CN103656621A - 一种新型鼠神经生长因子玻璃体腔注射给药系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种新型鼠神经生长因子玻璃体腔注射给药系统及其应用，本发明涉及一种可通过玻璃体腔注射给药治疗眼病的含鼠神经生长因子的药物领域。针对现有鼠神经生长因子治疗眼病的给药方式存在的治疗效果不理想、副作用大的问题，本发明的目的在于提供一种鼠神经生长因子玻璃体腔注射给药系统，其特征在于：包含鼠神经生长因子和超声造影剂。本发明还提供了鼠神经生长因子玻璃体腔注射给药系统在制备治疗青光眼性视神经损害的药物中的应用，所述药物用于在超声辐照下经玻璃体腔注射给药。本发明提供的这种新的给药方式具有治疗效果好、安全可靠的优点，可用于延缓或阻止青光眼性视神经损害的发生发展。

Description

一种新型鼠神经生长因子玻璃体腔注射给药系统及其应用
技术领域
本发明涉及一种可通过玻璃体腔注射给药治疗眼病的含鼠神经生长因子的药物领域。
背景技术
神经生长因子（Nerve Growth Factor，NGF）是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。临床上可用来治疗视神经损伤类眼疾。
鼠神经生长因子（mNGF）是从小鼠颌下腺提取的肌肉注射剂型NGF，是国家的I类新药，纯度可达98%以上，与人体NGF的结构具有高度的同源性，生物学效应无明显的种间(人与鼠)特异性。临床上已将其广泛应用于包括视神经损伤在内的神经损伤恢复的治疗。我们希望能够将这类药物用于眼底疾病，特别是青光眼的治疗研究。对应视网膜疾病，只有将鼠神经生长因子应用于眼局部才会取得理想的治疗效果。
对于眼疾的治疗，目前临床上鼠神经生长因子的给药方式为肌肉注射，需通过全身循环后才能到达眼部组织，这就导致在眼部的治疗效果不理想，同时经全身代谢后还会对其他组织器官产生副作用。究其原因可能是由于血眼屏障和眼部解剖的特殊性使药物在视网膜、视神经的局部有效浓度较低，导致疗效不佳，使得其在临床上的应用受到了很大的限制，因此寻求一种让鼠神经生长因子更为有效、更安全地局部应用于视网膜和视神经的新型给药方式，成为了眼疾临床治疗的迫切需求。
由于血-眼屏障的存在使得眼球处于一个相对免疫赦免的状态，眼内注射外源抗体能最小程度引发潜在的免疫反应和炎症反应，因此眼球是局部治疗的一个理想器官。而玻璃体腔注射技术具有眼内直接给药的优势，可避免经全身代谢后对其它器官产生的副作用。但是，目前国内外尚未见到有关玻璃体腔注射鼠神经生长因子治疗眼疾的任何报道。
发明内容
针对背景技术中提到的现有鼠神经生长因子治疗眼病的给药方式存在的治疗效果不理想、副作用大的问题，本发明的目的在于提供一种鼠神经生长因子玻璃体腔注射给药系统，以打破现有的给药方式，而采用玻璃体腔注射鼠神经生长因子的方式治疗眼病，这种新的给药方式具有治疗效果好、安全可靠的优点。
为实现上述目的，本发明提供了这样一种鼠神经生长因子玻璃体腔注射给药系统，其特征在于：包含鼠神经生长因子和超声造影剂。
进一步地，所述超声造影剂为六氟化硫微泡。
本发明还提供了鼠神经生长因子玻璃体腔注射给药系统在制备治疗青光眼性视神经损害的药物中的应用，所述药物用于在超声辐照下经玻璃体腔注射给药。
进一步地，所述药物用于在超声声强为0.5W/cm2，辐照时间为30s-60s下经玻璃体腔注射给药。
进一步地，所述药物的注射剂量为12ug/kg的鼠神经生长因子。
进一步地，所述药物为鼠神经生长因子与超声造影剂的稳定混悬剂。
更进一步地，所述混悬剂中鼠神经生长因子与超声造影剂1:1混合。
有益效果：
与现有技术相比，本发明提供了一种新型超声微泡介导的鼠神经生长因子眼科局部给药系统，通过玻璃体腔注射给药，让药物到达眼部的途径变得更单纯，不用经过全身代谢，避免药物经血液循环时所面临的分解及机体内环境对药物的干扰和破坏过程，从而最大限度地保证到达靶器官的药物浓度，发挥最大的治疗作用，提高视网膜局部的药物浓度的同时，也减少了全身毒副作用，减少了给药次数，延缓或阻止青光眼视性神经损害的发生发展，给青光眼患者带来更有效的治疗，减少其致盲率，为患者复明带来新的希望，大大拓宽了青光眼视神经保护治疗的视野，提供了一种新思路。
附图说明
图1是不同造模周期眼压变化曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。
鼠神经生长因子玻璃体腔注射用药物：
六氟化硫微泡与鼠神经生长因子1:1溶于生理盐水中得到的稳定混悬液
上述药物经玻璃体腔注射给药的方法：
爱尔卡因滴眼液表面麻醉，复方托吡卡胺滴眼液滴眼散瞳，在手术显微镜下，于上方角巩膜缘处透明角膜区隧道穿刺抽出适量房水，于上方角巩膜缘3mm垂直巩膜进针，刺入玻璃体腔，经散大的瞳孔明确针尖在玻璃体腔后，缓慢注入上述药物，注射剂量为12ug/kg的鼠神经生长因子，棉签按压进针处，抽出针头，给予泰利必妥滴眼液点眼预防感染。闭合眼睑后涂耦合剂，置超声探头于眼睑表面进行超声辐照，超声声强为0.5W/cm2，辐照时间为30s-60s。
本发明提供的鼠神经生长因子玻璃体腔注射给药系统治疗青光眼性视神经损害的药效学实验：
本研究首先构建了兔眼高眼压视神经损害模型，然后将超声爆破微泡与鼠神经生长因子联合，观察超声爆破微泡介导鼠神经生长因子对高眼压兔视神经损害的治疗作用，并分析该给药系统的安全性、可行性和有效性，为临床治疗青光眼提供了一种新思路。
实验材料
一、主要试剂
二、主要设备和仪器
Figure BDA0000428396640000051
三、实验动物
健康新西兰白兔体重1.5kg，雌雄不限，由广东省医学动物实验中心提供，用裂隙灯、直接眼底镜检查眼前节及眼底无明显异常；Tono-pen笔试眼压计测量眼压＜21mmHg的动物方可采用。
实验方法与步骤
一、实验动物分组
健康新西兰大白兔25只，随机分为5组，每组5只（10眼）。分组如下：
1、空白对照组
2、高眼压模型组
3、高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组
4、高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声组
5、高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组
二、兔慢性高眼压模型的制备
耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1ml/kg）麻醉动物，爱尔卡因滴眼液眼部表面麻醉后，开睑器开睑，用1ml注射器在9点位沿角巩膜缘内1mm抽出前房房水0.2ml后，然后在对侧的角巩膜缘内1mm前房注入0.3%复方卡波姆溶液0.2ml。术毕泰利必妥眼水滴眼。如在实验周期中发现眼压＜22mmHg，7天后按上述方法重复注药1次。高眼压兔视神经损害模型以眼压＞22mmHg，并能维持4周为标准。采用Tono-pen笔式眼压计测量每日相同时间点眼压并记录。
三、溶液的配制
（1）复方卡波姆溶液的配制
称取3.0g卡波姆-940和0.25g地塞米松，溶于1000ml的生理盐水中，PH为4。
（2）注射用鼠神经生长因子溶液的配制
用灭菌注射用水溶解注射用鼠神经生长因子，给予兔玻璃体腔内注射18ug/0.1ml的注射用鼠神经生长因子溶液。
（3）微泡混悬液的制备
用0.9%生理盐水5ml缓慢注入六氟化硫微泡冻干粉瓶内静置备用，使用前用力振摇以产生微泡，微泡浓度为2×108/ml，微泡平均直径2.5μm，90%的微泡直径＜8μm，渗透压为290Osm/kg，与人体血浆等渗，配制的微泡溶液在6h内用完。
四、各组的处理
（1）空白对照组
玻璃体腔内注射PBS液0.1ml：爱尔卡因滴眼液表面麻醉，复方托吡卡胺滴眼液滴眼充分散瞳，开睑器开睑，3%碘伏冲洗结膜囊，无菌条件下用1ml注射器于上方角巩膜缘处透明角膜区隧道穿刺抽出适量房水，然后于上方角巩膜缘后3mm垂直巩膜进针，刺入玻璃体腔，经散大的瞳孔明确针尖在玻璃体腔后，缓慢注入0.1ml PBS液，棉签按压进针处，抽出针头，观察眼压及眼部血管充盈情况，给予氧氟沙星滴眼液点眼，迪可罗眼膏涂眼预防感染。上述操作每周1次，持续3周。
（2）高眼压模型组
不做处理。
（3）高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组
爱尔卡因滴眼液表面麻醉，复方托吡卡胺滴眼液滴眼充分散瞳，开睑器开睑，3%碘伏冲洗结膜囊，无菌条件下用1ml注射器于上方角巩膜缘处透明角膜区隧道穿刺抽出适量房水，然后于上方角巩膜缘后3mm垂直巩膜进针，刺入玻璃体腔，经散大的瞳孔明确针尖在玻璃体腔后，缓慢注入0.1ml mNGF溶液，棉签按压进针处，抽出针头，观察眼压及眼部血管充盈情况，给予氧氟沙星滴眼液点眼，迪可罗眼膏涂眼预防感染。上述操作每周1次，持续3周。
（4）高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声组
玻璃体腔注射mNGF方法同上，注射完毕后闭合兔眼后涂耦合剂，置超声探头于眼球上方立即用频率1MHZ，声强为0.5W/cm2照射眼球60s，上述操作每周1次，持续3周。
（5）高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组
兔散瞳、麻醉方式同前，用1ml注射器距角巩膜缘3mm处刺入玻璃体腔吸出相应量的玻璃体液后，注入0.1ml mNGF溶液，具体操作方法同上；再从相同部位注入0.1ml微泡混悬液，闭合兔眼后涂耦合剂，给予上述参数的超声辐照，每周1次，持续3周。
实验结果
一、眼压测量
如表1所示，造模前模型组眼压为15.0±2.0mmHg，对照组眼压为13.6±1.5mmHg，两者相比眼压差异无统计学意义（P=0.137）；经独立样本t检验，模型组眼压在造模后1周、2周、4周的眼压值（33.4±2.8、34.1±2.5和34.8±2.2mmHg），与对照组眼压（13.6±1.8、13.4±1.7、13.3±1.4mmHg）相比差异具有显著统计学意义（P=0.000）。从图1可见，该模型所致眼压升高可维持在30mmHg以上达4周。
表1对照眼与模型眼不同造模时间眼压比较(
Figure BDA0000428396640000071
mmHg)
Figure BDA0000428396640000072
注：独立样本t检验
二、兔活体眼科检查
1、兔眼前节照相
空白对照组：兔角膜透明，前房深度正常，房水清，虹膜纹理色泽正常，瞳孔3×3mm，晶状体透明。
高眼压模型组：兔结膜混合性充血明显，结膜血管迂曲扩张，中央角膜雾状水肿，前房加深，房水基本清亮，虹膜纹理不清，瞳孔散大固定，晶状体尚透明。
高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组或+超声组和高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组：兔眼前节改变与高眼压模型组基本一致。
2、兔眼底照相形态学观察
空白对照组：兔眼底视网膜呈橘红色，视盘为椭圆形，边界清楚，颜色淡红；视杯呈不规则花瓣形，盘沿较宽；从视盘两侧分别发出一对伴行的视网膜中央动、静脉，水平走向，动静脉比例1:2，周边血管呈放射状。
高眼压模型组：隐约可见视网膜，色淡，兔视网膜萎缩，大量颗粒状和片状色素沉着；视盘水肿，边界欠清，颜色变淡；视杯明显增大，色苍白，盘沿面积明显变窄；视网膜血管变细，从视盘边缘呈屈膝状爬出。
高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组或+超声组：与高眼压模型组相比，兔视网膜色淡红，视网膜轻度萎缩；视盘边界欠清，轻度水肿，颜色变淡红；视杯变小，盘沿面积明显变宽；视网膜血管未见明显变细。
高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组：兔视网膜色淡红，视盘边界清晰，颜色淡红；视杯较高眼压模型组明显变小，盘沿面积明显变宽；视网膜血管粗细和走向基本正常。
3、兔F-VEP的检测
各组F-VEP潜伏期和振幅的比较结果如表2所示。
经单因素方差分析，各组N1、P1、N2潜伏期的差异均具有显著统计学意义（P=0.000）；经两两比较分析，高眼压模型组N1、P1、N2潜伏期较空白对照组明显延长，差异有显著统计学意义（P＜0.05）；高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组或+超声组N1、P1、N2潜伏期较高眼压模型组明显缩短，差异有显著统计学意义（P＜0.05）；高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组N1、P1、N2潜伏期较高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组或+超声组缩短，差异也有显著统计学意义（P＜0.05）。各组N1-P1振幅的差异均具有显著统计学意义（P=0.000）；经两两比较分析，高眼压模型组N1-P1振幅较空白对照组明显降低，差异有显著统计学意义（P＜0.05）；高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组或+超声组N1-P1振幅较高眼压模型组明显升高，差异有显著统计学意义（P＜0.05）；高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组N1-P1振幅较高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组或+超声组升高，差异也有显著统计学意义（P＜0.05）。
表2各组F-VEP潜伏期（ms）和振幅（nV）的比较(
Figure BDA0000428396640000091
)
Figure BDA0000428396640000092
注：单因素方差分析，△※表示组间两两比较无显著统计学差异（P＞0.05），
余组间两两比较有显著统计学差异（P＜0.05）
4、Cirrus OCT测量兔视网膜厚度的比较
Cirrus OCT测量1-5组兔视网膜平均厚度值分别为226.20±4.49、194.00±5.40、206.50±2.10、207.15±2.40和211.50±3.41μm。
经单因素方差分析，各组兔视网膜平均厚度的差异具有统计学意义（P=0.000）；经两两比较分析，高眼压模型组兔视网膜平均厚度明显薄于空白对照组，差异有显著统计学意义（P＜0.05）；高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组和高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声组兔视网膜平均厚度明显厚于高眼压模型组，差异有显著统计学意义（P＜0.05），但3、4组比较无显著统计学意义（P＞0.05）；高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组兔视网膜平均厚度明显厚于高眼压模型组，但仍较空白对照组变薄，差异有显著统计学意义（P＜0.05）。
三、兔视网膜和视神经病理组织学检查
3.1兔视网膜光镜形态学观察
空白对照组：兔视网膜各层结构清晰，排列紧密、整齐；感光细胞层排列整齐呈规则的毛刷状；外核层细胞数量最多，胞核较小，染色深，排列较致密；内核层排列整齐，胞核较大，染色稍深；内丛状层和外丛状层呈明显的网状结构；神经节细胞层呈单层排列，胞核大而染色淡，呈圆形或椭圆形，细胞边界清晰。
高眼压模型组：视网膜各层结构紊乱、疏松，层次不清；感光细胞层排列紊乱；外核层细胞排列紊乱，厚度变薄；内核层细胞排列疏松、紊乱，可见大量空泡变的细胞；内丛状层和外丛状层结构紊乱，轻度变薄，与神经节细胞层分界不清；神经节细胞层细胞数目明显减少，呈空泡样变。
高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组或+超声组：视网膜各层结构相对完整，分层相对清晰；感光细胞层排列较疏松；外核层细胞排列欠规则；内核层细胞排列轻度疏松，可见散在空泡变细胞；丛状层和外丛状层厚度变薄；神经节细胞层细胞数目较高眼压模型组增多，仍可见散在空泡样变的细胞。
高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组：视网膜各层结构较完整，分层较清晰；感光细胞层内外节交界较清晰，排列较整齐；内、外核层细胞排列较规则，厚度较正常；丛状层和外丛状层厚度基本正常；神经节细胞层细胞数目明显增多，形态大致正常，偶可见空泡样变的细胞。
3.2光镜测量兔视网膜厚度和视网膜RGCs计数
3.2.1光镜测量各组兔视网膜厚度
1-5组兔视网膜厚度光镜测量平均值分别为289.30±2.39、239.15±2.68、254.50±3.03、257.05±2.28和269.50±3.00μm。
经单因素方差分析，光镜测量各组兔视网膜厚度的差异具有统计学意义（P=0.000）；经两两比较分析，高眼压模型组兔视网膜厚度明显薄于空白对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组或+超声组兔视网膜厚度明显厚于高眼压模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05），但3、4组比较无显著统计学差异（P＞0.05）；高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组兔视网膜厚度明显厚于高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF或+超声组，但仍薄于空白对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
3.2.2光镜测量各组兔视网膜RGCs计数
在视网膜铺片的甲苯胺蓝染色中，RGCs胞体较大，胞质内充满尼氏小体，核染色浅，核仁明显；而无长突细胞胞体相对较小，多呈圆形或卵圆形，胞质较少，细胞核染色较深。因此通过细胞的大小、形状规则及核染色深浅等来大致区别这两种细胞。
1-5组兔视网膜铺片RGCs计数分别为26.04±0.70、14.97±1.30、19.33±0.78、20.25±0.98和23.97±0.90个。
经单因素方差分析，各组兔RGCs计数的差异均具有统计学意义（P=0.002）；经两两比较分析，高眼压模型组RGCs计数明显少于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组或+超声组RGCs计数明显高于高眼压模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），但3、4组比较无显著统计学差异（P＞0.05）；高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组RGCs计数明显高于高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF或+超声组，但仍低于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。
3.3兔视神经轴突光镜定量分析
兔视神经的尼氏染色中，细胞核呈淡蓝色，神经元细胞内含有丰富的尼氏体，它是细胞内一种噬碱性物质，深蓝色，呈斑块状或颗粒状。空白对照组在光镜下可见较多的染为深蓝色的尼氏体和粗大的视神经轴突。
1-5组兔视神经轴突数如表3所示。
经单因素方差分析，各组兔视神经轴突数、视神经轴突直径、轴突占视神经面积百分比的差异具有统计学意义（P=0.000，0.001和0.02）；经两两比较分析，高眼压模型组视神经轴突肿胀，数目减少，视神经轴突直径增大和视神经轴突占视神经横截面积百分比减少，与空白对照组相比具有显著统计学差异（P＜0.05）；玻璃体腔注射mNGF后，视神经轴突数增加，视神经轴突直径减小，视神经轴突占视神经横截面积百分比增大，与高眼压模型组相比具有显著性统计学差异（P＜0.05）；随着超声联合微泡的应用，视神经轴突髓鞘损失程度明显减轻，视神经轴突肿胀减轻，数目增多，与高眼压模型组、高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组或+超声组相比，具有显著性统计学差异（P＜0.05）。
表3兔视神经轴突定量图像分析结果
Figure BDA0000428396640000121
注：单因素方差分析，△※表示组间两两比较无显著统计学差异（P＞0.05），余组间
两两比较有显著统计学差异（P＜0.05）
四、透射电镜观察兔视网膜和视神经的超微结构
4.1兔视网膜超微结构观察
空白对照组：感光细胞（视杆、视锥细胞）结构清晰，排列整齐；感光细胞的细胞核区构成了视网膜的外核层，排列整齐，核染色质分布均匀，含有较多线粒体等细胞器；双极细胞核区构成内核层，排列整齐，核染色质均匀；神经节细胞呈圆形或卵圆形，核膜清晰，染色质分布均匀，核仁明显，细胞器线粒体、粗面内质网、高尔基体等丰富。
高眼压模型组：感光细胞部分断裂，外节膜盘轮廓模糊，线粒体不同程度肿胀、空泡变性；外核层细胞排列紊乱、疏松，核染色质不均匀，线粒体明显肿胀及空泡样变；神经节细胞数目减少，肿胀、色淡，微丝、微管成分减少，线粒体、内质网和高尔基体等细胞器基本消失。
高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组或+超声组：尚可见感光细胞外节膜盘结构，排列轻紊乱；外核层核膜基本完整，核染色质较均匀，线粒体未见明显空泡变；内核层细胞轻度肿胀，染色质边集；神经节细胞层包膜清晰，核内充满均匀的常染色质，线粒体轻度空泡变性。
高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组：感光细胞排列整齐，线粒体未见明显肿胀及空泡样变；外核层核染色质均匀；内核层核膜欠清，线粒体改变不明显；大多数神经节细胞核膜清晰，染色质分布均匀，核仁明显，线粒体尚清晰，粗面内质网基本正常。
4.2兔视神经超微结构的观察
空白对照组：视神经轴突规则，髓鞘结构完整；轴浆内可见清晰的微管、微丝和线粒体等细胞器。
高眼压模型组：视神经髓鞘溶解、疏松；轴突结构紊乱，微管和微丝结构消失，线粒体肿胀、空泡变性。
高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组：视神经轴突大小不规则，排列紊乱，部分髓鞘变薄、疏松、分离；轴突内微管和微丝肿胀，但不消失，线粒体部分空泡变性。
高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声组：视神经轴突的髓鞘变薄，排列紊乱、疏松；轴突内可见微管和微丝，部分线粒体空泡变性。
高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组：视神经髓鞘结构完整，排列致密，但欠整齐；轴突内微管、微丝结构清晰，未见明显线粒体空泡变性。
五、免疫组织化学染色法测定凋亡相关因子Bcl-2和Bax在细胞内的蛋白表达
空白对照组兔视网膜各层均未明显见呈棕黄色的Bcl-2和Bax表达；高眼压模型组兔视网膜内核层和神经节细胞层中可见较多呈棕黄色的Bax表达，而Bcl-2的表达减少；高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF或+超声组兔视网膜内核层和神经节细胞层中可见较少呈棕黄色的Bax表达，而Bcl-2的表达增多；高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组兔视网膜各层可见散在呈棕黄色的Bax表达，而Bcl-2的表达明显增多。
经单因素方差分析，由表4可见，高眼压模型组与空白对照组相比，抑凋亡基因Bcl-2的表达降低，促凋亡基因Bax的表达增加，Bcl-2/Bax比值下降，两组之间的Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax的基因蛋白表达有显著统计学差异（P＜0.05），这说明在高眼压模型中促凋亡蛋白执行凋亡程序，细胞趋于凋亡。随着mNGF的应用，Bcl-2基因蛋白的表达开始升高，Bax基因蛋白的表达开始降低，Bcl-2/Bax比值增大，各组之间Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax的基因蛋白表达无显著统计学差异（P＞0.05）；但与高眼压模型组相比，Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax的基因蛋白表达有显著统计学差异（P＜0.05），这说明mNGF发挥了神经保护作用，抑凋亡蛋白执行抑制凋亡程序，细胞趋于存活，而玻璃体腔注射mNGF后单纯给予超声辐照并没有显著使细胞凋亡减少。随着mNGF联合超声微泡的应用，抑凋亡基因Bcl-2的表达明显增多，促凋亡基因Bax的表达明显减少，Bcl-2/Bax比值升高，与其他各组相比Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax的基因蛋白表达有显著统计学差异（P＜0.05），这说明mNGF在超声微泡的介导下视神经保护作用明显增大，细胞存活明显增加。
表4免疫组织化学染色法和RT-PCR方法检测兔视网膜组织
内Bcl-2、Bax的蛋白表达量和mRNA表达量（）
Figure BDA0000428396640000142
注：单因素方差分析，△※表示组间两两比较无显著统计学差异（P＞0.05），
余组间两两比较有显著统计学差异（P＜0.05）
六、荧光定量PCR检测Bcl-2和Bax在细胞内的mRNA表达
由表4可见，经单因素方差分析，高眼压模型组抑凋亡基因Bcl-2的mRNA表达量降低，促凋亡基因Bax的mRNA表达量增加，与空白对照组相比，两组之间Bcl-2和Bax的mRNA表达量有显著统计学差异（P＜0.05），这说明在高眼压状态下，Bcl-2和Bax的表达量发生变化，促凋亡基因执行凋亡程序，细胞趋于凋亡。高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF或+超声组的抑凋亡基因Bcl-2的mRNA表达量增加，促凋亡基因Bax的mRNA表达量降低，与高眼压模型组相比，Bcl-2和Bax的mRNA表达量有显著统计学差异（P＜0.05），这说明mNGF发挥了作用，Bcl-2和Bax的表达量发生变化，使得凋亡细胞减少，存活细胞增多。高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组抑凋亡基因Bcl-2的mRNA表达量进一步增加，促凋亡基因Bax的mRNA表达量进一步降低，与其他各组相比，Bcl-2和Bax的mRNA表达量有显著统计学差异（P＜0.05）。
七、兔视网膜组织内NO、MDA、SOD含量检测
由表5可见，经单因素方差分析，空白对照组图视网膜NO含量为23.384±3.282umol/g、MDA含量为7.415±0.3444nmol/mgprot，余各组兔视网膜组织中NO、MDA的含量均升高，各组有显著统计学差异（P=0.000）。经两两比较分析，高眼压模型组兔视网膜中NO、MDA的含量显著升高，与空白对照组相比有显著统计学差异(P＜0.05)。高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组或+超声组、高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组兔视网膜中NO、MDA的含量两两比较均无显著统计学差异(P＞0.05)，但分别与空白对照组和高眼压模型组相比，有显著统计学差异(P＜0.05)。
经单因素方差分析，空白对照组视网膜SOD的活性为75.147±2.375U/mgprot，余各组兔视网膜中SOD的活性均明显下降，各组有显著统计学差异（P=0.000）。经两两比较分析，高眼压模型组兔视网膜中SOD的活性下降明显，与各组比较有显著统计学差异(P＜0.05)。高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF组或+超声组、高眼压模型+玻璃体腔注射mNGF+超声+微泡组兔视网膜SOD活性较高眼压模型组升高，但3、4、5组两两比较均无显著统计学差异(P＞0.05)。
表5各组兔视网膜NO、MDA和SOD的含量变化（）
Figure BDA0000428396640000152
Figure BDA0000428396640000161
注：单因素方差分析，△※表示组间两两比较无显著统计学差异（P＞0.05），
余组间两两比较有显著统计学差异（P＜0.05）
讨论
1、兔高眼压视神经损害模型的制备
青光眼动物模型在青光眼的研究过程中非常重要。目前已经很多研究提出许多种青光眼动物模型，其中最理想的是激光烧灼小梁网诱导猴高眼压模型，但其价格昂贵，来源稀少，不能大批量做实验，限制了研究的应用。研究者早期尝试制作青光眼模型就是从制作兔眼青光眼模型开始的，兔眼大，易于操作，成本低，但造成的眼内炎症反应亦重。兔眼青光眼模型一般选择前房注射糜蛋白酶、甲基纤维素、复方卡波姆等，本实验选择了兔前房注射复方卡波姆来造模。卡波姆水液在PH值6～12时成凝胶状，房水的PH值为7左右，将其注入前房后，卡波姆从溶液状态变成凝胶状，不但能阻塞房角和小梁网防碍房水的排出，迅速成为凝胶状又不易从注入点返流出来[12]。本实验期间高眼压模型组平均眼压为32～37mmHg，高眼压可持续4周以上，这与以往的研究结果相一致，前房内注入复方卡波姆溶液是一种较理想的高眼压造模方法。
视觉诱发电位是视大脑皮质枕叶区对视刺激发生的电反应，是代表视网膜接受刺激，经视路传导至枕叶皮层而引起的电位变化，是一种评价神经损害的敏感手段，主要反映视网膜到视皮层之间的病变，F-VEP的潜伏期和振幅主要反映视神经髓鞘和轴索的功能状态。所以对于本实验来说，F-VEP是评价视神经功能的一个较好手段。本实验结果显示高眼压膜型组兔F-VEP的N1潜伏期、P1潜伏期、N2潜伏期较空白对照组明显延长，N1-P1波振幅明显降低，比较具有显著统计学差异。
OCT和光镜测量兔视网膜厚度结果显示，高眼压模型组兔视网膜厚度显著变薄，说明慢性高眼压对兔视网膜造成了一定的损伤，使得视网膜厚度整体变薄。本实验从兔视网膜病理组织形态学观察发现，高眼压模型组视网膜各层结构紊乱、疏松，层次不清；感光细胞层排列紊乱；外核层细胞排列紊乱，厚度变薄；内核层细胞排列疏松、紊乱，可见大量空泡变的细胞；内丛状层和外丛状层结构紊乱，轻度变薄，与神经节细胞层分界不清；神经节细胞层细胞数目明显减少，呈空泡样变。这说明在慢性高眼压作用下视网膜各层组织结构发生了损害。兔视网膜RGCs计数高眼压模型组与空白对照组比较差异具有统计学意义，说明慢性高眼压主要作用于神经节细胞层，使神经节细胞发生凋亡，数目减少。另外兔视神经轴突在持续高眼压后可出现损害，视神经轴突肿胀，数目减少，高眼压膜型组的视神经轴突数减少，视神经轴突直径增大和视神经轴突占视神经横截面积百分比减少，与空白对照组相比具有显著统计学差异。
本实验还用透射电镜观察高眼压状态下兔视网膜和视神经的超微结构，发现高眼压模型组感光细胞膜盘轮廓模糊，线粒体不同程度肿胀、空泡变性；外核层细胞排列紊乱、疏松，核染色质不均匀，线粒体明显肿胀及空泡样变；神经节细胞数目减少，肿胀、色淡，微丝、微管成分减少，线粒体、内质网和高尔基体等细胞器基本消失。视神经轴突结构紊乱，髓鞘溶解、疏松，微管和微丝结构消失，线粒体肿胀、空泡变性。
综上所述，本实验从结构和功能方面，病理组织形态学和超微结构方面证实兔高眼压视神经损害动物模型制备成功，这为下一步实验奠定了基础。
2、超声微泡介导视鼠神经生长因子对高眼压兔视神经损害的保护作用
我们将造模成功的高眼压兔进行分组处理，从兔视网膜和视神经的结构和功能，宏观和超微结构等方法进行观察，探讨超声微泡介导视鼠神经生长因子对高眼压兔视神经损害的保护作用。本实验结果显示单纯玻璃体腔注射鼠神经生长因子后F-VEP的N1、P1、N2潜伏期较高眼压膜型组缩短，N1-P1波振幅较高眼压膜型组升高，比较有显著统计学差异（P＜0.05），说明单纯玻璃体腔注射鼠神经生长因子对兔高眼压视神经损害有一定保护作用。玻璃体腔注射鼠神经生长因子后单纯给予超声辐照，发现F-VEP的N1、P1、N2潜伏期和N1-P1波振幅与单纯玻璃体腔注射鼠神经生长因子相比无显著统计学差异（P＞0.05），这说明单纯给予超声辐照并不能增加鼠神经生长因子的保护作用，这是因为只单纯给予超声辐照没有给予微泡，没有产生空化效应，没有增加视鼠神经生长因子到达视网膜局部的药物浓度。超声微泡联合玻璃体腔注射鼠神经生长因子，F-VEP的N1、P1、N2潜伏期明显缩短，N1-P1波振幅明显升高，与玻璃体腔注射鼠神经生长因子后单纯给予超声辐照相比有显著统计学差异（P＜0.05），这说明在超声爆破微泡的作用下，鼠神经生长因子更有效促进高眼压导致视神经损害的功能恢复。
本实验通过光镜病理组织学和OCT测量兔视网膜厚度发现，玻璃体腔注射鼠神经生长因子后兔视网膜厚度测量值较高眼压模型组明显增厚，比较具有显著统计学差异（P＜0.05），这说明鼠神经生长因子对高眼压性视神经损害起到一定的保护作用。超声微泡联合玻璃体腔注射鼠神经生长因子的光镜视网膜厚度测量值与单纯玻璃体腔注射鼠神经生长因子或玻璃体腔注射鼠神经生长因子后单纯给予超声辐照相比有显著统计学差异（P＜0.05），这也说明超声爆破微泡能显著增加鼠神经生长因子对视网膜和视神经的保护作用。我们的研究结果显示，在高眼压作用下，兔视神经轴突结构紊乱，髓鞘发生不同程度的溶解、疏松，微管和微丝结构消失。经玻璃体腔注射鼠神经生长因子后，其视神经轴突数增加，视神经轴突直径减小，视神经轴突占视神经横截面积百分比增大。超声微泡联合鼠神经生长因子组的视神经轴突肿胀明显减轻，轴突直径减小，视神经轴突髓鞘损失程度明显减轻，轴突数目增多，与其它各组相比具有显著统计学差异（P＜0.05）。另外，本实验还从视网膜和视神经的病理组织形态学和超微结构方面进行了观察，研究发现超声微泡联合玻璃体腔注射鼠神经生长因子组的视网膜病理组织结构较完整，各层较清晰，RGCs数目增多，偶可见空泡样变的细胞。兔视网膜和视神经超微结构方面发现，超声微泡联合玻璃体腔注射鼠神经生长因子组的感光细胞排列稍有紊乱，内核层核膜欠清，大多数神经节细胞核膜清晰，染色质分布均匀，核仁明显，线粒体未见明显肿胀及空泡样变。视神经髓鞘排列致密，整齐，可见微管、微丝等结构。这说明超声微泡联合鼠神经生长因子不仅对高眼压导致的RGCs损害有保护作用，而且对感光细胞层和内、外核层都起到一定的保护作用。
综上所述，超声微泡联合鼠神经生长因子对高眼压兔视神经损害有明显的保护作用。这种靶向给药方式，让药物到达眼部的途径变得更单纯，不用经过全身代谢，避免药物经血液循环时所面临的分解及机体内环境对药物的干扰和破坏过程，从而最大限度地保证到达靶器官的药物浓度，发挥最大的治疗作用，大大拓宽了青光眼视神经保护治疗的视野，提供了一种新思路。

Claims (7)

1.一种新型鼠神经生长因子玻璃体腔注射给药系统，其特征在于：包含鼠神经生长因子和超声造影剂。
2.根据权利要求1所述的给药系统，其特征在于：所述超声造影剂为六氟化硫微泡。
3.权利要求1或2所述的给药系统在制备治疗青光眼性视神经损害的药物中的应用，所述药物用于在超声辐照下经玻璃体腔注射给药。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述药物用于在超声声强为0.5W/cm2，辐照时间为30s-60s下经玻璃体腔注射给药。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述药物的注射剂量为12ug/kg的鼠神经生长因子。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述药物为鼠神经生长因子与超声造影剂的稳定混悬剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述混悬剂中鼠神经生长因子与超声造影剂1:1混合。
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