TW201350109A - 用於降低眼部不適的方法及組成物 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種包含滲溶性(osmolytic)試劑,特別是甜菜鹼或肉毒鹼化合物的組成物及裝置,其係用來降低與多種疾病或症狀,特別是與高淚液膜張力相關的疾病或症狀相關之眼部不適。本發明亦關於使用本發明之組成物及裝置來治療或防止多種疾病或症狀的方法。
Description
本發明係關於一種包含滲溶性試劑特別是甜菜鹼或肉毒鹼化合物之組成物及裝置,其用於降低與多種疾病或症狀相關特別是與高淚液膜張力相關的疾病或症狀之眼部不適。本發明亦關於一種使用本發明之組成物及裝置來治療或防止多種疾病或症狀的方法。
乾眼症係一種常見的眼睛表面疾病,其影響數百萬人及其特徵為乾燥、刺激、視力模糊及眼淚不穩定性。乾眼症的關鍵病理學因素之一為眼淚滲透壓增加。乾眼症患者的淚液膜張力之範圍通常在320至400mOsm間,且亦已報導淚液膜之增加的張力係與乾眼症疾病的嚴重性相關聯。淚液膜高滲透壓造成眼部不適及發炎。高滲透壓壓力刺激角膜上皮細胞製造介白素-1(IL-1)、IL-6、IL-8及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、及蛋白代謝性酵素諸如MMP-9。
高張性造成細胞有害地改變作用,及高張性的立即效應為細胞體積減少(細胞收縮),此可由細胞內組分包括
無機離子及大分子的累積而抵消,造成細胞體積之立即且有效率地調整。但是,此無機離子的累積可中斷蛋白質穩定性及導致細胞因凋亡而死亡。在人類角膜上皮細胞中之高張性引發的凋亡係經由細胞色素c主導的凋亡途徑發生,其係受JNK及ERK/MAPK發信途徑影響。MAP激酶藉由活化細胞素包括TNF-α的轉錄因子來調節基因轉錄。TNF-α依次經由外因性凋亡途徑及經由發炎來活化凋亡蛋白酶-8而主導細胞凋亡。額外的是,由人類緣上皮細胞產生的TNF-α增加已經與媒質滲透壓增加有相關聯。
對許多人來說,佩戴隱形眼鏡的明顯阻礙係舒適性。抛開先前已具有降低隱形眼鏡佩戴的舒適性之眼睛症狀的人不說,佩戴隱形眼鏡在其它方面可造成健康眼睛不適。
至今所使用的隱形眼鏡分成二個一般種類。硬式鏡片係從藉由丙烯酸酯類諸如聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)之聚合所製備的材料形成。凝膠、水凝膠或軟式鏡片係藉由聚合諸如甲基丙烯酸2-羥乙酯(HEMA)之單體製得,或在延長佩戴型鏡片的情況中,係藉由聚合含矽單體或大單體製得。軟式隱形眼鏡的實施例有聚矽氧水凝膠鏡片。
再者,在具有造成角膜過度彎曲或角膜突出的病症人中,佩戴隱形眼鏡會是治療的重要部分。但是,若其造成明顯不適時,此係不可行。同樣地,雖然至少某些小孩佩戴隱形眼鏡可係較佳,若佩戴隱形眼鏡令人不舒服時,小孩更可能反對其而非佩戴眼鏡或根本無眼睛矯正。
已經報導有高如50%中止隱形眼鏡佩戴。研究已發現放棄隱形眼鏡的主要理由係由於在隱形眼鏡佩戴期間眼部不適的徵候。已熟知放棄隱形眼鏡係全球隱形眼鏡市場無法成長的主要原因之一。隱形眼鏡佩戴可造成淚液膜中斷而導致乾眼症。此乾眼症可增加淚液膜的張力而導致隱形眼鏡佩戴者不適。軟式隱形眼鏡及延長佩戴型鏡片典型包含水,通常係24至75%或較高。在隱形眼鏡內的水蒸發造成隱形眼鏡藉由從眼睛的淚液層吸收水來補充此水。若淚液層脫水時,隱形眼鏡變得令人不舒服並危及視力。
於此,對改善與多種疾病及症狀相關,特別是與隱形眼鏡佩載者的淚液膜張力增加相關之不適的組成物及方法存在有需求。
在本專利說明書中對任何先述技藝之參照不且應該不採用作為確認或建議的任何形式,此先述技藝在澳洲(Australia)或任何其它管轄地中形成普通的一般知識之部分,或此先述技藝可合理地預計由熟知此技藝者查明、了解及視為有關聯。
本發明解決一或多個上述概述的先述技藝之問題。
在一個態樣中,本發明提供一種包含生理學可接受的滲溶性試劑諸如甜菜鹼或肉毒鹼之眼科裝置,其中該裝置在佩戴期間准許從該裝置脫附一治療有效量的試劑進
入眼睛中。典型來說,該裝置係藉由可釋放性吸收一滲溶性試劑而准許脫附該試劑。在較佳的具體實例中,該滲溶性試劑係一種甜菜鹼化合物或肉毒鹼化合物或二者之組合,較佳為三甲基甘胺酸及/或L-肉毒鹼。該甜菜鹼化合物亦可係脯胺酸甜菜鹼。典型來說,該裝置包含一或多種甜菜鹼化合物及/或一或多種肉毒鹼化合物。
在一個具體實例中,該裝置係隱形眼鏡,較佳為單次使用型隱形眼鏡。該單次使用型隱形眼鏡可係每日或延長佩戴型。較佳的是,該隱形眼鏡係聚矽氧水凝膠鏡片。
在另一個具體實例中,該裝置准許在約2、4、6、8、10、12或24小時時期內脫附該滲溶性試劑。
在本發明的任何態樣中,該眼科裝置能抑制、改善或降低與高淚液膜張力相關的眼部不適。不由任何理論或作用模式限制,來自裝置諸如隱形眼鏡的滲溶性試劑之釋放就地進入淚液膜中,此允許該試劑由眼睛中的細胞包括角膜上皮細胞取用,其增加細胞內滲透壓及依次降低細胞由於高淚液膜張力而遭遇的滲透壓。此降低細胞遭遇的滲透壓降低細胞將減少體積、經歷凋亡及產生眼部不適的可能性。
在進一步態樣中,本發明之眼科裝置更包含一擴散衰減劑。較佳的是,該擴散衰減劑係維他命E,如在下列解釋。該擴散衰減劑可係修改該裝置的分子擴散性之液體、或複數種相分離的液體聚集物、或經分散以作用為一或多種包含在該裝置內的滲溶性試劑之擴散的阻礙物之固
體顆粒的任何組合。若維他命E係存在於本發明之眼科裝置中時,較佳的是,該維他命E係在加入甜菜鹼或肉毒鹼化合物前存在於該裝置中或上。
較佳的是,該眼科裝置以任何方式包含該滲溶性試劑,諸如甜菜鹼化合物及/或肉毒鹼化合物,如此該試劑能從該裝置脫附然後可獲得用以引進眼睛細胞諸如角膜上皮細胞中。該眼科裝置可以任何方式包括一試劑,如此該試劑可獲得以降低在角膜上皮細胞中因細胞外環境中之異常高張力所引起的滲透壓。較佳的是,該試劑係甜菜鹼化合物及/或肉毒鹼化合物。較佳的是,該甜菜鹼化合物及/或肉毒鹼化合物係存在於該裝置與角膜間之界面處。
在一個具體實例中,該甜菜鹼化合物及/或肉毒鹼化合物係與該眼科裝置整合,例如,該甜菜鹼化合物及/或肉毒鹼化合物係在製造期間加入至該裝置。在此具體實例中,該甜菜鹼化合物及/或肉毒鹼化合物係存在於該裝置內。在另一個具體實例中,該甜菜鹼化合物及/或肉毒鹼化合物亦可在製造後之任何時間處加入至該眼科裝置的外部,其中能從該裝置脫附一有效量的化合物。較佳的是,該裝置係在包含一或多種滲溶性試劑的溶液中包裝。
在較佳的具體實例中,該眼科裝置諸如隱形眼鏡的結構性組成物或聚合物於本文中指為不包含甜菜鹼化合物。換句話說,該眼科裝置之結構性組成物或聚合物係無甜菜鹼。
較佳的是,包含在該裝置中之滲溶性試劑諸如甜
菜鹼化合物及/或肉毒鹼化合物的量足以持續在該裝置施加至眼睛的期間降低於角膜上皮細胞中之滲透壓。甚至更佳的是,包含在該裝置中的甜菜鹼化合物及/或肉毒鹼化合物之量足以抑制、改善或降低角膜上皮細胞收縮。
本發明之裝置特別合適於使用在具有異常高淚液膜張力的患者中。那些患者可具有淚液膜張力大於約300、400、500、600或700mOsm。典型來說,具有異常高淚液膜張力的患者具有張力範圍在約300mOsm至約500mOsm間,甚至更典型的範圍在320至400mOsm間。典型來說,那些患者係經臨床診斷為具有乾眼症症候群(DES)。
在另一種態樣中,本發明提供一種包含生理學可接受的滲溶性試劑諸如甜菜鹼或肉毒鹼之眼科裝置的用途,其係使用來治療、防止或抑制眼部不適,其中該裝置准許在佩戴期間讓一治療有效量的試劑從該裝置脫附進入眼睛中。
較佳的是,本發明之眼科裝置係使用來治療、防止或抑制與乾眼症症候群或隱形眼鏡佩戴相關的眼部不適。
在進一步態樣中,有提供一種用以在患者中抑制、降低或改善與高淚液膜張力相關的眼部不適之方法,其包括下列步驟:˙將本發明之眼科裝置施加至經認定具有或係在發展出具有高張力的淚液膜之風險下的患者;因此,在患者中抑制、降低或改善與高淚液膜張
力相關的眼部不適。
在進一步態樣中,有提供一種用以在患者中抑制、降低或改善與高淚液膜張力相關的眼部不適之方法,其包括下列步驟:˙決定一患者是否具有或係在發展出具有高張力的淚液膜之風險下;及˙將本發明之眼科裝置施加至經認定具有或係在發展出具有高張力之淚液膜的風險下之患者;因此,在患者中抑制、降低或改善與高淚液膜張力相關的眼部不適。
在另一種態樣中,本發明提供一種用以在患者中抑制、降低或改善與高淚液膜張力相關的眼部不適之方法,其包括將本發明之眼科裝置施加至患者。
在較佳的具體實例中,本發明提供一種用以在經認定具有乾眼症症候群或高淚液膜張力的患者中抑制、降低或改善與高淚液膜張力相關的眼部不適之方法,其包括將本發明之眼科裝置施加至患者。
在進一步態樣中,本發明提供一種甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物之用途,其係使用在用於抑制、降低或改善與高淚液膜張力相關的眼部不適之藥劑的製備中。較佳的是,該藥劑係一種眼科裝置,甚至更佳為隱形眼鏡。若該藥劑係一種眼科裝置時,該藥劑准許在佩戴期間讓一治療有效量的試劑從該裝置脫附進入眼睛中。
在另一個具體實例中,有提供一種使用在上述提
及之本發明的方法中之套組,該套組包括:˙一容納該眼科裝置或本發明之組成物的容器;及˙一含有用法說明的標籤或包裝說明書。
在進一步具體實例中,當使用在上述提及之本發明的方法中時,有提供一種套組。
在另一個具體實例中,有提供一種用以使用在上述提及之本發明的方法中之套組,該套組包括:˙一本發明之眼科裝置;及˙一含有用法說明的標籤或包裝說明書。
在進一步具體實例中,當使用在上述提及之本發明的方法中時,有提供一種套組。
在某些具體實例中,該套組可包括一或多種進一步成份,用以防止在隱形眼鏡/眼科裝置之佩戴期間的不適、改良舒適度或改善在眼睛舒適度上的減低。
在另一種態樣中,本發明亦關於一種製造用以抑制、降低或改善與高淚液膜張力相關的眼部不適之眼科裝置的方法,其中該眼科裝置包含一有效量的滲溶性試劑諸如甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物,其中該方法包括讓一眼科裝置在製造期間與一包含該試劑的溶液接觸之步驟,如此該試劑能在佩戴期間從該裝置脫附。
再者,本發明提供一種用以製造具有滲溶性試劑的眼科裝置之方法,其包括讓該裝置與一包含該滲溶性試劑諸如甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物的組成物接觸一段足以讓該試劑被吸收進該裝置之基質中的時間之步驟。該吸收
程度係如此,該試劑當在使用於白天佩戴時期能從該裝置脫附。較佳的是,該裝置係一種隱形眼鏡,甚至更佳為該隱形眼鏡係單次使用型。該滲溶性試劑可在將該眼科裝置銷售或輸送至患者前與該眼科裝置接觸(例如,在密封該包裝前將甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物加入至溶液,隨後消毒該包裝),或在該眼科裝置之製備期間與該眼科裝置接觸。
在一個具體實例中,該眼科裝置係一種隱形眼鏡。較佳為該隱形眼鏡係一種軟式隱形眼鏡。該軟式隱形眼鏡的實施例有聚矽氧水凝膠鏡片。該鏡片可藉由將鏡片浸泡在一溶液中而製備,包括一包含甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物的溶液。典型來說,將該鏡片浸泡在該溶液中15分鐘至8小時,較佳為1小時。該甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物想要以0.01至10容積重量%之量範圍存在於該溶液中。在一個具體實例中,其存在的量範圍係0.1至5容積重量%。在一個具體實例中,該甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物基本上係該溶液唯一的活性成份。
在較佳的具體實例中,本發明之眼科裝置係藉由從在5至20mM間之溶液吸收該滲溶性試劑而製備。較佳的是,該滲溶性試劑係一種甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物。例如,該甜菜鹼化合物可以範圍約1.0微克至15微克存在於眼科裝置例如隱形眼鏡中,較佳為1.2微克至12微克,及/或該肉毒鹼化合物的存在範圍可係約1.0微克至20微克,較佳為1.6微克至16微克。再者,該甜菜鹼化合物可以範圍約0.05%至0.2%w/w存在於鏡片中,及/或該肉毒鹼化合物的存在範
圍可係約0.08%至0.3%w/w。較佳的是,於鏡片中存在任何量的甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物,如此當使用在如描述於本文的方法中時,提供約5至100mM之脫附的化合物之淚液膜濃度,較佳為約5至50mM,甚至更佳為約20mM。
在進一步態樣中,本發明提供一種在患者中抑制、降低或改善眼部不適的方法,其包括將一甜菜鹼化合物給藥至眼睛,其中該患者已經診斷出具有與高淚液膜張力相關的症狀。較佳的是,該症狀係乾眼症症候群。在一個具體實例中,以滴眼液形式將甜菜鹼給藥至眼睛。在另一個具體實例中,藉由從眼科裝置脫附將甜菜鹼給藥至眼睛。較佳的是,甜菜鹼係該滴眼液中唯一的醫藥活性組分。
在另一種態樣中,本發明提供一種組成物,其包含甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物作為唯一的醫藥活性組分。較佳的是,該組成物更包括一生理學可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明不包括描述在PCT/US2005/041064或US2010/0184664中的組成物。在較佳的具體實例中,本發明之組成物不包括丁四醇或係無丁四醇。
本發明之任何組成物可以套組、包裹或容器提供給患者使用,以增加該欲從眼科裝置較佳為隱形眼鏡脫附的滲溶性試劑之量,較佳為甜菜鹼或肉毒鹼化合物。例如,可由患者使用一包含該組成物的套組、包裹或容器來接觸該眼科裝置一段足夠時間以讓該試劑被吸收進該裝置之基質中。該套組、包裹或瓶子可包括用法說明以指導患者將該眼科裝置與本發明之組成物接觸。該眼科裝置較佳為可
用於延長佩戴或係可再使用的隱形眼鏡,及該用法說明可指導患者將該裝置與該組成物接觸。
如於本文中所使用,除了上下文需要外,否則用語“包含(comprise)”及該用語的變化諸如“包括(comprising)”、“包含(comprises)”及“包含(comprised)”不想要排除進一步添加劑、組分、事物或步驟。
本發明的進一步態樣及在前述段落中所描述的態樣之進一步具體實例將從下列描述,藉由實施例提供及伴隨著參照伴隨的圖形變明瞭。
圖1係HCLE細胞在曝露至甜菜鹼(1.0-200mM在具有滲透壓300mOsm的培養媒質中)16小時後之粒腺體活性。*代表經甜菜鹼處理的群組與沒有甜菜鹼的對照比較之顯著差異(p<0.05,n=6)。
圖2係高滲透壓在細胞凋亡(A)及細胞體積(B)上之效應的流動式細胞測量分析:圖2A(I)係典型的點圖,其顯示出使用Annexin V(指示出凋亡)及PI(壞死)對細胞生存能力進行之流動式細胞測量分析。健康細胞群顯示在該點圖的左下角落“a”中。這些係對Annexin V及PI二者之染色呈負者。由象限“b”(右下象限)表示的細胞群體係對PI之染色呈負但是對Annexin V黏結呈正,此指示出早期凋亡細胞群。象限“c”係對Annexin V及PI二者染色呈正者,此指示出薄膜完整性喪失。因此,此象限代表晚期凋亡細胞。最後,象限“d”描出對Annexin V
黏結呈負,但是對PI呈正的細胞,其指示出細胞膜完全喪失,因此表示壞死的細胞。圖2A(II)顯示出健康細胞(在等滲壓狀態下,300mOsm)及在500mOsm下含或不含甜菜鹼(10mM)之凋亡細胞的統計分析。*代表所觀察到在等滲壓狀態(300mOsm)下之健康細胞與在高滲透壓壓力(500mOsm)下之細胞的比較百分比之顯著差異(p<0.05)。已觀察到在高張條件下以10mM甜菜鹼處理(500mOsm+10mM甜菜鹼),相當大地增加健康細胞之百分比,類似於在等滲壓狀態下的那些。圖2B(I)描出含及不含甜菜鹼(10mM)該高滲透壓效應在細胞體積上的衝擊之流動式細胞測量分析的典型影像。於此,右多邊形“a”指示出健康細胞群。與此相對,多邊形“b”代表縮小的細胞群。圖2B(II)顯示出健康及縮小的細胞之百分比的統計分析。已觀察到在遭受高滲透壓衝擊時,健康細胞的百分比明顯減低(p<0.05)。在將10mM甜菜鹼給藥至500mOsm時,健康細胞的百分比明顯增加,接近在等滲壓狀態(300mOsm)下之細胞。
圖3係甜菜鹼在曝露至高滲透壓媒質16小時的HCLE細胞上之效應:(A)細胞粒腺體活性;及(B)細胞數量。資料係以平均±SD(n=10)百分比顯示出,與未處理的等滲壓(300mOsm)媒質組比較。*係在經等滲壓300mOsm及高滲透壓500mOsm處理之細胞間的顯著差異。#係在含及不含甜菜鹼處理在500mOsm下之細胞間的顯著差異(p<0.05)。
圖4係由在曝露至含或不含甜菜鹼(10mM)的高滲透壓媒質(500mOsm)16小時後之HCLE細胞所產生的TNF-α。資
料代表五個樣品之平均±SD。*顯示出統計顯著差異,與沒有甜菜鹼的對照比較(p<0.05)。
圖5係於甜菜鹼存在或缺乏下,在細胞曝露至等滲壓(300mOsm)或高張媒質(500mOsm)16小時後,HCLE因應高滲透壓壓力及以甜菜鹼(5或10mM)處理之凋亡蛋白酶活性:(A)凋亡蛋白酶-8;(B)凋亡蛋白酶-9;及(C)凋亡蛋白酶-3/7。資料係以除以其各別的等滲壓媒質組(300mOsm)之平均百分比±SD(n=6)顯示出。*係在含及不含甜菜鹼處理且曝露至相同媒質滲透壓之細胞間的顯著差異(p<0.05)。
圖6係HCLE的Annexin V/PI染色:a)當接受高滲透壓條件時,與等滲壓條件比較之損傷細胞的百分比之統計分析,及甜菜鹼的滲透保護性(osmoprotective)效應。*顯示出與當細胞接受高滲透壓條件時比較的統計顯著差異(p>0.05)。該損傷細胞包括早期凋亡細胞(b)、晚期凋亡細胞(c)、早期壞死(d)及晚期壞死(e)。影像係使用共焦顯微鏡在60X下獲得。圖(f)(g)(h)係各別在300mOsm、500mOsm及500mOsm+10mM甜菜鹼中的細胞之典型影像,及其係在10X下以共焦顯微鏡獲得。
圖7係於肉毒鹼(10mM)存在或缺乏下,對高滲透壓衝擊的細胞反應之流動式細胞測量分析。
圖7A(I)表示出流動式細胞測量點圖,其顯示出因應含或不含肉毒鹼(10mM)的高滲透壓處理之健康及縮小的細胞群。已看見損傷/縮小的細胞數目(由多邊形“b”表示)大大地增加;因此,由多邊形“a”表示的健康細胞群當接受高滲
透壓條件時減少。圖7A(II)顯示出從流動式細胞測量資料獲得之健康及縮小的細胞之百分比的統計分析。當細胞於肉毒鹼存在下曝露至500mOsm時,縮小的細胞數目明顯降低。圖7B(I)及圖7B(II)各別顯示出流動式細胞測量分析的凋亡細胞及典型影像,及健康細胞的百分比之統計分析。從流動式細胞測量分析證明,凋亡及壞死細胞的百分比(由在圖7B(II)中的象限b,c,d表示)在接受高滲透壓壓力的細胞中係比較高,及其當給藥10mM滲透保護劑肉毒鹼時減低。因此,健康細胞群在以10mM肉毒鹼處理時增加(由在圖7B(II)中的象限“a”表示)。
圖8係HCLE因應高滲透壓壓力及肉毒鹼處理的凋亡蛋白酶活性。細胞係於肉毒鹼(10mM)存在或缺乏下曝露至等滲壓(300mOsm)或高張媒質(450或500mOsm)16小時:(A)凋亡蛋白酶-8;(B)凋亡蛋白酶-9;及(C)凋亡蛋白酶-3/7。資料係以除以各別的等滲壓媒質群(300mOsm)之百平均分比±SD(n=6)顯示出。*係在含及不含滲透保護劑處理且曝露至相同媒質滲透壓(p<0.05)之細胞間的顯著差異。
圖9係在含或不含肉毒鹼(10mM)下曝露至高滲透壓媒質(450或500mOsm)16小時後,由HCLE細胞產生之TNF-α。資料代表五個樣品之平均±SD。*顯示出與其沒有甜菜鹼的各別對照比較之統計顯著差異(p<0.05)。
圖10係在60小時時間時期(A)或10小時時間時期(B)內,來自含及不含維他命E的O2OPTIX及ACUVUE OASYS鏡片之甜菜鹼釋放。
圖11係在10小時時間時期內,來自含及不含維他命E的O2OPTIX鏡片之甜菜鹼釋放,其以隨著時間釋放的甜菜鹼之微克數(A)或總甜菜鹼的%(B)顯示出。
圖12係在150小時時間時期(A)或60小時時間時期(B)內,來自含及不含維他命E的ACUVUE OASYS鏡片之甜菜鹼釋放,其以隨著時間釋放的甜菜鹼之微克數或總甜菜鹼的%顯示出。
圖13係計劃1在第0、14、21或35天的時間點處,因應甜菜鹼(10mM)或肉毒鹼(10mM)處理之老鼠角膜染色的平均分數,其中在老鼠開始安置於ICES中時,將化合物給藥至其。星號*顯示出在相同時間點處,與含有PBS的對照比較之統計顯著差異(p<0.05)。
圖14係在四組間,於每個時間點處之角膜染色分數的比較。星號*顯示出比較B及C處理組與PBS組在第35天時之統計顯著差異(p<0.05)。在全部四組間,於第0天、第14天及第21天之時間點處無明顯差異。
圖15係在老鼠被安置於ICSE中21天後,在安置開始時起始一天四次的局部處理(A、B或C)(計劃1)或沒有處理(d)之老鼠結膜的TNF-α、IL-17、IL-6或IL-1β之mRNA表現性,藉由qRT-PCR。使用未經安置或處理的正常健康老鼠作為正常健康對照。
圖16係在老鼠被安置於ICSE中21天後,沒有任何處理接著繼續安置另外14天且以A、B或C一天四次局部處理(在第22天起始)或沒有處理(d)之老鼠結膜的TNF-α、IL-17、
IL-6或IL-1β之mRNA表現性,藉由qRT-PCR。使用未經安置或處理的正常健康老鼠作為正常健康對照。
圖17係因應L-肉毒鹼(0.25%在培養媒質中)之處理在4小時蒸發乾燥後的凋亡/壞死細胞百分比(對Annexin V正染色/對碘化丙啶(propiium iodide)正染色)。使用在沒有蒸發的正常培養條件下,或在蒸發乾燥與無L-肉毒鹼處理下之培養媒質作為對照。
將要了解的是,在本專利說明書中所揭示及定義的本發明擴展至二或更多種從本文或圖形提到或明瞭之各別特徵的全部可替代的組合。全部這些不同組合構成多種本發明之可替代的態樣。
現在,將詳細地參照本發明的某些具體實例。雖然本發明將描述相關連的具體實例,將要了解其目的並非將本發明限制至那些具體實例。相反地,本發明想要涵蓋全部的代用品、改質及同等物,其可被包含在本發明如由申請專利範圍所定義的範圍內。
熟習該項技術者將了解許多類似或相等於在本文中描述的那些方法及材料,其可使用在本發明之實施中。本發明決不限於所描述的方法及材料。
本發明係以從眼科裝置就地釋放出滲溶性試劑諸如甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物為基準,以緩和產生自高淚液膜張力的眼部不適。不由任何理論或作用模式所限制,
從隱形眼鏡就地釋放出這些試劑進入淚液膜中允許該試劑被眼睛的細胞包括角膜上皮細胞取用,其依次增加細胞內滲透壓及降低細胞由於高淚液膜張力所遭遇的滲透壓。此降低細胞所遭遇的滲透壓降低細胞將經歷凋亡及產生不適之可能性。
已發現甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物在治療與眼睛症狀及病症諸如乾眼症症候群(DES)相關的不適上有用。DES(有時亦指為“乾眼症病症”)係一種正常淚液膜的病症,其產生自下列之一:˙減少眼淚產生;˙過量的眼淚蒸發;˙正常在淚液層中發現的黏液或脂質之產生異常。
水性(水狀)眼淚缺陷係由水狀眼淚之生產差或該水狀淚液層過量蒸發造成。淚腺差地製造眼淚可係老化、荷爾蒙改變或多種自體免疫病的結果,諸如原發性索格倫氏(Sjogren)症候群、類風濕性關節炎或狼瘡。該水狀淚液層的蒸發性喪失通常係覆蓋的脂質層不足之結果(其可由例如瞼板腺之油產生缺陷造成)。此外,某些藥療法諸如抗組織胺、抗抑鬱劑、β-阻斷劑及口服避孕劑可減少眼淚生產。
本發明的優點包括一種有效降低在隱形眼鏡使用期間的眼部不適之方法。本發明可在隱形眼鏡之持續佩戴期間提供降低此眼部不適。經由眼科裝置就地提供甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物緩和對額外調配物之施加諸如滴眼
液或人造眼淚的需求。
本發明的具體實例包括使用一種擴散衰減劑,諸如維他命E。本發明的此形式係優良的,因為慢慢釋放出滲溶性試劑諸如甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物允許更延長地降低需要延長使用隱形眼鏡的患者之眼部不適。因此,眼部不適的降低可伴隨著隱形眼鏡的持續使用時間。此外,甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物之慢慢或減弱釋放在重覆使用型隱形眼鏡中特別有用及緩和對該裝置重覆施加化合物的需求。對單次使用型隱形眼鏡來說,該試劑足以在該天內擴散,例如6,8,10或12小時,如此改善或避免不適。
其它減弱該滲溶性試劑擴散的方法包括使用含配位基的眼科裝置諸如隱形眼鏡作為傳遞化合物的媒介。此對策係以在化合物與聚合物基質中的配位基間之弱交互作用為基礎,包括氫鍵、靜電交互作用及客宿交互作用,其可引發該化合物負載及控制其釋放。併入鏡片聚合物基質中的陽離子或陰離子配位基官能基將係有用,及該滲溶性試劑之釋放可透過離子交換。此方法更完整描述在Hu等人的International Journal of Polymer Science.Volume 2011(2011),Article ID 814163,9 pages中。
另一種減弱擴散的方法包括以一經控制的親水性/疏水性共聚物比率來製備一眼科裝置。在隱形眼鏡聚合物中併入親水性單體將增加在親水性化合物與聚合物基質間之交互作用,特別在包含疏水性聚矽氧之矽水凝膠鏡片中。該親水性/疏水性共聚物的比率具材料相依性及應該平
衡其它鏡片性質的需求,諸如最理想的鏡片機械性質、水含量、離子滲透性及穿透度。此方法在上述Hu等人中有更完整描述。
減弱擴散的進一步方法係在膠體結構中內含化合物的眼科裝置,其係使用奈米粒子、奈米乳液、奈米懸浮液及脂粒分散在該裝置中。奈米粒子的尺寸從10變化至1000奈米,及在隱形眼鏡的應用中,較佳的尺寸係小於50奈米。肉毒鹼或甜菜鹼化合物可溶解或分散進該聚合物溶液中及乳化進水溶液中,以製得一水在油中微乳液。負載在該奈米粒子中的化合物可藉由在奈米粒子製造那時併入藥物;或藉由在奈米粒子形成後,藉由在包含該化合物的溶液中培養該奈米粒子而吸附藥物來達成。此等方法更完整描述在:Diebold及Calonge等人,Progress in Retinal and Eye Research,(2010),29:596-609;Kumar等人,Journal of Advanced Pharmaceutical Technology & Research,(2013)4(1):9-17;Gulsen及Chauhan,Investigative Ophthalmology & Visual Science,(2004),45(7):2342-2347;Gulsen及Chauhan,International Journal of Pharmaceutics(2005),292:95-117)中。
另一種減弱擴散的方法為分子壓印型聚合物水凝膠。此等方法更完整描述在Singh等人,Journal of Basic and Clinical Pharmacy,(2001),002(002):87-101中,其係可應用。對模板分子例如肉毒鹼化合物或甜菜鹼化合物壓印以形成一記憶口袋,其將在鏡片聚合物合成期間埋入聚
合物網狀物內。親和力可藉由變化在肉毒鹼及/或甜菜鹼化合物與鏡片聚合物間之交互作用的數目及強度而修改,及其釋放可由聚合物篩孔尺寸、模板尺寸及肉毒鹼及/或甜菜鹼化合物與該聚合物鏈之交互作用影響。
“滲溶性試劑”或“滲溶質(osmolyte)”係一種實質上影響滲透作用的化合物。此容易地在所提供的環境中經驗地評估。特別是,滲溶性試劑或滲溶質作用以平衡滲透壓及較佳為不參與細胞新陳代謝。這些化合物當能移動通過在不同滲透壓之流體間的阻礙物諸如細胞膜時,具有滲透保護性質。較佳的是,該滲溶性試劑或滲溶質係一種甜菜鹼或肉毒鹼化合物。
如於本文中所使用,“甜菜鹼化合物”係包含甜菜鹼化學基團及可應用於給藥至眼睛的任何化合物。典型來說,該甜菜鹼化合物具有分子量約600Da或較少。較佳為,該甜菜鹼化合物具有分子量約在60至600Da間。更佳為,該甜菜鹼化合物具有分子量約250、200或150Da或較少。特別佳的甜菜鹼化合物包括三甲基甘胺酸、脯胺酸甜菜鹼、甜菜鹼鹽酸、β-丙胺酸甜菜鹼、羥基脯胺酸甜菜鹼、椰子醯胺丙基甜菜鹼、甜菜鹼脂質、甜菜鹼酯類(例如,氫氧化乙氧羰基甲基三甲基銨)或甜菜鹼醯胺類。亦預期甜菜鹼的結構類似物如合適於使用在本發明中,只要它們具有滲透保護性質。此結構類似物的實施例包括膽鹼-O-硫酸鹽及二甲基二氫硫基丙酸鹽(DMSP)。
甜菜鹼係一種兩性離子四級銨化合物,其亦已知
為三甲基甘胺酸(TMG)、甘胺酸甜菜鹼、菾菜鹼及三甲甘胺酸。其係具有式(CH3)3N+CH2COO-及分子量117.2的胺基酸甘胺酸之甲基衍生物,及因為其3個化學反應性甲基,其已經標出如為甲胺的特徵。甜菜鹼係在微生物、植物及動物中發現,及係許多食物包括小麥、貝類、菠菜及甜菜的明顯組分。甜菜鹼係藉由膽鹼氧化酶從膽鹼合成(當膽鹼將這些基團之一供給至另一個分子時,其變成三甲基甘胺酸甜菜鹼),及其可將甲基供應至高半胱胺酸以形成甲硫胺酸。甜菜鹼亦間接包含在肉毒鹼之合成中,其需要將長鏈脂肪酸運輸穿過該內部粒腺體成員用於氧化。在一個具體實例中,“甜菜鹼化合物”不包括椰子醯胺丙基甜菜鹼。
應用在臨床及健康中的二種主要甜菜鹼形式係描述在下列。
(1)三甲基甘胺酸,純甜菜鹼形式;及(2)甜菜鹼鹽酸(甜菜鹼HCl)。
如於本文中所使用,“肉毒鹼化合物”係一種已知為3-羥基-4-(三甲基銨基(trimethylazaniumyl))丁酸酯或維他命Bt的化合物。肉毒鹼取得2種立體異構物形式,L-肉毒鹼及D-肉毒鹼。L-肉毒鹼在新陳代謝過程中扮演一活性角色,同時D-肉毒鹼不具有任何效應。呈乙醯基-L-肉毒鹼形式的肉毒鹼係使用來治療阿茲海默氏病,因為其正向影響膽鹼激素性系統、多巴胺及NMDA受體系統。L-肉毒鹼L-酒石酸鹽係比其它形式的L-肉毒鹼更生物可獲得及較快吸收。“肉毒鹼化合物”典型具有分子量300Da或較少。”肉毒
鹼化合物”亦包括烷醯基L-肉毒鹼,包括選自於由下列所組成之群的那些:乙醯基、丙醯基、異戊醯基、丁醯基及異丁醯基L-肉毒鹼;及其醫藥可接受的鹽。亦預期肉毒鹼的結構類似物如為合適於使用在本發明中,只要它們具有滲透保護性質。
如於本文中所使用,“高淚液膜張力”包括一具有可測量的滲透壓大於200mOsm之淚液膜,較佳為大於300mOsm、400mOsm或500mOsm。該高淚液膜張力典型在300至500mOsm間,甚至更佳為在320至400mOsm間。
眼淚滲透壓現在係從下彎月液面測量及其範圍在正常眼睛中係大約300至310mOsm/公斤。乾眼症之診斷可發生在大於310mOsm/公斤,較佳為大於311、312、313、314、315或316mOsm/公斤。但是,眼淚高滲透壓在患有乾眼症的各別患者中可到達高如360至400mOsm/公斤。
滲透壓測量係以溶液的四個依數性質之一的測量為基準:凝固點、沸點、蒸氣壓及滲透壓。凝固點滲透計依賴在滲透壓與因將溶質加入至溶劑的凝固點降低間的相關聯性。經由蒸氣壓降低之測量係以在滲透壓與因將溶質加入至溶劑的蒸氣壓降低間的相關聯性為基準。隨著凝固點及蒸氣壓技術二者,滲透壓測量係從所收集的眼淚樣品獲得。眼淚樣品尺寸依滲透計的型號在5-20微升變化。“晶片基底的滲透計”允許活體內測量。其同步收集及分析50奈升眼淚樣品的電阻抗(TearlabTM滲透壓系統)。
眼部不適通常係透過問卷來測量。最常使用的方
法係藉由一數字評定量表詢問患者來評比其眼睛舒適度,其係以數字評分例如1-10或1-100來呈現該人士及通常有描述1意謂著什麼或10或100意謂著什麼,通常為1=差的、壞的等等及10/100=好的或優良的。這些係受歡迎,由於其容易了解及容易使用,及其同樣地大概一般使用在人們生活的其它領域中。其它主觀評分包括李克特(likert)量表,其通常對問題/描述提供5種強迫式選擇答案,大體而言:強烈同意、同意、既非同意或也非不同意、不同意或強烈不同意。有亦視覺類比量表(visual analogue scales)(VAS),其允許個人將一垂直線條繪製到預定的水平線條上以指示出其現在的舒適度。
眼部不適可藉由關於診斷乾眼症之測量淚膜破裂時間、眼淚體積、角膜染色等等來臨床測量。
用語“治療有效量”或“有效量”指為一甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物的量,其產生眼部不適症狀之改良或整治、防止眼部不適、改善眼睛舒適度或改善眼睛舒適的降低。
用語“醫藥組成物”或“組成物”指為一包含甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物的組成物,其中該甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物係分散在一醫藥可接受的載劑中。該組成物可進一步包括一或多種額外的賦形劑,諸如稀釋劑、乳化劑、緩衝劑、安定劑、結合劑、充填劑及其類似物。本發明之醫藥組成物可包括二或更多種甜菜鹼化合物,例如三甲基甘胺酸及脯胺酸甜菜鹼;或二或更多種肉毒鹼化合物,例如
L-肉毒鹼及乙醯基-L-肉毒鹼。
用語“眼科裝置”指為一駐在眼睛中或上之物件。該裝置可提供光學修正、物理修正(例如,角膜過度彎曲或突出)、或可係化粧用品。該眼科裝置包括但不限於軟式隱形眼鏡、人工水晶體、重疊鏡片(overlay lenses)、眼睛嵌入物(ocular inserts)、淚點塞(punctal plugs)及光學嵌入物(optical inserts)。本發明的較佳眼科裝置係從聚矽氧彈性體或水凝膠製得的軟式隱形眼鏡,其包括但不限於聚矽氧水凝膠及氟水凝膠。該眼科裝置可係“單次使用型”裝置,例如單次使用型隱形眼鏡(日抛或延長佩戴型);或“多次使用型”裝置,例如多次使用型隱形眼鏡。
用語“防止眼部不適”指為避開、延遲或降低在想要佩戴眼科裝置的人士中與眼部不適相關的跡象及/或症狀(諸如乾燥及刺激)之頻率及強度。用語“防止”於本文中以臨床觀念使用,其意謂著抑制不適發生,而非使得不適從來不可能在所提供的患者中發生的絕對觀念。因此,抑制發展成不適或降低新的不適等同在本專利說明書的意義內之“防止”,即使有預存在的不適。用語“改善眼睛舒適度”指為藉由減少諸如乾燥及刺激之症狀增加佩戴眼科裝置人士的眼睛舒適度。用語“降低眼部不適”或“改善眼部不適”指為減少諸如乾燥及刺激的症狀,特別在佩戴眼科裝置的人士中。用語“改善眼睛舒適度減低”指為避免或減少佩戴眼科裝置的人士之眼部不適增加。
在本發明的一個具體實例中,在該眼科裝置中包
含一擴散衰減劑以影響甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物從該裝置釋放。同時考慮到合適於施加至眼睛及降低甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物可從眼科裝置擴散的速率之任何化合物,特別有用的擴散衰減劑係維他命E。包含維他命E的隱形眼鏡之實施例及其製備說明可在WO 2009/094466中找到,其揭示全文以參考方式併入本文。
在可替代的具體實例中,根據本發明之醫藥組成物將經調配用以給藥至眼睛,例如滴眼液或噴霧。
本發明的裝置或組成物及另一種活性成份可同時(在相同或不同組成物中)或在足夠接近的時間內給藥,如此該給藥產生想要的效應重疊。再者,本發明之組成物可進行或接著其它治療。例如,可由患者使用本發明之包含甜菜鹼化合物的眼科裝置,其然後同時給藥一包含肉毒鹼化合物的組成物。再者,可由患者使用本發明之包含肉毒鹼化合物的眼科裝置,其然後同時給藥一包含甜菜鹼化合物的組成物。
套組或“製造物件”可包含一容器及一在該容器上或與其相關之標籤或包裝說明書。合適的容器包括例如瓶子、小玻瓶、注射器、泡殼包裝等等。該容器可從多種材料形成,諸如玻璃或塑膠。該容器容納一甜菜鹼化合物及/或肉毒鹼化合物、有效治療該症狀之本發明的眼科裝置或本發明之醫藥組成物,及可具有一無菌存取埠。該標籤或包裝說明書指示出該甜菜鹼化合物及/或肉毒鹼化合物、本發明之眼科裝置或醫藥組成物係使用來治療選擇的
症狀。在一個具體實例中,該標籤或包裝說明書包括用法說明及指示出可使用該甜菜鹼化合物及/或肉毒鹼化合物、本發明之眼科裝置或醫藥組成物來抑制、改善或降低與高淚液膜張力相關的眼部不適。
該套組可包含(a)本發明之眼科裝置或本發明之醫藥組成物;及(b)一第二容器,其包含一合適於施加至眼睛的溶液、載劑、賦形劑、其它活性成份及其類似物。在本發明的此具體實例中之套組可進一步包含一或多個包裝說明書。該說明書可例如指示出本發明之眼科裝置或醫藥組成物可使用來抑制、改善或降低與高淚液膜張力相關的眼部不適,及提供該套組的用法說明。該第二容器可包含一合適於施加至眼睛的溶液(例如,水溶液)及/或醫藥可接受的緩衝劑,諸如用於注射的制菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝的鹽液、侖爵氏(Ringer)溶液及右旋糖溶液。其可進一步包含從商業及使用者觀點想要的其它材料,包括其它緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
本發明亦提供一種用來將治療有效量之一或多種甜菜鹼化合物及/或一或多種肉毒鹼化合物加入至眼科裝置的溶液,該溶液包含一甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物及一生理學可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。典型來說,該甜菜鹼化合物及/或肉毒鹼化合物係以約5至100mM存在於該溶液中,較佳為約5至50mM,甚至更佳為20mM。典型來說,該載劑、稀釋劑或賦形劑使得一或多種甜菜鹼化合物及/或一或多種肉毒鹼化合物加入至該眼科裝置容易。
水溶液對局部給藥來說通常較佳,以容易調配和患者容易藉由將一至二滴該溶液徐徐滴入受影響的眼睛來給藥此組成物之能力為基準。但是,該組成物亦可係懸浮液、黏或半黏的凝膠、或其它固體或半固體組成物型式、或合適於持續釋放的那些。
在本發明之方法中所使用的“溶液”可係以水為基礎(即,水性)的溶液。典型的溶液包括鹽液溶液、其它緩衝溶液及去離子水。較佳的水溶液係包含鹽類之去離子水或鹽液溶液,包括氯化鈉、硼酸鈉、磷酸鈉、磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉或其相應的鉀鹽。這些成份通常結合以形成包括酸及其共軛鹼的緩衝溶液,以便酸及鹼之加入僅造成pH相當小的改變。該緩衝溶液可額外包括2-(N-嗎福啉基)乙磺酸(MES)、氫氧化鈉、2,2-雙(羥甲基)-2,2’,2“-氮川三乙醇、N-三(羥甲基)甲基-2-胺基乙烷磺酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、醋酸、醋酸鈉、乙二胺四醋酸及其類似物、及其組合。較佳的是,該溶液係硼酸鹽緩衝或磷酸鹽緩衝的鹽液溶液或去離子水。特別佳的溶液包含約8克/升NaCl、0.2克/升KCl、1.15克/升Na2HPO4及0.2克/升K2HPO4緩衝液。
可在本發明之組成物中使用多種載劑之任何,包括水、水之混合物及水可溶混的溶劑,諸如C1-至C7-烷醇;包含0.4至5%無毒可溶於水的聚合物之蔬菜油或礦物油;凝膠產物,諸如明膠、藻酸鹽、果膠、特拉加康斯樹膠、刺梧桐膠、三仙膠、角叉菜膠、瓊脂及刺槐、及其衍生物;
澱粉衍生物,諸如澱粉醋酸酯及羥丙基澱粉;纖維素及其衍生物;及亦其它合成產物,諸如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯甲基醚、聚環氧乙烷,較佳為交聯的聚丙烯酸,諸如中性卡波剖(Carbopol);或那些聚合物之混合物;天然發生的磷脂質,例如,卵磷脂;或環氧烷烴與脂肪酸之縮合產物,例如聚硬脂酸氧乙烯酯;或環氧乙烷與長鏈脂肪族醇的縮合產物,例如十七伸乙基氧基鯨蠟醇;或環氧乙烷與衍生自脂肪酸及己糖醇的部分酯類之縮合產物,諸如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯;或環氧乙烷與衍生自脂肪酸及己糖醇酐類之部分酯類的縮合產物,例如,聚乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。
對pH之調整較佳至生理pH來說,緩衝劑可特別有用。本溶液的pH應該維持在4至8的範圍內。將由一般熟知技藝之人士了解,與眼睛表面相容的任何pH係合適。可加入合適的緩衝劑,諸如硼酸、硼酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸、碳酸氫鈉、TRIS、依地酸二鈉(EDTA)及多種混合的磷酸鹽緩衝劑(包括Na2HPO4、NaH2PO4及K2HPO4之組合)及其混合物。通常來說,該緩衝劑的使用濃度範圍將在約0.04至0.5M。
將要了解在本專利說明書中所揭示及定義的本發明擴大至從本文或圖形提到或證明的二或更多種各別特徵之全部可替代的組合。這些不同組合全部構成本發明之多種可替代的態樣。
現在,本發明將參照伴隨的實施例及圖形更完整地描述。但是,應該要了解的是,下列描述僅係闡明用及應該不以任何方式在上述本發明的普遍性上進行限制。
在此研究中,使用永生人類角膜緣上皮(HCLE)細胞株(來自Ilene Gipson,薛本斯眼科研究所(Schepens Eye Research Institute),波士頓(Boston),MA的仁慈捐贈)。HCLE細胞如先前描述般培養(Garrett等人,Invest Ophthalmol Vis Sci 2008;49:4844-4849)。簡單地說,將細胞以2×104/平方公分維持在塑膠上,於無角質細胞血清的媒質中(K-SEM;Invitrogen-Gibco,Grand Island,NY),及在37℃下於5%二氧化碳環境中生長,其係以25微克/毫升牛腦垂體萃取物、0.2奈克/毫升表皮生長因子(EGF;Invitrogen,Mount Waverley,VIC,澳洲(Australia))及0.4mM CaCl2補充。為了提高營養組成物,在大約50%群集時,將該培養物轉移至1:1的K-SFM及低鈣DMEM/F12混合物(Invitrogen),以達成群集。全部實驗包括HCLE細胞之培養皆在37℃下於5%二氧化碳環境中進行,除非其它方面有指示出。
為了決定使用在滲透保護性研究中的最理想甜菜鹼濃度,甜菜鹼(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO;1.0-200mM)係在培養媒質中製備。細胞係在密度5x104細胞毫升-1下板培養及生長直到80%群集,然後,於甜菜鹼存在或缺乏下曝露至具有滲透壓300mOsm的培養媒質16小時。在以甜菜鹼處理後,使用溴化3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯
基四銼(MTT)細胞存活檢測(Promega,Madison,WI)評估細胞生存能力。
由流動細胞儀所產生的雷射光之向前散射係與細胞的體積呈比例。使用此原理來分析甜菜鹼在恢復由於高張性而受相反影響的細胞體積上之滲透保護性效應。細胞群受閘選,如此顯示出較大向前散射(FSC)的細胞群構成該細胞百分比,其具有體積等於細胞在等滲壓狀態下之體積。另一方面,在流動細胞儀中的側散射之比例代表細胞結構複雜性及粒性。因此,具有較大側散射(SSC)的細胞群代表具有減低體積的細胞。讓細胞曝露至等滲壓媒質(300mOsm)、高滲透壓媒質(500mOsm)及包含甜菜鹼的高滲透壓媒質(500mOsm媒質+10mM甜菜鹼)16小時,在此之後,使用流動細胞儀分析其。
使用Attune®聲波聚焦細胞計數器(Life technologiesTM Applied Biosystems),經由流動式細胞測量法進行細胞體積及活/死染色。使用Annexin V及PI套組(InvitrogenTM)來分析該非凋亡、及早期及晚期凋亡細胞。如按照製造者的用法說明般進行染色。使用具有激發/發射光譜480/500奈米(20毫瓦)的藍色/紫色雷射進行Annexin染色之分析;及使用具有激發/發射光譜490/635奈米的藍色/紅色雷射進行PI染色分析。
500mOsm及曝露時間(16小時)係最有益,在此之下觀察到HCLE之高滲透壓引發的細胞反應(結果無顯示)。因此,在本研究中,遍及全部使用500mOsm的高滲透壓媒
質及曝露時間16小時。該高滲透壓媒質係藉由將NaCl加入至媒質而製備。媒質滲透壓係使用Vapro 5520蒸氣壓滲透計(Wescor,Logan,UT)測量。次融合細胞於甜菜鹼(5或10mM)存在或缺乏下曝露至高滲透壓媒質。如下列詳述般監視粒腺體及增殖活性用於細胞生存能力;TNF-α製造;凋亡蛋白酶活性及Annexin V/PI染色用於凋亡;及細胞收縮。
已觀察到450mOsm及500mOsm的滲透壓及16小時的曝露時間對HCLE之高滲透壓引發細胞反應的研究係最理想(結果無顯示)。因此,遍及本研究使用450mOsm及500mOsm的高滲透壓媒質及曝露時間16小時。藉由將適當量NaCl加入至該媒質達成其高滲透壓,及進一步使用Vapro 5520蒸氣壓力滲透計(Wescor,Logan,UT)測量。於10mM L-肉毒鹼存在或缺乏下,讓已達到70%-80%群集的細胞曝露至高滲透壓媒質。分析與高滲透壓壓力相關的細胞收縮、用於凋亡的Annexin V/PI染色、凋亡蛋白酶活性及TNF-α生產。
使用MTT生存能力分析套組來測量細胞生存能力(上述)。使用CyQUANT細胞增殖分析套組(Invitrogen-Molecular probe,Eugene,OR)來測量細胞數量。移出培養上層液及在1500rpm下離心10分鐘,以採集任何從上層液分離的細胞。剩餘細胞以PBS沖洗一次。將包含CyQUANT GR染料的溶解緩衝液加入至細胞,包括從上層液採集的細胞及在室溫下培養2-5分鐘。使用SpectraFuor Plus微板讀出器(Tecan,Männedorf,瑞士(Switzerland))測
量指示出細胞生存能力的螢光性;485奈米用於激發及535奈米係最大發射。
使用酶標記免疫吸附測定法(ELISA)來定量TNF-α。收集該培養上層液,在1500rpm下離心10分鐘以移除細胞碎物及貯存在-80℃直到處理。根據製造者的進行方法(R & D Systems,Minneapolis,MN)來進行試驗。
使用發光分析套組(Promega,Madison,WI),根據製造者的用法說明來分析凋亡蛋白酶-3/7、-8及-9活性。簡單地說,將100微升的凋亡蛋白酶-Glo-3/7、-8及-9試劑加入至以2×104/平方公分維持在塑膠上的HCLE,混合及在室溫下培養一小時。使用SpectraFuor Plus微板讀出器來測量發光。
使用Alexa Fluor 488 Annexin V/死亡細胞凋亡分析(Invitrogen-Molecular probe)與某些修改來鑑定經歷凋亡或壞死的細胞。細胞係以6.5×104細胞毫升-1播種在75平方公分的細胞培養燒瓶中及培養過夜。一旦細胞到達70%-80%群集時,它們接受不同滲透壓處理16小時。移出上層液及保留用以收集未黏著細胞。以PBS沖洗黏著細胞兩次及使用0.05%胰蛋白酶分離。將培養上層液及胰蛋白酶消化物製成丸粒,以PBS沖洗兩次,及在再懸浮於膜聯蛋白(annexin)黏結緩衝液中期間結合。將五微升Alexa Fluor 488 Annexin V、12.5微克毫升-1的Hoechst 33342及1微克毫升-1的碘化丙啶(PI)加入至100微升包含大約1×105細胞的細胞懸浮液及在室溫下培養15分鐘。細胞以200微升膜聯蛋白黏結緩衝液
清洗及沈積到蓋玻片上。使用FluoView FV1000共焦雷射掃描顯微鏡(Olympus,日本)捕捉影像,其中對每個處理的不同視野捕捉7-10張影像。細胞以Annexin V、PI或Hoechst染色各別用於細胞凋亡、壞死或總細胞,使用ImageJ對每個影像定量(http://rsbweb.nih.gov/ij/;National Institutes of Health,Bethesda,MD),以對每個處理獲得平均值。
全部結果以平均±SD呈現。群組平均係藉由單向變異數分析(ANOVA),使用邦弗朗尼(Bonferroni)校正來比較。進行學生T檢定用以在p<0.05的顯著性程度下比較包含二組的資料。
全部鏡片在空氣中乾燥過夜及在脫水後稱重。將經乾燥的鏡片浸泡在3毫升於乙醇中之維他命E溶液中。選擇數種濃度以獲得一在凝膠中的負載%如為在乙醇中的維他命E濃度之函數的校正曲線。該等鏡片在空氣中乾燥過夜,及稱重以測量負載在鏡片中的維他命E。
在該鏡片負載想要的量之維他命E後,將該鏡片轉移進泛醇(8毫克/毫升及體積3毫升)或甜菜鹼(80毫克/毫升及體積3毫升)中用以負載藥物。進行藥物負載至少20小時(某些鏡片浸泡在藥物溶液中最高3天,但是無偵測到顯著差異)。對照鏡片(無維他命E)亦藉由下列相同方法負載該藥物。
將該負載藥物的鏡片浸入2毫升新鮮的PBS中用於藥物釋放實驗。藥物濃度係藉由UV Vis分光光度計定期地測量。
每種型式的鏡片之每個實驗(純及負載維他命E二者)至少進行一式三份。
甜菜鹼濃度的滴定範圍係0mM至200mM,決定最高40mM的甜菜鹼對細胞無毒(圖1)。再者,已發現最高10mM的甜菜鹼在媒質的最後滲透壓上具有最小效應(結果無顯示)。因此,選擇5及10mM的甜菜鹼濃度用於進一步測試。
進行細胞生存能力分析以分析不同濃度的L-肉毒鹼之毒性及已發現10mM L-肉毒鹼濃度對進行滲透保護性研究係最理想。
進行流動式細胞測量分析以決定於甜菜鹼存在或缺乏下因應高滲透壓壓力的細胞生理學狀態(圖2A)及細胞體積(圖2B)。曝露至等滲壓媒質、高滲透壓媒質及高滲透壓媒質+10mM甜菜鹼之HCLE細胞的典型影像(圖2A(I))顯示出凋亡及壞死細胞的總百分比在曝露至高滲透壓狀態期間相當大地增加(從8.24%至29.63%),如與等滲壓狀態比較。於滲透保護劑甜菜鹼存在下,損傷細胞的數目戲劇性減低(從29.63%至15.70%)。此觀察在圖2A(II)中總結的實驗中進一步證實,其顯示出健康細胞在高滲透壓壓力下之百分比減低,與等滲壓狀態比較(p<0.05)。將甜菜鹼加入至高滲透壓媒質維持可存活的細胞百分比程度類似於在等滲壓狀態下所觀察到的那些。
當細胞接受高滲透壓狀態時,縮小的細胞群顯著
增加(從4.73%至26.82%),與接受等滲壓環境的群體比較。當細胞以10mM在高滲透壓媒質中的甜菜鹼處理時,縮小的細胞群之數量減低(從26.82%至11.01%),將細胞體積有效地恢復至在等滲壓狀態下所觀察到者。圖2(II)進一步證實高滲透壓壓力在正常(等滲壓)體積的細胞群中造成明顯減低,與等張的對照群比較(p<0.05)。將甜菜鹼加入至高滲透壓壓力細胞群抵消此減低。
使用流動式細胞測量分析來測量因應含或不含L-肉毒鹼的高張性之細胞體積。曝露至等滲壓媒質、高張媒質及與10mM L-肉毒鹼一起的高張媒質之HCLE細胞的典型影像指示出在高滲透壓壓力下顯示出失去細胞體積之細胞百分比戲劇性增加(從>4.0%至>30.0%),如與在等滲透壓狀態下的那些比較。另一方面,當額外補充L-肉毒鹼時,在高滲透壓壓力下之細胞顯示出縮小的細胞之百分比相當大地降低,類似於在等滲壓狀態下所觀察到者(18.01%)。當以10mM在高滲透壓媒質中的肉毒鹼處理時,此縮小的細胞數目減低有效地指示出L-肉毒鹼在恢復細胞體積上的角色。
在曝露至含或不含甜菜鹼的高滲透壓媒質後,評估指示出細胞生存能力的粒腺體活性(第3A圖)及細胞數量(第3B圖)。與等滲壓媒質比較,曝露至沒有甜菜鹼的高滲透壓媒質造成粒腺體新陳代謝功能減低38%,如藉由MTT試驗評估;及細胞數量減低35%,如藉由CyQUANT增殖試驗評估(p<0.05)。但是,曝露至包含5或10mM甜菜鹼的高
滲透壓媒質之細胞具有明顯較高的存活,粒腺體活性及細胞數量各別增加17%及12%,其與高滲透壓對照(沒有甜菜鹼處理;p<0.05)比較明顯不同。
在曝露至含或不含甜菜鹼(10mM)的高滲透壓媒質後,測量在培養上層液中的TNF-α表現性(圖4)。TNF-α在對照樣品(300mOsm)中幾乎不可偵測(結果無顯示)。比較在高滲透壓媒質中經甜菜鹼處理的樣品與沒有甜菜鹼的樣品(圖4,p<0.05)顯示出TNF-α程度減低40%。
進一步描述在曝露至滲透壓力後,甜菜鹼在HCLE凋亡蛋白酶活性上的效應,其中凋亡蛋白酶係一種細胞凋亡過程的特定指示劑(圖5)。當曝露至高滲透壓媒質時,在經5或10mM甜菜鹼處理群中之凋亡蛋白酶-8、-9及-3/7活性程度明顯低於沒有經甜菜鹼處理的對照(p<0.05)。對全部測量的凋亡蛋白酶活性(凋亡蛋白酶-8、-9及-3/7)來說,觀察到於5mM甜菜鹼存在下減低大約2至3倍及於10mM甜菜鹼存在下減低4至5.2倍。
凋亡蛋白酶在哺乳動物細胞中的活性向上調節特別指示出細胞凋亡過程開始。為了證實在流動式細胞測量術中觀察到的高滲透壓之有害的效應及肉毒鹼的滲透保護性特徵,進一步檢驗在曝露至高滲透壓壓力16小時後之凋亡蛋白酶活性。當曝露至高張媒質時,凋亡蛋白酶-8、-9及-3/7活性的程度戲劇性增加。對肉毒鹼處理的對照顯示出凋亡蛋白酶-9及-3/7明顯降低,但是在凋亡蛋白酶-8活性上顯示出最小或無可看見的減退。
甜菜鹼的正滲透保護性效應進一步在圖6中證明。圖6a顯示出在曝露至高滲透壓媒質後,損傷細胞的數目戲劇般增加(總細胞的15%),與等滲壓對照300mOsm比較(3.8%,p<0.05)。但是,於10mM甜菜鹼存在下,因應高滲透壓衝擊之損傷細胞的百分比明顯減低至沒有甜菜鹼的高滲透壓媒質之一半(7.5%,p<0.05)。在本研究中之損傷細胞係使用Annexin V及PI染色藉由共焦顯微鏡在60x下分析,及証明係由早期凋亡(圖6b,正Annexin V免疫染色;晚期凋亡(圖6,正Annexin V及PI染色);早期及晚期壞死(圖6d及6e,PI正)細胞組成。由高滲透壓衝擊引發的細胞損傷,及甜菜鹼的滲透保護性效應由在10x共焦顯微鏡下取得的典型影像(圖6f-6h)進一步闡明,其中可觀察到對Annexin V及PI二者的正染色細胞群因應沒有甜菜鹼之高滲透壓衝擊而增加,與於10mM甜菜鹼存在下之等張\或高張比較。
在分析細胞體積後,以流動細胞儀,藉由進行Annexin V/死亡細胞凋亡試驗來進一步分析細胞的生理學狀態。下列圖顯示出健康細胞的百分比於高滲透壓狀態存在下相當大地減退(>90.0%至>70.0%)及凋亡及壞死細胞增加,如與在等張狀態下的那些比較(~20.0%)。但是,於肉毒鹼存在下,凋亡及壞死細胞的數目因此明顯減低(從~29.0%至~19.0%),健康細胞的百分比增加顯示出類似於在等張狀態下所觀察到的那些,因此建議肉毒鹼的滲透保護性角色。
將經培養的HCLE細胞曝露至含或不含肉毒鹼(10mM)在300mOsm(等滲壓)及500mOsm(高滲透壓)下的培養媒質16小時。進行流動式細胞測量術,以根據所偵測的向前及側散射值來測量細胞體積改變。
當細胞接受500mOsm高滲透壓狀態時,縮小的細胞之百分比明顯增加(~27%),與接受等滲壓300mOsm環境的群體比較(~5%)(圖7)。但是,當細胞以10mM在500mOsm高滲透壓媒質中的肉毒鹼處理時,這些縮小的細胞之百分比顯著減低(~15%)。肉毒鹼能夠調節在高滲透壓壓力下之細胞體積,防止隨後的凋亡。
將經培養的人類角膜緣上皮(HCLE)細胞曝露至含或不含肉毒鹼(10mM)在300mOsm(等張)、450mOsm(中等)及500mOsm(高滲透壓)下之培養媒質16小時。藉由使用凋亡蛋白酶活性試驗來量化凋亡蛋白酶-8、凋亡蛋白酶-9或凋亡蛋白酶-3/7的蛋白代謝活性,及使用ELISA來量化已知為細胞凋亡誘導物之腫瘤壞死因子(TNF)-α的生產來偵測細胞凋亡之誘導。進行Annexin V及丙啶碘(PI)染色,以使用共焦顯微鏡及流動式細胞測量術偵測凋亡細胞的百分比。
與高滲透壓壓力的HCLE比較,肉毒鹼(10mM)存在於高滲透壓媒質(500mOsm)中造成細胞凋亡蛋白酶-9活性明顯減低(33%,p<0.05)及凋亡蛋白酶-3/7活性有減低趨勢(20%)(圖8);明顯減低TNF-脉產生(25%)(p<0.01)(圖9);和明顯增加非損傷(非凋亡/非壞死)細胞的百分比
(63%)(p<0.05),此指示出於肉毒鹼存在下減少細胞凋亡。相容的溶質肉毒鹼可抑制經培養的人類角膜上皮細胞在高滲透壓壓力期間細胞凋亡。
圖10顯示出在60小時時間時期(A)或10小時時間時期(B)內,來自含及不含維他命E的O2OPTIX及ACUVUE OASYS鏡片之甜菜鹼釋放。維他命E作為擴散衰減劑的存在減慢在每種型式的隱形眼鏡中之甜菜鹼釋放。圖11顯示出在10小時時間時期內,來自含及不含維他命E的O2OPTIX鏡片之甜菜鹼釋放,其以隨著時間釋放之微克的甜菜鹼(A)或總甜菜鹼%(B)顯示出。圖12顯示出在150小時時間時期(A)或60小時時間時期(B)內,來自含及不含維他命E的ACUVUE OASYS鏡片之甜菜鹼釋放,其以隨著時間釋放之甜菜鹼的微克數或總甜菜鹼的%顯示出。維他命E作為擴散衰減劑之存在減慢在每種型式的隱形眼鏡中之甜菜鹼釋放。換句話說,於維他命E存在下,在任何提供的時間處從隱形眼鏡釋放出較低量的甜菜鹼,與從沒有維他命E的隱形眼鏡之甜菜鹼釋放比較。
此實施例以動物模型來闡明本發明。
在該研究中,總共使用110隻母C57BL/6老鼠(年齡4-6週,來自溫州醫學院(Wenzhou Medical College)的動物飼養單位)。這些老鼠係使用狹縫燈顯微鏡及角膜染色藉由臨床檢驗小心地從350隻老鼠選出。僅選擇無角膜感染、
浸潤或角膜白斑(leukom)且具有總分數小於10的角膜螢光黃染色之那些健康老鼠用於研究。
此研究使用ICES引發的鼠科乾眼症模型,其中相對溼度、氣流及溫度係各別維持在15.7±3.2%(平均±SD)、2.1±0.2公尺/秒及21-24℃,及從安置後第21天,老鼠開始發展出類似於在人類中的那些乾眼症症狀(Chen等人,由智慧型控制環境系統引發乾眼症的鼠科模型(A Murine Model of Dry Eye Induced by an Intelligently Controlled Environmental System)。Investigative Ophthalmology & Visual Science,2008:49(4):1386-1391)。每日監視ICES系統的相對溼度及溫度。
使用耳標來標記在不同群組中的老鼠。將老鼠安置在籠中(每籠最多五隻動物)及在每個ICES系統中放置二個各自獨立的籠。使用二個計劃對測試化合物,甜菜鹼(0.234%(10mM)在無菌的PBS中)或肉毒鹼(0.25%(10mM)在無菌的PBS中)進行局部給藥,或無菌的PBS作為對照。使用沒有任何局部治療的老鼠作為另一種對照。在第一計劃中,在老鼠安置於ICES中時開始將化合物給藥至其(計劃1),以研究這些化合物在乾眼症之發展上的效應。在第二計劃中,在老鼠已經安置於ICES中21天後開始化合物給藥(計劃2),在此時間,乾眼症症狀已經發展(Chen等人IOVS 2008),以研究這些化合物在治療乾眼症上的效應。將化合物局部給藥至動物的二個眼睛。對計劃1來說,在老鼠仍然安置於ICES中期間,每日局部給藥在PBS中製得的化合物
溶液四次最高總共35天,或對計劃2來說14天。
在每籠中的四隻(4x)老鼠接受各別治療:A、B、C、D,其中:A=甜菜鹼(10mM在PBS中);B=肉毒鹼(10mM在PBS中);C=僅有PBS;D=未治療。
在第0、14、21及35天時,使用微量吸管,將0.5微升5%螢光黃溶液(1毫克螢光黃鈉在0.5毫升PBS)徐徐滴入下結合膜囊,在全部眼睛上進行角膜螢光黃染色的臨床檢驗。角膜係使用含有鈷藍光的狹縫燈顯微鏡立即在滴入螢光黃後檢驗。評估經染色的區域及使用2007 Dry Eye Work Shop(DEW)推薦的分級系統分級。老鼠角膜係將角膜表面劃分成五個區域以範圍0至4來評估(0點,等級0;1-5點,等級1;6-15點,等級2;16-30點,等級3;及30點,等級4)。記錄來自五個區域的總計分。
對計劃1來說,在安置於ICES中及接受治療後,每組六隻(6x)老鼠在第21天結束時及每組五隻(5x)老鼠在第35天結束時伴隨著過度給予氯胺酮與甲苯噻 之混合物犧牲,用於角膜炎性反應的qRT-PCR評估。另一方面,對計劃2來說,在安置於ICES中及接受治療後,在第21天結束時犧牲三隻(3x)老鼠,及在第35天結束時犧牲全部其它老鼠。額外地,未安置在ICES中及未接受治療的七隻健康動物安樂死,作為用於比較的健康對照。
qRT-PCR
對IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α及GAPDH之qRT-PCR偵測來說,根據製造者的用法說明,使用RNA分離套組(PicoPure RNA分離套組,40分離,Arcturus),從五個實驗組每組萃取及儲備來自結膜的總RNA(2隻眼睛/群組/計劃)。cDNA係從1微克的總RNA使用隨機引子及M-MuLV逆轉錄酶合成。在用於qRT-PCR工作之製備中,已經設計出用於這些介體的qRT-PCR偵測之引子序列(表1)。
圖13顯示出在安置於ICSE中後第0、14、21或35天時之老鼠角膜染色的平均計分,其中在安置開始時起始以一天四次局部治療(A、B或C)(計劃1)或沒有治療(D)。化合物A(甜菜鹼)及B(肉毒鹼)二者在第14天及第21天時於角膜染色上顯示出統計顯著性減低,如與對照C(僅有PBS)或D(沒有治療)比較,此建議以甜菜鹼或肉毒鹼處理減慢乾眼症之發展。但是,在第35天時,僅有化合物B(肉毒鹼)具有減低的角膜染色,如與對照C或D比較。
在第21天時乾眼症發展後,僅有以B(肉毒鹼)處理在老鼠角膜染色中闡明統計顯著性減低,如與對照C或D比較(圖14)。但是,如肉毒鹼般,甜菜鹼從第21天至第35天亦在角膜染色上顯示出統計顯著性減低。這些結果建議甜菜鹼及肉毒鹼二者在治療乾眼症上可具有治療效應,且肉毒鹼顯示出較大的效應。
一起採用甜菜鹼及肉毒鹼二者闡明阻抗角膜染色發展的能力,其中該染色係乾眼症的跡象。一旦乾眼症症狀發展,肉毒鹼亦可減低乾眼症之症狀。
讓來自即時PCR在mRNA程度下偵測之IL-1β、IL-6、IL-17或TNF-α的表現性對家務基因GAPDH標準化。從來自每組的2個眼睛(每治療組總共6x眼睛使用於qRT-PCR)之儲備的結膜收集總RNA。
對計劃1第21天來說,在安置於ICSE中但是未接受治療之E組中,每種炎性介體的mRNA表現性程度明顯比在正常健康(NT)組中的那些高。以化合物A或B二者治療顯露出在全部炎性介體的表現性上造成統計顯著性減低,與PBS治療組C比較。在全部化合物當中,B顯露出具有最低的TNF-α、IL-17、IL-6及IL-1β表現性程度(圖15)。
對計劃2第35天來說,已發現伴隨著以A處理,在TNF-α表現性上的統計顯著性減低或如與PBS對照(C)比較。但是,僅有處理組B在IL-17、IL-6或IL-1β上發現統計顯著性減低(圖16)。
乾燥壓力引發眼睛表面組織的炎性細胞素分
泌,特別是IL-1、TNF-α及IL-6,其促進固有的抗原呈現細胞(APC)活化及朝向局部引流淋巴結漂移。這些細胞素亦已知為Th17細胞之誘導物,而該細胞已知為IL-17產生細胞。此外,已經證明IL-17與角膜上皮屏障功能之中斷相關,其係乾眼症疾病的最大視力威脅併發症。其引發上皮細胞分泌MMP-3及-9而造成角膜上皮滲透壓明顯增加。
已觀察到局部給藥甜菜鹼或肉毒鹼可延遲乾眼症發展。二者亦可導致降低乾眼症嚴重性,此建議在治療乾眼症上的可能治療效應。與甜菜鹼比較,肉毒鹼顯示出具有較大的效應。
產生自細胞外滲透壓增加的滲透壓力係在多種組織包括角膜上皮中對細胞之正常作用的主要挑戰。淚液膜高滲透壓性可增加眼睛表面細胞脫落、減少細胞間連結、造成細胞膜瓦解、及在細胞中引發凋亡及發炎反應。
在健康細胞中擠滿蛋白質分子及蛋白質鍵結的水而遺留非常些微未錯合的水。因此,甚至外部高滲透壓的小擾亂可造成細胞體積激烈改變。細胞曝露至高滲透壓環境導致水的戲劇性滲透流出、減少細胞體積、細胞收縮及伴隨著全部細胞內構成物濃度增加,及提昇離子強度。生化學的不平衡導致不可逆的細胞凋亡連鎖反應,及在體內平衡事件中的細胞死亡無法恢復。
至於存活機制,產生細胞體積減少亦可發出滲壓調節反應信號。在高張狀態下,刺激在細胞中累積相容的滲溶質之機制,允許細胞佔用及保留足夠滲溶質以保護在
等滲壓狀態下之細胞活性。相容的滲溶質累積可保護細胞不受由乾眼症症候群及/或其它症狀/疾病所引起之不間斷的高張損傷。在本研究中,與甜菜鹼不存在之高張衝擊下的那些細胞比較,HCLE細胞於甜菜鹼存在下曝露至高滲透壓狀態可產生減少的縮小細胞群,此建議此相容的有機滲溶質累積在HCLE細胞中以維持細胞體積。
HCLE在高滲透壓壓力下由甜菜鹼保護可在將甜菜鹼施加至500mOsm媒質後之16小時研究時期內改善細胞新陳代謝及存活。我們的實驗證據進一步闡明高張性引發的細胞收縮,若未由調節體積機制補償時,此可導致細胞凋亡。HCLE細胞在曝露至高張條件後顯示出細胞凋亡的特徵外觀,包括細胞收縮及導致膜聯蛋白黏結的磷脂醯絲胺酸部分之再排列。再者,亦藉由PI染色顯示出壞死開始,此建議若體積不以一適時方式恢復時,不可逆地連鎖反應至細胞死亡。
凋亡蛋白酶活化係細胞凋亡的嚴重早期事件。凋亡蛋白酶之活化係透過內因性(粒腺體)或外因性(死亡受體)凋亡途徑被觸發。內因性凋亡途徑產生自粒腺體結構及功能改變,從粒腺體釋放出細胞色素c及導致凋亡蛋白酶-9活化。此接著活化下游凋亡蛋白酶而引發凋亡蛋白酶-3/7,造成數種死亡基質切割及隨後DNA凝聚及斷裂。外因性凋亡途徑之起始係產生自死亡域受體之活化,接著凋亡蛋白酶-8之活化,其然後可與粒腺體各自獨立地活化下游受動器凋亡蛋白酶-3/7。在高滲透壓狀態下,我們觀察到每種所監
視的凋亡蛋白酶(9、8及3/7)之活性明顯增加和TNF-α生產明顯提昇,與等滲透壓對照比較。凋亡蛋白酶-8活性增加指示出該外因性途徑涉及伴隨著TNF-α表現性增加,此建議HCLE在高張條件下起始製造此死亡配體及活化一自毀序列而觸發凋亡細胞死亡。TNF-α藉由黏結至TNF-α受體,然後活化凋亡蛋白酶-8而觸發細胞凋亡。額外地,所觀察到的凋亡蛋白酶-9活性增加建議進一步TNF-α無關的機制,其經由內因性途徑主導高張性引發的凋亡細胞死亡,導致粒腺體功能障礙而繼續進行凋亡。亦已報導因應高滲透壓從粒腺體釋放出細胞色素c及活化凋亡蛋白酶-3。因此,於延長曝露至高滲透壓壓力存在下,在HCLE中似乎刺激內因性及外因性凋亡途徑二者。
TNF-α係包含於與導致細胞凋亡的炎性反應相關之反應中,及已知引發MAPK連鎖反應之活化,其可導致前細胞凋亡症狀。如全部死亡域般,TNF-α亦可包含於死亡發信中。但是,重要要注意的是,TNF-α引發的細胞死亡可扮演較少的角色,如與其炎性反應比較。由TNF-α起始的炎性反應係經由NF-κ B途徑的組分發生,同時與TNF-α引發死亡相關的那些係經由凋亡蛋白酶8之募集反應發生。
將甜菜鹼加入至高張媒質可將凋亡蛋白酶活性明顯降低至接近等滲透壓對照。於甜菜鹼存在下觀察到之凋亡蛋白酶-9活性降低可部分由於凋亡蛋白酶-8活化的串音(cross-talk)造成之細胞色素c釋放減低。凋亡蛋白酶3/7活
性由於凋亡蛋白酶-8及凋亡蛋白酶-9二者減低而減低,與在甜菜鹼治療組中觀察到之粒腺體活性及細胞數量及體積恢復一致。我們的研究結果顯示出在加入L-肉毒鹼時,凋亡蛋白酶9及凋亡蛋白酶3/7的表現性有明顯減少,此建議L-肉毒鹼可經由抑制內因性途徑而抑制細胞凋亡。進一步觀察顯示在高張處理後之TNF-α表現性向上調節上,更在凋亡蛋白酶8的表現性上看見非常小的差異,此建議HCLE在滲透壓力下可不具有經由外因性途徑之起始細胞死亡。反而,TNF-α單獨增加可建議炎性反應活化。這些炎性反應可經由NF-κ B途徑起始。
總而言之,外源的甜菜鹼及肉毒鹼在高滲透壓壓力下安定角膜上皮細胞體積及限制高滲透壓壓力誘發的HCLE凋亡起始。
此實施例顯示出藉由L-肉毒鹼保護細胞免受乾燥及高滲透壓。
使用試管內人類角膜上皮細胞培養模型,其中細胞在慢慢乾燥條件下培養,伴隨著培養媒質在4-4.5小時的時間時期內於34℃(人類眼睛的溫度)下慢慢蒸發,以模仿淚液膜蒸發。媒質滲透壓如預計般當該培養媒質蒸發時增加,然而該媒質的滲透壓沒有蒸發時不改變。
當細胞在缺乏蒸發下培養時,凋亡及壞死細胞的百分比係低(圖17,左手列)。由於蒸發而增加的滲透壓造成細胞損傷(凋亡及壞死的死亡),如顯示在圖17的中心列。但
是,在蒸發前將L-肉毒鹼加入至該培養媒質可減少由該培養媒質之滲透壓增加所造成的細胞損傷(圖17,右手列)至可與沒有蒸發的對照(左手列)比較之程度。
Claims (24)
- 一種包含生理學可接受的滲溶性試劑之眼科裝置,其中該裝置在佩戴期間准許一治療有效量的試劑從該裝置脫附進眼睛中。
- 如申請專利範圍第1項之眼科裝置,其中該滲溶性試劑係一或多種甜菜鹼化合物。
- 如申請專利範圍第1項之眼科裝置,其中該滲溶性試劑係一或多種肉毒鹼化合物。
- 如申請專利範圍第1項之眼科裝置,其中該滲溶性試劑包括一或多種甜菜鹼化合物及一或多種肉毒鹼化合物。
- 如申請專利範圍第2或4項之眼科裝置,其中該甜菜鹼化合物具有分子量約600Da或較少。
- 如申請專利範圍第5項之眼科裝置,其中該甜菜鹼化合物具有分子量約250Da較少。
- 如申請專利範圍第2或4項之眼科裝置,其中該甜菜鹼化合物係選自於由下列所組成之群:三甲基甘胺酸、脯胺酸甜菜鹼、甜菜鹼鹽酸、β-丙胺酸甜菜鹼、羥基脯胺酸甜菜鹼、椰子醯胺丙基甜菜鹼、氫氧化乙氧羰基甲基三甲基銨及其類似物。
- 如申請專利範圍第2或4項之眼科裝置,其中該甜菜鹼化合物係選自於由下列所組成之群:三甲基甘胺酸、脯胺酸甜菜鹼、甜菜鹼鹽酸、β-丙胺酸甜菜鹼及羥基脯胺酸甜菜鹼。
- 如申請專利範圍第3或4項之眼科裝置,其中該肉毒鹼化合物係選自於由下列所組成之群:L-肉毒鹼;烷醯基L-肉毒鹼,包括選自於由下列所組成之群的那些:乙醯基、丙醯基、異戊醯基、丁醯基、及異丁醯基L-肉毒鹼;及其醫藥可接受的鹽。
- 如申請專利範圍第9項之眼科裝置,其中該肉毒鹼化合物係L-肉毒鹼。
- 如申請專利範圍第1至10項之任何一項的眼科裝置,其中該裝置係隱形眼鏡。
- 如申請專利範圍第11項之眼科裝置,其中該隱形眼鏡係單次使用型隱形眼鏡。
- 如申請專利範圍第1至12項之任何一項的眼科裝置,其中該裝置准許在約12小時時期內脫附一治療有效量的滲溶性試劑。
- 如申請專利範圍第1至13項之任何一項的眼科裝置,進一步包括一擴散衰減劑。
- 如申請專利範圍第1至14項之任何一項的眼科裝置,其中該擴散衰減劑係維他命E。
- 一種用於抑制、降低或改善患者與高淚液膜張力相關的眼部不適之方法,其包括將如申請專利範圍第1至15項之任何一項的眼科裝置施加至該患者。
- 如申請專利範圍第16項之方法,其中該方法包括一決定患者在施加該眼科裝置前是否具有或係於發展出具有高張力之淚液膜的此風險下之步驟。
- 如申請專利範圍第16項之方法,其中該患者具有乾眼症症候群。
- 一種甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物之用途,其係使用在製備用於抑制、降低或改善與高淚液膜張力相關的眼部不適之藥劑。
- 如申請專利範圍第19項之用途,其中該藥劑係一眼科裝置。
- 如申請專利範圍第20項之用途,其中該眼科裝置係隱形眼鏡。
- 如申請專利範圍第19至21項之任何一項的用途,其中該藥劑不包括丁四醇。
- 一種用以將一治療有效量的一或多種甜菜鹼化合物及/或一或多種肉毒鹼化合物加入至一眼科裝置的溶液,該溶液包括一甜菜鹼及/或肉毒鹼化合物及一生理學可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。
- 如申請專利範圍第23項之溶液,其中該載劑、稀釋劑或賦形劑促進該一或多種甜菜鹼化合物及/或一或多種肉毒鹼化合物加入至該眼科裝置。
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