以备阿魏菇多糖口服液等深加工产品添加之用。
(1)、发酵产物的预处理
将经过罐批发酵获得的发酵产物50L装入200目的过滤袋中置于SS800三足式离心机中，在1200r/min的转速下离心30min，再按料液比1∶1.5加入无水乙醇，在上述相同工作转速下离心30min，收集干菌体，然后将得到的干菌体50Kg平均装入4个25L球磨罐中置于QM-2SP100-GL球磨机中，在700r/min的转速下破壁30min，收集破碎菌体。
(2)、阿魏菇多糖的连续提取及浓缩
将经过预处理的发酵产物130Kg按料液比1∶5加入650L经过去离子处理的自来水平均打入700L 1、2号提取罐中，经过功率6KW的超声波处理5min后，在100℃的提取温度、50r/min的转速下搅拌提取60min，然后将1号罐中的提取液放入暂存罐中，关闭阀门再将2号提取罐的提取液打入1号提取罐中，暂存罐中的提取液打入2号提取罐中，在上述相同的提取条件下搅拌提取60min，接着将提取液放入暂存罐中，开启减压阀门在0.08Mpa的负压下提取液被倒吸入2.5m2刮膜式旋转蒸发器中在95℃、200r/min减压浓缩，蒸发的水蒸气经过10m2冷凝器在0℃液化回收到1.5m3溶剂回收罐中，得到的浓缩物打入醇析罐中结晶。
(3)、低温醇析
将得到的浓缩物按料液比1∶5打入装有150L无水乙醇的200L醇析罐中在-4℃结晶12h，然后放入12-15个孔径38μm的尼龙袋中挂于300L存储罐中过滤24h，将得到的结晶物倒入30L不锈钢桶中以备后续脱溶。
(4)、两步脱溶
称量30Kg结晶物倒入脱溶锅中，在60℃的脱溶温度、0.08MPa工作压力下减压脱溶2h；然后从脱溶锅底部通入N2，在上述相同的条件下减压脱溶1.5h。最后，收集阿魏菇菌丝体粗多糖，以备阿魏菇多糖口服液等深加工产品添加之用。
实施例3、基于阿魏菇多糖营养保健功能的口服液生产方法
基于阿魏菇多糖营养保健功能的口服液生产方法包括配料、高压匀质、脱气灌封、杀菌、抽检及包装几个阶段，经过上述操作生产的阿魏菇多糖口服液呈浅棕黄色、澄清、清凉爽口、酸甜适中、无分层、无沉淀，阿魏菇多糖含量≥1.0g/L、总酸(以柠檬酸计)＜1.0％、pH值4.20，细菌数＜1000cfu/g、霉菌数＜100cfu/g、大肠菌群、致病菌未检出。
(1)、调配
按照正交优化获得的阿魏菇多糖口服液配方称量配料，然后将原料边搅拌边加入50℃的蒸馏水中进行调配，其中，口服液配方为(w/v)：5.0g/L的阿魏菇多糖溶液20％、甜味剂蔗糖12％、酸味剂(柠檬酸、柠檬酸钠质量比10∶1)0.1％、稳定剂(海藻酸钠、CMC-Na质量比2∶1)0.2％、Vc 0.02％。
(2)、高压匀质
将调配好的浆液加入稳定剂后均质，均质压力为15～20MPa。
(3)、脱气灌封
均质后，将料液进行脱气处理，适宜条件为0.05MPa脱气10min，脱气后，按10mL/瓶的量在全自动灌装生产线上灌装、压盖密封。
(4)、杀菌
采用高温灭菌，灭菌条件：115℃灭菌30min。
(5)、抽检及包装
冷却后，对产品进行随机抽样进行理化指标(见表1)、微生物指标检验，最后，对合格品进行贴签、装盒、装箱入库。
表1理化指标
通过上述具体的实施例，更容易理解本发明。上述实施例只是举例性的描述，而不应当被理解为用来限制本发明的范围。
Claims (3)
1.一种基于阿魏菇生物学特性的罐批发酵方法，其特征在于：母种的斜面培养：用无菌接种钩刮取少量阿魏菇菌丝体，接种到PDA斜面培养基上，在28℃培养7d；原种的种瓶培养：用无菌接种钩挑取一定量的斜面菌丝块，接种到装有350ml种瓶培养基的500ml广口瓶中，28℃恒温静置培养15d，其中，种瓶培养基的成分为(w/v)：木屑粉30％、麸皮粉7％、白砂糖0.5％、石膏0.5％、石灰2％，其余为无菌水；种液的150L-1500L种子罐扩大培养：菌丝体长满种瓶后，用无菌接种铲将菌丝块搅碎并瓶于装有1500mL无菌水的2000mL三角瓶中，然后加入0.2％的土霉素等广谱抗菌素抑止杂菌污染，按1∶20的接种量接种于装有100L种液培养基一的150L气升式发酵罐中，通气充分搅拌培养，28℃发酵96小时，接着按10％的接种量接入装有1000L种液培养基二的1500L搅拌釜式发酵罐中扩培，25℃恒温培养96h，其中，150L、1500L搅拌釜式发酵罐的搅拌转速分别为200r/min和160r/min、空气流量分别为12m3/h和120m3/h，种液培养基一的成分为(w/v)：小麦粉1.5％、蔗糖1.0％、酵母膏0.4％、麸皮(煮汁)1.5％、KH2PO40.2％、MgSO40.15％，种液培养基二的成分为(w/v)：小麦粉0.7％、蔗糖0.7％、酵母膏0.28％、麸皮(煮汁)1.0％、KH2PO40.2％、MgSO40.15％，pH值灭菌前均自然，121℃灭菌30min；10m3发酵罐发酵培养：将经过扩培的发酵液按1∶10的比例接种于装有7m3发酵培养基的10m3搅拌釜式发酵罐中，28℃恒温发酵120h后结束发酵；其中，搅拌转速为120r/min、空气流量为840m3/h，发酵培养基的成分为(w/v)：小麦粉0.5％、蔗糖0.5％、酵母膏0.2％、麸皮(煮汁)0.7％、KH2PO40.2％、MgSO40.15％，pH值灭菌前自然，121℃灭菌30min。
2.一种基于阿魏菇多糖理化特性和阿魏菇菌体细胞结构组成特点的后提取方法，其特征在于：发酵产物的预处理：将经过罐批发酵获得的发酵产物50L装入200目的过滤袋中置于SS800三足式离心机中，在1200r/min的转速下离心30min，再按料液比1∶1.5加入无水乙醇，在上述相同工作转速下离心30min，收集干菌体，然后将得到的干菌体50Kg平均装入4个25L球磨罐中置于QM-2SP100-GL球磨机中，在700r/min的转速下破壁30min，收集破碎菌体；阿魏菇多糖的连续提取及浓缩：将经过预处理的发酵产物130Kg按料液比1∶5加入650L经过去离子处理的自来水平均打入700L 1、2号提取罐中，经过功率6KW的超声波处理5min后，在100℃的提取温度、50r/min的转速下搅拌提取60min，然后将1号罐中的提取液放入暂存罐中，关闭阀门再将2号提取罐的提取液打入1号提取罐中，暂存罐中的提取液打入2号提取罐中，在上述相同的提取条件下搅拌提取60min，接着将提取液放入暂存罐中，开启减压阀门在0.08Mpa的负压下提取液被倒吸入2.5m2刮膜式旋转蒸发器中在95℃、200r/min减压浓缩，蒸发的水蒸气经过10m2冷凝器在0℃液化回收到1.5m3溶剂回收罐中，得到的浓缩物打入醇析罐中结晶；低温醇析：将得到的浓缩物按料液比1∶5打入装有150L无水乙醇的200L醇析罐中在-4℃结晶12h，然后放入12-15个孔径38μm的尼龙袋中挂于300L存储罐中过滤24h，将得到的结晶物倒入30L不锈钢桶中以备后续脱溶；两步脱溶：称量30Kg结晶物倒入脱溶锅中，在60℃的脱溶温度、0.08MPa工作压力下减压脱溶2h；然后从脱溶锅底部通入N2，在上述相同的条件下减压脱溶1.5h，最后，收集阿魏菇菌丝体粗多糖，以备阿魏菇多糖口服液等深加工产品添加之用。
3.一种基于阿魏菇多糖营养保健功能的口服液生产方法，其特征在于：调配：按照正交优化获得的阿魏菇多糖口服液配方称量配料，然后将原料边搅拌边加入50℃的蒸馏水中进行调配，其中，口服液配方为(w/v)：5.0g/L的阿魏菇多糖溶液20％、甜味剂蔗糖12％、酸味剂(柠檬酸、柠檬酸钠质量比10∶1)0.1％、稳定剂(海藻酸钠、CMC-Na质量比2∶1)0.2％、Vc 0.02％；高压匀质：将调配好的浆液加入稳定剂后均质，均质压力为15～20MPa；脱气灌封：均质后，将料液进行脱气处理，适宜条件为0.05MPa脱气10min，脱气后，按10mL/瓶的量在全自动灌装生产线上灌装、压盖密封；杀菌：采用高温灭菌，灭菌条件：115℃灭菌30min；抽检及包装：冷却后，对产品进行随机抽样进行理化指标(见表1)、微生物指标检验，最后，对合格品进行贴签、装盒、装箱入库。
表1理化指标
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Free format text: FORMER OWNER: LIN ZENGXIANG LV ZHANGWU Effective date: 20120112 Owner name: XINJIANG UNIVERSITY Free format text: FORMER OWNER: CHEN HENGLEI Effective date: 20120112 |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 830008 URUMQI, XINJIANG UYGUR AUTONOMOUS REGION TO: 830046 URUMQI, XINJIANG UYGUR AUTONOMOUS REGION |
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Effective date of registration: 20120112 Address after: 830046 No. 14 Shengli Road, Xinjiang, Urumqi Applicant after: Xinjiang University Address before: 830008 No. 21 friendship north road, the Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi Applicant before: Chen Henglei Co-applicant before: Lin Zengxiang Co-applicant before: Lv Changwu |
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Granted publication date: 20130529 Termination date: 20190131 |