CN101797223A - 石杉碱甲眼用制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及石杉碱甲眼用制剂及其应用。所述的石杉碱甲眼用制剂在制备预防、治疗青光眼、眼压升高或伴有视网膜神经节细胞损伤的眼科疾病药物中的应用，所述的眼用制剂是石杉碱甲滴眼液和石杉碱甲眼用原位凝胶剂。本发明优点在于：成功开发了石杉碱甲滴眼液和石杉碱甲眼用原位凝胶剂，所述的两个剂型方便眼科疾病患者使用。所述的石杉碱甲眼用原位凝胶剂在体外为流动性良好的液体；滴眼时，剂量容易准确控制，使用方便；滴入眼内后，能均匀铺展，并形成凝胶，在眼内停留时间较长，不易流失进入全身而被吸收，能维持局部有效药物浓度，提高生物利用度，且毒性低，刺激性效，生物相容性好，是一个有效的治疗青光眼的药物，具有广阔的开发前景。

Description

石杉碱甲眼用制剂及其应用

【技术领域】

本发明涉及眼用制剂，尤其涉及石杉碱甲眼用制剂及其应用。

【背景技术】

青光眼是临床最常见的眼病之一，主要表现为眼内压增高导致眼底视神经乳头塌陷，视野变窄，视力下降，严重者可能失明，且一旦失明，就会永久丧失视力。近年大量研究表明视网膜神经细胞主要是神经节细胞(retinal ganglioncells，RGCs)的进行性死亡(凋亡为主)是青光眼视神经病变的关键机制。因此选择性阻抑视网膜神经细胞主要是RGCs死亡无疑成为防治青光眼的重要策略。

不可否认有效控制眼压是目前视神经保护的重要手段，但对非眼压因素所致视神经损害的防护仍不能忽视。因此，理想的抗青光眼药物不仅仅具有改善机械压力效应还应具有多靶点的视神经保护作用(青光眼的神经保护治疗一般是指药物直接作用于视网膜和视神经而预防、阻止或延缓RGCs死亡)。

石杉碱甲(Huperzine A，HupA)是我国从石杉属植物蛇足石杉中成功开发的新一代可逆、高效、高选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂，因具有独特的药理特征和低毒性，而引起了人们的广泛注意。Hup A通过与乙酰胆碱酯酶可逆性结合，使胆碱酯酶不能水解乙酰胆碱，从而乙酰胆碱水平升高，产生促胆碱能作用。石杉碱甲目前已被广泛用于治疗阿尔茨海默病、早老性痴呆、血管性痴呆以及改善学生的学习与记忆能力、脑外伤性记忆功能和认知功能。作为治疗老年痴呆的首选药物，已上市或研究的石杉碱甲有片剂，胶囊剂，滴丸，缓释微球，鼻腔给药等剂型，石杉碱甲在治疗眼科疾病方面的应用及眼用制剂的制备均未见文献报道。

当前临床常用眼科用药大多以滴眼液、药膏等传统剂型出现，滴眼液作为眼科最常用的局部给药剂型，因使用方便，生产成本低而使患者及生产企业乐于接受，但普通滴眼液滴入眼内后，易经鼻泪管损失造成全身吸收，且数分钟内可被泪液稀释至原来浓度的0.1％，因此需增加给药次数才能达到有效治疗浓度，给使用带来很多不便。眼膏虽然释药缓慢，但油腻感强且使用后影响视力及美观，夜间应用又易污染衣被，因而不受患者欢迎。目前市场上也又眼用凝胶剂商品，但多为粘稠状半固体，如果直接将凝胶滴入眼内，凝胶在眼内缺乏良好的铺展性，药物不易均匀分布，同时使用剂量也不能准确控制，还可能影响美观及视力，因此也非理想眼用制剂。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种石杉碱甲眼用制剂在制备预防、治疗眼科疾病药物中的应用。

本发明的再一的目的是，提供一种石杉碱甲眼用原位凝胶剂。

本发明的另一的目的是，提供一种石杉碱甲滴眼液。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：石杉碱甲眼用制剂在制备预防、治疗青光眼、眼压升高或伴有视网膜神经节细胞损伤的眼科疾病药物中的应用，所述的眼用制剂是石杉碱甲滴眼液和石杉碱甲眼用原位凝胶剂。

所述的石杉碱甲眼用原位凝胶剂是由下列组分组成：

组分                含量(重量％)

石杉碱甲            0.001-1

0.1N HCl            0.002-0.2

增稠剂              0.05-20

等渗调节剂          0-40

防腐剂              0.01-0.5

络合剂              0-0.1

pH调节剂            0-0.05

水                  余量，

所述的增稠剂含有温度敏感型、pH敏感型或离子敏感型高分子材料中的一种或多种；

所述的等渗调节剂是选自甘露醇、葡萄糖、氯化钠、甘油或丙二醇；

所述的防腐剂选自苯扎氯胺、苯扎溴胺、尼泊金甲、乙、丙酯中的一种或多种；

所述的pH值调节剂选自盐酸、硼酸、枸橼酸、硼酸钠、枸橼酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、或三乙醇胺。

所述的石杉碱甲滴眼液是由下列组分组成：

组分              含量(重量％)

石杉碱甲          0.001～1

0.1N HCl          0.002-0.02

增稠剂            0～15

防腐剂            0.01-0.5

等渗调节剂        0-40

pH值调节剂    0-0.05

络合剂        0-0.1

水            余量，

所述的增稠剂选自羟丙基甲基纤维素、透明质酸钠或聚乙烯醇；

所述的防腐剂选自苯扎氯胺、苯扎溴胺、尼泊金甲、乙、丙酯中的一种或一种以上的混合物的一种或多种；

所述的等渗调节剂是选自甘露醇、葡萄糖、氯化钠、甘油或丙二醇；

所述的pH值调节剂选自盐酸、硼酸、枸橼酸、硼酸钠、枸橼酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾或三乙醇胺；

所述的络合剂选自依地酸二钠。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种石杉碱甲眼用原位凝胶剂，所述的眼用原位凝胶剂是由下列组分组成：

组分            含量(重量％)

石杉碱甲        0.001-1

0.1N HCl        0.002-0.2

增稠剂          0.05-20

等渗调节剂      0-40

防腐剂          0.01-0.5

络合剂          0-0.1

pH调节剂        0-0.05

水              余量。

所述的增稠剂含有温度敏感型、pH敏感型或离子敏感型高分子材料中的一种或多种。

所述的等渗调节剂是选自甘露醇、葡萄糖、氯化钠、甘油或丙二醇。

所述的防腐剂选自苯扎氯胺、苯扎溴胺、尼泊金甲、乙、丙酯中的一种或多种。

所述的pH值调节剂选自盐酸、硼酸、枸橼酸、硼酸钠、枸橼酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾或三乙醇胺。

所述的增稠剂含有增稠剂可含有甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素、透明质酸钠的一种或多种。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种石杉碱甲滴眼液，所述的石杉碱甲滴眼液是由下列组分组成：

组分              含量(重量％)

石杉碱甲          0.001～1

0.1N HCl          0.002-0.02

增稠剂            0～15

防腐剂            0.01-0.5

等渗调节剂        0-40

pH值调节剂        0-0.05

络合剂            0-0.1

水                余量，

所述的增稠剂选自羟丙基甲基纤维素、透明质酸钠或聚乙烯醇；

所述的防腐剂选自苯扎氯胺、苯扎溴胺、尼泊金甲、乙、丙酯中的一种或一种以上的混合物的一种或多种；

所述的等渗调节剂是选自甘露醇、葡萄糖、氯化钠、甘油或丙二醇；

所述的pH值调节剂选自盐酸、硼酸、枸橼酸、硼酸钠、枸橼酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾或三乙醇胺；

所述的络合剂选自依地酸二钠。

需要说明的是：增稠剂必须含有温度敏感型、pH敏感型或离子敏感型高分子材料中的一种或多种；

温度敏感型高分子材料包括泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、N-异丙基丙稀酰胺共聚物和/或聚乙二酸-PLGA嵌段共聚物；

pH敏感型高分子材料包括醋酸纤维素酞酸酯，丙烯酸树脂卡波姆或聚乙烯缩醛二乙胺醋酸；

离子敏感型高分子材料包括去乙酰结冷胶、海藻酸钠、黄原酸、卡拉胶/文莱胶。

增稠剂可含有甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素、透明质酸钠的一种和/或多种。

本发明优点在于：

1、本发明经大量细胞、动物实验研究证明，药物石杉碱甲对视网膜神经节细胞具有良好的保护作用，口服及局部滴眼均有较好的降眼压作用，可用于预防及治疗青光眼。

2、本发明成功开发了石杉碱甲滴眼液和石杉碱甲眼用原位凝胶剂，所述的两个剂型方便眼科疾病患者使用。

3、石杉碱甲眼用原位凝胶剂适用于治疗各类青光眼及眼压升高或伴有视网膜神经节细胞损伤的眼科疾病。石杉碱甲眼用原位凝胶剂在体外为流动性良好的液体，滴眼时，剂量容易准确控制，使用方便，滴入眼内后，能均匀铺展，并形成凝胶，在眼内停留时间较长，不易流失进入全身而被吸收，能维持局部有效药物浓度，提高生物利用度，且毒性低，刺激性效，生物相容性好，是一个有效的治疗青光眼及高眼压的药物，能应用于临床，具有广阔的开发前景。

【附图说明】

图1：石杉碱甲眼用制剂对家兔瞳孔直径的影响，^*p＜0.05vs对照组，^**p＜0.01vs对照组。■：N生理盐水对照组，▲Drop石杉碱甲滴眼液组，◆Gel石杉碱甲眼用原位凝胶剂组

图2：石杉碱眼用制剂对甲基纤维素(CMC)致高眼压家兔眼压的影响，^*p＜0.05vs模型组，^**p＜0.01vs模型组。■：Model模型组，▲Drop石杉碱甲滴眼液组，◆Gel石杉碱甲眼用原位凝胶组

图3：石杉碱甲对视网膜神经节细胞(RGC-5)活力的影响，^**p＜0.01vs对照组，^##p＜0.01vs谷氨酸(glutamic acid，Glu)损伤组。

N正常对照组，

glu谷氨酸损伤组，

用药(石杉碱甲)组

图4：不同实验条件下视网膜神经节细胞形态学变化，A：正常组，B：谷氨酸损伤组，C：用药(石杉碱甲)组。

图5：石杉碱甲对视网膜神经节细胞凋亡的影响，A：正常组，B：谷氨酸损伤组，C：用药(石杉碱甲)组。

图6：不同条件下HE染色后视网膜切片组织学特征图，A：正常组，B：缺血再灌注损伤模型组，C：用药(石杉碱甲)组。

图7：石杉碱甲眼用原位凝胶剂与人工泪液混合前后流变学特征。

【具体实施方式】

下面结合附图对本发明提供的石杉碱甲眼用制剂及其应用具体实施方式作详细说明。

实施例一：石杉碱甲滴眼液的制备(一)

按下述配比取原料

石杉碱甲        0.1g

0.1N HCl        0.2g

HPMC            2g

葡萄糖          200g

苯扎溴胺        0.1g

去离子水        余量至1000ml(处方一般总量为1000ml)

制备方法如下：

取石杉碱甲，用0.1N HCl溶解，加注射用水稀释后；搅拌状态下加入HPMC直至溶解，放置12-24小时至完全溶胀溶解；搅拌条件下依次加入葡萄糖，苯扎溴胺，溶解并混匀，0.22μm微孔滤膜过滤，再自滤器上加水至总量混匀。所制备的石杉碱甲滴眼剂pH 6，粘度20cps，渗透压289mOsm，澄明度良好。

实施例二：石杉碱甲滴眼液的制备(二)

按下述配比取取原料

石杉碱甲        10g

0.1N HCl        2g

透明质酸钠      1g

葡萄糖          400g

尼泊金乙酯      0.1g

EDTA            0.01g

注射用水        余量至1000ml

制备方法如下：

取石杉碱甲，用0.1N HCl溶解，加注射用水稀释后；搅拌状态下加入透明质酸钠直至溶解，放置12-24小时至完全溶胀溶解；搅拌条件下依次加入葡萄糖，尼泊金乙酯，EDTA，溶解并混匀，0.22μm微孔滤膜过滤，再自滤器上加水至总量混匀。

所制备的石杉碱甲滴眼剂pH 6，粘度15cps，渗透压290mOsm，澄明度良好。

实施例三：石杉碱甲滴眼液的制备(三)

按下述配比取原料

石杉碱甲         0.01g

0.1N HCl         0.02g

聚乙烯醇         140g

NaCl             6g

尼泊金乙酯       0.1g

EDTA             0.01g

注射用水         余量至1000ml

制备方法如下：

取石杉碱甲，用0.1N HCl溶解，加注射用水稀释后；搅拌状态下加入聚乙烯醇直至溶解，放置12-24小时至完全溶胀溶解；搅拌条件下依次加入NaCl，尼泊金乙酯，EDTA，溶解并混匀，0.22μm微孔滤膜过滤，再自滤器上加水至总量混匀。所制备的石杉碱甲滴眼剂pH 7，粘度3cps(25℃±0.1℃)，渗透压290mOsm，澄明度良好。

实施例四：石杉碱甲眼用原位凝胶剂的制备(一)

按下述配比取原料

石杉碱甲        0.1g

0.1N HCl        0.02g

卡波姆971       3g

泊洛沙姆        130g

NaCl            6.0g

尼泊金甲酯      0.1g

EDTA            0.01g

硼酸            0.2g

注射用水        余量至1000ml

制备方法如下：

将石杉碱甲溶于0.1N HCl中，注射用水稀释后，搅拌状态下加入、卡波姆、泊洛沙姆，至溶解，放置过夜，使高分子材料完全溶胀溶解；搅拌条件下依次将NaCl，尼泊金甲酯，EDTA至充分溶解，用硼酸调节pH为5.5，溶液通过微孔滤膜过滤，再自滤器上加水至总量混匀。

实施例五：石杉碱甲眼用原位凝胶剂的制备(二)

按下述配比取原料

石杉碱甲        10g

0.1N HCl        2g

海藻酸钠        1g

HPMC            1g

葡萄糖          400g

苯扎溴胺        0.05g

三乙醇胺        0.01g

注射用水        余量至1000ml

制备方法如下：

将石杉碱甲溶于适量稀盐酸中，注射用水稀释后，搅拌状态下加入海藻酸钠、HPMC，至溶解，放置过夜，使高分子材料完全溶胀溶解；搅拌条件下依次将葡萄糖，苯扎溴胺，至充分溶解，用三乙醇胺调节pH为7，溶液通过微孔滤膜过滤，再自滤器上加水至总量混匀。

实施例六：石杉碱甲眼用原位凝胶剂的制备(三)

按下述配比取原料

石杉碱甲        0.01g

0.1N HCl        0.02g

卡波姆          2g

HPMC            1g

NaCl            5g

尼泊金乙酯      0.1g

EDTA            0.01g

硼酸            0.5g

注射用水       余量至1000ml

制备方法如下：

将石杉碱甲溶于0.1N HCl中，注射用水稀释后，搅拌状态下加入卡波姆、HPMC，至溶解，放置过夜，使高分子材料完全溶胀溶解；搅拌条件下依次将NaCl，尼泊金乙酯，EDTA至充分溶解，用硼酸调节pH为5，溶液通过微孔滤膜过滤，再自滤器上加水至总量混匀。

本发明的石杉碱甲原位凝胶剂为一种在体外呈流动性良好液体状态，滴入眼内成凝胶状态的眼用制剂。其毒性低刺激性小，生物相容性好，可提高患者依从性和耐受性。石杉碱甲眼用原位凝胶剂与人工泪液混合前后流变学特征见图7。本发明的石杉碱甲原位凝胶剂与滴眼液、眼膏等常用传统剂型相比有如下优点：(1)非生理条件下为流动性较好的液体，即传统的滴眼剂形式，进入眼内在生理条件下迅速发生相变成为粘弹性凝胶。具有使用方便，剂量准确，且与眼角膜作用时间长，生物利用度高等优点。(2)本发明的原位凝胶剂具有假塑性流变学特征，即随眨眼次数的增加，粘度逐渐降低，使用感觉舒适。同时因其在眼内停留时间长而具有缓释作用，可减少使用次数，大大方便患者，因此本发明的石杉碱甲眼用原位凝胶剂能应用于临床，具有广阔的开发前景。实施例七：石杉碱甲眼用制剂对家兔瞳孔直径的影响

1实验材料

1.1药物

实施例一提供的石杉碱甲滴眼液，实施例四提供的石杉碱甲原位凝胶剂。

1.2试验动物

新西兰大白兔，体重2.2-2.8kg，雌雄兼用，由上海交通大学医学院实验动物中心提供，许可证号SYXK 2003-0026。

2实验方法：

2.1瞳孔的测定

将兔固定于兔箱，在自然光线下用瞳孔尺(Castroviejo caliper)测量兔瞳孔直径。

2.2给药方法

选择健康无眼疾白色家兔30只，随机分成3组(每组十只兔20只眼)。分别为生理盐水组：每眼滴入生理盐水50μl；石杉碱甲滴眼液组：每眼滴入实施例一的石杉碱甲滴眼液50μl；石杉碱甲眼用原位凝胶剂组：每眼滴入实施例四的石杉碱眼用甲原位凝胶剂50μl。分别与给药前与给药后的30，60，90，120，180，210，240，270，310，330min测量兔瞳孔直径。

3统计学处理

所得数据均用mean±SEM表示，组间比较采用单因素方差分析(one wayanalysis of variance，ANOVA)。p＜0.05认为具有统计学意义。

4实验结果

石杉碱甲滴眼液和石杉碱甲眼用原位凝胶剂均使兔虹膜括约肌收缩，瞳孔缩小，并显时效关系，同时石杉碱甲眼用原位凝胶剂的缩瞳时间明显长于石杉碱甲滴眼液(见图1)。

实施例八：石杉碱甲眼用制剂对甲基纤维素(CMC)致高眼压家兔眼压(Intraocular pressure，IOP)的影响

1.1药物

实施例一提供的石杉碱甲滴眼液，实施例四提供的石杉碱甲原位凝胶剂。

1.2试验动物

新西兰兔，体重2.2-2.8kg，雌雄兼用，由上海交通大学医学院实验动物中心提供，许可证号SYXK 2003-0026。

2实验方法：

2.1眼压测定

将兔固定于兔箱，用0.1％丁卡因进行眼球表面麻醉，用眼压计测量眼压，重复测量三次，取其平均值，记录眼压曲线。

2.2兔高眼压模型的建立

选择健康无眼疾白色家兔，每兔从耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠(1mL/kg)全身麻醉。双眼滴入1％丁卡因局部角膜麻醉，用眼压计测量基础眼压，原发性高眼压者弃之不用。然后用4号针头沿角膜边缘内1mm处进针象前房穿刺，抽取房水0.05ml，换针管注入2％CMC0.05ml，拔出针头，即制成兔高眼压模型。

2.3给药方法

实验大白兔30只，随机分成3组(每组10只20只眼)。分别为生理盐水空白对照组：每眼滴入生理盐水50μl；石杉碱甲滴眼组：每眼滴入实施例一的石杉碱甲滴眼液50μl)，石杉碱甲眼用原位凝胶组(每眼滴入实施例四的石杉碱眼用甲原位凝胶剂50μl。分别与给药前与给药后的30，60，90，120，180，210，240，270，300，330min测量眼压。

3统计学处理

所得数据均用mean±SEM表示，组间比较采用单因素方差分析(one wayanalysis of variance，ANOVA)。p＜0.05认为具有统计学意义。

4实验结果

甲基纤维素(CMC)制作的高眼压模型，方法简单，重复性好，高眼压作用可靠，维持时间长。

在制备高眼压模型前，各组家兔基础眼压无明显差别。前房内注射CMC后随眼压的整个观察期间眼压均明显高于基础值(P＜0.01)。治疗组眼压也高于正常，但眼压上升幅度明显低于对照组，其中石杉碱甲眼用原位凝胶剂的降眼压时间较石杉碱甲滴眼液明显延长。(见图2)。

实施例九：石杉碱甲对视网膜神经节细胞(RGC-5)的体外保护实验

1实验材料

1.1细胞株

RGC-5视网膜神经节细胞株，购自ATCC。

1.2实验药品及试剂

石杉碱甲(上海中科院药物研究所)，用DMSO溶解制成贮备液，-20℃贮存，临用前用培养液稀释成所需浓度。

谷氨酸(Glu)购自Sigma，用培养液溶解制成贮备液，-20℃贮存，临用前用培养液稀释成所需浓度。

2实验方法

取稳定生长、复苏后培养3-10代的RGC-5细胞，0.25％胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，以3×10³/孔接种于96孔板，每孔100μl。细胞生长至70％-80％融合时，将细胞分为对照组、谷氨酸(Glu)处理组和药物预处理组，每组5复孔。药物预处理组分别应用0.1，1，10μM HupA预处理2h，然后加入5mMGlu。孵育24h后每孔加入MTT溶液10μl，37℃继续培养4h，弃上清液，加入DMSO 200μl/孔，振荡10min充分溶解染料结晶，酶标仪测定吸光度(测定波长490nm，参考波长655nm)。

细胞存活率(％)＝用药组细胞存活率/对照组细胞存活率×100％

3实验结果

HupA预处理能够剂量依赖性地抑制Glu(5mM)的细胞毒性，表现为细胞存活率的增加(见图3)和细胞形态、密度的改善(见图4)，表明HupA对谷氨酸引起的视网膜神经细胞损伤有明显的保护效应。

4统计学处理

所得数据均用mean±SEM表示，组间比较采用单因素方差分析(one wayanalysis of variance，ANOVA)。p＜0.05认为具有统计学意义。

实施例十：流式细胞仪测定细胞凋亡率

1实验材料：见实施例九

2实验方法

取稳定生长、复苏后培养3-10代的RGC-5细胞，0.25％胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，以1×10⁵/ml接种于6孔板，每孔2ml。细胞生长至70％融合时，将培养液换为无血清培养液，并将细胞分为对照组、Glu处理组和HupA预处理组，每组2复孔。药物预处理组应用1μM HupA预处理2h，然后加入5mMGlu。孵育24h后，参照凋亡试剂盒说明进行凋亡检测。

3实验结果

与MTT实验结果相似，5mM Glu诱发了明显的细胞凋亡；HupA(1μM)预处理能够抑制Glu的促凋亡作用(见图5)。

实施例十一：石杉碱甲对视网膜神经节细胞的体内保护实验

1实验材料

1.1实验动物

Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，体重在250-350g，由上海交通大学医学院实验动物中心提供，标准号为清洁级，所有大鼠经一般检查和眼部检查均无异常后采用。全身情况要求：毛发色泽光亮，无脱毛，四肢和尾部无疾缺，颈部无歪斜。眼部检查要求：双侧眼球等大，眼睑完整，睫毛整齐，角膜透明，前房清晰，瞳孔对光反射灵敏。均取左眼做损伤模型。

1.2主要试剂

石杉碱甲，戊巴比妥钠，盐酸利多卡因注射液

2实验方法

2.1动物模型的建立

1)石杉碱甲预处理

滴眼组组给予0.01％石杉碱甲滴眼，每天4次，连续3天。

2)大鼠视网膜缺血/再灌注模型的建立

腹腔注射3％戊巴比妥钠麻醉后，用5号一次性输液针头做左眼前方穿刺，经一次性消毒输液器连接乳酸钠林格氏液输液瓶。将液面高度调整至距实验眼水平面150cm，使之产生约110mmHg静水压。在大鼠左眼前房内持续加压灌注，50min后拔除针头，大鼠自行苏醒。左眼前房注入生理盐水加压，此时可见动物左眼虹膜苍白，角膜浑浊，外突，并维持此眼内压50min。然后将眼压缓慢降至加压前水平。视网膜缺血/再灌注的判定：提升眼压后以1％阿托品眼膏散瞳，直接检眼镜检查眼底，以视网膜动脉血中断，视网膜苍白为视网膜缺血成功标志；视网膜动脉学流恢复，视网膜充血微视网膜再灌注成功标志。当眼压升高后，可以见到眼球在约2min内变白(由于眼底血管被阻断，导致眼底反光由红色变为白色，同时虹膜也因缺血而变白)。如果在前房穿刺中不慎损伤晶状体，则去掉该动物的数据。对照组只滴加了消炎药，但没有做前房穿刺和眼压升高。

3)术后石杉碱甲继续滴眼，每天4次，连续3天。

4)组织制备

实验动物达存活时间点后，麻醉下急性取双眼眼球，3.7％甲醛溶液固定，去角膜，晶状体和玻璃体后，常规乙醇梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，平行于眼球剖面通过视神经作连续切片，常规HE染色。

5)数据收集和处理

每只动物取2张切片，每张切片采用Laica数码相机在Laica显微镜40倍物镜下以视神经为中心对称取6个部位(3个部位/侧)摄片，用IPP图像分析系统进行分析。HE染色片测量内核层(IPL)和内网状层(INL)厚度，及RGCs密度(1mm视网膜中RGCs个数)。双盲计数节细胞层细胞数；数据对各组均数进行单因素方差分析。

3统计学处理

所得数据均用mean±SEM表示，组间比较采用单因素方差分析(one wayanalysis of variance，ANOVA)。p＜0.05认为具有统计学意义。

4实验结果

HE及尼氏染色显示正常对照组视网膜层次结构清晰；神经节细胞层(GCL)细胞排列紧密，细胞呈圆形或卵圆形，胞浆丰富，染色均匀，核呈圆形，核仁清晰；RGCs间的Muller细胞纤维栏排列整齐；内外网状层节后清晰；内外颗粒层结构清楚，排列均匀(见图6)。

模型组内层视网膜厚度变薄，IPL和INL厚度变小，GCL细胞数目显著减少，排列稀疏，RGCs固缩，形态不规则，细胞周围间隙扩大，核固缩，形态不一，染色不均；Muller西柏纤维栏排列紊乱，内外网状层变薄，结构尚清晰；内颗粒层细胞周围间隙扩大；外颗粒层结构尚清晰，排列均匀；视网膜各层轮廓清晰，未见炎性细胞浸润。

石杉碱甲组GCL细胞数目明显多于模型组，IPL和INL厚度恢复，内层视网膜变薄不明显。统计结果表明：急性高眼压组节细胞数明显低于正常对照组(P＜0.01)，石杉碱甲组可显著改善节细胞数目，明显高于急性高眼压组(P＜0.01)。IPL和INL厚度在石杉碱甲组也较急性高眼压组有明显恢复(表1)。

表1各组大鼠IPL、INL厚度及神经节细胞层(GCL)细胞数量比较(mean±s.e.m，n＝5)，^##P＜0.01vs模型组

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.石杉碱甲眼用制剂在制备预防、治疗青光眼、眼压升高或伴有视网膜神经节细胞损伤的眼科疾病药物中的应用，所述的眼用制剂是石杉碱甲滴眼液和石杉碱甲眼用原位凝胶剂。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的石杉碱甲眼用原位凝胶剂是由下列组分组成：

组分             含量(重量％)

石杉碱甲         0.001-1

0.1N HCl         0.002-0.2

增稠剂           0.05-20

等渗调节剂       0-40

防腐剂           0.01-0.5

络合剂           0-0.1

pH调节剂         0-0.05

水               余量，

所述的增稠剂含有温度敏感型、pH敏感型或离子敏感型高分子材料中的一种或多种；

所述的等渗调节剂是选自甘露醇、葡萄糖、氯化钠、甘油或丙二醇；

所述的防腐剂选自苯扎氯胺、苯扎溴胺、尼泊金甲、乙、丙酯中的一种或多种；

所述的pH值调节剂选自盐酸、硼酸、枸橼酸、硼酸钠、枸橼酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、或三乙醇胺。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的石杉碱甲滴眼液是由下列组分组成：

组分              含量(重量％)

石杉碱甲          0.001～1

0.1N HCl          0.002-0.02

增稠剂            0～15

防腐剂            0.01-0.5

等渗调节剂        0-40

pH值调节剂        0-0.05

络合剂            0-0.1

水                余量，

所述的增稠剂选自羟丙基甲基纤维素、透明质酸钠或聚乙烯醇；

所述的防腐剂选自苯扎氯胺、苯扎溴胺、尼泊金甲、乙、丙酯中的一种或一种以上的混合物的一种或多种；

所述的等渗调节剂是选自甘露醇、葡萄糖、氯化钠、甘油或丙二醇；

所述的pH值调节剂选自盐酸、硼酸、枸橼酸、硼酸钠、枸橼酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾或三乙醇胺；

所述的络合剂选自依地酸二钠。

4.一种石杉碱甲眼用原位凝胶剂，其特征在于，眼用原位凝胶剂是由下列组分组成：

组分              含量(重量％)

石杉碱甲          0.001-1

0.1N HCl          0.002-0.2

增稠剂            0.05-20

等渗调节剂        0-40

防腐剂        0.01-0.5

络合剂        0-0.1

pH调节剂      0-0.05

水            余量。

5.根据权利要求4所述的石杉碱甲眼用原位凝胶剂，其特征在于，所述的增稠剂含有温度敏感型、pH敏感型或离子敏感型高分子材料中的一种或多种。

6.根据权利要求4所述的石杉碱甲眼用原位凝胶剂，其特征在于，所述的等渗调节剂是选自甘露醇、葡萄糖、氯化钠、甘油或丙二醇。

7.根据权利要求4所述的石杉碱甲眼用原位凝胶剂，其特征在于，所述的防腐剂选自苯扎氯胺、苯扎溴胺、尼泊金甲、乙、丙酯中的一种或多种。

8.根据权利要求4所述的石杉碱甲眼用原位凝胶剂，其特征在于，所述的pH值调节剂选自盐酸、硼酸、枸橼酸、硼酸钠、枸橼酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾或三乙醇胺。

9.根据权利要求5所述的石杉碱甲眼用原位凝胶剂，其特征在于，所述的增稠剂含有增稠剂可含有甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素、透明质酸钠的一种或多种。

10.一种石杉碱甲滴眼液，其特征在于，石杉碱甲滴眼液是由下列组分组成：

组分              含量(重量％)

石杉碱甲          0.001～1

0.1N HCl          0.002-0.02

增稠剂            0～15

防腐剂            0.01-0.5

等渗调节剂        0-40

pH值调节剂        0-0.05

络合剂            0-0.1

水                余量，

所述的增稠剂选自羟丙基甲基纤维素、透明质酸钠或聚乙烯醇；

所述的防腐剂选自苯扎氯胺、苯扎溴胺、尼泊金甲、乙、丙酯中的一种或一种以上的混合物的一种或多种；

所述的等渗调节剂是选自甘露醇、葡萄糖、氯化钠、甘油或丙二醇；

所述的pH值调节剂选自盐酸、硼酸、枸橼酸、硼酸钠、枸橼酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾或三乙醇胺；

所述的络合剂选自依地酸二钠。

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