CN103622968A

CN103622968A - 陶扎色替在制备治疗青光眼病的药物中的用途

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Publication number: CN103622968A
Application number: CN201210303268.3A
Authority: CN
Inventors: 常辉; 李劢
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2012-08-24
Publication date: 2014-03-12

Abstract

本发明公开了陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐的新用途，所述新用途为在制备治疗青光眼病的药物中的用途。所述陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐可以制备成普通制剂和长效制剂。上述制剂治疗青光眼病能够达到作用非常显著的效果。

Description

陶扎色替在制备治疗青光眼病的药物中的用途

技术领域

本发明涉及一种治疗青光眼病的药物的用途，具体涉及陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐在制备治疗青光眼疾病的药物中的用途。

背景技术

青光眼是一种不可逆致盲的眼病。截止到2010年，世界上已有6050万人患有青光眼病，其中4470万人是原发性开角型青光眼，1570万人是原发性闭角型青光眼。估计到2020年，闭角型青光眼病人数量将增为2100万人，其中有530万人将会致盲。青光眼的一个主要致盲因素就是眼内压(inira ocular pressure，IOP)升高。

开角型青光眼的前房角是开放的，大都是宽角其发病原因可能是由于小梁网，静脉窦(Schlemm管)或房水静脉出现变性或硬化，导致房水排出系统阻力增加。阻碍的部位大多在小梁网，少部分在房水排出通道的远端。开角型青光眼房水排出阻力主要在于Schlemm管本身，管腔变窄、进行性萎缩闭塞，使房水流出阻力增加，是导致眼压升高的主要原因。

闭角型青光眼是一种常见的青光眼类型，是由于患者的前房角关闭，眼内的房水排出受阻所致。闭角型青光眼有原发性闭角型青光眼和继发性闭角型青光眼。原发性闭角型青光眼是指没有其他眼病存在，单由于患者的瞳孔阻滞，或患者虹膜根部肥厚、前移，导致前房角关闭、房水流出困难、眼压升高的一种情况。慢性闭角型青光眼其特点是有不同程度的眼部不适，发作性视朦与虹视。

目前，主要从两个方面来治疗青光眼，一是降低眼内压，其作用机制是通过促进房水引流、减少房水生成和高渗脱水作用从而降低眼压；二是保护视神经，青光眼视神经损害最终导致视力功能丧失，视神经保护治疗措施包括降低眼压，使用钙拮抗剂，抗氧化剂，免疫疗法，补充和替代疗法，潜在的细胞修复和基因治疗，并非所有的视神经保护手段均可用于临床，不少尚在实验研究阶段。

一、临床常用的抗青光眼眼内压升高的药物有：

1前列腺素类药

前列腺素类药物是前列腺素FP受体兴奋剂的前体，能增加色素膜巩膜的房水外流而降低眼压且不影响房水的生成，但是其增加房水外流的具体作用机制尚不十分清楚。这类药物还可能松弛睫状肌，也可能是其增加房水外流的另一原因。每日1次局部给予前列腺素类药可使开角型，闭角型，正常眼压性青光眼和高眼压病人降低眼压25％左右。但是其机理不明确，可使眼睑皮肤和虹膜色素沉着，致睫毛长度及密度增加，并且仅仅能将低眼压，对于青光眼其他症状毫无缓解约束了这个药物的应用。

2肾上腺素β受体阻断药

肾上腺素β受体阻断药是目前青光眼治疗中使用最广泛的药物，包括噻吗洛尔、卡替洛尔、左布诺洛尔、美替洛尔等。这些药物通过阻断肾上腺素和去甲基肾上腺素与β受体的结合使睫状体上皮细胞中环磷酸腺苷(cAMP)水平降低，从而减少房水的生成，通常能使眼压降低20％-25％。它们对开角型和闭角型青光眼均有效，但是同样由于治标不治本，因此并不能对治愈青光眼产生积极深远的效果。

3肾上腺素α2受体兴奋药

肾上腺素α2受体(α2受体)兴奋药是另一类重要的治疗青光眼的药物，包括溴莫尼定、阿可乐定等。它们作用于睫状突中的α2受体，抑制房水形成，也可适当提高房水外流，但其细胞作用机制尚不清楚。它们对开角和闭角型青光眼均是有效的降眼压药，可降低眼压20％-30％，此药也是仅针对于降低眼压，对于青光眼病治疗意义有限。

4碳酸酐酶抑制药(CAI)

口服CAI治疗青光眼已有多年，如多佐胺、布林佐胺。然而因其在神经、消化系统以及代谢方面的不良反应，其临床应用始终受到限制。

5缩瞳药

缩瞳药匹罗卡品(pilocarpine)为第一个局部用于治疗青光眼的药物，已有一百余年临床应用的历史。缩瞳药模仿乙酰胆碱(acetylcholine)激活胆碱受体的作用而引起眼内睫状肌和瞳孔括约肌的收缩，睫状肌的收缩牵拉小梁致使房水外流增加。主要作为联合用药用于原发性开角型青光眼的治疗，治疗效果和作用意义有限。

6肾上腺素类药

肾上腺素类药能兴奋各种肾上腺素受体的亚型引起复杂的降眼压机制，包括抑制房水生成以及增加房水外流。不幸的是这类药物对眼部和全身的不良反应如眼痛、头痛、心律不齐、高血压和心动过快等限制了此类药的应用。

二、临床常用的保护视神经的药物有：

1钙拮抗药

是一类能选择性地减少慢通道Ca²⁺内流，使血管扩张或减少血管痉挛。根据这一原理，人们利用钙拮抗药物提高视神经乳头的血液供应从而治疗青光眼，但是治疗效果不是很明显。

2神经营养因子

神经营养因子是一些对神经细胞的生长分化、增殖再生及功能特性的表达均有重要调节作用的多肽或蛋白质。神经营养因子包括神经生长因子(NGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养素(NT)，睫状神经营养因子(CNTF)，胰岛样生长因子(IGF)，胆碱能发育因子(CDF)等。目前认为对视网膜神经节细胞(RGC)作用比较肯定的神经营养因子有BDNF，NGF，CNTF等，但是这类药物对于神经保护的作用有限，且有特异性。

3自由基清除剂

目前氧自由基清除剂包括有抗氧化酶如过氧化物酶和超氧化物歧化酶(SOD)，抗氧化剂如维生素C，维生素E，维生素A，谷胧甘肽等，此类药物仅仅可作为辅助保护视神经的治疗。

4一氧化氮(NO)途径的抑制剂

NO可损伤神经细胞，抑制NO能保护缺血和兴奋性毒素介导的神经元损伤。作用机理揭示此类抑制剂仅限对通过NO途径损害视神经的治疗，并且机理有待证明。

5谷氨酸受体阻滞剂

青光眼病人玻璃体内的谷氨酸浓度明显升高，经治疗适当控制眼压后也是如此。体外实验证实，视网膜神经节细胞中大的节细胞对谷氨酸特别敏感，在细胞培养中，当视网膜神经节细胞接触高浓度的谷氨酸或N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)时，大的视网膜神经节细胞发生凋亡。阻断谷氨酸的过量释放或干涉NMDA受体与谷氨酸的结合可以保护视网膜神经节细胞。这类药物的机理有待更深入的实验证明，而且目前在动物实验阶段证明效果一般。

6中药

自20世纪70年代以来，国内学者致力于挖掘中草药治疗眼压以控制青光眼病，同时也在视神经保护方面进行了一系列研究，取得了较好的成果，但是中药制剂诸如灯盏细辛，川芎嗪，复方丹参，鱼腥草，黄蔑，人参等起效较慢，而且多数只是针对一些简单轻微的病症，只能作为临床上辅助保护视神经的药物。

总体看来，目前临床用药和在研的药物很多，但是效果非常有限，且作用机理单一，不能兼顾降低眼压和保护视神经，目前为止没有一种药物得到广泛的认可，亟需一种全面地治疗青光眼病症的药物。

本发明人意外地发现陶扎色替及其结构类似的化合物在治疗青光眼病上有意想不到的效果。陶扎色替(英文：Tozasertib；化学名称：N-[4-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-2-嘧啶基]硫]苯基]环丙烷甲酰胺；别名：MK 0457或VX680，是近年来发现的一种抗肿瘤药物，目前对于陶扎色替类化合物治疗青光眼病尚无报道。

发明内容

本发明提供了陶扎色替类化合物或其可药用盐在制备治疗青光眼病的药物中的新用途。

本发明还提供了新的治疗青光眼病的普通制剂和缓释长效制剂。

本发明的技术方案如下：

一种式(I)的化合物或其可药用盐在制备治疗青光眼病的药物中的用途，其特征在于所述式(I)化合物结构如下：

其中R1选自氢或C_1-12脂族基，优选C_1-6脂族基；R2选自氢或C_1-12脂族基，优选C_1-6脂族基；R3选自C_1-12脂族基，优选C_1-6脂族基；X选自C、O、N或S，优选N；Y选自O或S，优选S；Z选自N、O或S，优选N。

所述的脂族基选自烷基或环烷基。

更优选，R1选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、叔丁基、环丁基或环戊基；R2选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、叔丁基、环丁基或环戊基；R3选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、叔丁基、环丁基或环戊基。

更优选，式(I)化合物选自：

(A)N-[4-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-2-嘧啶基]硫]苯基]环丙烷甲酰胺；结构式如下：

(B)N-[4-[[4-(4-环丙基-1-哌嗪基)-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-2-嘧啶基]硫]苯基]乙酰胺；结构式如下：

(C)N-[4-[[4-(4-异丙基-1-哌嗪基)-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-2-嘧啶基]硫]苯基]乙酰胺；结构式如下：

(D)N-[4-[[4-(1-哌嗪基)-6-[(5-乙基-1H-吡唑-3-基)氨基]-2-嘧啶基]硫]苯基]叔丁酰胺；结构式如下：

或

(E)N-[4-[[4-(1-哌嗪基)-6-[(5-环丙基-1H-吡唑-3-基)氨基]-2-嘧啶基]硫]苯基]乙酰胺；结构式如下：

式(I)化合物或其可药用盐可以制备成各种常用的制剂，包括：普通制剂、长效缓释制剂。所述的普通制剂为片剂、粉针剂或胶囊剂等，优选粉针剂；所述长效缓释制剂为纳米粒制剂、微球制剂、水凝胶制剂、聚乙二醇修饰制剂或脂质体形式的制剂，优选纳米粒制剂、微球制剂和脂质体制剂。

所述的纳米粒、微球制剂中包括高聚物或天然产物，所述高聚物选自：聚酸酐、聚氧化烯、聚酰胺、聚酯、聚丙烯酸树脂、聚醚、聚磷腈或聚糖中的一种或多种，或选自所述高聚物的不同单体之间的共聚物，包括乳酸-羟基乙酸共聚物、乳酸-羟基乙酸-乙二醇共聚物、聚乙交酯、乙交酯丙交酯-乙二醇-乙交酯丙交酯三嵌段共聚物、聚乙二醇、癸二酸酐-乙二醇共聚物、十八烷二酸酐-乙二醇嵌段共聚物、聚羟基丁酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚乳酸、聚马来酸酐、聚癸二酸酐、聚乙烯醇、N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸共聚物、壳聚糖、聚醚砜、纤维素、葡聚糖、海藻酸盐、右旋糖酐、透明质酸、明胶、泊洛沙姆、纤维蛋白原、白蛋白或胶原蛋白等高聚物中的一种或多种。所述的脂质体采用天然或合成的磷脂和类脂构成，包括卵磷脂、豆磷脂、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、脑磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、牛胆酸钠、蛋磷脂酰胆碱、磷脂酰丝胺酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯、二肉豆酰卵磷脂、硬脂酰胺、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸等包括天然或合成的磷脂、类脂或其组合。

本发明人研究发现：直接将式(I)化合物静脉注射，可极大地缓解青光眼病状，且毒副作用小；从动物实验的结果看，式(I)化合物的治疗效果超出噻吗心安、多佐胺、三甲醋心安、拉坦前列素、毛果芸香碱等已知可对青光眼有治疗效果的临床用药，而且该药并未出现任何明显的副作用，例如：严重的肝功能和肾功能异常等。

进一步的研究显示，将式(I)化合物制备成缓释长效制剂可以实现眼内注射一次，效果更佳，超过普通制剂的治疗效果，且作用时间长，直接针对眼部，降低副作用，减少了频繁给药的痛苦，提高了病患的耐受性，将为未来青光眼病患者解除痛苦。可以极大地提高青光眼病患者和其家人的生命质量，对促进社会和谐稳定起到非常积极的作用。

具体实施方式

本发明所用的式(I)化合物可以商购，也可以根据CN100484934C公开的制备方法进行制备，其并不限制本发明的保护范围。

药物制备实施例

用式(I)中的下述化合物制备药物：

(A)N-[4-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-2-嘧啶基]硫]苯基]环丙烷甲酰胺，结构式如下：

(B)N-[4-[[4-(4-环丙基-1-哌嗪基)-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-2-嘧啶基]硫]苯基]乙酰胺，结构式如下：

(C)N-[4-[[4-(4-异丙基-1-哌嗪基)-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-2-嘧啶基]硫]苯基]乙酰胺，结构式如下：

(D)N-[4-[[4-(1-哌嗪基)-6-[(5-乙基-1H-吡唑-3-基)氨基]-2-嘧啶基]硫]苯基]叔丁酰胺，结构式如下：

和

(E)N-[4-[[4-(1-哌嗪基)-6-[(5-环丙基-1H-吡唑-3-基)氨基]-2-嘧啶基]硫]苯基]乙酰胺，结构式如下：

逐一将化合物(A)-(E)按照以下所述制剂种类的任一方法或是其他类似方法分别制备成粉针剂和缓释长效制剂(微球制剂、纳米粒制剂、脂质体)。

粉针剂的制备：

①取共计200mg甘露醇、磷脂、甘油和1800mg式(I)化合物在注射用水中混合并使之溶解；

②混匀溶解后待稳定后先用0.45um微孔滤膜粗滤，再用0.2um微孔滤膜过滤；

③分装入小西林瓶，加入其他冻干保护剂和辅料；

④进行程序性冻干；

⑤进行热原、无菌、可见异物、不溶性微粒等相应检查，均符合要求后待用。

微球制剂的制备：

①取200mg聚乳酸羟基乙酸加入到1ml二氯甲烷溶液中制备成溶液；

②将50mg式(I)化合物加入0.2ml乙腈和二氯甲烷的混合液中，混匀后加入到①制得的溶液中，均质器搅拌1min后得到初乳；

③将其加入到2％聚乙烯醇溶液中，1000r/min搅拌5min后再加入0.5％聚乙烯醇溶液后进行复乳；

④降低转速至200r/min继续搅拌4小时后，8000r/min离心5min；

⑤收集微球，蒸馏水洗涤后冷冻干燥。

纳米粒制剂的制备：

①取160mg癸二酸酐-乙二醇共聚物加入到2ml二甲基亚砜和二氯甲烷的混合液中制备成有机相；

②将40mg式(I)化合物加入到①中，混匀后，放置于1％聚乙烯醇中超声；

③将②中溶液置于聚乙烯醇溶液中搅拌；

④除去③中有机溶剂，离心收集，得到纳米粒溶液。

⑤收集纳米粒，洗涤后冷冻干燥。

脂质体制剂的制备：

①精密称取卵磷脂100mg和胆固醇100mg于小烧杯中，加入10ml无水乙醇并搅拌使溶解；

②加入式(I)化合物溶液5ml混匀，匀速注入水浴65℃40ml磷酸缓冲液中；

③慢速搅拌20分钟，水浴保温50分钟，即得脂质体制剂。

本发明所述药物制备实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式和制剂制备的限定。实施例中所涉及的药物制剂可以用很多常用的制备方法制得，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述药物制备实施例的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有常用的制备方法用于制备实施方式予以举例。凡是属于本发明的技术方案引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围。

效果实施例

1陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐对皮质类固醇激素性青光眼大鼠的保护作用(为方便表示，效果实施例中用陶扎色替类药物代指陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐)

1.1实验动物及分组

健康成年Wistar大鼠240只，体重200-250克，无任何眼部疾病。饲育环境在温度25℃±1℃，相对湿度70％，专业饲育人员饲育。造模前用眼压计测量动物眼内压，持续观察记录眼压1周，估计正常眼压区间，剔除眼压高于或低于正常眼压区间者，取出10只作为正常对照组，其他动物开始造模，造模1周后，将模型动物随机分为23组：即模型组、陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐(A-E)的纳米制剂组、微球制剂组、脂质体制剂组和普通注射液组、阳性药组拉坦前列素滴眼液以及口服对照药组噻吗心安。所有动物继续造模，分组后开始给药，陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐的纳米制剂组、微球制剂组和脂质体实行眼内直接注射给药，陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐普通注射液组采用静脉给药，阳性药滴眼给药，口服对照药药物采取口服，正常对照组不做处理。

1.2动物模型的建立

健康成年Wistar大鼠实验组用10％的水合氯醛以0.375ml.100g-1行腹腔麻醉后，用1毫升的注射器隔日定时在右眼球结膜下注射地塞米松0.25mg(0.05ml)，左眼为对照眼，计14次，共28天。

1.3测定指标

1.3.1眼压测量

每次球结膜下注射造模药物前，自制大鼠开睑器开睑，眼压计测量眼压，测量结果取变异系数为5％的眼压，记录。所有大鼠眼压测量由同一人完成。

1.3.2免疫组化检测水通道蛋白AQP1和AQP4的表达

球结膜下持续注射造模药物4周后随机抽取每组大鼠各3只，10％水合氯醛深麻醉后，显微镜下摘除眼球，去除球外筋膜及眼外肌，4％多聚甲醛固定，酒精梯度脱水，二甲苯I、II透明各10分钟，60℃浸蜡3小时，而后包埋并切片4微米厚。1.3.3逆转录聚合酶链式反应半定量检测免疫组化检测水通道蛋白AQP1的mRNA水平

用药4周后后，深麻醉处死动物。快速摘除眼球，在眼科手术显微镜下，去除球外筋膜、眼外肌，角膜缘后1mm左右360°剪开眼球，去除晶状体、玻璃体和葡萄膜等后段组织，眼科剪环形剪去虹膜及角膜，留取房角组织，按说明书方法提取总RNA，根据浓度计算出制备DNA模板所需的RNA量，并用1％琼脂糖凝胶电泳来鉴定RNA的抽提情况(RNA完整性)。依据TAKARA的One Step RNA PCR Kit试剂盒的方法，进行半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，用2％的琼脂糖凝胶电泳及结果分析，用100bp-1000bp DNA Ladder鉴定片断大小，扫描并用图像分析系统测定目的片段和内参照物的灰度值，统计相对灰度比。

1.4统计学分析

各组大鼠观察所得数据以均数±标准差(x±s)来表示，组间进行t检验。

1.5实验结果

1.5.1皮质类固醇激素性青光眼大鼠眼压结果

正常对照组平均眼压始终在14-15mmHg左右，未见明显变化，与正常对照组比较，模型组大鼠造模后1周(给药前)后眼压开始升高，并且随着继续造模时间延长而逐渐升高(P＜0.05或P＜0.01)，陶扎色替类药物各个药物组均对眼内压升高均有抑制作用，且作用效果均强于滴眼阳性对照组前列素滴眼液和口服药阳性对照组噻吗心安(P＜0.05或P＜0.01)，其中陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐的纳米制剂组、微球制剂组和脂质体制剂组的效果最为明显，起效快而且作用持续时间比较长(见表1)。说明该类药物能有明显降低眼内压的作用而且作用持久。

表1皮质类固醇激素性青光眼大鼠眼压结果(mmHg，n＝10)

与对照组比较^##P＜0.01，与模型组比较^*P＜0.05^**P＜0.01

1.5.2免疫组化结果

正常对照组大鼠房角组织可见网孔样小梁网、虹膜睫状体及巩膜静脉窦(shclemm管)等结构；AQP1呈棕黄色颗粒阳性表达于小梁网、shclemm管内皮细胞、细胞外基质、虹膜基质和睫状体无色素上皮细胞，AQP4阳性表达于虹膜基质和睫状体无色素上皮细胞，而小梁网、shclemm管内皮细胞及细胞外基质未见AQP4的阳性表达；模型组大鼠通过地塞米松作用4周后，AQP4的表达部位和表达量未发现明显变化，而AQP1在小梁网、shclemm管内皮细胞及细胞外基质上的显色减弱，表达量减少。各个药物治疗组均可以使AQP1在小梁网、shclemm管内皮细胞及细胞外基质上的显色增强，表达量增多，其中陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐的纳米制剂组、微球组和脂质体组治疗后与正常对照组大鼠相当。AQP1主要与房水的排出关系密切，而AQP4可能主要与房水的产生有关。说明陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐可使AQPI表达提高为房水的排出提供高水平的渗透性能，允许水高效率地穿过小梁网及shclemm管，排入巩膜及色素膜血管。

1.5.3RT-PCR结果

提取的RNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳带未见杂带。用AQP1特异性引物，经RT-PCR方法进行逆转录扩一增，检测到各组大鼠房角组织(小梁网、shclemm管内皮细胞和细胞外基质)中均有特异性AQP1的mRNA，片段长度为523bp，且模型组较正常对照组大鼠房角组织中AQP1的mRNA量(灰度比)明显减少(P＜0.01)；各个药物治疗组能够使大鼠房角组织中AQP1的mRNA量(灰度比)明显增加(P＜0.05或P＜0.01)(见表2)，其中陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐纳米制剂组的效果比较明显，而且作用后灰度比效果与正常对照动物组的相当，基本恢复正常，属于完全治愈。微球组、普通制剂组和脂质体组的效果均强于坦前列素滴眼液组和药噻吗心安组(P＜0.05)。

表2皮质类固醇激素性青光眼大鼠房角组织AQPI表达的结果(n＝10)

与对照组比较^##P＜0.01，与模型组比较^*P＜0.05^**P＜0.01

2陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐长效制剂对兔开角型青光眼的保护作用

2.1实验动物及分组

健康普通级青紫兰兔184只，雌雄各半，体重2.5kg左右，裂隙灯显微镜检查无眼前节病变。未造模前，随机选取实验兔20只，分别于每日多时间点测量兔双眼眼压并记录。连续观察一周后，以确定本组实验兔正常眼压范围。造模1周后后，将模型动物随机分为23组：即模型组、陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐(A-E)的纳米制剂组、微球制剂组、脂质体制剂组和普通注射液组、阳性药组美替洛尔(三甲醋心安)滴眼液以及口服对照药组噻吗心安。所有动物不再继续造模，分组后开始给药，陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐纳米制剂组、微球制剂组和脂质体组进行眼内注射给药，陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐普通注射液组采用静脉给药，阳性药滴眼给药，阳性口服对照药药物采取口服。

2.2动物模型的建立

每组10只兔右眼角膜缘12点位前房穿刺，抽出房水0.1-0.2毫升。0.3％卡波姆和0.025％地塞米松0.1-0.2毫升经穿刺口注射至前房，左眼为对照眼，连续造模一周后开始给药。

2.3测定指标

2.3.1眼压测量

动物给药后，用眼压计测量给药后第1、4、7、14、28天眼内压，测量结果取变异系数为5％的眼压，并记录。

2.3.2组织形态学观察

给药后第1、7、14、28天四个时间段以耳缘静脉推注20ml空气，处死每组兔各2只，立即摘除双侧兔眼。先将眼球作赤道部切开，小心剪断晶状体悬韧带，取出晶状体及玻璃体。每组兔实验眼和对照眼以中央为轴矢状切开为两半。将两半眼球壁分别放入4％多聚甲醛和2.5％戊二醛溶液中固定，制成光镜和电镜标本。

2.4统计学分析

各组观察所得数据以均数±标准差(x±s)来表示。组间进行t检验。

2.5实验结果

2.5.1药物对青光眼兔眼压的影响

兔造模后一周(给药前)眼压升高，即各个药物治疗组在给药前没有任何差别，给药后，各个药物组对眼内压升高均有抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)，其中陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐纳米制剂组、微球组、脂质体组效果最为明显，且治疗效果强于阳性药物组(P＜0.05)，起效快而且作用持续时间比较长(见表3)。陶扎色替类药物的普通制剂组亦能表现强于口服和滴眼的阳性药物的治疗效果，说明该药物确实能够明显降低眼内压，不但起效快而且作用持久，比现有的药物的疗效更好。

表3各组药物对青光眼兔眼压的影响(n＝8)

与模型组比较^*P＜0.05^**P＜0.01

2.5.2光镜结果

结果显示：正常兔眼(对照眼)下组织层为腺样层和深层的纤维层，结膜上皮层为薄的2-4层柱状上皮构成，结膜内有较细的血管；巩膜为纤维结缔组织；前房角无Schlemm管；睫状体表面有一层无色素上皮细胞，下面是色素上皮细胞层，睫状突内富含血管，睫状体平坦部仅有一层睫状肌。视神经轴索排列整齐，线粒体和微丝可见，胞浆丰富。模型组兔眼球结膜水肿，炎症细胞浸润；角膜基质水肿，炎症细胞浸润，房角闭塞。视神经有部分存在部位脱髓鞘情况，并且血管周围间质水肿。角膜周边血管豁形成，部分血管长入角膜基质层；睫状突无色素上皮层呈堆状，表面形成结缔组织；眼球扩张，巩膜壁变薄。各个药物治疗组球结膜水肿、炎症细胞浸润减轻；其中陶扎色替类药物要比对照阳性药物(目前的临床用药)的作用更加有效，角膜水肿减轻，部分角膜上皮细胞变薄，后弹力层皱褶；巩膜断端周围可见轻度炎症细胞浸润；睫状体断端可见少量色素颗粒。眼球无明显扩张，巩膜壁厚度变化不明显。其中陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐长效纳米制剂组和微球组效果更为明显。结果表明，陶扎色替类药物能够抑制由眼部高压所致的病理改变。

2.5.3电镜结果

正常兔眼：睫状体神经上皮和色素上皮排列整齐，细胞膜完整，神经上皮胞浆丰富，内含丰富的线粒体和内质网，细胞核呈圆形或椭圆形；色素上皮细胞核圆，胞浆内含有丰富的圆形色素颗粒。睫状体基质内含有睫状肌纤维，以及毛细血管。视神经髓鞘结构规则，排列紧密。模型组兔睫状体色素细胞可见空泡，部分线粒体肿胀，山脊断裂，空泡变性；视神经轴突与髓鞘之间出现空泡，有洋葱样小体生成，胶质增生，轴突缩小不均部分变成网状。睫状体无色素细胞线粒体肿胀，微血管扩张。各个药物治疗组无色素细胞核皱缩，线粒体肿胀，山脊断裂现象，基质呈无结构样改变；部分轴突肿胀、髓鞘有空泡，毛细血管充血。视神经少数轴突构仍未完全恢复正常，髓鞘层次清楚，轴浆电子密度高。陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐纳米制剂组和微球组效果比较明显。实验结果说明，各个药物组均能改善兔开角型青光眼的病理改变，对此模型具有保护作用，陶扎色替类药物好于临床目前已应用的药物，而陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐纳米制剂和微球制剂的效果更好，安全性非常好，可使高眼压模型眼压降低，明显减轻视神经损害。

3陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐长效制剂对大鼠闭角型青光眼的保护作用

3.1实验动物及分组

实验采用成年雄性Wistar大鼠960只，体重200g-250g。造模前，将动物随机分为24组：即空白对照组、模型组、陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐(A-E)的纳米制剂组、微球制剂组、脂质体组和普通注射液组、阳性药组毛果芸香碱滴眼液以及口服对照药组多佐胺。所有药物均在造模后第1天各给药一次，其中陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐的纳米制剂组、微球制剂组和脂质体组进行眼内注射给药后并不再给药。其他药物组均在第4，7天再行给药两次，其中陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐普通注射液组采用静脉给药，阳性药毛果芸香碱滴眼液组滴眼给药，口服对照药多佐胺采取口服。

3.2动物模型的建立

大鼠于实验前腹腔注射4％水合氯醛(200mg.kg-1)，然后1％利多卡因局部麻醉大鼠角膜。高眼内压(IOP)期间，每隔0.5小时腹腔注射4％水合氯醛0.1-0.2毫升使动物保持麻醉状态。采用滑轮-缝线系统使大鼠右眼眼内压(IOP)升高，左侧眼球做对照。将70厘米外科缝线两端各系一相同重量祛码，缝线中间系一圆圈用于环绕大鼠眼角巩膜缘后2毫米，两端的祛码通过分别一组滑轮对大鼠眼睛持续稳定施压。砝码施压为15克，持续压力6小时，则造成大鼠闭角型青光眼模型。

3.3测定指标

3.3.1视神经损伤评估

将动物用过量麻醉药处死后，角巩膜缘后4毫米延眼眶剪开巩膜，将眼球从眼眶中剜出，尽量暴露视神经，在眼窝深处剪断视神经，保留视神经长度约3-5毫米，然后将两侧视神经从眼球上分离后取下，在含2％多聚甲醛和2.5％戊二醛的0.1摩尔的磷酸缓冲液(PBS)中过夜固定后置于枸橼酸铅和醋酸双氧铀中各2小时，采用梯度酒精脱水，丙酮脱酒精，环氧树脂包埋，切成1微米厚的薄片置于载玻片上，用1％甲苯胺蓝染色，显微镜下10倍物镜拍照，保证所有有视神经都在拍照视野下。视神经损伤通过视神经损伤评分(ONDS)量化，ONDS分五级：1级：正常；2级：20％轴突死亡，染色变暗并伴有极少神经胶质增生；3级：超过50％轴突死亡伴有轻度神经胶质增生；4级：超过80％轴突死亡伴有轻度神经胶质增生；5级：100％轴突死亡伴有严重神经胶质增生。每个视神经需要三个观察者分别进行评分并取其均值进行统计分析。

3.3.2视网膜切片观察

高IOP后28天处死大鼠，取出两侧眼球置于4％多聚甲醛中过夜固定后用梯度酒精脱水，二甲苯脱酒精，浸蜡，石蜡包埋，将视乳头附近的眼球壁切成4微米厚的切片，烤片，用二甲苯脱蜡，梯度酒精脱二甲苯，蒸馏水冲洗，苏木素染色2min，蒸馏水洗，1％盐酸酒精分化，蒸馏水洗，1％氨水返蓝，蒸馏水洗，伊红染色1min，蒸馏水洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片显微镜观察记录。

3.3.3葡聚糖四甲基罗丹明(DTMR，dextran Tetramethyl Rhodamine)标记视网膜节细胞(RGC)的量化

造模后第3、7、14、21、28天分别处死动物，每组随机抽取5只，动物处死前24小时腹腔注射4％水合氯醛(200mg.kg-1)麻醉，1％利多卡因浸润麻醉眼角膜，颗侧角巩膜缘后5毫米，沿眼眶切开5毫米，分离视神经，行视神经横断术(不损伤眼动脉)。将葡聚糖四甲基罗丹明(DTMR)放置于视神经横断面处。24小时后，取出大鼠眼球并固定于4℃4％多聚甲醛中120min。将视网膜从眼杯中取出，周边剪开分成4瓣，平铺于载玻片上，置于暗盒中，过夜风干，中性树胶封片，DTMR标记RGC通过荧光显微镜红色的滤光片观察并记录。其中每片视网膜按前所述分四个区，对每个分区的外周和中心部位在40倍物镜下进行观察，计数每个观察图像所标记的RGC的数量并计算出细胞密度。

3.4统计学分析

各组大鼠观察所得数据以均数±标准差(x±s)来表示。组间进行t检验。

3.5实验结果

3.5.1药物对视神经损伤的保护作用

实验结束28天后，观察视神经的组织学变化并进行视神经损伤评分。结果详见表4，空白对照组的视神经没有明显的组织学改变；模型组大鼠视神经出现明显损伤，表现为轴突数量减少，出现暗染色颗粒和神经胶质细胞增生(P＜0.001)；各个药物治疗组均能改善组织学改变，减少视神经损伤(P＜0.05或P＜0.01)，其中陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐各种制剂组的效果均较为明显，且治疗效果均强于毛果芸香碱滴眼液组和多佐胺组(P＜0.05)，显示出了非常好的治疗效果，其中纳米制剂组和微球组的治疗效果最优。

表4药物对闭角型青光眼大鼠视神经损伤评分的影响

与对照组比较^###P＜0.001，与模型组比较^*P＜0.05^**P＜0.01

3.5.2药物对视网膜的保护作用

饲养至第28天处死，观察视乳头周围视网膜各层厚度及视网膜节细胞层(RGCL)细胞密度改变。与正常对照组相比，视网膜全层厚度、内层厚度均变薄，RGCL细胞数量明显减少(P＜0.01)；与模型组比较，药物组能明显改善由视网膜内层变薄导致的视网膜全层变薄，并且使RGCL细胞数量不再减少，陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐的纳米制剂和微球制剂组甚至可使细胞数目与正常对照组持平(P＜0.05或P＜0.01)，详见表5。视网膜内层的供血依靠视网膜中央动脉，而且该层细胞代谢旺盛，这使该区域的细胞和视网膜外层相比更容易受到损伤，而陶扎色替类药物各个组的药物可以明显改善其病理改变，所以陶扎色替类药物对闭角型青光眼能起到非常好的保护作用，且治疗作用效果均较阳性药组好(P＜0.05)。

表5药物对闭角型青光眼大鼠视网膜的影响

与对照组比较^###P＜0.001，与模型组比较^*P＜0.05^**P＜0.01

3.5.3药物对视网膜DTMR阳性节细胞数量的影响

与正常对照组相比，模型组大鼠DTMR阳性节细胞密度随着时间的延长而逐渐减少，至第28天出现最低值(P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001)。与模型组比较，药物治疗组均可使DTMR阳性节细胞密度增加(P＜0.05)，陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐的各个制剂组使阳性节细胞密度增加的程度超过阳性药组毛果芸香碱滴眼液和多佐胺组(P＜0.05)，其中纳米制剂组、微球制剂组和脂质体组可使DTMR阳性节细胞密度明显增加(P＜0.01)，效果显著。详见表6。

表6药物对视网膜DTMR阳性节细胞数量的影响(/mm²)

与对照组比较^#＜0.05^###P＜0.001，与模型组比较^*P＜0.05^**P＜0.01

4陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐对培养的牛眼小梁细胞骨架及细胞间黏附的影响

4.1牛眼小梁细胞培养

牛眼小梁细胞用组织块法培养及传代培养。乙醇浸泡蒸馏水冲洗后，沿角巩膜缘后5mm处剪开眼球，去掉眼后段、晶状体和睫状体等组织。以拉细的玻璃针插人Schlemm′s管，从玻璃针外侧切开小梁网，将小梁网组织块原代培养，胰蛋白酶消化，传代培养。

4.2标本的制作

第三代牛眼小梁细胞悬液以2×10⁵/ml的密度接种于预置有4mm×4mm盖玻片的培养皿或培养板中，37℃在5％浓度的CO₂条件下孵育。待细胞已基本长满玻片时取出玻片，固定后冻存备用。分别作小梁细胞肌动蛋白(actin)、微管蛋白(tubulin)神经元特异性烯醇化酶免疫细胞化学染色。

4.3测定指标

4.3.1MTT比色法

将第三代小梁细胞以1×10⁵/ml密度均匀接种于96孔培养板，每孔100微升，共60孔。37℃在5％CO₂条件下孵育24小时后，分为正常对照组、培养液内含药物陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐的纳米制剂组、微球制剂组、脂质体制剂组和普通注射液组、阳性药组毛果芸香碱滴眼液的实验组，作用8小时，每组12孔，进行二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色。

4.3.2免疫细胞化学染色

免疫细胞化学染色按说明书行抗生物素-生物素法操作。

4.3.3ELISA定量法

第三代小梁细胞悬液以2×10⁵/ml密度均匀接种于96孔培养板，每孔100微升，共60孔。37℃在5％CO2条件下孵育24小时后，分为正常对照组、培养液内含药物陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐的纳米制剂组、微球制剂组、脂质体制剂组和普通注射液组、阳性药组毛果芸香碱滴眼液的实验组，作用4小时，每组12孔，而后用酶标仪(波长570nm)测A值。

4.4数据统计

4.5实验结果

4.5.1对细胞形态的影响

药物作用15-30分钟后，可见细胞出现退缩，退缩程度随药物不同而不同，其中两种微球和纳米制剂效果最好，其次是脂质体制剂和普通注射制剂，这几种陶扎色替类药物的药物疗效均强于阳性药(P＜0.05)。胞体变圆，由扁平的多角形细胞变为星形、梭形甚至圆球形，细胞出现长的胞突，细胞间隙增大。陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐长效纳米制剂组甚至可见部分细胞脱落。

4.5.2对细胞骨架的影响

培养的牛眼小梁细胞行肌动蛋白微丝、微管抗体免疫细胞化学染色。对照组细胞肌动蛋白微丝的染色表现为胞浆内弥漫性棕黄色染色的基础上还可见到较多的束状走行的纤维，纤维走行以与细胞长轴平行为主，在细胞周边部这种纤维也较明显，细胞微管的染色表现为较浓集于核周，自核周放射状分布，走行趋势与细胞长轴平行；药物组肌动蛋白微丝的染色分布不均匀，呈不规则的斑块状染色浓集，纤维走行消失，微管染色明显浓集于核周。其中纳米制剂，微球制剂和脂质体制剂的效果最好，其次是药物普通制剂，产生的细胞间隙均较阳性药大，细胞间隙大，可提高放房水流畅，由此可见陶扎色替类药物对提高放水流畅，从而产生降低眼压的潜在能力超过阳性药物毛果芸香碱，尤其是纳米制剂、脂质体制剂和微球制剂使粗纤维和肌动蛋白微丝萎缩的最明显，超过普通注射制剂的效果，远远超过阳性药毛果芸香碱的效果，可以预计陶扎色替类药物若未来应用后会，将产生非常积极的治疗效果。

4.5.3药物对培养牛眼小梁细胞增殖的影响

表7表明药物作用8小时，与对照组比较，陶扎色替类药物各组均能抑制牛眼小梁细胞的增值，可推测陶扎色替类药物能抑制细胞间隙的封堵，其中陶扎色替及其类似化合物或其可药用盐的各类制剂均表现出强于阳性药的效果，其中纳米制剂、微球制剂和脂质体制剂组的抑制率最高。

表7药物对培养牛眼小梁细胞增殖的影响(n＝12)

与正常对照组比较^*P＜0.05^**P＜0.01

综合上述实验结果得出结论：化合物(A)，(B)，(C)，(D)，(E)制备的药物均可以明显治疗青光眼，缓解视神经损伤及改善其他青光眼衍生眼部疾病的症状，起到较好的治疗作用，而且无毒副作用，其治疗效果明显好于噻吗心安、多佐胺、三甲醋心安、拉坦前列素、毛果芸香碱等目前临床效果相对较好的药物；其中陶扎色替类药物的长效纳米粒制剂、微球制剂和脂质体制剂相对于普通粉针制剂治疗效果更好，持续时间更长，给药方式更易于被患者接受，会产生更大的社会和经济效益。

Claims

1.一种式(I)的化合物或其可药用盐在制备治疗青光眼病中的用途，其特征在于所述式(I)化合物结构如下：

其中R1选自氢或C_1-12脂族基，优选C_1-6脂族基；

R2选自氢或C_1-12脂族基，优选C_1-6脂族基；

R3选自C_1-12脂族基，优选C_1-6脂族基；

X选自C、O、N或S，优选N；

Y选自O或S，优选S

Z选自N、O或S，优选N。

2.权利要求1的用途，其特征在于：所述的脂族基选自烷基或环烷基。

3.权利要求1的用途，其特征在于R1选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、叔丁基、环丁基或环戊基。

4.权利要求1或3的用途，其特征在于R2选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、叔丁基、环丁基或环戊基。

5.权利要求4的用途，其特征在于R3选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、叔丁基、环丁基或环戊基。

6.权利要求1的用途，其特征在于式(I)化合物选自下列化合物：

或

最优选，(A)N-[4-[[4-(4-甲基-1-哌嗪基)-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-2-嘧啶基]硫]苯基]环丙烷甲酰胺，结构如下：

7.权利要求1-6中任一项的用途，其特征在于将式(I)化合物或其可药用盐制备成各种常用的制剂，包括：普通制剂、长效缓释制剂。

8.权利要求7的用途，所述的普通制剂为片剂、粉针剂或胶囊剂等，优选粉针剂；所述长效缓释制剂为纳米粒制剂、微球制剂、水凝胶制剂、聚乙二醇修饰制剂或脂质体形式的制剂，优选纳米粒制剂、微球制剂或脂质体制剂。

9.权利要求8的用途，所述的纳米粒或微球制剂中包括高聚物，所述高聚物选自：聚乳酸羟基乙酸、聚酸酐、聚氧化烯、聚酰胺、聚酯、聚丙烯酸树脂、聚醚、聚磷腈或聚糖中的一种或多种，或选自所述高聚物的不同单体之间的共聚物。

10.权利要求8的用途，所述脂质体制剂制备时采用的膜材包括卵磷脂、豆磷脂、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、脑磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、牛胆酸钠、蛋磷脂酰胆碱、磷脂酰丝胺酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯、二肉豆酰卵磷脂、硬脂酰胺、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸等包括天然或合成的磷脂、类脂或其组合。

11.权利要求9的用途，所述的高聚物选自：乳酸-羟基乙酸共聚物、乳酸-羟基乙酸-乙二醇共聚物、聚乙交酯、乙交酯丙交酯-乙二醇-乙交酯丙交酯三嵌段共聚物、聚乙二醇、癸二酸酐-乙二醇共聚物、十八烷二酸酐-乙二醇嵌段共聚物、聚羟基丁酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚乳酸、聚马来酸酐、聚癸二酸酐、聚乙烯醇、N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸共聚物、壳聚糖、聚醚砜、纤维素、葡聚糖、海藻酸盐、右旋糖酐、透明质酸、明胶、泊洛沙姆、纤维蛋白原、白蛋白或胶原蛋白等中的一种或多种。