WO2010088827A1 - 石杉碱甲及其石杉碱甲眼用制剂的新用途 - Google Patents

Description

石杉碱甲及其石杉碱甲眼用制剂的新用途

技术领域

本发明涉及石杉碱甲及其石杉碱甲眼用制剂的用途， 尤其涉及石杉碱甲及其石杉碱甲眼 用制剂在制药领域中的应用。

背景技术

青光眼是临床最常见的眼病之一， 主要表现为眼内压增高导致眼底视神经乳头塌陷， 视 野变窄， 视力下降， 严重者可能失明， 且一旦失明， 就会永久丧失视力。 其发病率约占 全民的 1 %， 40岁以上人群发病率约占 2.5 %， 危害极大。

长久以来对青光眼的治疗仅限于对其主要危险因素一高眼压的处理。 通过药物和 /手术治 疗控制眼压后， 大部分患者的视功能损害得到有效的遏制， 但仍有相当部分， 特别是中 晚期青光眼患者的视功能损害仍继续进展而无有效的治疗手段。 高眼压或视神经缺血更 可能只是青光眼发病的一个诱因， 除机械压迫和微循环损害等原发性损伤外， 可能存在 其它的原发性损害机制， 或由原发性损害导致的继发性损害机制。

研究表明青光眼视神经病变病理特征非常类似于阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD) 的中枢神经系统胆碱能神经退行性病变， 甚有学者称青光眼为 "眼阿尔采末病" （ocular Alzheimer's disease )。 因此， 确切地说： 青光眼是一种有多病因因素参与的视神经退行性 疾病， 在控制眼压的基础上给予视神经保护治疗被认为是青光眼理想的治疗方式。 （青光 眼的神经保护治疗一般是指药物直接作用于视网膜和视神经而预防、 阻止或延缓 RGCs 死亡。 )理想的抗青光眼药物不仅仅具有改善机械压力效应还具有多靶点的视神经保护作 用。

石杉碱甲（Huperzine A, HupA)是我国从石杉属植物蛇足石杉中成功开发的新一代可逆、 高效、 高选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂， 因具有独特的药理特征和低毒性， 而引起了人们 的广泛注意。 Hup A通过与乙酰胆碱酯酶可逆性结合， 使胆碱酯酶不能水解乙酰胆碱， 从而乙酰胆碱水平升高， 产生促胆碱能作用。 石杉碱甲目前已被广泛用于治疗阿尔茨海 默病、 早老性痴呆、 血管性痴呆以及改善学生的学习与记忆能力、 脑外伤性记忆功能和 认知功能。 有研究证明石杉碱甲对脑神经元细胞有良好的保护作用， 但其是否确实具有 有效的降眼压作用？对视网膜神经节细胞是否保护作用？ 能否用于预防治疗眼压升高相 关疾病？ 上述内容目前还未见文献报道。

石杉碱甲作为治疗老年痴呆的首选药物， 已上市或研究的石杉碱甲有片剂， 胶囊剂， 滴 丸， 缓释微球， 鼻腔给药等剂型， 石杉碱甲在治疗眼科疾病方面的应用及眼用制剂的制 备均未见文献报道。 当前临床常用眼科用药大多以滴眼液、 药膏等传统剂型出现， 滴眼 液作为眼科最常用的局部给药剂型， 因使用方便， 生产成本低而使患者及生产企业乐于 接受， 但普通滴眼液滴入眼内后， 易经鼻泪管损失造成全身吸收， 且数分钟内可被泪液 稀释至原来浓度的 0.1%， 因此需增加给药次数才能达到有效治疗浓度， 给使用带来很多 不便。 眼膏虽然释药缓慢， 但油腻感强且使用后影响视力及美观， 夜间应用又易污染衣 被， 因而不受患者欢迎。 目前市场上也有眼用凝胶剂商品， 但多为粘稠状半固体， 如果 直接将凝胶滴入眼内， 凝胶在眼内缺乏良好的铺展性， 药物不易均匀分布， 同时使用剂 量也不能准确控制， 还可能影响美观及视力， 因此也非理想眼用制剂。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供一种石杉碱甲在眼科方面的应用。

本发明的再一的目的是， 提供一种石杉碱甲眼用制剂在制备预防、 治疗眼科疾病药物中 的应用。

本发明的另一的目的是， 提供一种石杉碱甲眼用原位凝胶剂。

本发明的另一的目的是， 提供一种石杉碱甲滴眼液。

为实现上述目的， 本发明采取的技术方案是：

石杉碱甲在制备预防、 治疗高眼压或视网膜神经节细胞损伤的眼科疾病药物中的应用。 所述的眼科疾病是青光眼、 眼压升高或伴有视网膜神经节细胞损伤的眼科疾病。

所述的眼科疾病是青光眼。

为实现上述第二个目的， 本发明采取的技术方案是： 石杉碱甲眼用制剂在制备预防、 治 疗青光眼、 眼压升高或伴有视网膜神经节细胞损伤的眼科疾病药物中的应用， 所述的眼 用制剂是石杉碱甲滴眼液和石杉碱甲眼用原位凝胶剂。

所述的石杉碱甲眼用原位凝胶剂是由下列组分组成：

组分 含量 （重量％)

石杉碱甲 0.001-1

0.1N HC1 0.002-0.2

增稠剂 0.05-20

等渗调节剂 0-40

防腐剂 0.01-0.5

络合剂 0-0.1

pH调节剂 0-0.05

水 余量， 所述的增稠剂含有温度敏感型、 pH敏感型或离子敏感型高分子材料中的一种或多种； 所述的等渗调节剂是选自甘露醇、 葡萄糖、 氯化钠、 甘油或丙二醇；

所述的防腐剂选自苯扎氯胺、 苯扎溴胺、 尼泊金甲、 乙、 丙酯中的一种或多种； 所述的 pH值调节剂选自盐酸、硼酸、枸橼酸、硼酸钠、枸橼酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、 或三乙醇胺。

所述的石杉碱甲滴眼液是由下列组分组成：

组分 含量 （重量％)

石杉碱甲 0.001〜1

0.1N HC1 0.002-0.02

增稠剂 0〜15

防腐剂 0.01-0.5

等渗调节剂 0-40

pH值调节剂 0-0.05

络合剂 0-0.1

水 余量，

所述的增稠剂选自羟丙基甲基纤维素、 透明质酸钠或聚乙烯醇；

所述的防腐剂选自苯扎氯胺、 苯扎溴胺、 尼泊金甲、 乙、 丙酯中的一种或一种以上的混 合物的一种或多种；

所述的等渗调节剂是选自甘露醇、 葡萄糖、 氯化钠、 甘油或丙二醇；

所述的 pH值调节剂选自盐酸、 硼酸、 枸橼酸、 硼酸钠、 枸橼酸钠、 氢氧化钠、 氢氧化钾 或三乙醇胺；

所述的络合剂选自依地酸二钠。

为实现上述第三个目的， 本发明采取的技术方案是：

一种石杉碱甲眼用原位凝胶剂， 所述的眼用原位凝胶剂是由下列组分组成：

组分 含量 （重量％)

石杉碱甲 0.001-1

0.1N HC1 0.002-0.2

增稠剂 0.05-20

等渗调节剂 0-40

防腐剂 0.01-0.5

络合剂 0-0.1 pH调节剂 0-0.05

水 余量。

所述的增稠剂含有温度敏感型、 pH敏感型或离子敏感型高分子材料中的一种或多种。 所述的等渗调节剂是选自甘露醇、 葡萄糖、 氯化钠、 甘油或丙二醇。

所述的防腐剂选自苯扎氯胺、 苯扎溴胺、 尼泊金甲、 乙、 丙酯中的一种或多种。

所述的 pH值调节剂选自盐酸、 硼酸、 枸橼酸、 硼酸钠、 枸橼酸钠、 氢氧化钠、 氢氧化钾 或三乙醇胺。

所述的增稠剂含有增稠剂可含有甲基纤维素、 羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素、 透 明质酸钠的一种或多种。

为实现上述第四个目的， 本发明采取的技术方案是：

一种石杉碱甲滴眼液， 所述的石杉碱甲滴眼液是由下列组分组成：

组分 含量 （重量％)

石杉碱甲 0.001〜1

0.1N HC1 0.002-0.02

增稠剂 0〜15

防腐剂 0.01-0.5

等渗调节剂 0-40

pH值调节剂 0-0.05

络合剂 0-0.1

水 余量，

所述的增稠剂选自羟丙基甲基纤维素、 透明质酸钠或聚乙烯醇；

所述的防腐剂选自苯扎氯胺、 苯扎溴胺、 尼泊金甲、 乙、 丙酯中的一种或一种以上的混 合物的一种或多种；

所述的等渗调节剂是选自甘露醇、 葡萄糖、 氯化钠、 甘油或丙二醇；

所述的 pH值调节剂选自盐酸、 硼酸、 枸橼酸、 硼酸钠、 枸橼酸钠、 氢氧化钠、 氢氧化钾 或三乙醇胺；

所述的络合剂选自依地酸二钠。

需要说明的是： 增稠剂必须含有温度敏感型、 pH敏感型或离子敏感型高分子材料中的一 种或多种；

温度敏感型高分子材料包括泊洛沙姆 407、 泊洛沙姆 188、 N-异丙基丙稀酰胺共聚物和 / 或聚乙二酸 -PLGA嵌段共聚物； pH敏感型高分子材料包括醋酸纤维素酞酸酯，丙烯酸树脂卡波姆或聚乙烯縮醛二乙胺醋 酸；

离子敏感型高分子材料包括去乙酰结冷胶、 海藻酸钠、 黄原酸、 卡拉胶 /文莱胶。

增稠剂可含有甲基纤维素、 羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素、 透明质酸钠的一种和 / 或多种。

本发明优点在于：

1、 本发明对石杉碱甲发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。

2、 本发明的石杉碱甲安全无毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。

3、 经大量细胞、 动物实验研究证明， 药物石杉碱甲对视网膜神经节细胞具有良好的保护 作用， 口服及局部滴眼均有较好的降眼压作用， 可用于预防及治疗青光眼。

4、本发明成功开发了石杉碱甲滴眼液和石杉碱甲眼用原位凝胶剂， 所述的两个剂型方便 眼科疾病患者使用。

5、石杉碱甲眼用原位凝胶剂适用于治疗各类青光眼及眼压升高或伴有视网膜神经节细胞 损伤的眼科疾病。 石杉碱甲眼用原位凝胶剂在体外为流动性良好的液体， 滴眼时， 剂量 容易准确控制， 使用方便， 滴入眼内后， 能均匀铺展， 并形成凝胶， 在眼内停留时间较 长， 不易流失进入全身而被吸收， 能维持局部有效药物浓度， 提高生物利用度， 且毒性 低， 刺激性效， 生物相容性好， 是一个有效的治疗青光眼及高眼压的药物， 能应用于临 床， 具有广阔的开发前景。

附图说明 图 1 是石杉碱甲滴眼液水负荷诱导高眼压兔的降眼压作用， 数据表示为平均值 ±标准差 (n=10 p<0.01 :对照组 (control)与模型组 (model)比较（ 15-210min); p<0.01 : 0.025 %HupA和 0.005 %HupA与模型组比较 （30-180min); p<0.01 : 0.01 %HupA与模型组比 较 （15-210min)。

图 2石杉碱甲滴眼液对家兔瞳孔直径的影响， 数据表示为平均值 ±标准差 （n=10)。 *p < 0.05， **p < 0.01 : 与对照组 (control) 比较。

图 3A石杉碱甲对缺血 /再灌注青光眼视网膜的保护作用： 不同实验条件大鼠视网膜切片 组织学特征。 （a): 对照组， （b): 缺血再灌注组， （c): HupA处理组； ONL: 外核层， INL: 内核层， IPL: 内网状层， GCL: 神经节细胞层。

图 3B石杉碱甲滴眼液对缺血 /再灌注青光眼视网膜上 Caspase-3 表达的影响， 数据表示 为平均值±标准误（n=3 )。 **p<0.01 :与对照组（control)比较； ##p<0.01 :与模型组（model) 比较。

图 3C石杉碱甲滴眼液对缺血 /再灌注青光眼视网膜上 ChAT表达的影响， 数据表示为平 均值 ±标准误 （n=3 )。 **p<0.01与对照组 （control) 比较， ##p<0.01与模型组 （model) 比较。

图 4 石杉碱甲滴眼液 DBA/2J 鼠的降眼压作用， 数据表示为平均值 ±标准误 （n=10)。 p<0.01 : HupA组与对照组 （control) 比较 （30-210 min); p<0.01 : 毒扁豆碱组 （ES) 与对照组 （control) 比较 （30-210 min)。

图 5 石杉碱甲滴眼液水负荷诱导高眼压兔的降眼压作用， 数据表示为平均值 ±标准误 (n=10 p< 0.01： 对照组 （control) 与模型组 （model) 比较 （30-210 min); p<0.01 : HupA组与模型组（model)比较（30-180 min); p<0.01 :毒扁豆碱组（ES)与模型组（model) 比较 (30-210 min)

图 6 石杉碱甲口服对家兔水负荷高眼压的影响， 数据表示为平均值 ±标准差（n=10)， *p < 0.05， **p < 0.01 : 与模型组 (model) 比较。

图 7 石杉碱甲口服对家兔瞳孔直径的影响，数据表示为平均值 ±标准差 (n=10)，*p < 0.05， **p < 0.01 : 与对照组 （control) 比较。

图 8 谷氨酸兴奋毒所致 RGC-5凋亡的量效关系， 数据表示为平均值 ±标准差 （3次独立 实验， 每次 5个复孔）。 **P<0.01 : 与对照组 （control) 比较。

图 9 石杉碱甲对 RGC-5保护作用的量效关系， 数据表示为平均值 ±标准差 （3次独立实 验， 每次 5个复孔）。 **p<0.01 : 与对照组 （control) 比较； #p<0.05， ##p<0.01 : 与模型 组 （model) 比较。

图 10 阿托品及哌仑西平对石杉碱甲阻抑 Glu兴奋毒的影响， 数据表示为平均值 ±标准差 (3次独立实验， 每次 5个复孔）。 **p<0.01 : 与对照组 (A) 比较； #p<0.05, ##p<0.01 : 与谷胺酸损伤组 （B) 比较。

图 11 石杉碱甲对 Glu兴奋毒致 RGC-5凋亡的影响， A: 对照组； B: 谷胺酸损伤组； C: HupA预处理组。

图 12 石杉碱甲对 Glu兴奋毒致 RGC-5线粒体膜电位改变的影响， A: 对照组； B: 谷胺 酸损伤组； C: HupA保护组。数据表示为平均值 ±标准差（3次独立实验，每次 5个复孔）。 **p<0.01 : 与对照组比较； #p<0.05， ##p<0.01 : 与谷胺酸损伤组比较。

图 13 石杉碱甲对 Glu兴奋毒致 RGC-5钙流变化的影响， A: 对照组； B: 谷胺酸损伤组； C: HupA预处理组。

图 14 石杉碱甲对 Glu兴奋毒致 RGC-5 Bcl-2及 Bax mR A变化的影响， A: 对照组； B: 谷胺酸损伤组； C: HupA预处理组。 数据表示为平均值 ±标准差（3次独立实验， 每个样 本重复 2次）。 **p<0.01 : 与对照组比较； #p<0.05， ##p<0.01 : 与谷胺酸损伤组比较。 图 15 石杉碱甲对 Glu兴奋毒致 RGC-5 Bcl-2及 Bax mR A变化的影响， A: 对照组； B: 谷胺酸损伤组； C: HupA预处理组。 数据表示为平均值 ±标准差 （3次独立实验， 每 个样本重复 2次）。 **p<0.01 : 与对照组比较； #p<0.05， ##p<0.01 : 与谷胺酸损伤组比 较。

图 16A石杉碱甲阻抑 Glu兴奋毒性的相关通路 I， A: 对照组； B: 谷胺酸损伤组； C: HupA预处理组； D: Chelerythrine chloride (CC1 M，PKC通路抑制剂)预处理组。数据表 示为平均值 ±标准差（3次独立实验，每次 5个复孔）。 **p<0.01 :与对照组比较； #p<0.05 , ##p<0.01与谷胺酸损伤组比较。

图 16B 石杉碱甲阻抑 Glu兴奋毒性的相关通路 II， A: 对照组； B: 谷胺酸损伤组； C: HupA预处理组； D: U0126 (5 μΜ, ΜΕΚ通路抑制剂） 预处理组。 数据表示为平均值 ±标 准差 （3 次独立实验， 每次 5个复孔）。 **ρ<0.01 : 与对照组比较； #ρ<0.05， ##ρ<0.01 与谷胺酸损伤组比较。

图 16C 石杉碱甲阻抑 Glu兴奋毒性的相关通路 III， A: 对照组； B: 谷胺酸损伤组； C: HupA预处理组； D: LY294002 (ΙΟμΜ,ΡΒ 通路抑制剂） 预处理组。 数据表示为平均值 ± 标准差 （3次独立实验， 每次 5个复孔）。 **ρ<0.01 : 与对照组比较； #ρ<0.05， ##ρ<0.01 与谷胺酸损伤组比较。

图 17 石杉碱甲紫外吸收图。

图 18 石杉碱甲原位凝胶剂在生理和非生理条件下粘度变化， Α: 与人工泪液混合 （25 V ); Β: 与人工泪液混合 （37°C )。

图 19 石杉碱甲原位凝胶剂与人工泪液混合后的流变学性质。

图 20 石杉碱甲原位凝胶剂对家兔瞳孔直径的影响， 数据表示为平均值 ±标准差 (n=10 *p<0.01， **p<0.01 : 与对照组 ( control) 比较。

图 21 石杉碱甲原位凝胶剂对水负荷诱导高眼压兔的降眼压作用， 数据表示为平均值 ±标 准差 （n=10)。 *p<0.01， **p<0.01 : 与 control 组比较。

图 22 微透析采样图。

图 23 石杉碱甲一级质谱图。

图 24 石杉碱甲二级质谱图。

图 25 石杉碱乙一级质谱图。

图 26 石杉碱乙二级质谱图。 图 27 单次用药石杉碱甲药 -时曲线图。 数据表示为平均值 ±标准差 （n=3 )。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例 1 石杉碱甲滴眼抗青光眼作用的整体药效学实验

1 材料与仪器

1.1 实验动物

新西兰大白兔， 体重 2.2-2.8kg， 雌雄兼用， 由上海交通大学医学院实验动物中心提供， 许可证号 SYXK 2003-0026。

Sprague-Dawley (SD) 大鼠， 体重 250-350g， 雄性， 清洁级， 由上海交通大学医学院实验 动物中心提供。

1.2 主要试剂

石杉碱甲 中国科学研究院合成

毛果芸香碱 Sigma公司

戊巴比妥钠中国医药集团上海化学试剂公司

盐酸利多卡因注射液 浙江海普药业有限公司

一次性静脉输液针 (0.5x20)及输液器上海康德莱企业发展集团有限公司， Caspase-3抗体

Santa Cruz公司，

ChAT抗体 武汉博士德公司。

1.3 主要仪器

Castroviejo caliper, Schiotz 眼压计 苏州医疗器械厂

2 方法

2.1 石杉碱甲滴眼液的制备

取处方量石杉碱甲， 用 0.1N HC1溶解， 加注射用水稀释后； 搅拌条件下依次加入 NaCl， 苯扎溴胺， 溶解并混匀， 调节 pH至 6.0-7.0， 0.22μηι微孔滤膜过滤， 再自滤器上加水至 总量混匀。所制备的石杉碱甲滴眼剂 ρΗ6.0，粘度 20cps，渗透压 289mOsm，澄明度良好。 分别制备浓度为 0.005%、 0.01%、 0.025%的石杉碱甲滴眼液， 备用。

2.2.2 石杉碱甲滴眼液对水负荷诱导高眼压兔的降眼压作用考察

1) 眼压测定

将兔固定于兔箱，用 0.1%丁卡因进行眼球表面麻醉，用眼压计测量眼压， 重复测量三次， 取其平均值， 记录眼压曲线。

2) 高眼压模型的建立一水负荷诱导高眼压 选择健康无眼疾白色家兔， 耳缘静脉注射 3%戊巴比妥钠 （1 ml/kg) 全身麻醉。 用眼压计 测量基础眼压， 原发性高眼压者弃之不用。 然后经胃管向胃内缓慢灌入 37°C温水 100 ml/kg， 造成高眼压模型。 2h后再次灌胃 50 ml/kg以维持眼压。

3) 给药方法

实验大白兔随机分成 6组， 即石杉碱甲滴眼液组 （0.0025%、 0.005%、 0.01%), 2%毛果 芸香碱阳性对照组、 生理盐水空白对照组和水负荷高眼压模型组， 每兔每眼滴入药液 50μ1， 分别于给药后 15， 30， 60， 90， 120， 150， 180， 210和 240分钟测量眼压。

2.2.3石杉碱甲滴眼液对家兔瞳孔直径的影响作用考察

1) 瞳孔直径的测定

将兔固定于兔箱， 在自然光线下用瞳孔尺 （Castroviejo caliper) 测量兔瞳孔直径。

2) 给药方法

实验大白兔随机分成 5组，每组 10只（10只眼）。即石杉碱甲组滴眼液组（0.005%、0.01%、 0.025%)， 2%毛果芸香碱阳性对照组和生理盐水空白对照组， 每兔每眼分别滴入药液 50μ1， 分别于给药前与给药后的 30， 60， 90， 120， 150， 180， 210和 240 分钟测量兔瞳 孔直径。

2.2 石杉碱甲滴眼对缺血 /再灌注青光眼的保护作用考察

1) 实验动物及分组

Sprague-Dawley (SD) 大鼠， 经一般检查和眼部检查均无异常后采用。 全身情况要求： 毛 发色泽光亮， 无脱毛， 四肢和尾部无疾缺， 颈部无歪斜。 眼部检查要求： 双侧眼球等大， 眼睑完整， 睫毛整齐， 角膜透明， 前房清晰， 瞳孔对光反射灵敏。 均取左眼做损伤模型。 将大鼠随机分为 3组， 即模型组、 对照组及用药组。 用药组给予 0.1%石杉碱甲滴眼液， 模型组给予不含药物的滴眼液基质， 每天 4次， 连续 3天。 模型组不予处理。

2) 大鼠视网膜缺血 /再灌注青光眼模型的建立

三天后， 用药组与模型组大鼠腹腔注射 3%戊巴比妥钠麻醉后， 用 5号输液针做左眼前房 穿刺， 经消毒输液器连接乳酸钠林格氏液输液瓶。 并将液面高度调整至距实验眼水平面 150cm, 使之产生约 110 mmHg静水压。 在大鼠左眼前房内持续加压灌注， 50 min后拔 除针头， 大鼠自行苏醒。 左眼前房注入生理盐水加压， 此时可见动物左眼虹膜苍白， 角 膜浑浊， 外突， 并维持此眼内压 50 min。 然后将眼压缓慢降至加压前水平。 视网膜缺血 / 再灌注的判定： 提升眼压后以 1%阿托品眼膏散瞳， 直接检眼镜检查眼底， 以视网膜动脉 血中断， 视网膜苍白为视网膜缺血成功标志； 视网膜动脉学流恢复， 视网膜充血微视网 膜再灌注成功标志。 当眼压升高后， 可以见到眼球在约 2 min内变白 （由于眼底血管被 阻断， 导致眼底反光由红色变为白色， 同时虹膜也因缺血而变白）。 如果在前房穿刺中不 慎损伤晶状体， 则去掉该动物的数据。 对照组只滴加了消炎药， 但不做做前房穿刺和眼 压升高。

3) 术后按 1) 项下继续滴眼， 每天 4次， 连续 3天。

4) 组织制备

实验动物达存活时间点后， 麻醉状态下取双眼眼球， 3.7%甲醛溶液固定， 去角膜， 晶状 体和玻璃体后， 常规乙醇梯度脱水， 二甲苯透明， 浸蜡， 包埋， 平行于眼球剖面通过视 神经作连续切片， 常规 HE染色。

5) HE染色

苏木精染色 2min， 流水洗 l min， 1%盐酸酒精分化 20sec， 流水洗 2 min终止， 分化并反 蓝， 伊红染色 30sec， 流水洗 30sec， 70%, 80%, 90%, 95%酒精各脱水 lmin， 100%酒 精脱水 2 minx2次， 二甲苯透明 2 minx2次。 中性树胶封片。

6) 数据收集和处理

每只动物取 2张切片， 每张切片采用 Laica数码相机在 Laica显微镜 40倍物镜下以视神 经为中心对称取 6个部位（3个部位 /侧）摄片， 用 Image-Pro Plus (IPP) 6.0 software图像 分析系统进行分析。 HE染色片测量 IPL和 INL厚度，及 RGCs密度（ 1mm视网膜中 RGCs 个数）。 双盲计数节细胞层细胞数； 数据对各组均数进行单因素方差分析。

2.2.2 免疫组织化学检测

采用 MaxVision二步法进行染色。将石蜡切片脱腊， 切片置于 0.01M, PH6.0的柠檬酸盐 缓冲液内， 微波抗原修复 15 min， 室温冷却 20 min后，磷酸盐缓冲液 （PBS ) 漂洗 3次， 滴加 3 %过氧化氢室温下孵育 10 min以阻断内源性过氧化物酶活性， PBS漂洗 3次， 然 后滴加抗 Caspase-3和 ChAT抗体 （1 : 100， 1 : 100 ) 4°C孵育过夜， PBS漂洗 3次， 羊抗 鼠 /兔 IgG抗体 -HRP多聚体室温孵育 15 min， PBS漂洗 3次， DAB显色， 苏木精复染， 常规梯度乙醇脱水， 中性树胶封片观察。 阴性对照以 PBS代替一抗进行上述染色。 每张 切片采用 Laica数码相机在 Laica显微镜 40倍物镜下摄片， 用 IPP图像分析系统进行分 析。

2.2.3 统计学处理

所得数据均用 mean ± SD 表示， 组间比较采用单因素方差分析 （one way analysis of variance, ANOVA p<0.05认为具有统计学意义。

3实验结果

3.1石杉碱甲滴眼液对水负荷诱导高眼压兔的降眼压作用 新西兰大白兔基础眼压平均为 25.26±0.08 mmHg (n=10), 水负荷后眼压迅速升高。石杉 碱甲可明显降低水负荷所致高眼压（图 1 )，其降眼压作用在眼部给药后约 15分钟时开始 起效， 药效可持续 210分钟。 各时间点石杉碱甲的降眼压效果与生理盐水组相比具有显 著差异。 各浓度石杉碱甲滴眼液均可明显降低眼压， 其中 0.01%石杉碱甲的作用与 2%毛 果芸香碱相似， 但无外周胆碱能副作用。

3.2石杉碱甲滴眼液对家兔瞳孔直径的影响

石杉碱甲 （0.0025%， 0.005%及 0.01%) 滴眼后， 兔瞳孔在给药后约 15分钟时开始 收縮， 收縮作用可以维持 3小时左右（图 2)。其中给药后 30分钟， 兔瞳孔收縮效应达到 最强。 石杉碱甲引起的瞳孔收縮幅度呈剂量依赖性。 其中 0.01%石杉碱甲在眼部给药后 30分钟，兔瞳孔直径收縮为 3.46±0.15 mm,约为给药前瞳孔直径的 60%。量效曲线显示， 0.0025%, 0.005%及 0.01%三个浓度剂量的石杉碱甲在各时间点所致的瞳孔收縮效应与生 理盐水组相比具有明显差异， 而 0.01%石杉碱甲组与 0.2%毛果芸香碱组作用时间相似， 但未观察到任何外周胆碱能副作用， 因此选 0.01%作为后续研究的浓度。

3.2 石杉碱甲滴眼液对缺血 /再灌注青光眼的保护作用

3.2 1石杉碱甲滴眼液对缺血 /再灌注青光眼的保护作用一视网膜结构变化

HE及尼氏染色显示 （图 3A):

正常对照组： 视网膜层次结构清晰， GCL细胞排列紧密， 细胞呈圆形或卵圆形， 胞浆丰 富， 染色均匀， 核呈圆形， 核仁清晰； RGCs间的 Muller细胞纤维栏排列整齐； 内外网 状层节后清晰； 内外颗粒层结构清楚， 排列均匀。

模型组： 内层视网膜厚度变薄， IPL和 INL厚度变小， GCL细胞数目显著减少， 排列稀 疏， RGCs固縮， 形态不规则， 细胞周围间隙扩大， 核固縮， 形态不一， 染色不均； Muller 西柏纤维栏排列紊乱， 内外网状层变薄， 结构尚清晰； 内颗粒层细胞周围间隙扩大； 外 颗粒层结构尚清晰， 排列均匀； 视网膜各层轮廓清晰， 未见炎性细胞浸润。

石杉碱甲组： GCL细胞数目明显多于模型组， IPL和 INL厚度恢复， 内层视网膜变薄不 明显。 统计结果表明： 急性高眼压组节细胞数明显低于正常对照组 （P<0.01 )， 石杉碱 甲组可显著改善节细胞数目 （与急性高眼压组比， P<0.01 )。 IPL和 INL厚度在石杉碱甲 组也较急性高眼压组有明显恢复 （表 1 )。

表 1 石杉碱甲滴眼液对缺血 /再灌注青光眼视网膜内网状层， 内核层及神经节细胞数的影 响

内网状层 (μηι) 内核层 （μηι) 神经节层细胞数 （per mm²) 对照组 60.33±4.25 58.36±4.92 112.99±10.85 损伤组 30.25±2.13 17.34±0.87 58.09±3.14

HupA预处理组 48.02±2.09 37.22±2.16** 99.63±6.77**

Data were expressed as mean士 SD， n=6, **P< 0.01 v.s control group

3.2石杉碱甲滴眼液对缺血 /再灌注青光眼的保护作用一 Caspase-3和 ChAT表达变化 视网膜缺血 /再灌注损伤后， caspase-3 阳性细胞主要在大鼠视网膜节细胞层、 内丛状层和 内核层内侧强表达。 阳性颗粒位于胞质， 分布不均， 呈棕色， 与对照组相比较， 阳性颗 粒平均光密度具有显著差异。 在石杉碱甲滴眼组， 阳性颗粒平均光密度较缺血组明显减 少， 与其对视网膜缺血 /再灌注损伤的视网膜神经细胞凋亡有明显的抑制作用有关 （图 3B 视网膜缺血 /再灌注损伤后， 视网膜 RGC 层 ChAT 的阳性颗粒明显减少， 表明胆 碱能神经元细胞数减少， 功能受损。 而给予石杉碱甲后， 视网膜 ChAT 的阳性颗粒较模 型组增多， 表明胆碱能神经元细胞数增多， 功能恢复， 具有显著性意义。 实施例 2石杉碱甲与毒扁豆碱（Eserine, ES) 降眼压对比实验

1 材料与仪器

1.1 实验动物

新西兰大白兔， 体重 2.2-2.8kg， 雌雄兼用， 由上海交通大学医学院实验动物中心提供， 许可证号 SYXK 2003-0026。

DBA小鼠， 体重 25-35g， 雌雄兼用， 清洁级， 由上海交通大学医学院实验动物中心提供。 1.2 主要试剂

石杉碱甲 中国科学研究院合成

毒扁豆碱 Sigma公司

乌拉坦 中国医药集团上海化学试剂公司

1.3 主要仪器

TONO-PEN 笔式眼压计 北京欣明仁医疗器械技术有限公司

2实验方法

2.1石杉碱甲对 DBA/2J高眼压鼠降眼压作用考察

1) 眼压测定

10月龄 DBA/2J鼠， 用 11.5%乌拉坦腹腔注射进行全身麻醉， 用笔式眼压计测量眼压， 重复测量三次， 取其平均值， 记录眼压曲线， 眼压低者弃之不用。

2) 给药方法

10月龄 DBA/2J鼠随机分成 3组， 即 0.01%石杉碱甲滴眼液组， 0.25%毒扁豆碱阳性对照 组和生理盐水空白对照组， 每鼠每眼滴入药液 10μ1， 分别于给药后 30， 60， 90， 120， 150， 180， 210分钟测量眼压。

3 ) 实验结果

10月龄 DBA/2J鼠基础眼压平均为 29.53±1.47 mmHg (n=10), 明显高于 2月龄 DBA/2J 小鼠 （平均眼压 17.26±1.26)。 石杉碱甲可明显降低 10月龄小鼠眼压 （图 4)， 其降眼压 作用在眼部给药后约 30分钟时开始起效， 药效可持续 180分钟左右。各时间点石杉碱甲 的降眼压效果与生理盐水组相比具有显著差异。 与 0.25%毒扁豆碱作用相似， 但无外周 胆碱能副作用。

2.2 石杉碱甲滴眼液对水负荷诱导高眼压兔的降眼压作用考察

1) 眼压测定

将兔固定于兔箱， 用 0.1%丁卡因进行眼球表面麻醉， 用笔式眼压计测量眼压， 重复 测量三次， 取其平均值， 记录眼压曲线， 原发性高眼压者弃之不用。

2) 高眼压模型的建立一水负荷诱导高眼压

选择健康无眼疾白色家兔， 耳缘静脉注射 3%戊巴比妥钠 （1 ml/kg) 全身麻醉。 用笔式眼 压计测量基础眼压，原发性高眼压者弃之不用。然后经胃管向胃内缓慢灌入 37°C温水 100 ml/kg， 造成高眼压模型。 2h后再次灌胃 50 ml/kg以维持眼压。

3) 给药方法

实验大白兔随机分成 4组， 即 0.01石杉碱甲滴眼液组， 0.25%毒扁豆碱阳性对照组 和生理盐水空白对照组， 每兔每眼滴入药液 50μ1， 分别于给药后 30， 60， 90， 120， 150， 180， 210分钟测量眼压。

2.2.3 统计学处理

所得数据均用 mean ± SD 表示， 组间比较采用单因素方差分析 （one way analysis of variance, ANOVA) o p<0.05认为具有统计学意义。

3实验结果

新西兰大白兔基础眼压平均为 25.26±0.08 mmHg (n=10), 水负荷后眼压迅速升高。 石杉碱甲可明显降低水负荷所致高眼压 （图 5 )， 各时间点石杉碱甲的降眼压效果与生理 盐水组相比具有显著差异。 石杉碱甲的作用与 0.25%的毒扁豆碱相似， 但无外周胆碱能 副作用。

实施例 3: 石杉碱甲口服对家兔瞳孔直径的影响 1实验材料

1.1 主要药品与试剂

石杉碱甲 （上海中科院药物研究所）。

1.2 试验动物

新西兰大白兔， 体重 2.2-2.8kg， 雌雄兼用， 由上海交通大学医学院实验动物中心提供， 许可证号 SYXK 2003-0026。

2实验方法：

2.1 瞳孔的测定

将兔固定于兔箱， 在自然光线下用瞳孔尺 （Castroviejo caliper) 测量兔瞳孔直径。 2.2 给药方法

实验大白兔随机分成 2组， 每组 10只 （10只眼）。 即生理盐水空白对照组和口服石 杉碱甲组， 生理盐水空白对照组每只家兔灌胃生理盐水 2tng/kg， 口服石杉碱甲组每只家 兔灌胃石杉碱甲 2mg/kg。 分别与给药前与给药后的 30, 60, 90， 120， 180min测量兔瞳 孔直径。

2.3 统计学处理

所得数据均用 mean±SD表示， 组间比较采用单因素方差分析 （one way analysis of variance, ANOVA) o p<0.05认为具有统计学意义。

3 实验结果

石杉碱甲口服均兔虹膜括约肌收縮， 瞳孔縮小， 并显时效关系 （见图 6)。 实施例 4: 石杉碱甲对水负荷致高眼压家兔眼压的影响

1 试验动物

新西兰大白兔， 体重 2.2-2.8kg， 雌雄兼用， 由上海交通大学医学院实验动物中心提供， 许可证号 SYXK 2003-0026。

2实验方法：

2.1眼压测定

将兔固定于兔箱， 用 0.1%丁卡因进行眼球表面麻醉， 用眼压计测量眼压， 重复测量 三次， 取其平均值， 记录眼压曲线。 2.2 高眼压模型的建立 水负荷诱导高眼压

选择健康无眼疾白色家兔，每兔从耳缘静脉注射 3%戊巴比妥钠（ lmL/kg)全身麻醉。 双眼滴入 1%丁卡因局部角膜麻醉， 用眼压计测量基础眼压， 原发性高眼压者弃之不用。 然后经胃管向胃内缓慢灌入 37°C温水 100ml/kg，水负荷后即制成高眼压。

2.3 给药方法

实验大白兔随机分成 3组， 每组 10只 （10只眼）。 即生理盐水空白对照组、 水负荷 高眼压模型组和口服石杉碱甲组， 生理盐水空白对照组、 水负荷高眼压模型组每只家兔 灌胃生理盐水 2mg/kg， 口服石杉碱甲组每只家兔灌胃石杉碱甲 2mg/kg。分别与给药前与 给药后的 30， 60， 90， 120， 180min测量兔眼压。

2.4 统计学处理

所得数据均用 mean±SD表示， 组间比较采用单因素方差分析 （one way analysis of variance, ANOVA) o p<0.05认为具有统计学意义。

3 实验结果

水负荷模拟临床的水激发实验， 可使眼内压 （IOP) 明显升高。 该作用可持续 3h， 水 负荷模型制作方法简单， 重复性， 与文献报道相符。 实验结果证明口服石杉碱甲有明显 的降压作用 （见图 7)。 实施例 5石杉碱甲对视网膜神经节细胞的保护作用及机制研究

1 材料与仪器

1.1 细胞株

RGC-5视网膜神经节细胞株， 复苏后培养 3-10代， 购自 ATCC

1.2 药品

石杉碱甲， 上海中科院药物所慧赠

哌企西平 (pirenzepine, PZ)， 阿托品 ( atrophine, Atro ) , Sigma公司

1.3 细胞培养有关主要试剂

DMEM培养基， 胎牛血清 （fetal bovine serum, FBS)， NeuroBase培养液 +B27营养液， Gibco公司 阿糖胞苷， 多聚赖氨酸， 谷氨酸， 谷氨酰胺， Sigma公司

木瓜蛋白酶， 四甲基偶氮唑盐（methylthio-tetrazole, MTT)， 上海生工生物工程有限公司 DNase酶 I， 宝生物工程 （大连） 有限公司

1.4 RT-PCR有关主要试剂

基因引物 由 Invitrogene公司合成

Bcl-2 R(bp781C): 5*-GCAGATGCCGGTTCAGGTA-3*

Bcl-2 F(bp619): 5*-ACGGTGGTGGAGGAACTCTT-3*

BaxF(bp412): 5*-GGCTGGACACTGGACTTCCT-3*

BaxR(bp546C): 5*-GGTGAGGACTCCAGCCACAA-3*

β-actin: 5-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3

5-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3

TRIzol试齐 U Invitrogen公司

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Fermentas公司

PerfectShot Taq(Loading dye mix) Takara公司

DEPC (焦碳酸二乙酯） BBI公司

氯仿、 异丙醇和乙醇为国产分析纯， 并专用于 R A操作

1.5 Western Blot有关主要试剂

Tip头和 EP管 Axygen公司

Mouse Anti Bax一抗 Santa cruz公司

Rabbit Anti Bcl-2一抗 Santa cruz公司

Mouse Anti actin一抗 Santa cruz公司

Goat anti-rabbit IRDye 800CW荧光标记： ：抗 LI-COR公司

Goat anti-mouse IRDye 800CW荧光标记：：抗 LI-COR公司

1.6主要仪器

超净工作台 NUAIRE, 美国

恒温细胞培养箱 Heraus, 美国

荧光倒置显微镜 OLYMPUS, 日本

酶标仪 BIO-RAD, 美国

FACSCalibur流式细胞仪 BD， 美国

低温高速离心机 Sigma, 美国

实验室超纯水系统 Sartorius, 德国 DY-501B型电泳仪 上海琪特分析仪器有限公司

H6-1微型电泳槽 上海琪特分析仪器有限公司

凝胶成像系统 GIS-2008上海天能科技有限公司

基因扩增仪 TC-96/T/H(a) 杭州大和热磁电子有限公司

各种微量取样器 Eppendorf 公司

-80 °C超低温冰箱 MDF-U52V SANYO公司

Eppendorf centrifuge 5417R Eppendorf公司

Western-blot蛋白电泳及转膜系统 Bio-Rad公司

Odyssey双色红外激光成像系统 LI-COR公司

PVDF膜 Millipore公司

2实验方法

2.2石杉碱甲对 Glu兴奋毒所致 RGC-5 凋亡的保护作用研究

2.2.1 视网膜神经节细胞 RGC-5 的培养

将 RGC-5 细胞置于 37°C、 5%C02 培养箱中进行培养。 培养液为低糖 DMEM, 100 U/ ml青霉素，100 μ_§/ ml链霉素和 10% FCS。每 2天更换一次培养液。细胞融合率为 80% 左右时， 用 0.25%胰蛋白酶消化， 按 1 : 2的比例传代。

2.2.2谷氨酸损伤模型的建立

取稳定生长、 复苏后培养 3-10 代的 RGC-5 细胞， 0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬 液， 以 3 xl03 /孔接种于 96 孔板， 每孔 100 μ1。 细胞生长至 70%-80% 融合时， 将细 胞分为对照组、 Glu处理组 （0.1， 0.3， 1， 3， 5 mM)， 每组 6 复孔。 孵育 24h后， 每 孔加入 CCK-8 10 ， 继续培养 2h，酶标仪测定吸光度（测定波长 450 nm，参考波长 630 nm) o 每孔测 3次， 取其平均值。

细胞存活率 （％) =用药组细胞存活率 /对照组细胞存活率 χ100%

2.2.3 石杉碱甲对 Glu兴奋毒所致 RGC-5 凋亡的保护作用考察

取稳定生长、复苏后培养 3-10 代的 RGC-5 细胞， 0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液， 以 3x 103 /孔接种于 96 孔板， 每孔 ΙΟΟ μΙ 。细胞生长至 70%-80% 融合时， 将细胞分为 对照组、 Glu处理组和石杉碱甲预处理组， 每组 6 复孔。 药物预处理组分别用 0.1， 1， 10 μΜ 石杉碱甲预处理 2h， 然后加入 3 mM Glu。孵育 24h， 每孔加入 CCK-8溶液 10 μ1， 37°C继续培养 2h， 酶标仪测定吸光度 （测定波长 450 nm， 参考波长 630 nm)。 每孔测 3 次， 取其平均值。

细胞存活率 （％) =用药组细胞存活率 /对照组细胞存活率 χ100% 2.3石杉碱甲对 Glu兴奋毒所致 RGC-5凋亡的保护作用的机制研究

2.3.1 流式细胞仪测定细胞凋亡率

取稳定生长、 复苏后培养 3-10代的 RGC-5细胞， 0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液， 以 5 x l 04/ ml接种于 6孔板， 每孔 2 ml。 细胞生长至 70%融合时， 将细胞分为对照组、 Glu处理组和药物预处理组， 每组 2复孔。 药物预处理组应用 1 μΜ石杉碱甲处理 2h， 然后加入 3 mM Glu。 孵育 24h后， 每孔加入 0.125%胰蛋白酶 800 μΐ消化 40s， 终止反应 后， 转移至 EP管中， 于 4°C以 1500 rpm离心 5 min， 弃上清。 用预冷的 PBS洗 2次后， 每管加入 200 μΐ Annexin buffer, 吹匀后， 均分为两份， 一份加入 Annexin V和碘化丙锭 (propidium iodide, PI)各 5μ1， 另一份作为阴性对照。 室温下避光反应 15 min后， 加入 1 ΟΟμΙ Annexin buffer终止反应， 冰浴中上样。

2.3.2 HCS检测线粒体膜电位的变化

1) 取稳定生长、复苏后培养 3-10代的 RGC-5细胞， 0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液， 以 5x 104/ ml接种于 6孔板， 每孔 2 ml。 细胞生长至 70%融合时， 将细胞分为对照组、 Glu处理组和药物预处理组， 每组 2复孔。药物预处理组应用 ΙμΜ石杉碱甲处理 2h， 然 后加入 3 mM Glu。 孵育 23.5h后， 加入 50μ1/孔的 Mito Tracker/Hoechst溶液， 37°C孵育 30 min。

2) 孵育结束后继续加入 ΙΟΟμΙ的固定液， 室温孵育 10min。

3) l xWash Buffer-M漂洗一次， 弃去洗液， 加入 l xPermeabilization Buffer, 孵育 90sec。

4) 弃去渗透液， l xWash Buffer-M 漂洗一次， 加入 50μ1/孔 Alexa Fluor488 Phalloidin Solution，孵育 30 min。

5) 弃去染液， l x Wash Buffer-M漂洗三次， 封板， 运行 HCS检测。

2.3.3 激光共聚焦显微镜测定视网膜神经节细胞内钙动态变化

1) 取稳定生长、复苏后培养 3-10代的 RGC-5细胞， 0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液， 以 5 x 104/ ml接种于 12孔板， 每孔 2 ml。 细胞生长至 70%融合时， 将细胞分为对照组、 Glu处理组和药物预处理组， 每组 2复孔。 药物预处理组应用 ΙμΜ石杉碱甲处理 90sec， 然后加入 3 mM Glu。弃去培养液， HEPES缓冲液漂洗，加入荧光探针 Fluo-3 /AM (10 μΜ), 避光 37°C孵育 45 min。

2) 弃去探针， HEPES漂洗 2次， 换成培养液 (或 EGTA液)。

3) 加入药物， 以可见光 490 nm作为激发波长， 530 nm为发射波长， 用 LSCM 510观察 细胞内游离钙的动态变化。

4) 钙离子的动态变化采用 LSCM510-Expert Mode SP3， Time series 软件分析。 2.3.4 视网膜神经细胞凋亡相关基因表达分析

2.3.4.1 凋亡相关基因 RT-PCR荧光定量分析

PBS溶液 （DEPC处理）： PBS溶液中加入 0.1%DEPC， 震荡混匀过夜， 高温灭菌备用。 ddH20 (DEPC处理）： ddH20中加入 0.1 %DEPC， 震荡混匀过夜， 高温灭菌备用。

DEPC处理枪头及离心管： 用 0.1 %DEPC水浸泡， 过夜， 弃水溶液后烘干， 高温灭菌备 用。

1) R A提取

a裂解细胞： 吸去培养皿中培养液， 用 DEPC处理的 PBS溶液洗一次， 加入 TRIzol试 剂 1 ml， 室温孵育 5分钟，吹打混匀细胞， 移入 1.5 ml EP管中。

b 相分离： 在 EP管中加入 0.2 ml 氯仿， 剧烈振荡 15秒， 室温静置 2-3分钟。 然后 4 V 离心 12000 rpm X 15 分钟。

c R A沉淀：取上清 0.5 ml,加入等体积异丙醇，混匀，静置 10分钟。 4 °C离心 12000 rpm 10分钟。

d RNA洗涤： 弃上清，加入 75 %乙醇（用 DEPC水配制） 1 ml,漩涡震荡。 4 °C离心 8000 rpm x5 分钟。

e 重溶 RNA: 弃上清， 空气干燥沉淀 5-10分钟， 加入 DEPC处理水 15μ1， 将沉淀完全 溶解。

f 测定 R A纯度和浓度： 取 1-2 μΙΚ Α样品， 用 1 %琼脂糖凝胶电泳以观察所提 R A 质量。

2) 逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)

a在冰上 DEPC处理过的 PCR反应管中， 配置下列反应混合物

R A模板 1

Random hexamer primer(0.2 μ /μ1) 1 μΐ

R ase-free ddH20 Up to 12 μΐ

70°C孵育 5 min， 冰上冷却， 离心。

b 冰上加入下列成分

5 ^xreaction buffer 4 μΐ

RiboLock Ribonuclease inhibitor(20u/ l) 1 μΐ

!O mM dNTP mix 2 μΐ c加入 RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase(200u/ l) 1μ1，42°〇孵育 60 min。

d 70°C孵育 10 min， 终止反应， 冰上冷却。

e 以合成好的 cDNA为模板， 使用 Taq酶进行 PCR扩增。 反应体系如下：

ddH20 Up to 50μ1

PI (20μΜ) 1 μΐ

Ρ2 (20μΜ) 1 μΐ

cDNA Templates 3 μΐ

PerfectShot Tag酶 25 μΐ

f 将以上反应混合物置 PCR扩增仪上进行 PCR反应： 94°C预变性 2 min, 然后进行 27 个循环反应： 94°C变性 30s， 50.4°C退火 30s， 72 °C延伸 40s; 最后 72 °C继续延伸 8分钟。 g 反应结束后， 每管各取 5 μΐ扩增反应液进行 1 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。 混匀， 离心。 37°C孵育 5 min。

2.3.4.2 凋亡相关基因 Western Blot定量分析

15 SDS-PAGE, 1.5mm的胶， 上样量为 25 l/lane。

Bax转膜条件： 250mA恒流， 25 min。

Bel— 2转膜条件： 250mA恒流， 30 min。 （pvdf膜， 孔径 0.2μηι)。

封闭： 5%脱脂牛奶 （2.5g脱脂牛奶， 用灭菌的 PBS缓冲液溶解至 50 ml， 混匀； PBS缓 冲液： 8g 氯化钠， 0.2g 氯化钾， 1.42g无水磷酸氢二钠， 0.27g无水磷酸二氢钾， 补水 至 1L， 调 pH值 7.3， 高压灭菌）封闭， 室温下孵育 60 min。

加入一抗： Mouse Anti Bax, 稀释度 1 : 200, 室温下孵育 3h。 Rabbit Anti bcl， 稀释度 1 : 200， 室温下孵育 3h。

洗膜： PBST缓冲液 （1L灭菌的 PBS缓冲液加 1 ml tween-20原液， 混匀。 ） 洗膜 3次， 每次 5 min。

力口入二抗： goat anti-rabibit或 goat anti-mouse IRDye 800cw secondary antibody,稀释度 1：

3000, 室温避光条件下孵育 60 min。

洗膜： 避光条件下 PBST洗膜， 每次 5 min， 洗 4次。

扫描： Odyssey仪进行显影。

检测样品中内参蛋白 actin, 膜在洗脱液 （6.35 ml lM Tris-HCl PH6.8， 5 ml 20% SDS, 350 μ1 2-巯基乙醇， 38.3 ml of 双蒸水） 中， 50-55 °C振荡洗膜 30 min。

洗膜： PBS缓冲液洗膜 6次， 每次 5 min。 封闭： 5%脱脂牛奶封闭， 室温下孵育 60 min。

加入 mouse anti actin一抗， 稀释度 1： 1000， 室温孵育 2h。

洗膜： PBST缓冲液 （PBS缓冲液， 0.1 %tween 20) 洗膜 3次， 每次 5 min。

加入 goat anti mouse IRDye 800 cw secondary antibody荧光标记的二抗， 稀释度 1： 5000， 室温避光条件下孵育 60 min。

洗膜： 避光条件下 PBST洗膜， 每次 5 min， 洗 4次。

扫描： Odyssey仪进行显影。

处理胶片，对样品中的目的蛋白和 actin蛋白进行半定量分析，通过灰度值得到读数， Bax 蛋白或 Bcl-2蛋白读数除以 actin蛋白读数的比值进行结果分析。

2.3.5石杉碱甲对 Glu兴奋毒所致 RGC-5凋亡的保护作用信号通路研究

取稳定生长、复苏后培养 3-10代的 RGC-5细胞， 0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬 液， 以 3 10³/孔接种于 96孔板， 每孔 100μ1。 细胞生长至 70%-80%融合时， 将细胞分为 对照组、 Glu处理组和药物预处理组， 每组 6复孔。 药物预处理组分别用 Chelerythrine chloride ( CC，1 μΜ， PKC抑制剂）和 U0126 ( 5 μΜ， MEK1和 ΜΕΚ2选择性抑制剂）孵 育 2h， LY294002 ( 10 μΜ,ΡΒ激酶抑制剂)和 SB216763 ( 5 μΜ， 选择性 GSK-3抑制剂） 孵育 lh。继而 ΙμΜ石杉碱甲孵育 2 h后， 3 mM谷氨酸继续共处理 24 h。每孔加入 CCK-8 溶液 10 μ1， 37°C继续培养 2 h，酶标仪测定吸光度（测定波长 450 nm，参考波长 630 nm)。 每孔测 3次，取其平均值。

细胞存活率 （％) =用药组细胞存活率 /对照组细胞存活率 xl00%

2.3.6 统计学处理

所得数据均用 mean ± SD 表示， 组间比较采用单因素方差分析 （one way analysis of variance, ANOVA p<0.05认为具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 石杉碱甲对 Glu兴奋毒所致 RGC-5凋亡的保护作用

3.1.1谷氨酸损伤量效曲线

随着谷氨酸浓度的增加， 视网膜神经细胞的活力降低， 坏死样或空泡样改变增多； 与正常细胞相比， 3 mM和 10 mM的谷氨酸组视网膜神经细胞活力均降低明显， 具有显 著性差异 （P< 0.01 ) (图 8)。

3.1.2石杉碱甲对 RGC-5保护作用的 M胆碱受体介导机制

CCK-8 结果显示： 与谷氨酸损伤组对比， 0.1、 1、 10 μΜ的石杉碱甲预孵后视网膜 神经细胞活力明显提高， 谷氨酸兴奋毒性被减轻， 石杉碱甲对谷氨酸引起的视网膜神经 细胞损伤有明显的保护效应（图 9)。且此保护作用可被非选择性 M胆碱能受体拮抗剂阿 托品 (atrophine)和选择性 Ml胆碱能受体拮抗剂哌仑西平 (pirezephine)所阻断 （图 10)。 3.2 石杉碱甲对 Glu兴奋毒致 RGC-5损伤的保护作用机制

3.2.1 石杉碱甲对 Glu兴奋毒致 RGC-5凋亡的影响

应用流式细胞技术，我们进一步观察了石杉碱甲对 Glu所致的 RGC-5细胞凋亡作用 的影响。 结果显示， 与 CC-K8实验结果相似， 3 mM Glu诱发了明显的细胞凋亡； 石杉 碱甲可逆转 Glu的作用 （图 11 )。

3.2.2石杉碱甲对 Glu兴奋毒致 RGC-5线粒体膜电位改变的影响

Mito Tracker Red可以特异结合在细胞线粒体膜上， 反映线粒体膜电位， 结合多、 荧 光强， 表明线粒体膜电位高， 线粒体功能好， 而结合少、 荧光弱， 则表明线粒体膜电位 降低， 线粒体功能下降。与正常细胞相比， 3 mM谷氨酸作用后视网膜神经细胞线粒体膜 上 Mito Tracker Red染料结合减少荧光减弱， 线粒体膜电位明显降低； 而与谷氨酸作用相 比， 石杉碱甲作用后， Mito Tracker Red染料结合增多荧光增强， 线粒体膜电位明显升高 (图 12)。说明石杉碱甲可以对抗谷氨酸造成的线粒体膜电位降低， 恢复线粒体功能， 这 可能也是石杉碱甲神经保护作用机制。

3.2.3石杉碱甲对 Glu兴奋毒致 RGC-5钙流变化的影响

谷氨酸 （1 mM) 能引起视网膜神经细胞内钙迅速增加， 当细胞外钙与 EDTA螯合 时， 此效应消失。 表明细胞内钙的升高主要来源于细胞外钙的内流。 石杉碱甲预先孵育 90 sec, 细胞内钙明显减少， 峰值降低 （图 13 )。 提示石杉碱甲可能维持细胞内钙的稳态， 减弱谷氨酸引起的外钙内流， 这可能为石杉碱甲神经保护作用机制。

3.2.4石杉碱甲对 Glu兴奋毒致 RGC-5 Bcl-2及 Bax表达变化的影响

RT-PCR和 Western Blot分别从基因和蛋白水平测定 Bcl-2和 Bax变化， 结果显示谷氨酸 作用后， 相对正常细胞， Bcl-2表达降低， 而 Bax表达增加 （图 14， 图 15 ); 石杉碱甲作 用后， 相对谷氨酸组， Bcl-2表达增加， 而 Bax表达降低 （图 12， 图 13 )。 说明石杉碱甲 可以对抗谷氨酸引起的 Bcl-2和 Bax表达变化， 这可能也是石杉碱甲神经保护作用机制。 3.2.5石杉碱甲阻抑 Glu兴奋毒性的相关通路

预先给予阻断剂 Chelerythrine chloride (CC， PKC抑制剂， 1 μΜ)、 U0126 (MEK1 和 MEK2选择性抑制剂， 5 μΜ)、 LY294002 (ΡΒ激酶抑制剂， 10 μΜ) 、 SB216763 (选择性 GSK-3抑制剂， 5 μΜ)_; 再行石杉碱甲和 Glu处理， 采用 CCK-8法检测视网膜 神经节细胞存活率变化情况。 结果显示， 谷氨酸明显降低视网膜神经节细胞存活率， 石 杉碱甲 （Ι μΜ)可以提高 RGC-5细胞存活率； 给予 CC后， 石杉碱甲的神经保护作用消 失， 表明 PKC的激活参与了石杉碱甲对视网膜神经节细胞保护的作用 （图 16A)。 给予 U0126后， 石杉碱甲的逆转 RGC-5凋亡作用消失， 表明 MEK1和 MEK2的激活也参与 石杉碱甲的神经保护作用 （图 16B); 给予 LY294002后， 石杉碱甲的逆转 RGC-5凋亡的 作用消失， 表明 PI3激酶依赖的 Akt通路参与石杉碱甲对石杉碱甲的神经保护作用 （图 16C); 说明 PKC、 MAPK及 Akt通路可能参与石杉碱甲神经保护作用。 实施例 6石杉碱甲眼用缓释原位凝胶剂制备及评价

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

石杉碱甲 上海中科院药物所惠赠

海藻酸钠 国际特品公司惠赠

羟丙基甲基纤维素 (HPMC k4M)美国卡乐康公司惠赠

戊巴比妥钠上海化学试剂有限公司

1.2 仪器

Castroviejo caliper, Schiotz 眼压计 苏州医疗器械厂

DV-III Ultra流变仪美国 Brookfield公司

1.3 试验动物

新西兰大白兔， 体重 2.2-2.8kg， 雌雄兼用， 由上海交通大学医学院实验动物中心提供， 许可证号 SYXK 2003-0026。

2实验方法

2.2 石杉碱甲眼用原位凝胶剂的制备

2.2.1 处方筛选

拟定供筛选的基质组成， 见表 2。

将石杉碱甲溶于适量稀盐酸中备用， 将处方量的海藻酸钠及 HPMC在搅拌下加入适量注 射用水中， 至充分溶胀溶解溶解再加溶解好的石杉碱甲 (0.01 %)， 氯化钠， 苯扎溴胺， 至 充分溶解， 用三乙醇胺调节 pH为 7.0， 溶液通过微孔滤膜过滤， 再自滤器上加水至总量 混匀， 即得。

表 2不同配比高分子的流动性

海藻酸钠用量 HPMC K4M用 流动性

(%w/w) 量 (％W/W) 25 °C , pH6.0 37°C， pH7.4与 ATF混 0.5 0.5 十 十

0.5 1.0 十 十

1.0 0.5 十 十十

1.0 1.0 十 十十十

1.5 1.0 十十 十十十

Liquid, + very easy to flow; ++ liquid-gel like, flow less readily; +++ gel, difficult to flow (翻 译成中文）。

2.2.2石杉碱甲眼用原位凝胶剂含量测定

石杉碱甲紫外光谱扫描： 精密称取石杉碱甲适量， 配成 10μ_§/ ml的溶液。 以蒸馏水为空 白， 在 200-400 nm波长范围内扫描绘制紫外吸收光谱图。

标准曲线的制备： 精密称取石杉碱甲适量， 配制 100μ_§/ ηι1的石杉碱甲储备液， 再用此溶 液配制成 2、 5、 10、 15、 20、 25、 30 μ_§/ ml的待测液， 测定其吸光度。 以石杉碱甲浓度 对吸光度进行线形回归， 建立标准曲线。

精密度测定： 按标准曲线的制备方法配制浓度分别为 5、 15、 30 μ_§/ ml样品溶液， 进行 日内和日间精密度考察， 日内测定 5次， 日间连续测定 5次， 计算精密度。

回收率测定： 按标准曲线的制备方法配制浓度分别为 5、 15、 30 μ_§/ ml样品溶液， 测定 其吸光度， 每个浓度的样品重复 5次， 进行回收率计算。

2.2.2 石杉碱甲眼用原位凝胶剂的流变学特征

样品温度控制在 25和 37±0.1 °C， 测定不同剪切率 （0-200S-1 ) 样品粘度和剪切应力的变 化。 25°C测定时未与人工泪液混合， 37°C测定时与人工泪液混合。

2.2.3 石杉碱甲眼用原位凝胶剂对水负荷诱导高眼压图降眼压作用考察

1 ) 眼压测定

将兔固定于兔箱， 用眼压计测量眼压， 重复测量三次， 取其平均值， 记录眼压曲线。

2) 高眼压模型的建立一水负荷诱导高眼压

选择健康无眼疾白色家兔， 每兔从耳缘静脉注射 3%戊巴比妥钠（1 ml/kg)全身麻醉。 用 眼压计测量基础眼压， 原发性高眼压者弃之不用。 然后经胃管向胃内缓慢灌入 37°C温水 100 ml/kg, 水负荷后即制成高眼压。 实验进行至 120 min时， 再行灌胃以维持眼压。

3 ) 给药方法

实验大白兔随机分成 4 组， 即石杉碱甲组滴眼液组 （0.01%)， 石杉碱甲原位凝胶剂组 ( 0.01%), 生理盐水空白对照组和水负荷高眼压模型组， 每兔每眼分别滴入药液 50μ1， 分别于给药前、 给药后 30， 60， 90， 120， 150， 180， 210， 240 min测量眼压。

2.2.4 石杉碱甲眼用原位凝胶剂对家兔瞳孔的作用考察

实验大白兔随机分成 3组， 每组 10只 （10只眼）。 即生理盐水组， 石杉碱甲滴眼液组及 石杉碱甲原位凝胶组。 每兔每眼滴入药液 50μ1。 分别于给药前与给药后的 30， 60， 90， 120， 150， 180， 210和 240 min测量兔瞳孔直径。

3 统计学处理

所得数据均用 mean±SD表示，组间比较采用单因素方差分析（one way analysis of variance, ANOVA) o p<0.05认为差别有显著性。

3实验结果

3.1石杉碱甲含量测定的方法学验证

石杉碱甲在波长为 310±1 nm处有最大吸收， 故选择 310±1 nm为测定波长 （图 15 )。 以 石杉碱甲浓度 （C ) 对吸光度 (A)进行线形回归， 得标准曲线如下： C=11.236A-1.397 (r=0.9991, n=5), 表明在 2-30μ_§/ ml范围内石杉碱甲浓度与吸光度线性关系良好， 回收率 和精密度结果见表 3和表 4。 测定结果符合生物样品分析测试要求。

表 3 石杉碱甲紫外吸收日间差日内差

Added Intra-day RSD ( %) Inter-day RSD ( %) concentration(g/ ml) ( g/ ml)

4.99±0.13 0.64 4.90±0.18 2.71

15.52±0.12 0.73 15.55±0.15 0.72

30 29.49±0.58 1.33 29.28±0.50 1.61

表 4石杉碱甲紫外含 定回收率

Added Founded Recoveries

concentration(g/ ml) concentration ( g/ ml)

5 5.11±0.19 101.4±2.8

15 15.84±0.23 99.4±1.47

30 29.35±0.31 97.7±1.0

3.2 石杉碱甲原位凝胶剂流变学特征

石杉碱甲原位凝胶剂与泪液后粘度迅速增加， 随剪切力的增加， 凝胶剂的粘度逐渐降低， 而与泪液混合前， 凝胶剂粘度随剪切力变化不大 （图 18， 图 19)。 3.3 石杉碱甲眼用原位凝胶剂对家兔瞳孔的影响

0.01%HupA滴眼液的縮瞳时间约 210 min。 而相同浓度的石杉碱甲原位凝胶剂的縮瞳效 应时间延长至 300 min， 具有显著性差异 （图 20) (P<0.01 )。

3.4石杉碱甲原位凝胶剂对水负荷诱导高眼压兔的降眼压作用

新西兰大白兔基础眼压平均为 25.26±0.08 mmHg (n=10), 水负荷后眼压迅速升高。石杉 碱甲可明显降低水负荷所致高眼压， 其降眼压作用在眼部给药后 15分钟时开始起效， 药 效可持续 180 min。 各时间点石杉碱甲的降眼压效果与生理盐水组相比具有显著差异 （P <0.01 )。 浓度为 0.01%的石杉碱甲滴眼液及原位凝胶剂均可明显降低眼压， 原位凝胶剂 组的降压时间大于 240 min， 较滴眼液组时间长 （图 21 )。

本研究采用离子敏感型高分子材料海藻酸钠， 辅以 HPMC制备了石杉碱甲原位凝胶剂， 具有良好的假塑流体特征， 药效延长近 2倍， 是石杉碱甲眼部用药的理想剂型。 实施例 7石杉碱甲眼用缓释原位凝胶剂药动学研究

1 材料与仪器

1.1试验动物

新西兰大白兔， 体重 2.2-2.8kg， 雌雄兼用， 由上海交通大学医学院实验动物中心提供， 许可证号 SYXK 2003-0026。 健康无眼疾， 服药前两周， 禁服一切药物。

1.2 药品与试剂

石杉碱甲滴眼液 （0.1%) 自制

石杉碱甲眼用原位凝胶剂 （0.1%) 自制

石杉碱乙 （内标） 上海同田生物技术有限公司

等张灌注缓冲液 CMA公司 （USA)

甲醇、 乙腈、 甲酸、 水为色谱纯 Fisher公司

乌拉坦 国药集团化学试剂有限公司

托吡卡胺滴眼液 无锡山禾药业股份有限公司

MR-5314型黏合剂 美国 BSA公司

1.3 主要仪器

CMA微透析系统： CMA/102型微注射泵， CMA/110 Liquid switch, CMA/ 142样品收集 器 （Acton, MA， USA), MD-2005型微透析探针 (BSA， West Lafayette, IN, USA), 包括导 入、 导出管， 中空纤维管， 半透膜及相应接头。

安捷伦 6410质谱仪：配有 API—电喷雾离子源， MassHunter数据采集处理工作站安捷伦 1200液相色谱系统： 配有 G1311A四元梯度泵， G1322A在线真空脱气机， G1329A自动 进样器， G1316A柱温箱， Sartorius BT 224S型 电子天平， Sartorius arium 611型纯水器， Thermo Forma-86C 低温冰箱

Sigma 3K18型高速冷冻离心机， 其他： 眼科剪， 眼科镊， 止血钳， 持针器， 眼科缝针及 缝线，导入针，动脉夹， IPBS， CMA公司，含 Na+147mmol/l， K+4mmol/l， Ca2+2.3mmol/l，

CL-156mmol/l， 渗透压为 290mosm/kg， H 7.4

2 体内分析方法的建立

2.1 仪器条件

2.1.1高效液相色谱条件

色谱柱： XDB Zorbax C18柱 （4.6mmx l50mmx5mm)， 流动相： 甲醇： 0.05 %甲酸 =60: 40， 流 速： 0.8 ml/ min， 柱 温： 25 °C

2.1.2 质谱条件

质谱条件： 离子源： 电喷雾离子源 (ESI), 正离子检测，

干燥气流速： 8L/ min， 喷雾气压力： 35psig， 干燥气温度： 350°C， 离子源电压： 4000V, 扫描方式： 多反应监测 （MRM), 参数见下表

表 5 石杉碱甲与石杉碱乙 MRM模式扫描条件

Compound Transition Dwell Fragment Collision MSI MS2

time (ms) voltage(V) energy (V)

HupA 243.0→225. 200 160 20 Unit Unit

9

IS 257.1→145. 200 140 15 Unit Unit

9

2.2 样品处理及测定方法

精密量取收集的透析液 40 μ1， 置于 l ml EP管中， 加入石杉碱乙流动相溶液（0.5mg/ ml) 5 μ1， 振荡 30 s， 加入氯仿 l ml， 涡旋振荡 10 min， 3000 rpm离心 10 min， 取下层有机溶 剂， 转移置 l ml EP管中， N2 流下挥干， 加入 45 μ 流动相， 振荡 3 min， 进样 20μ1。 2.3 方法学验证

2.3.1标准溶液配制

石杉碱甲标准溶液： 精密称取石杉碱甲 10 mg， 甲醇： 水 （50: 50) 溶解稀释制成 100μ_§/ ml的储备液， 避光保存于 4°C冰箱备用。

石杉碱乙标准溶液： 精密称取石杉碱甲 10 mg， 甲醇： 水 （50: 50) 溶解稀释制成 100μ_§/ ml的储备液备用。

2.3.2 线性范围考察

取空白透析液加入石杉碱甲储备液， 甲醇： 水 （50: 50) 稀释， 使石杉碱甲浓度为 0.5、 5、 20、 100、 200ng/ ml, 按透析房水样品处理项下操作， HPLC/MS法测定， 计算石杉碱 甲与内标峰面积之比， 此值为纵坐标， 石杉碱甲浓度为横坐标， 回归得线性方程。

2.3.3 精密度考察

取空白透析房水 40μ1数份， 加入石杉碱甲标准溶液， 配置高、 中、 低三个浓度的样品， 按样品处理项下操作， HPLC/MS法测定。

日内差异： 一天重复 3次

日间差异； 每天测定一次， 连续测定 3天。

2.3.4 回收率试验

2.3.4.1 萃取回收率

配制高、 中、 低三个浓度的石杉碱甲流动相溶液， 各直接进样 20 μ1， 其峰面积作为对照 组峰面积。 另取 3份空白透析房水各 40 μ1， 分别加入不同浓度的石杉碱甲标准溶液， 配 制成高、 中、 低三份样品， 混匀后按前述方法萃取进样， 所得峰面积与对照品峰面积比 较得萃取回收率。

2.3.4.2 方法回收率

取空白透析房水加入石杉碱甲标准溶液， 配制高、 中、 低三个浓度的样品， 按样品处理 项下操作， HPLC/LC法测定， 根据标准曲线折算出理论浓度， 与实际浓度相比得出方法 回收率。

2.3.4.3 微透析探针体外回收率测定

微透析探针经导管与微透析泵相连接， 将微透析膜浸润于 IPBS中， IPBS中石杉碱甲浓 度分别为 100ng/ ml和 1μ_§/ ηι1， 设定微透析泵流速为 2 μΐ/ min, 平衡 2小时后开始采样， 每 20分钟采样一次， 共采样 6次。 将采集的样品按上述方法进样检测， 所得浓度与灌注 液中初始浓度相比， 即得微透析法体外回收率 （公式如下）： 回收率(％)=01/0)

Cn为每 20分钟采集的样本经检测所得石杉碱甲浓度， CO为 IPBS中石杉碱甲的初始浓 度。

2.3.5稳定性考察

2.3.5.1 石杉碱甲在 IPBS液中的稳定性考察

用 IPBS配制 20ng/ ml， 200ng/ ml浓度的石杉碱甲的标准液， -20°C保存， 分别于保存后 的第 0、 7、 14天按样品处理下操作后测定， 将第 7、 14天测定浓度与第 0天测定浓度相 比较， 考察其稳定性。

2.3.5.2石杉碱甲在房水中的稳定性考察

用家兔房水配制 20 ng/ ml， 200ng/ ml浓度的石杉碱甲的标准液， -20°C保存， 分别于保 存后的第 0、 7、 14天按样品处理下操作后测定， 将第 7、 14天测定浓度与第 0天测定浓 度相比较， 考察其稳定性。

2.3.6 基质效应考察

基质效应是指检测样品中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响。 根据质谱检 测的特点， 方法学验证应进行基质效应考察。

用流动相配制浓度为 20ng/ ml, 200ng/ ml石杉碱甲溶液 （A)， 同时用 IPBS配制相同浓 度的石杉碱甲溶液（B)， 分别加入相同浓度石杉碱乙内标， HPLC/MS法检测分析， 考察 IPBS对于石杉碱甲和内标的离子抑制效应以及石杉碱甲和内标相互间的离子抑制效应。 3实验方法

新西兰大白兔 6只随机分为两组， 一组为 0.1 %石杉碱甲滴眼液组， 一组为 0.1 %石杉碱 甲原位凝胶剂组。 称重， 耳缘静脉注射 20%乌拉坦（5 ml/kg)， 使其完全麻醉。 然后将其 置于兔台， 四肢及头部用绳索固定并使其一侧眼睛处于水平位置， 用眼科剪剪去眼睫毛， 将兔眼瞬膜缝合于眼睑， 然后用托吡卡胺滴眼液滴眼， 10分钟后将导入针从兔角膜边缘 一侧刺入， 迅速从另一端刺出， 将微透析探针从针孔中引入， 当半透膜位于兔眼前房中 央时， 迅速到拨出入针， 同时用黏合剂封堵穿刺孔。 微透析探针的导入管与微注射泵相 接， 导出管与样品采集器连接， 微注射泵流速设定在 2μ1/ ηώι (图 22)。 平衡 2小时后， 给药 50μ1每眼， 2 min后开始采样， 共采样 5h， 每 20 min采样一次。 采样结束后按样品 处理项下操作进样。

4实验结果

4.1 一般情况

兔麻醉后， 生命体征平稳， 探针放置后， 眼部粘性分泌物增多， 2h后该现象基本消失。 1%石杉碱甲滴眼液滴眼后，各时间点均未出现兔眼结膜充血、 水肿、流泪等刺激症状， 流 涎现象亦未观察到。

4.2 石杉碱甲和石杉碱乙的质谱特征

在 ESI正离子检测模式下， 石杉碱甲在一级质谱中形成的分子离子峰 [M+H]+为 m/z 243 (图 23 )， 二级质谱中可得到稳定的碎片离子 m/z 226和 m/z 210 (图 24)。在选定的检测 条件下， 碎片离子 m/z 226的丰度大于碎片离子 m/z 210， 因此选择 m/z 243→m/z 226做 多通道反应监测 （MRM ) 进行定量分析。 石杉碱乙在一级质谱中形成的分子离子峰 [M+H]+为 257 (图 23 )， 二级质谱中可得到稳定的碎片离子 m/z 198和 m/z 146 (图 25 )， 因此选择 m/z 282→m/z 212做多通道反应监测 （MRM)。 在选定的检测条件下， 碎片离 子 m/z 146的丰度大于碎片离子 m/z 198， 因此选择 m/z 257→m/z 198做多通道反应监测

(MRM) 进行定量分析。

4.3石杉碱甲及石杉碱乙的色谱行为

在选用的检测条件下， 标准样本 （含石杉碱甲及内标） 及微透析采集的生物样本在检测 过程中无干扰物质， 峰形良好， 石杉碱甲与内标的保留时间约为 2 min， 表明本检测方法 具有良好的特异性。

4.4 方法学评价

4.4.1 线性范围-标准曲线

标准曲线反映了所测定物质浓度与仪器响应值之间的关系， 标准曲线高低浓度范围为定 量范围。

IPBS液中， 石杉碱甲定量范围在 0.5-200ng/ ml浓度之间。在此范围所测定物质浓度与仪 器响应值之间的线性关系良好， 回归方程为 y=0.8745X+0.0786， (r=0.9991)_o

4.4.2 定量下限（The lower limit of quantification, LLQ), 最低检测限（Minimum detection limit, LDT)

定量下限是标准曲线上的最低浓度点， 表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低 药物浓度， 检测限 (LDT)是指分析方法能够从背景信号中区分出药物时， 所需样品中药物 的最低浓度， 无需定量测定。

在本试验建立的检测条件下， IPBS液中石杉碱甲的 LLQ为 0.5 ng/ ml (S/N≥10)， LDT为 0.2ng/ ml o

4.4.3 精密度

Variance within-day Variance between-day

C(ng/ ml)

C RSD(%) C RSD(%)

20 20.2 6.8 19.4 5.6

50 49.3 7.4 48.5 7.9

200 211.5 3.8 199.3 8.4

4.3.4 回收率 浓度为 20-200ng/ ml的石杉碱甲方法回收率达 99%， 提取回收率在 55 %左右， 方法回收 率和萃取回收率测定结果见表 7， 浓度为 lOOng/ ml和 1μ_§/ ml的石杉碱甲在不同时间点 的探针回收率在 30-40%之间。

表 7石杉碱甲测定回收率

C (ng/ ml) 20 50 100 200 ¹⁰⁰⁰ Mean士 SD

Method recovery (%) 98.5 102.5 98.8 99.9±2.2 Extraction recory (%) 51.6 62.4 53.5 55.8±5.8 Probe recovery (%) —— —— 38.5 32.5 35.5±4.2

4.3.5 样品稳定性

4.3.5.1 石杉碱甲在 IPBS液中的稳定性

结果显示样品保存 7天、 14天后， 测定的 RSD均在 15%范围内 （表 8)， 说明在该储存 条件下石杉碱甲稳定性良好。

表 8 石杉碱甲在 IPBS液中的稳定性

Concentration Determined at Determined at

(ng/ ml) seventh day (%) fourteenth day ( )

20 98.56±0.51 99.85±3.05

200 99.40±1.83 97.24±8.77

4.3.5.2石杉碱甲在房水中的稳定性

结果显示样品保存 7天、 14天后， 测定的 RSD均在 15%范围内， 说明在该储存条件下 石杉碱甲稳定性良好。

表 9石杉碱甲在房水中的稳定性

Concentration Determined at Determined at

(ng/ ml) seventh day (%) fourteenth day ( )

20 94.56±3.34 97.85±4.12

200 95.09±2.38 98.65±7.54

4.3.6 IPBS样品的基质效应一离子抑制效应考察

在质谱检测中， 离子抑制效应指所检测的混合物中含有难挥发性成分 （如盐） 从而导致 带电液滴形成或带电液滴蒸发的效率发生改变，最终影响到进入检测器的带电离子数目， 最终影响检测的精确度与准确度。 而 IPBS液中含有钠盐、钾盐和钙盐， 有可能导致离子 抑制效应而影响检测， 实验结果发现， IPBS对石杉碱甲的检测有较强离子抑制现象， 从 不经处理的透析房水中不能检测出石杉碱甲与内标石杉碱乙。

4.4 房水药物浓度数据

将房水样品按测定方法项下测定药物浓度， 结果见表 10， 表 11。

将 3只家兔滴眼石杉碱甲滴眼液及原位凝胶剂的药物浓度平均值与时间作图， 得到药物 浓度一时间曲线图 （图 27)。

表 10单次给药石杉碱甲滴眼液房水内药物浓度

T( min) 1 2 3 Mean士 SD

0-20 15.51 23.02 44.97 27.83±15.30

20-40 61.13 104.26 81.73 78.04±21.57

40-60 78.81 97.82 89.91 88.85±9.55

60-80 61.72 54.95 61.57 59.41±3.87

80-100 50.89 41.53 31.59 41.34±9.66

100-120 31.92 23.09 17.27 24.09±7.37

120-140 16.89 18.99 5.20 13.72±7.43

140-160 11.44 2.20 9.65 7.76±4.90

160-180 8.18 1.22 3.13 4.18±3.60

180-200 5.19 0.30 0.92 2.14±2.66

200-220 2.17 0.60 0.60 1.13±0.91

表 11单次给药石杉碱甲原位凝胶剂房水内药物浓度

T( min) 1 2 3 Mean士 SD

0-20 78.18 59.18 50.10 62.49±14.33

20-40 98.94 87.95 59.44 83.11±20.39

40-60 94.11 82.32 55.08 77.17±20.02

60-80 80.38 65.36 51.38 63.71±14.50

80-100 64.08 55.17 44.17 54.48±9.97

100-120 58.17 44.35 34.08 45.53±12.09

120-140 52.40 20.45 37.40 36.75±15.99

140-160 47.74 18.47 25.14 30.45±15.34

160-180 36.43 17.25 22.13 25.27±9.97

180-200 31.68 15.86 16.68 21.41±8.91

200-220 28.67 24.60 11.31 17.95±9.40

220-240 15.96 21.04 9.06 15.91±6.01

240-260 11.88 19.04 7.81 12.91±5.68

260-280 9.92 16.12 6.92 10.99±4.69

280-300 7.96 13.91 7.82 9.90±3.48

300-320 6.96 10.94 6.36 8.08±2.49

4.2 药动学参数的计算

4.2.1 统计计算结果

本文采用 Das软件处理房水内药物浓度数据计算 AUC及 AUMC。 峰浓度 Cmax与达峰 时 tmax、 直接从药-时曲线读出， 清除速度常数 ke可根据药时曲线消除相中末端数个试 验点的 logC对时间进行线性回归， 由直线的斜率求出。半衰期 tl/2 = 0.693/ke。运用统计 矩原理， 计算平均滞留时间 MRT:

MRT=AUMC/AUC

计算结果见表 12， 表 13。

表 12单次给药石杉碱甲滴眼液房水内药动学参数 parameter 1 2 3 Mean士 SD

Cmax(ng/ ml) 78.81 97.82 89.91 88.85±9.55 tmax( min) 50 50 50 50±0 ke(l/ min) 0.010 0.018 0.013 0.013±0.004

72.19 39.15 53.31 54.88±16.57

AUC[(ng/

6012 6718 7100 6910±552 ml)*h]]

AUMC 430396 461678 425949 439341±19472

MRT(h) 61.30 68.72 59.99 63.34±44.71

13单次给药石杉碱甲原位凝胶剂房水内药动学参数

parameter 1 2 3 Mean士 SD

Cmax(ng/ ml) 98.9434 87.9537 59.4434 83.11±20.39 tmax(h) 30 30 50 36.37±11.55 ke(l/h) 0.008 0.011 0.006 0.008±0.002 tl/2(h) 86.39 63.37 113.54 87.77±25.11

AUC[(ng/

12071 9950 11251 11092±1170 ml)*h]]

1126661±11246

AUMC 1027315 1248764 1103905

5

MRT(h) 85.10 125.50 98.11 102.91±20.62

4.2.2 相对生物利用度

相对生物利用度按下式计算：

Fr=AUC(test)* 100/AUC(reference)

生物利用度结果见表

表 14石杉碱甲原位凝胶剂与滴眼液药动学参数比较

Paramerters Drop Gel

Cmax(ng/ ml) 88.85士 9.55 106.09士 5.37 tmax( min) 50±0 37±11.5 ke(l/ min) 0.013±0.004 0.014±0.007

54.88±16.57 87.77±25.11**

AUC[(ng/ ml)*h]] 6910±552 11092±1170

AUMC 439341±19472 1126661±112465

MRT(h) 63.34±44.71 102.91±20.62**

Fr(%) 100% 167.79%**

( mean士 SD， n=3 ) * *p < 0.01 v.s. HupA drop group

实施例 8: 石杉碱甲滴眼液的制备 (一）

按下述配比取原料

石杉碱甲 O.lg

0.1N HC1 0.2g

HPMC 2g

葡萄糖 200g

苯扎溴胺 O.lg

去离子水 余量至 1000ml (处方一般总量为 1000ml)

制备方法如下：

取石杉碱甲， 用 0.1N HC1溶解， 加注射用水稀释后； 搅拌状态下加入 HPMC直至溶解， 放置 12-24小时至完全溶胀溶解； 搅拌条件下依次加入葡萄糖， 苯扎溴胺， 溶解并混匀， 0.22μηι微孔滤膜过滤， 再自滤器上加水至总量混匀。

所制备的石杉碱甲滴眼剂 ρΗ 6， 粘度 20cps， 渗透压 289mOsm， 澄明度良好。 实施例 9: 石杉碱甲滴眼液的制备（二）

按下述配比取取原料

石杉碱甲 10g

0.1N HC1 2g

透明质酸钠 lg

葡萄糖 400g

尼泊金乙酯 O.lg EDTA O.Olg

注射用水 余量至 1000ml

制备方法如下：

取石杉碱甲， 用 0.1N HC1溶解， 加注射用水稀释后； 搅拌状态下加入透明质酸钠直至溶 解， 放置 12-24小时至完全溶胀溶解； 搅拌条件下依次加入葡萄糖， 尼泊金乙酯， EDTA, 溶解并混匀， 0.22μηι微孔滤膜过滤， 再自滤器上加水至总量混匀。

所制备的石杉碱甲滴眼剂 ρΗ 6， 粘度 15cps， 渗透压 290mOsm， 澄明度良好。 实施例 10: 石杉碱甲滴眼液的制备（三）

按下述配比取原料

石杉碱甲 O.Olg

0.1N HC1 0.02g

聚乙烯醇 140g

NaCl 6g

尼泊金乙酯 O.lg

EDTA O.Olg

注射用水 余量至 1000ml

制备方法如下：

取石杉碱甲，用 0.1N HC1溶解，加注射用水稀释后；搅拌状态下加入聚乙烯醇直至溶解， 放置 12-24小时至完全溶胀溶解； 搅拌条件下依次加入 NaCl, 尼泊金乙酯， EDTA, 溶 解并混匀， 0.22μηι微孔滤膜过滤， 再自滤器上加水至总量混匀。 所制备的石杉碱甲滴眼 剂 ρΗ 7， 粘度 3cps (25°C±0.rC )， 渗透压 290mOsm， 澄明度良好。 实施例 11: 石杉碱甲眼用原位凝胶剂的制备（一）

按下述配比取原料

石杉碱甲 O.lg

0.1N HC1 0.02g

卡波姆 971 3g

泊洛沙姆 130g

NaCl 6 .0g

尼泊金甲酯 O.lg EDTA O.Olg

硼酸 0.2g

注射用水 余量至 1000ml

制备方法如下：

将石杉碱甲溶于 0.1N HC1中， 注射用水稀释后， 搅拌状态下加入、 卡波姆、 泊洛沙姆， 至溶解， 放置过夜， 使高分子材料完全溶胀溶解 ； 搅拌条件下依次将 NaCl, 尼泊金甲 酯， EDTA至充分溶解， 用硼酸调节 pH为 5.5， 溶液通过微孔滤膜过滤， 再自滤器上加 水至总量混匀。 实施例 12: 石杉碱甲眼用原位凝胶剂的制备（二）

按下述配比取原料

石杉碱甲 10g

0.1N HC1 2g

海藻酸钠 lg

HPMC lg

葡萄糖 400g

苯扎溴胺 0.05g

三乙醇胺 O.Olg

注射用水 余量至 1000ml

制备方法如下：

将石杉碱甲溶于适量稀盐酸中， 注射用水稀释后， 搅拌状态下加入海藻酸钠、 HPMC, 至溶解， 放置过夜， 使高分子材料完全溶胀溶解； 搅拌条件下依次将葡萄糖， 苯扎溴胺， 至充分溶解， 用三乙醇胺调节 pH为 7， 溶液通过微孔滤膜过滤， 再自滤器上加水至总量 混匀。 实施例 13: 石杉碱甲眼用原位凝胶剂的制备（三）

按下述配比取原料

石杉碱甲 O.Olg

0.1N HC1 0.02g

卡波姆 2g

HPMC lg NaCl 5g

尼泊金乙酯 O.lg

EDTA O.Olg

硼酸 0.5g

注射用水 余量至 1000ml

制备方法如下：

将石杉碱甲溶于 0.1N HC1中， 注射用水稀释后， 搅拌状态下加入卡波姆、 HPMC, 至溶 解，放置过夜，使高分子材料完全溶胀溶解；搅拌条件下依次将 NaCl,尼泊金乙酯， EDTA 至充分溶解，用硼酸调节 pH为 5,溶液通过微孔滤膜过滤，再自滤器上加水至总量混匀。

Claims

权利要求

1. 石杉碱甲在制备预防、 治疗高眼压或视网膜神经节细胞损伤的眼科疾病药物 中的应用。

2. 根据权利要求 1所述的应用， 其特征在于： 所述的眼科疾病是青光眼、 眼压 升高或伴有视网膜神经节细胞损伤的眼科疾病。

3. 根据权利要求 1所述的应用， 其特征在于： 所述的眼科疾病是青光眼。

4. 石杉碱甲眼用制剂在制备预防、 治疗青光眼、 眼压升高或伴有视网膜神经节 细胞损伤的眼科疾病药物中的应用， 所述的眼用制剂是石杉碱甲滴眼液和石 杉碱甲眼用原位凝胶剂。

5. 根据权利要求 4所述的应用， 其特征在于， 所述的石杉碱甲眼用原位凝胶剂 是由下列组分组成：

组分 含量 （重量％)

石杉碱甲 0.001-1

0.1N HC1 0.002-0.2

增稠剂 0.05-20

等渗调节剂 0-40

防腐剂 0.01-0.5

络合剂 0-0.1

pH调节剂 0-0.05

水余量，

所述的增稠剂含有温度敏感型、 _PH敏感型或离子敏感型高分子材料中的一 种或多种；

所述的等渗调节剂是选自甘露醇、 葡萄糖、 氯化钠、 甘油或丙二醇； 所述的防腐剂选自苯扎氯胺、 苯扎溴胺、 尼泊金甲、 乙、 丙酯中的一种或多 种；

所述的 pH值调节剂选自盐酸、 硼酸、 枸橼酸、 硼酸钠、 枸橼酸钠、 氢氧化 钠、 氢氧化钾、 或三乙醇胺。

6. 根据权利要求 4所述的应用， 其特征在于， 所述的石杉碱甲滴眼液是由下列 组分组成:

组分 a里 aa ¾

石杉碱甲

0.1N HC1 0.002-0.02

增稠剂 0 15

防腐剂 0.01-0.5

等渗调节剂 0-40

pH值调节剂 0-0.05

o

络合剂 0- o0.1

水余量， 1

所述的增稠剂选自羟丙基甲基纤维素、 透明质酸钠或聚乙烯醇； 所述的防腐剂选自苯扎氯胺、 苯扎溴胺、 尼泊金甲、 乙、 丙酯中的一种或 一种以上的混合物的一种或多种；

所述的等渗调节剂是选自甘露醇、 葡萄糖、 氯化钠、 甘油或丙二醇； 所述的 pH值调节剂选自盐酸、 硼酸、 枸橼酸、 硼酸钠、 枸橼酸钠、 氢氧化 钠、 氢氧化钾或三乙醇胺；

所述的络合剂选自依地酸二钠。

7. 一种石杉碱甲眼用原位凝胶剂， 其特征在于， 眼用原位凝胶剂是由下列组分 组成：

. jgg- 0/、

组分

石杉碱甲 0.001-1

0.1N HC1 0.002-0.2

增稠剂 0.05-20

等渗调节剂 0-40

防腐剂 0.01-0.5

络合剂 0-0.1

pH调节剂 0-0.05

水 余量。

8. 根据权利要求 7所述的石杉碱甲眼用原位凝胶剂， 其特征在于， 所述的增稠 剂含有温度敏感型、 _PH敏感型或离子敏感型高分子材料中的一种或多种。

9. 根据权利要求 7所述的石杉碱甲眼用原位凝胶剂， 其特征在于， 所述的等渗 调节剂是选自甘露醇、 葡萄糖、 氯化钠、 甘油或丙二醇。

10. 根据权利要求 Ί所述的石杉碱甲眼用原位凝胶剂， 其特征在于， 所述的防 腐剂选自苯扎氯胺、 苯扎溴胺、 尼泊金甲、 乙、 丙酯中的一种或多种。

11. 根据权利要求 7所述的石杉碱甲眼用原位凝胶剂， 其特征在于， 所述的 pH 值调节剂选自盐酸、 硼酸、 枸橼酸、 硼酸钠、 枸橼酸钠、 氢氧化钠、 氢氧化 钾或三乙醇胺。

12. 根据权利要求 8所述的石杉碱甲眼用原位凝胶剂， 其特征在于， 所述的增 稠剂含有增稠剂可含有甲基纤维素、 羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素、 透明质酸钠的一种或多种。

13. —种石杉碱甲滴眼液， 其特征在于， 石杉碱甲滴眼液是由下列组分组成： 组分 含量 （重量％)

石杉碱甲 0.001〜1

0.1N HC1 0.002-0.02

增稠剂 0〜15

防腐剂 0.01-0.5

等渗调节剂 0-40

pH值调节剂 0-0.05

络合剂 0-0.1

水余量，

所述的增稠剂选自羟丙基甲基纤维素、 透明质酸钠或聚乙烯醇； 所述的防腐剂选自苯扎氯胺、 苯扎溴胺、 尼泊金甲、 乙、 丙酯中的一种或 一种以上的混合物的一种或多种；

所述的等渗调节剂是选自甘露醇、 葡萄糖、 氯化钠、 甘油或丙二醇； 所述的 pH值调节剂选自盐酸、 硼酸、 枸橼酸、 硼酸钠、 枸橼酸钠、 氢氧化 钠、 氢氧化钾或三乙醇胺；

所述的络合剂选自依地酸二钠。