CN101784558A - 神经甾体化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有作用于神经系统的抗细胞凋亡性、神经保护性和神经源性的新的神经甾体衍生物及其制备方法，以及它们在治疗和/或预防或改善与神经元细胞凋亡或神经元损伤相关的神经变性疾病，或与细胞凋亡有关或由细胞凋亡导致的病症中的应用，所述疾病或病症包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化和肌萎缩侧索硬化(ALS)、视网膜变性和脱离、由遗传异常导致的周围神经病变、糖尿病、脊髓灰质炎、疱疹、艾滋病和化疗、脑外伤、或局部缺血和中风。所述活性化合物如式(I)所示：
Figure 200880021099.6_AB_0
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、A、B、X、Y和Z定义于本发明的说明书中。本发明还包括包含一种或多种式(I)的化合物的组合物。

Description

神经甾体化合物
技术领域
本发明涉及没有内分泌作用但具有强的抗细胞凋亡性、神经保护性和神经源性的神经甾体化合物，包括螺环神经甾体类似物；以及它们在治疗、预防或改善神经变性疾病中的应用，所述神经变性疾病包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化和肌萎缩侧索硬化(ALS)、视网膜变性和脱离，和用于缓解见于老年性痴呆或与神经变性疾病相关的良性健忘和记忆缺陷。作为一个非限制性的实例，给出了甾体化合物对神经系统的直接效应。这些神经甾体化合物的另外的适应症是治疗神经病，特别是由遗传异常引起的周围神经病变以及其它病症例如糖尿病、脊髓灰质炎、疱疹、艾滋病、化疗、脑外伤、或局部缺血和中风。
背景技术
术语神经变性在此用于表示神经细胞的进行性损失，出现在衰老和神经变性障碍中，包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、多发性硬化和亨廷顿病、以及中风、头部和脊椎外伤(Nature Rev.Mol.Cell.Biol.1，120(2000))。最初，这些疾病特征在于脑部或周围神经分散区域中神经元慢性和进行性损失，导致虚弱症状例如痴呆、失忆、感觉或行动能力丧失、整体生活和健康质量降低、残疾，最终导致过早死亡。对于大多数神经变性疾病来说，目前几乎没有治疗方法；充其量，治疗方法只是针对症状本身，而无法预防或减缓疾病的发展。
术语由凋亡引起的神经元细胞死亡在此用于表示多种人神经障碍的“终点”，包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病、中风/外伤、多发性和肌萎缩侧索硬化(Trends Neurosci 28，670(2006))。海马和皮层神经元的凋亡性死亡引起阿尔茨海默病症状；利用神经递质多巴胺的中脑神经元的死亡支撑着帕金森病；亨廷顿病涉及控制躯体运动的纹状体中神经元的死亡；下运动神经元的死亡则表现为肌萎缩侧索硬化。此外，脑局部缺血和外伤诱导的小部分脑区域坏死，由于坏死细胞释放神经毒性物质，之后通过细胞凋亡扩及更大脑区域的神经元细胞损失。作为生理过程，在老化的脑中还观察到了凋亡的神经元细胞损失。
术语天然神经甾体在此用于表示产生于脑部的具有胆固醇骨架的分子，例如去氢表雄酮(DHEA)或异孕(甾)烷醇酮(Proc Natl Acad Sci USA 95，4089(1998))。先前的研究已经表明这些内源性、天然产生的神经甾体可以保护神经元免受由神经元营养因子缺失所诱导的细胞凋亡(Proc Natl Acad Sci USA101，8209(2004))。这些神经甾体的神经保护、抗细胞凋亡效应在非常低的、纳摩尔浓度(1nM)发生，且受特定膜受体激活和随后的抗细胞凋亡的Bcl-2蛋白产生的介导(FASEB J 20，577(2006))。此外，在纳摩尔浓度下的这些天然神经甾体刺激神经保护性多巴胺的分泌和产生(Endocrinology146，3309(2005))。
传统上知道成人中枢神经系统(CNS)是一种具有非常有限的再生能力的结构。然而，已表明几种病理状况如局部缺血、癫痫症和外伤正调节下区域和齿状回中的神经干细胞活动。这些发现表明信号遍及成人脑中，使有限的神经元再生得以可能。该基础发现改变了我们对于神经再生以及脑再生能力的认识，给我们再生特定脑区域的潜在能力。近期在多个实验模型中发现两种天然产生的神经甾体(DHEA和异孕(甾)烷醇酮)能够诱导神经发生(Proc NatlAcad Sci USA 101，3202(2004)和J Neurosci 25，4706(2005))。
针对破坏性的神经变性疾病治疗手段的缺乏已经引起人们对于开发能够预防或治疗神经功能进行性损失引起的严重损伤和死亡的神经保护方法的巨大兴趣。对于开发用于神经细胞保护、修复和复苏，瞄准神经细胞凋亡和存活或神经发生的新化合物存在着持续的需求。天然神经甾体例如DHEA在实验动物中具有重要的体内和体外的神经保护性和神经源性。然而，天然产生的神经甾体在人体内被代谢为雌激素、雄激素或孕激素类，引起全身性的和严重的内分泌副作用，包括激素依赖的瘤形成(Front Neuroendocrinol 21，1(2000))，从而限制了它们的临床应用。
GB 1,079,840(1966)公开了在合成一些甾族内酯类化合物中作为中间体的3β-羟基-17-螺环环氧乙基-雄甾-5-烯。
US 3,320,242(1967)公开了17β，20-环氧甾体及其生产方法。具体请求保护17β，20-环氧-17α-甲基雄甾-5-烯-3β-醇(1)和17β，20-环氧-17α-甲基雄甾-4-烯-3-酮(2)。
US 3,300,489(1967)公开了甾族C-17螺内酯及在其制备中所使用的方法和中间体。下述化合物3和4作为中间体被公开。
Figure G2008800210996D00032
其中X是C-C单键或亚甲基。
US 3,413,288(1968)和US 3,506,652公开了使用具有下述结构式的甾族环氧化合物作为中间体合成甾族C-17螺内酯的方法
其中当W是羟基时Y是单键。
US 3,365,475(1968)公开了17α-(3’-羟基-丙基)-4-雄甾烯-3β，17β-二醇的制备方法，其可用于制备甾体17-螺环四氢呋喃，后者作为醛固酮抑制剂具有有效的治疗效用。
US 3,364,238(1968)公开了下述结构式的3-氧合螺环[雄甾烯-17，1’-环丙基-2’-烯]及其2’，3’-二氢衍生物
Figure G2008800210996D00041
其中R可以是氢或低级烷酰基，R’和R”可以是氢或低级烷基，点线表示任选地存在双键。
US 4,026,918(1977)描述了某些被认为具有抗炎症活性的高D环甾类的制备。(3β，11α，17α)-螺环[雄甾-5-烯-17，2′-环氧乙烷]-3，11-二醇作为化学中间体被公开。
US 4,054,563(1977)公开了制备如下通式的17-螺环-(2’-氧杂环戊烷)甾体化合物的方法
Figure G2008800210996D00042
其中R1是氢原子或低级烷基，其在第5位包含双键以及在第10位包含甲基，或在第1、3和5(10)位包含三个双键，以及其在第9(11)位可包含一个额外的双键。该化合物被认为是用于制备醛固酮拮抗剂的有用的中间体。
WO 98/33506公开了某些化合物在抑制雄激素合成中的应用，所述化合物被认为可用于治疗前列腺癌和良性前列腺肥大。所列的比较化合物之一是17β，20β-乙烯亚氨基-孕甾-5-烯-3β-醇。
Helvetica Chimica Acta 34，756-767(1951)公开了可用于合成17，20-环氧-17α-别孕烷-3β，21-二醇双乙酸盐的20α-和20β-立体异构体的反应路线图。
在Journal of Medicinal Chemistry 10(4)，546-551(1967)中，提及下述式5的甾族环醚作为中间体用于制备具有抗雌激素性质的甾族化合物。
Figure G2008800210996D00051
Tetrahedron 29，883-889(1973)公开了一些甾体合成路线，其中(3β，17β)-3′-乙炔基螺环[雄甾-5-烯-17，2′环氧基]-3-醇乙酸酯和(3β，17β)-3′-[(三甲基硅烷基)乙炔基]螺环[雄甾-5-烯-17，2′环氧基]-3-醇乙酸酯是中间体。
Tetrahedron 43，631-641(1987)描述了下述式6和7化合物及其5α-H类似物的制备。
Figure G2008800210996D00052
发明内容
在第一方面，本发明涉及式I的化合物及其药学上可接受的酯、盐和酸加成盐：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、A、B、X、Y和Z如以下具体实施方式中所定义的。
在另一方面，本发明涉及一种组合物，包含作为活性成分的至少一种式I的化合物或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐，以及药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂。
在另一方面，本发明涉及一种预防或治疗与神经元细胞凋亡或神经元损伤相关的神经变性病症的方法，包括对患者施用有效量的式I的化合物，或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐。仅作为例举，所述病症可以是以下任何一种疾病：阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化(ALS)、视网膜变性、视网膜脱离、由遗传异常引起的周围神经病变、糖尿病、脊髓灰质炎、疱疹、艾滋病、脑外伤、局部缺血和中风。
在另一方面，本发明涉及一种式I的化合物，或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐，用于治疗。
在另一方面，本发明涉及一种式I的化合物，或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐用于预防或治疗与神经元细胞凋亡或神经元损伤相关的神经变性病症。所述病症可例如是上述所列的任何一种疾病。
在另一方面，本发明涉及一种式I的化合物，或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐在制造用于预防或治疗与神经元细胞凋亡或神经元损伤相关的神经变性病症的药物中的应用。所述病症可例如是上述所列的任何一种疾病。
在另一方面，本发明涉及一种式I的化合物，或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐在控制神经干细胞和神经祖细胞于包括中枢神经系统和周围神经系统的不同器官和组织中增殖、分化、迁移和再生中的应用。
在另一方面，本发明涉及一种式I的化合物，或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐在控制上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、淋巴样细胞、红细胞系细胞和单核细胞增殖、分化、迁移和再生中的应用。
在另一方面，本发明涉及一种式I的化合物，或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐用于结合、激活或抑制包括TrkA和p75NTR受体的神经生长因子(NGF)受体的应用。
如在说明书和例证性的具体实施方案中所描述和举例说明的，通过下列产品和所需特征、性质、特性，以及要素与工序关系、彼此相对关系的详细描述，本发明将得到更好的理解。
附图说明
图1是显示在使用分析技术的实验研究中，几种甾体化合物对神经嵴衍生的PC12细胞的凋亡影响的柱状图。
图2由几张图组成，显示了在使用分析技术的实验研究中，神经嵴衍生的PC12细胞的凋亡对于几种甾体化合物浓度的依赖性(如使用比色计通过光密度所测定的)。
图3显示了利用FACS分析的几种甾体化合物对神经嵴衍生的PC12细胞的凋亡的影响的实验研究结果。
图4显示了几种甾体化合物对神经嵴衍生的PC12细胞中抗细胞凋亡的Bcl-2和Bcl-xl蛋白水平的影响的实验研究结果。
图5显示了几种甾体化合物与PC12大鼠交感肾上腺细胞的分离的细胞膜结合的浓度依赖性实验研究结果。
图6显示了几种甾体化合物对多巴胺能神经嵴衍生的PC12细胞的影响的实验研究结果。
图7显示了几种化合物对于来自野生型小鼠的原发性外皮神经球的影响的实验研究结果。
图8显示了与对照相比，一种合成的神经甾体对分离自小鼠胎脑的神经祖细胞的影响的实验研究结果。
图9显示了在转染的HEK293细胞中，一种合成的神经甾体对神经生长因子的结合、激活或抑制能力的实验研究结果。
附图的更详细讨论见以下实施例7-13。
具体实施方式
本发明涉及式I的化合物
Figure G2008800210996D00081
其中
R1是羟基、烷氧基、烷酰氧基、氨基羰酰氧基或烷氧基羰酰氧基；
R2是氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的烷氧基烷基、任选取代的氨烷基、氰基、任选取代的氰烷基、任选取代的硫氰烷基、异硫氰基、任选取代的叠氮烷基、任选取代的烷酰氧烷基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基烷基、任选取代的芳基烯基、任选取代的杂芳基烯基、任选取代的芳基、任选取代的芳基炔基(arylkynyl)、任选取代的芳基烷基炔基(arylkylalkynyl)、任选取代的烷酰氧炔基、任选取代的杂芳基氧基炔基、任选取代的酮炔基或其缩酮、任选取代的氰基炔基、任选取代的杂芳基炔基、任选取代的羟基炔基、任选取代的烷氧基炔基、任选取代的氨基炔基、任选取代的酰氨基炔基、任选取代的巯基炔基、任选取代的羟基炔基二酸半酯或其盐、或任选取代的炔氧基炔基；
或
R1是氧，且R2是烷基或烯基或炔基，其与R1键合形成可被任选取代的氧化环；
R3是氢，或当甾环系统的C5和C6之间存在双键时，R3不存在；
R4是氢或低级烷基；
R5是氢、氨基、任选取代的烷基氨基、任选取代的二烷基氨基、任选取代的烯基氨基、任选取代的二烯基氨基、任选取代的炔基氨基、任选取代的二炔基氨基、氨基、硫代、亚磺酰基、磺酰基、亚磺酰氨基、卤素、羟基、任选取代的烷氧基、任选取代的烯基氧基、任选取代的炔基氧基烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基、叠氮基、任选取代的杂芳基、肟＝N-O-R8、羧甲基肟、羧乙基肟、或羧丙基肟；
R6是氢、氨基、硫代、亚磺酰基、磺酰基、亚磺酰氨基、卤素、羟基、任选取代的烷氧基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、或任选取代的炔基；
R7是氢、氨基、任选取代的烷基氨基、任选取代的二烷基氨基、任选取代的烯基氨基、任选取代的二烯基氨基、任选取代的炔基氨基、任选取代的二炔基氨基、氨基、硫、亚磺酰基、磺酰基、亚磺酰氨基、卤素、羟基、任选取代的烷氧基、任选取代的烯基氧基、任选取代的炔基氧基烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基、叠氮基、任选取代的杂芳基、肟＝N-O-R8、羧甲基肟、羧乙基肟、或羧丙基肟；
X是化合价键，亚甲基(-CH2-)或选自氧、硫的杂原子，或-NH、-S(O)、-SO2、-NR8、-NC(O)R8、-N-甲苯-4-磺酰基氧；
A是-(CH2)n-、C2-5亚烯基、或C2-5亚炔基，其中n是整数，且可取值为0或1或2或3或4或5；
B是-(CH2)y-、C2-5亚烯基、或C2-5亚炔基，其中y是整数，且可取值为1或2或3或4或5；
Y可键合到甾体骨架C17处螺环取代基的任何碳原子上，且独立地是H、任选取代的C1-10烷基、任选取代的稠双环系统、任选取代的桥双环系统、任选取代的桥三环系统、任选取代的C2-10烯基、任选取代的C2-10炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基烷基、甲酰基、羧基、-NC(O)R8、NC(S)R8、-NR8R9、任选取代的C(O)-W、任选取代的C(O)O-W、或任选取代的C(S)O-W；
Z可键合到甾体骨架C17处螺环取代基的任何碳原子上，且独立地是H、任选取代的C1-10烷基、任选取代的稠双环系统、任选取代的桥双环系统、任选取代的桥三环系统、任选取代的C2-10烯基、任选取代的C2-10炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基烷基、甲酰基、羧基、-NC(O)R8、NC(S)R8、-NR8R9、任选取代的C(O)-W、任选取代的C(O)O-W、任选取代的C(S)O-W；
Y和Z可键合到C17处螺环取代基的同一碳原子上；
W是任选取代的C1-10烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的稠双环系统、任选取代的桥双环系统、任选取代的桥三环系统、任选取代的C2-10烯基、任选取代的杂环烯基、任选取代的C2-10炔基、任选取代的杂环炔基、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基；
R8和R9独立地是任选取代的C1-10烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的稠双环系统、任选取代的桥双环系统、任选取代的桥三环系统、任选取代的C2-10烯基、任选取代的杂环烯基、任选取代的C2-10炔基、任选取代的杂环炔基、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基；
以及点线表示可能存在的单键或双键。
本发明还涉及组合物，包含作为活性成分的至少一种式I的化合物或其一种药学上可接受的酯、盐或酸加成盐，以及药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂。
式I的化合物及其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐可用于治疗、预防或改善神经变性疾病的症状，用于缓解见于老年性痴呆或与神经变性疾病相关的良性健忘和记忆缺陷，用于几种原因导致的神经病的治疗，以及用于预防脑外伤中的细胞凋亡性神经元损失。仅作为例举，可被治疗的病症包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(ALS)、视网膜变性、视网膜脱离、由遗传异常导致的周围神经病变、糖尿病、脊髓灰质炎、疱疹、艾滋病、局部缺血和中风。
在本发明优选的实施方案中，上述式I中的X是亚甲基、氧原子或-NH。更优选地，X是氧原子。
在本发明还优选的实施方案中，上述式I中的双键位于甾环系统的C5和C6之间，从而R3不存在。
在本发明还优选的实施方案中，上述式I中的R1＝OH；R2＝R5＝R6＝R7＝Y＝H且R4＝Me。
在本发明更优选的实施方案中，上述式I中的R1＝OH；R2＝R5＝R6＝R7＝Y＝H，A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；双键位于甾环系统的C5和C6之间，从而R3不存在；且R4＝Me。还更优选的是其中n＝0且y＝1的化合物。
在本发明最优选的实施方案中，上述式I的化合物选自下述化合物，包括其药学上可接受的酯、盐及酸加成盐：
17β-螺环-[5-雄甾烯-17，2’-环氧基]-3β-醇；
(20S)-3β，21-二羟基-17β，20-环氧-5-孕烯；
(20S)-3β-羟基-17β，20-环氧-20-(2-溴乙炔基)-5-雄甾烯；和
3β，21-二羟基-17α，20-环氧-5-孕烯。
由于上述式I的下列化合物本身是已知的，它们不包括在本发明的范围内：
1)R1＝OH；R2＝R5＝R6＝R7＝Y＝Z＝H，A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；双键位于甾环系统的C5和C6之间，从而R3不存在；R4＝Me；X＝O，n＝0且y＝1；
2)R1是羟基或烷氧基；R2＝R5＝R6＝R7＝Y＝Z＝H，A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；双键位于甾环系统的C5和C6之间，从而R3不存在；R4＝Me；X＝O，n＝0且y＝3；其中X位于17β-位；
3)3′，4′，5′，6′-四氢螺环[雄甾-5-烯-17，2′-(2′H)-吡喃]3β-醇，即式I的化合物中R1＝OH；R2＝R5＝R6＝R7＝Y＝Z＝H，A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；双键位于甾环系统的C5和C6之间，从而R3不存在；R4＝Me；X＝O，n＝0且y＝4；其中X位于17β-位；
4)R1是羟基或烷酰氧基；R2＝R5＝R6＝R7＝H，A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；双键位于甾环系统的C5和C6之间，从而R3不存在；R4＝Me；X＝-CH2-，Y和Z独立地是H或C1-C7烷基，n＝0且y＝1；
5)R1＝OAc；R2＝R5＝R6＝R7＝Z＝H，A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；R3＝H，或不存在，且甾环系统的C5和C6之间存在双键；R4＝Me；X＝O，Y＝2-吡啶基，n＝0且y＝1；
6)17β，20β-乙烯亚氨基-孕甾-5-烯-3β-醇，即式I的化合物中R1＝OH；R2＝R5＝R6＝R7＝Z＝H；Y＝CH3；A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；双键位于甾环系统的C5和C6之间，从而R3不存在；R4＝Me；X＝-NH-，n＝0且y＝1；其中X位于17β-位；
7)(3β，11α，17α)-螺环[雄甾-5-烯-17，2′-环氧乙烷]-3，11-二醇，即式I的化合物中R1＝OH；R2＝R5＝R6＝Y＝Z＝H；R7＝OH；A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；双键位于甾环系统的C5和C6之间，从而R3不存在；R4＝Me；X＝O，n＝0且y＝1；其中R1位于11α-位且X位于17α-位；
8)17，20-环氧-17α-别孕烷-3β，21-二醇双乙酸盐，即式I的化合物中R1＝OAc；R2＝R3＝R5＝R6＝R7＝Z＝H，A＝-(CH2)n-和B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；甾环系统的C5和C6之间不存在双键；R4＝Me；X＝O，Y＝-CH2OAc，n＝0且y＝1；和
9)(3β，17β)-3′-乙炔基螺环[雄甾-5-烯-17，2′环氧基]-3-醇乙酸酯和(3β，17β)-3′-[(三甲基硅烷基)乙炔基]螺环[雄甾-5-烯-17，2′环氧基]-3-醇乙酸酯，即式I的化合物中R1＝OAc；R2＝R5＝R6＝R7＝Z＝H，A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；双键位于甾环系统的C5和C6之间，从而R3不存在；R4＝Me；X＝O，Y＝-C≡CH或-C≡C-SiMe3，n＝0且y＝1；其中X位于17β-位。
虽然这些化合物本身是已知的，但是并不知道它们用于涉及神经元损伤或神经元细胞死亡的疾病或病症或在此提及的其他病症，或与之相关。因此这些化合物并不从本发明的其他方面(组合物、方法、用途等)中排除。
单独或组合使用的下列术语在此定义如下：
术语“烷基”在此表示直链或支链或环状饱和的烃基团。优选的是C1-C16烷基。除非另有特别限定，烷基可以是未被取代、单取代、或如果可能的话是多取代的，其取代基位于任何能够取代的位置。除非另有特别限定，环烷基包括单环、双环、三环和多环，例如金刚烷基、降莰基和相关的萜烯。
术语“杂环烷基”在此表示包含1、2、3或4个O、N或S原子或O、N、S原子组合的环烃基团，例如环氧乙基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢-2H-吡喃基、吗啉基、乙烯亚氨基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、四氢噻吩基、四氢-2H-硫吡喃基。除非另有特别限定，杂环烷基可以是未被取代、单取代、或者如果可能的话是多取代的，其取代基位于任何能够取代的位置。
术语“卤素烷基”在此表示用一个或多个卤素取代的烷基。
术语“烯基”，单独或组合使用，在此表示包含至少一个碳-碳双键的直链或支链或环状不饱和的烃基团。除非另有特别限定，烯基可以是未被取代、单取代、或者如果可能的话是多取代的，其取代基位于任何能够取代的位置。优选的是C2-C16烯基。烯基意在包括具有两个相邻的双键的丙二烯基。
术语“杂环烯基”在此表示含有至少一个包含1、2、3或4个O、N或S原子或O、N、S原子组合的碳-碳双键的环状不饱和的烃基团。除非另有特别限定，杂环烯基基团可以是未被取代、单取代、或者如果可能的话是多取代的，其取代基位于任何能够取代的位置。
术语“炔基”，单独或组合使用，在此表示包含至少一个碳-碳三键的直链或支链或环状不饱和的基团。除非另有特别限定，炔基可以是未被取代、单取代、或者如果可能的话是多取代的，其取代基位于任何能够取代的位置。优选的是C2-C16炔基。
术语“芳基”，单独或联合使用，在此表示包含至少一个具有共轭π电子的环的芳香基团、碳环芳基和联芳基，其可以是未被取代、单取代、或者如果可能的话是多取代的，其取代基位于任何能够取代的位置。优选的是C2-C10芳基基团。典型的芳基基团包括苯基、萘基、菲基、蒽基、茚基、薁基、联苯基、亚联苯基和芴基。
术语“联芳基”表示被其它芳基取代的芳基。
术语“碳环芳基”指其中芳香环上的原子是碳原子的基团。
术语“硫代”在此表示-SR10，其中R10是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基或杂芳基，上述基团均为任选取代的。
术语“亚磺酰基”在此表示-SOR10，其中R10是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基或杂芳基，上述基团均为任选取代的。
术语“磺酰基”在此表示-SO2R10，其中R10是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基或杂芳基，上述基团均为任选取代的。
术语“亚磺酰氨基”在此表示-SO2NR10R11，其中R10和R11独立地是氢、烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基或杂芳基，上述基团均为任选取代的。
术语“任选取代的”或“取代的”指被下述取代基在任何可能的位置取代的基团。对于上述部分，在本发明中有用的取代基是那些不会明显削弱本发明化合物生物活性的基团。不会明显削弱本发明化合物生物活性的取代基包括例如，低级烷基(脂肪族和环状的)、芳基(碳环芳基和杂芳基)、烯基、炔基、烷氧基、卤素、卤素烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、巯基、烷基硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、硝基、烷酰基、烷酰氧基、烷酰氧烷酰基、烷氧基羧基、烷酯基、甲酰胺基、甲酰基、羧基、羟基、氰基、叠氮基、异氰基、异硫氰基、肟、酮及其环缩酮、烷酰基氨基、杂芳基氧、O-芳酰基、O烷基OH、O烯基OH、O炔基OH、O烷基NX1X2、O烯基NX1X2、O炔基NX1X2、NH-酰基、NH-芳酰基、CF3、COOX3、SO3H、PO3X1X2、OPO3X1X2，，SO2NX1X2、CONX1X2，其中X1和X2各自独立地表示H或烷基或烯基或炔基，或X1和X2共同包含具有大约4到大约7个环原子的杂环的一部分，和任选的选自O、N或S的一个额外的杂原子，或X1和X2共同包含具有大约5到6个环原子的酰亚胺环的一部分，且X3表示H、烷基、烯基、炔基、羟基-低级烷基或烷基-NX1X2。
术语“低级”与有机基团或化合物连用时在此表示包含1个，至多6个碳原子。这样的基团可以是直链、支链或环。
术语“杂芳基”指含碳的5-14元环状不饱和基团，其包含1、2、3或4个O、N或S原子并含有在一个或多个环上不定域的6、10或14个π电子，例如，噻吩基、苯并[b]噻吩基、石脑油[2，3-b]噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、苯黄嘌呤基、2H-吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、中氮茚基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、5aH-肼基甲酰基、肼基甲酰基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、噁唑基、嘧啶基、苯并咪唑基、三唑基，上述任一基团都可以是如上述讨论中所述任选取代的。
本发明还包括式I化合物的药学上可接受的酯和盐，包括酸加成盐。
本领域技术人员将会确认存在于式I化合物的立体中心。由此，本发明包括作为混合物或纯的非对映异构体的式I所有可能的立体异构体和几何异构体。当需要一种单一的非对映异构体的式I化合物时，可通过终产物的分解或立体特异性合成来获得，其中立体特异性合成可从异构体纯的起始原料或使用任何合适的中间体进行合成。
包括于本发明范围(化合物、药物组合物、方法、用途等)内的是在此定义的式I化合物及其药学上可接受的盐或酸加成盐的结晶形式(例如多晶型物)、对映体形式和互变异构体形式。
式I的化合物可以采用本领域技术人员熟知的常规合成反应通过市售的甾体化合物进行制备。其中X是氧原子的本发明优选的实施方案可通过重要的中间体(20S)-3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-21-羟基-17β，20-环氧-5-孕烯进行制备，以合适的顺序采用了一系列的合成步骤，包括但不限于氧化、Wittig反应、还原、加氢、肟化、卤化、碳-碳偶联反应和去除C3上的保护基团。可使用除叔丁基二苯基甲硅烷基氧之外的其它合适的羟基保护基团。下述实施例举例说明了一些可适合采用的制备技术。
本发明的化合物作用于CNS和周围神经系统。本发明的药物组合物和方法的预期目的是治疗和/或预防与神经元细胞凋亡或神经元损伤相关的神经变性疾病或障碍，例如但不限于，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化和肌萎缩侧索硬化(ALS)、视网膜变性和脱离、由遗传异常导致的周围神经病变、糖尿病、脊髓灰质炎、疱疹、艾滋病和化疗、脑外伤、或局部缺血和中风、或任何其它导致中枢或周围神经系统的神经细胞变性和/或细胞凋亡的病症。
当在本文中使用时，术语“治疗(treat)”或“治疗方法(treatment)”指任何在受试者中进行的与神经元细胞凋亡或神经元损伤相关的障碍或疾病的治疗，包括但不限于，阻止还没有诊断为患有障碍或疾病的受试者发生障碍或疾病；抑制障碍或疾病，例如，阻止障碍或疾病的发展；减轻障碍或疾病，例如，使障碍或疾病减退；或缓解由疾病或障碍引起的症象，例如，终止障碍或疾病的症状。
本发明的制剂可以用于治疗所述疾病的标准方式施用，包括但不限于口服、肠胃外、舌下、经皮、直肠、或通过吸入或含服给药。另外，本发明的组合物可配制成肠胃外给药的剂型，通过注射或连续输注进行施用。根据本发明的组合物可作为缓释剂型或长效制剂进行配制。给药途径可以是任何有效传递活性化合物至目标位置用以发挥其抗细胞凋亡的效果的途径。任何本领域技术人员都可以将之前的描述扩展为任何其它的施用方法，而不会损害受试者。
通过根据公认步骤以足以在受试者、动物或人中产生期望药效活性无毒的量，将本发明的活性化合物或这种化合物的混合物与无毒的药学载体混合，以常规剂量单位形式制备本发明的药物化合物。优选地，组合物中包含活性成分的量为有活性而无毒性的，取决于期望的特定生物活性和患者的病症。
所使用的药学载体可以是，例如固体或液体。代表性的固体载体是乳糖、白土、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯树胶、硬脂酸镁、硬脂酸、微晶纤维素、高分子水凝胶以及类似物。典型的液体载体是丙二醇、β-环糊精水溶液、糖浆、花生油和橄榄油以及类似乳状剂。同样地，载体或稀释剂可包括任何本领域公知的延时材料，例如单独使用单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯或联用蜡、微胶囊、微球体、脂质体、和/或水凝胶。
对于固体载体，其制备可以是简单研磨、微粉化或纳米化、油包、片剂、硬明胶包被或在肠溶胶囊中以微粉化或丸剂的形态存在、或以含片、锭剂或栓剂的形式存在。对于液体载体，其制备可以是液体的形式，例如置于安瓿管中；或以水溶液或混合有药学上可接受的防腐剂的非水性悬液以及类似的形式进行。当需要低剂量时，也可以采用鼻腔喷雾、舌下施用和延时释放的皮肤药膏途径作为局部用药的给药形式。
以下列出了一些式I的具体化合物，根据下述实施例部分进行其合成。这些实施例仅用于更好地理解本发明，并不以任何方式作为对本发明范围的限制。
1)17β-螺环-[5-雄甾烯-17，2’-环氧基]-3β-醇(“BNN-50”)
2)(20S)-3β，21-二羟基-17β，20-环氧-5-孕烯(“BNN-124”)
3)(20S)-3β-羟基-17β，20-环氧-20-(2-溴乙炔基)-5-雄甾烯
4)3β，21-二羟基-17α，20-环氧-5-孕烯(“BNN-93”)
实验部分
在Bruker AC 300波谱仪上记录NMR波谱，对于1H在300MHz下运行，对于13C在75.43MHz下运行。1H NMR波谱以相对于在7.24ppm下的内标CHCl3的δ单位记录。13C NMR位移以相对于在77.0ppm下的CDCl3的δ单位表示。对13C NMR波谱进行质子噪声去偶。所有NMR光谱都在CDCl3中记录。使用硅胶板(Merck F254)进行薄层层析。使用硅胶(200-400目)进行层析纯化。
实施例1
17β-螺环-[5-雄甾烯-17，2’-环氧基]-3β-醇的制备
Figure G2008800210996D00181
在0℃，向去氢表雄酮(500mg，1.73mmol)的无水DMF(10mL)溶液中添加三甲基碘化锍(530mg，2.60mmol)和t-BuOK(292mg，2.60mmol)，将所得到的混合物在室温搅拌2小时。反应完成后加入水，用二乙醚萃取所得到的混合物。用盐水洗涤有机相，然后用无水Na2SO4干燥并真空蒸干溶剂。残留物经快速柱层析进行纯化(洗脱液：石油醚40°-60℃/丙酮8∶2)，得到实施例1的化合物，为白色结晶固体。得率：310mg(59％)；m.p.170-173℃；
Figure G2008800210996D00182
(C＝0.00125g/mL，CHCl3)；1H NMR(CDCl3)δ：5.35(s，1H，6-CH)，3.47-3.54(m，1H，3a-H)，2.89(d，J＝4.88Hz，1H)，2.59(d，J＝4.88Hz，1H)，2.2-0.9(m，20H)，1.00(s，3H，18-CH3)，0.88(s，3H，19-CH3)，13CNMR(CDCl3)δ：14.14，19.38，20.41，23.58，28.99，31.35，31.54，31.99，33.84，36.59，37.23，39.89，42.18，50.14，53.12，53.63，70.52，71.59，121.21，140.88。
实施例2
(20S)-3β，21-二羟基-17β，20-环氧-5-孕烯的制备
17α-乙烯基-5-雄甾烯-3β，17β-二醇
Figure G2008800210996D00183
在-78℃，向去氢表雄酮(250mg，0.87mmol)的无水四氢呋喃(7mL)溶液中滴加乙烯基溴化镁溶液(1M的四氢呋喃溶液，4.35mL，4.35mmol)，将所得到的混合物在室温搅拌12h。反应完成后加入饱和氯化铵，用乙酸乙酯萃取所得到的混合物。用盐水洗涤有机相，然后用无水Na2SO4干燥并真空蒸干溶剂。残留物经快速柱层析进行纯化(洗脱液：环己烷/丙酮9∶1)，得到17α-乙烯基-5-雄甾烯-3β，17β-二醇，为白色结晶固体。得率：200mg(74％)；m.p.180-183℃；1H NMR(CDCl3)δ：6.01(q，J＝10.99Hz，1H)，5.31(s，1H，)，5.09(t，J＝10.99Hz，2H)，3.47-3.51(m，1H，3a-H)，1.18-2.48(m，21H)，0.99(s，3H)，0.90(s，3H)；13C-NMR(CDCl3)δ：13.95，19.38，20.64，23.65，31.61，32.09，32.58，36.14，37.24，42.22，46.10，49.95，50.31，71.69，84.18，111.87，121.31，140.82，143.02。
3β，17β-二羟基-20，21-环氧-5-雄甾烯
Figure G2008800210996D00191
在-10℃，于17α-乙烯基-5-雄甾烯-3β，17β-二醇(150mg，0.47mmol)的无水二氯甲烷(5mL)溶液中，相继加入乙酰丙酮钒(2.5mg，0.01mmol)和70％的叔丁基氢过氧化物(0.14mL，0.94mmol)。将所得到的混合物在0℃搅拌12h。反应完成后用二氯甲烷稀释混合物，有机相用H2O、饱和Na2SO3和盐水进行萃取，然后用无水Na2SO4干燥，真空蒸干溶剂。残留物经快速柱层析进行纯化(洗脱液：二氯甲烷/乙酸乙酯6∶1)，得到3β，17β-二羟基-20，21-环氧-5-雄甾烯，为白色结晶固体。得率：50mg(32％)；m.p.165-168℃；(C＝0.00113g/mL，CHCl3)；1H NMR(CDCl3)δ：5.35(s，1H)，3.08(t，J＝4.27Hz，1H)，2.87(q，J＝3.05Hz，1H)，2.76(d，J＝3.05Hz，1H)，1.24-2.29(m，19H)，1.02(s，3H3)，0.92(s，3H)；13C NMR(CDCl3)δ：13.91，19.38，20.54，24.04，31.61，32.38，36.01，36.59，37.27，42.22，43.19，45.48，50.11，51.44，51.79，54.83，56.22，71.69，79.68，121.24，140.81。
(20S)-3β，21-二羟基-17β，20-环氧-5-孕烯
Figure G2008800210996D00193
在3β，17β-二羟基-20，21-环氧-5-雄甾烯(40mg，0.12mmol)的无水MeOH(2mL)溶液中加入K2CO3(41mg，0.3mmol)，将所得到的混合物在室温搅拌12小时。反应完成后混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用H2O和盐水进行萃取，然后用无水Na2SO4干燥。真空蒸干溶剂，残留物经快速柱层析进行纯化(洗脱液：二氯甲烷/乙酸乙酯3∶1)，得到(20S)-3β，21-二羟基-17β，20-环氧-5-雄甾烯，为白色结晶固体。得率：32mg(80％)；
Figure G2008800210996D00194
(C＝0.0009g/mL，CHCl3)；1H NMR(CDCl3)δ：5.28(s，1H)，3.63(q，J＝4.27Hz，1H)，3.40-3.49(m，2H)，3.12(q，J＝3.66Hz)，1.36-2.21(m，21H)，0.95(s，3H)，0.81(s，3H)。
实施例3
(20S)-3β-羟基-17β，20-环氧-20-(2-溴乙炔基)-5-雄甾烯的制备
3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-5-雄甾烯-17-酮
Figure G2008800210996D00201
在0℃，向去氢表雄酮(1g，3.47mmol)的无水DMF(20mL)溶液中加入咪唑(591mg，8.981mmol)。将所得到的混合物搅拌30分钟，加入叔丁基-二苯基甲硅烷基氯(2.22mL，8.681mmol)，50℃搅拌过夜进行反应。反应完成后加入20mL饱和NH4Cl，得到的混合物搅拌30分钟，真空蒸干溶剂。在残留物中加入乙酸乙酯，有机相用H2O和盐水进行萃取，然后用无水Na2SO4干燥。真空蒸干溶剂，残留物用EtOH/石油醚在40-60℃进行重结晶。滤去固体后，通过快速柱层析纯化母液(洗脱液：环己烷/EtOAc 95∶5)。得率：1282mg(70％)；1H NMR(CDCl3)δ：7.80-7.74(m，4H)，7.42-7.40(m，6H)，5.22(bs，1H)，3.62(bs，1H)，2.50-0.90(m，19H)，1.14(s，9H)，1.07(s 3H)，0.89(s，3H)。
3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-17α-乙烯基-5-雄甾烯-17β-醇
Figure G2008800210996D00202
在-78℃，向3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-5-雄甾烯-17-酮(861mg，1.635mmol)的无水THF(30mL)溶液中滴加乙烯基溴化镁的1M的THF溶液(16.35mL，16.35mmol)。混合物在-20℃搅拌两小时，然后室温下过夜。将饱和NH4Cl(25mL)倾入反应容器，混合物搅拌30分钟，真空蒸干溶剂。残留物经快速柱层析进行纯化(洗脱液：环己烷/EtOAc 95∶5)，得到3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-17α-乙烯基-5-雄甾烯-17β-醇，得率60％。1H NMR(CDCl3)δ：7.67-7.65(m，4H)，7.39-7.25(m，6H)，6.00(dd，J＝10.98，17.70Hz，1H)，5.14-5.05(m，3H)，3.50-3.46(m，1H)，2.32-0.87(m，19H)，1.05(s，9H)，0.99(s 3H)，0.88(s，3H).
3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-17β-羟基-20，21-环氧-5-雄甾烯
在-10℃，向3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-17α-乙烯基-5-雄甾烯-17β-醇(191mg，0.345mmol)的无水二氯甲烷(3.7mL)溶液中相继加入VO(acac)2(1.95mg，0.021eq.)和t-BuOOH0.2936mL(0.69mmol，于～2.35M 1，2-二氯乙烷溶液中)。反应混合物在0℃搅拌过夜，然后用15mL二氯甲烷稀释，用水、Na2SO3和盐水(1x10mL)洗涤。有机相用无水Na2SO4干燥，真空蒸干溶剂。残留物用快速柱层析进行纯化(洗脱液：石油醚∶二乙醚95∶5)，得到3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-17β-羟基-20，21-环氧-5-雄甾烯。得率：127mg(65％)；1H NMR(CDCl3)δ：7.73-7.69(m，4H)，7.43-7.36(m，6H)，5.17-5.15(m，1H)，3.59-3.53(m，1H)，3.09-3.07(m，1H)，2.89-2.87(m，1H)，2.76-2.73(m，1H)，2.42-2.34(m，1H)，2.21-0.84(m，18H)，1.09(s，9H)，1.04(s，3H)，0.93(s，3H)。
(20S)-3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-21-羟基-17β，20-环氧-5-孕烯
Figure G2008800210996D00211
在室温，向3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-17β-羟基-20，21-环氧-5-雄甾烯(51mg，0.0894mmol)的无水MeOH∶无水THF(1.5∶1.5mL)混合溶液中加入K2CO3(31mg，0.2235mmol)。反应混合物室温搅拌过夜，然后用EtOAc(5mL)稀释，用水和盐水洗涤。有机相用无水Na2SO4干燥，真空蒸干溶剂。残留物经快速柱层析进行纯化(洗脱液：环己烷∶EtOAc 8∶2)，得到(20S)-3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-21-羟基-17β，20-环氧-5-雄甾烯，得率80％。1H NMR(CDCl3)δ：7.69-7.65(m，4H)，7.42-7.33(m，6H)，5.13-5.12(m，1H)，3.76(dd，J＝3.66，12，20Hz，1H)3.58-3.49(m，2H)，3.17(dd，J＝4.27，6.71Hz，1H)，2.37-2.29(m，1H)，2.17-2.11(m，1H)，1.99-0.81(m，17H)，1.05(s，9H)，0.99(s 3H)，0.85(s，3H)。
(20S)-3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-17β，20-环氧-5-雄甾烯-21-羰醛
在0℃，向3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-21-羟基-17β，20-环氧-5-雄甾烯(51mg，0.0894mmol)的无水二氯甲烷(5mL)溶液中加入戴斯-马丁氧化剂(75.8mg，0.1782mmol)。混合物在室温搅拌1小时。反应混合物用二乙醚(10mL)稀释，并用混合的饱和NaHCO3∶饱和Na2S2O3 1∶2(10mL)、饱和NaHCO3(10mL)、和盐水(10mL)进行洗涤。有机相用无水Na2SO4干燥，真空蒸干溶剂。残留物经快速柱层析进行纯化(洗脱液：环己烷∶EtOAc 9∶1)，得到(20S)-3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-17β，20-环氧-5-雄甾烯-21-羰醛。得率46.6mg(98％)。1H NMR(CDCl3)δ：9.26(d，J＝5.49Hz，1H)，7.69-7.67(m，4H)，7.42-7.34(m，6H)，5.14-5.12(m，1H)，3.56-3.51(m，1H)，3.33(d，J＝4.88Hz，1H)，2.37-2.29(m，1H)，2.18-0.86(m，18H)，1.06(s，9H)，0.99(s 3H)，0.91(s，3H)。
3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-17β-羟基-17a-(1，3，3-三溴代烯丙基)-5-雄甾烯
在0℃，向(20S)-3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-17β，20-环氧-5-雄甾烯-21-羰醛(45mg，0.0792mmol)的无水二氯甲烷(2mL)溶液中加入Ph3P(113.8mg，0.434mmol)。0℃搅拌10分钟后加入CBr4(70.78mg，0.213mmol)。反应混合物在0℃搅拌1小时后加入水(1mL)。反应混合物用二氯甲烷进行萃取，有机相用无水Na2SO4干燥，真空蒸干溶剂。残留物经快速柱层析进行纯化(洗脱液：环己烷∶EtOAc98∶2)，得到3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-17β-羟基-17α-(1，3，3-三溴代-烯丙基)-5-雄甾烯。得率32.8mg(52％)；1H NMR(CDCl3)δ：7.68-7.66(m，4H)，7.41-7.36(m，6H)，7.08(d，J＝9.77Hz，1H)，5.11(bs，1H)，4.85(d，J＝10.37Hz，1H)，3.52(bs，1H)，2.43-0.87(m，19H)，1.06(s，9H)，0.99(s 3H)，0.95(s，3H)。
(20S)-3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-17β，20-环氧-20-(2，2-二溴代乙烯基)-5-雄甾烯
Figure G2008800210996D00222
在0℃，向3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-17β-羟基-17a-(1，3，3-三溴代-烯丙基)-5-雄甾烯(32.8mg，0.04136mmol)的无水THF(1mL)溶液中加入TBAF(0.08271mL，1M的THF溶液，0.08271mmol)。在0℃搅拌1分钟后，在此温度向反应中加入水(2mL)。反应混合物用二乙醚进行萃取，有机相用无水Na2SO4干燥，真空蒸干溶剂。残留物足够纯净，可直接用于下一步反应。得率：30mg(定量)；1H NMR(CDCl3)δ：7.69-7.65(m，4H)，7.44-7.33(m，6H)，6.19(d，J＝6.71Hz，1H)，5.14-5.12(m，1H)，3.75(d，J＝6.71Hz，1H)，3.59-3.47(m，1H)，2.38-2.29(m，1H)，2.16-2.10(m，1H)，1.99-1.92(m，1H)，1.79-0.85(m，16H)，1.05(s，9H)，0.99(s 3H)，0.85(s，3H)。
(20S)-3β-羟基-17β，20-环氧-20-(2-溴乙炔基)-5-雄甾烯
Figure G2008800210996D00231
在0℃，向(20S)-3β-(叔丁基二苯基甲硅烷基氧)-17β，20-环氧-20-(2，2-二溴代乙烯基)-5-雄甾烯(30mg，0.04212mmol)的无水THF(1mL)溶液中加入1M的TBAF的THF溶液(0.08424mL，0.08424mmol)。反应在室温搅拌10小时并加入水。反应混合物用二乙醚进行萃取，有机相用无水Na2SO4干燥，真空蒸干溶剂。残留物经快速柱层析进行纯化(洗脱液：环己烷∶EtOAc 98∶2)，得到(20S)-3β-羟基-17β，20-环氧-20-(2-溴乙炔基)-5-雄甾烯。得率：18mg(定量)；1H NMR(CDCl3)δ：5.37(bs，1H)，3.60-3.46(m，1H)，3.47(s，1H)，2.38-0.86(m，19H)，1.02(s，3H)，0.89(s，3H)。
实施例4
3β，21-二羟基-17α，20-环氧-5-孕烯的制备
(3β-羟基-5-雄甾烯-17-亚基)-乙腈
Figure G2008800210996D00232
在0℃，向t-BuOK(4.14mmol，465mg)的无水THF(5mL)溶液中加入二乙基氰基甲基膦酸酯(2.76mmol，0.44mL)，搅拌反应1h。在上述混合物中滴加DHEA(0.69mmol，200mg)的无水THF(5mL)溶液，室温下搅拌混合物直至反应结束。通过加入饱和NH4Cl终止反应，用乙酸乙酯进行萃取，用盐水洗涤有机相，无水Na2SO4干燥，真空蒸干溶剂。残留物经快速柱层析进行纯化(洗脱液：石油醚∶EtOAc 6∶4)，得到上述化合物。得率：175mg(81.5％)。1H NMR(CDCl3)δ：5.28(bs，1H)，5.06(s，0.3H)，4.96(s，0.7H)，3.49-3.41(m，1H)，2.7-0.9(m，19H)，0.99(s，3H)，0.91(s)，0.79(s，3H).13C NMR(CDCl3)δ：180.9，179.2，141.1，140.9，120.9，120.8，117.4，116.6，87.9，87.8，71.3，60.4，55.2，54.1，49.9，46.4，45.9，42.1，37.2，36.5，34.5，32.4，31.5，31.4，30.2，23.8，20.8，20.7，19.4，17.7，16.6。
(3β-羟基-5-雄甾烯-17-亚基)-乙醛
Figure G2008800210996D00241
在-78℃，向3β-羟基-5-雄甾烯-17-亚基)-乙腈(150mg，0.48mmol)的无水二氯甲烷(15mL)溶液中加入DIBAL-H的溶液(1M的二氯甲烷溶液，1.44mmol)，反应混合物在-78℃搅拌30min，室温搅拌5小时。反应混合物用二氯甲烷稀释，并加入Na-K酒石酸盐溶液。有机相用盐水进行萃取，无水Na2SO4干燥，真空蒸干溶剂。残留物经快速柱层析进行纯化(洗脱液：石油醚∶丙酮8∶2)，得到上述化合物。得率：151mg(93％)。1H NMR(CDCl3)δ：10.02(d，J＝8.54Hz，0.63H)，9.74(d，J＝7.93，0.37H)，5.74-5.71(m，0.63H)，5.67-5.64(m，0.37H)，5.25-5.21(m，1H)，3.44-3.39(m，1H)，2.89-0.93(m，19H)，0.99(s)和0.93(s)和0.78(s)(所有的三个6H)；13CNMR(CDCl3)δ：192.4，190.7，180.5，179.4，140.9，124.0，120.8，119.3，71.2，65.0，55.6，53.3，50.1，49.4，46.9，46.3，42.0，38.6，37.1，36.6，36.5，36.4，34.7，33.5，31.5，31.3，27.7，24.3，23.9，21.3，20.8，19.3，18.8，17.8。
17-(2-羟基-亚乙基)-5-雄甾烯-3β-醇
Figure G2008800210996D00242
向3β-羟基-5-雄甾烯-17-亚基)-乙醛(0.24mmol，75mg)的MeOH(2.5mL)溶液中相继加入CeCl3.7H2O(0.24mmol，89mg)和NaBH4(0.24mmol，10mg)。反应完成后加入饱和NH4Cl至pH 7。混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用盐水进行萃取，无水Na2SO4干燥，真空蒸干溶剂。残留物经快速柱层析进行纯化(洗脱液：石油醚∶丙酮8∶2)，得到上述化合物。得率：70mg(92％)。
1H NMR(CDCl3)δ：5.36-5.24(m，2H)，4.33-3.99(m，2H)，3.42-3.39(m，1H)，2.4-0.9(m，19H)，1.02(s)和0.94(s)(均为3H)，0.90(s)和0.77(s)均为3H。
3β，21-二羟基-17α，20-环氧-5-孕烯
向17-(2-羟基-亚乙基)-5-雄甾烯-3β-醇(0.22mmol，70mg)的无水二氯甲烷(2.2mL)溶液中加入K2CO3(0.26mmol，36mg)和间氯过氧苯甲酸55％(0.22mmol，61mg)，室温下搅拌混合物至反应完成。过滤固体，真空蒸干滤出液，用快速柱层析进行纯化(洗脱液：石油醚∶乙酸乙酯1∶1)，得到上述化合物，得率75％。
1H NMR(CDCl3)δ：5.36-5.34(m，1H)，3.90-3.53(m，3H)，3.15-3.11(m，1H)，2.4-0.9(m，19H)，0.99(s，3H)，0.83(s，3H).
实施例5
3β，22-二羟基-17β，21-氧杂环丁基-5-孕烯的制备
17α-烯丙基--5-雄甾烯-3β，17β-二醇
Figure G2008800210996D00251
在0℃，向3β-乙酰-5-雄甾烯-17-酮(200mg，0.6mmol)的无水四氢呋喃(4mL)溶液中滴加烯丙基溴化镁溶液(1.7M的四氢呋喃溶液，3.52mL，6mmol)，将所得到的混合物在室温搅拌12h。反应完成后加入饱和氯化铵，得到的混合物用乙酸乙酯进行萃取。用盐水洗涤有机相，然后用无水Na2SO4干燥并真空蒸干溶剂。残留物经快速柱层析进行纯化(洗脱液：环己烷/乙酸乙酯85∶15)，得到17α-烯丙基-5-雄甾烯-3β，17β-二醇，为白色结晶固体。得率：190mg(95％)。
3β，17β-二羟基-21，22-环氧-5-雄甾烯
Figure G2008800210996D00252
在-10℃，向17α-烯丙基-5-雄甾烯-3β，17β-二醇(190mg，0.57mmol)的无水二氯甲烷(6mL)溶液中相继加入乙酰丙酮钒(6.6mg，0.025mmol)和70％的叔丁基氢过氧化物(0.74mL，1.7mmol)。将所得到的混合物在0℃搅拌12h。反应完成后混合物用二氯甲烷稀释，有机相用H2O、饱和Na2SO3和盐水进行萃取，然后用无水Na2SO4干燥，然后真空蒸干溶剂。残留物经快速柱层析进行纯化(洗脱液：二氯甲烷/乙酸乙酯6∶1)，得到3β，17β-二羟基-20，21-环氧-5-雄甾烯，为白色结晶固体。得率：69mg(35％)；1HNMR(CDCl3)δ：5.35(bs，1H)，3.53(m，1H)，3.26(m，1H)，2.84-2.97(m，1H)，2.52-2.49(m，1H)，2.28-1.01(m，H)，1.02(s，3H)，0.90和0.89(s，3H)。
3β，22-二羟基-17β，21-氧杂环丁基-5-孕烯
Figure G2008800210996D00261
向3β，17β-二羟基-21，22-环氧-5-雄甾烯(40mg，0.12mmol)的无水亚甲基氯(12mL)溶液中加入p-TsOH(0.6mmol，114mg)，将所得到的混合物在室温下搅拌12小时。反应完成后滤去固体，真空蒸干滤出液。残留物经快速柱层析进行纯化，得到目标的17-螺环-环氧丙烷衍生物。
实施例6
17β-螺环-[3β-羟基-5-雄甾烯-17，2’-环氧基-7-亚基氨基氧]-乙酸的制备
Figure G2008800210996D00262
在0℃，向去氢表雄酮-7-羧甲基肟(20mg，0.052mmol)的无水DMF(0.5mL)溶液中加入三甲基碘化锍(32mg，0.16mmol)和叔-BuOK(18mg，0.16mmol)，将所得到的混合物在室温搅拌10小时。反应完成后加入水，溶液使用稀HCl酸化至pH 5，得到的混合物用二氯甲烷进行萃取。用盐水洗涤有机相，然后用无水Na2SO4干燥并真空蒸干溶剂。残留物经快速柱层析进行纯化(洗脱液：石油醚40°-60℃/丙酮8∶2)，得到标题的化合物。
实施例7
合成螺环神经甾体在保护神经嵴衍生的PC12细胞抗去血清诱导的细胞凋亡中的应用
方法
在5％CO2、37℃，在含有2mM L-谷氨酰胺、15mM HEPES、100单位/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、10％马血清和5％胎牛血清的RPMI 1640培养基中维持神经嵴衍生的PC12细胞。无血清培养基补充有1％牛血清白蛋白(BSA)。以不同浓度使用的不同甾体最初在乙醇中稀释。在包括对照的每个孔中乙醇终浓度为0.01％。缀合物DHEA-BSA最初在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释。
细胞在无血清条件下培养12小时，补加10nM的DHEA和各种合成螺环神经甾体。细胞凋亡通过两种不同方法进行定量：根据制造商的使用说明书，APOPercentage细胞凋亡分析(Biocolor Ltd.，Belfast，N.Ireland)用来定量细胞凋亡。通过使用滤色器微板比色计，在550nm(参考滤光片620nm)处测量掺入凋亡细胞中的染料，从而在细胞裂解后定量细胞凋亡(DynatechMicroElisa reader，Chantilly，VA)(见图1和2)。FACS分析：根据我们的方案进行凋亡细胞的FACS分析(Proc Natl Acad Sci USA 101，8209(2004))。采用FACScan(Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)进行流式细胞术，结果使用FACScan和Cell Quest软件进行分析(见图3)。
如ApoPercentage分析结果所示(图1)，与补充血清的细胞培养相比，PC12细胞在无血清条件下的培养产生了强的细胞凋亡诱导。DHEA、非渗透性DHEA-BSA缀合物和螺环神经甾体逆转了去血清诱导的细胞凋亡几乎50％，保护PC12细胞免于细胞凋亡，其IC50为0.15nM(图2)。合成的17-螺环神经甾体还表现出强的抗细胞凋亡、细胞保护效应，对于BNN-50、BNN-93和BNN-124，分别具有0.088、4.16和68.4nM的IC50(图2)。合成螺环神经甾体的抗细胞凋亡效应同样为FACS分析所证实(图3)。
实施例8
通过在神经嵴衍生的PC12细胞中诱导神经保护和抗细胞凋亡的Bcl-2蛋白来研究合成螺环神经甾体的神经保护和抗细胞凋亡效应
方法
在无血清但补充有10nM不同的神经甾体的条件下培养神经嵴衍生的PC12细胞8小时。温育结束时，通过12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶对细胞裂解物进行电泳。然后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，按照标准的蛋白质印迹步骤进行处理。为检测蛋白水平，将膜与合适的抗体：Bcl-2(Santa CruzBiotechnology Inc.，Santa Cruz，CA，稀释度1∶100)、Bcl-xL(Cell SignallingTechnology Inc.，Beverly，MA，稀释度1∶100)进行温育。使用基于PC的图像分析程序来定量每条带的强度(Image Analysis，Inc.，Ontario，Canada)。为归一化蛋白含量，剥下印迹并用抗肌动蛋白抗体(Chemicon，Temecula，CA，稀释度1∶400)染色；对肌动蛋白归一化每一靶蛋白的浓度。
这些实验的结果如图4所示。PC12细胞的去血清(SF)引起了抗细胞凋亡的Bcl-2和Bcl-xL蛋白的强抑制水平。DHEA和所有三种合成螺环神经甾体(BNN-50、BNN-93和BNN-124)早在12h即可阻止该效应，其水平可以与那些血清补充物(S)相比。
实施例9
在结合到DHEA特异性膜受体上之后，合成螺环神经甾体的神经保护、抗细胞凋亡效应研究
方法
在225cm2培养瓶中培养PC12大鼠交感肾上腺细胞，并在用PBS洗涤两次后，通过剧烈摇动将它们与培养瓶分离。在1500g离心后，通过超声处理均质化细胞，该均质化过程在4℃于50mM Tris-HCl缓冲液pH 7.4中进行，缓冲液包含新鲜添加的蛋白酶抑制剂(1mM PMSF和1μg/ml抑肽酶)。在1500g离心(10min，4℃)除去未破裂的细胞，通过在4℃于102,000g离心1hr收集细胞膜。细胞膜用Tris-HCl洗涤一次，用50mM甘氨酸(pH 5.0)在4℃简单进行酸化(持续3min)，重悬于相同的缓冲液中。通过Bradford方法测定蛋白含量，其中使用了来自Bio-Rad(Hercules，CA)的试剂。在Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 7.4)中，在10-12-10-6M浓度和100μl终体积的未标记的神经甾体及它们的合成螺环类似物不存在(测定总结合)或存在下，将细胞膜(终浓度为2mg/ml)与5nM[3H]DHEA温育。在37℃水浴中温育30min后，在于4℃用0.5％PEI溶液中预湿的GF/B滤纸上收集细胞膜。使用冰预冷的Tris-HCl洗涤滤纸三次，干燥，补充闪烁介质(Sigma Hellas，Athens，Greece)，并在对于氚具有60％效率的β-闪烁计数器(Perkin Elmer，FosterCity，CA)上计数。
结果如图5所示。未标记的DHEA以1.1nM的KD与[3H]DHEA竞争结合分离的PC12细胞膜。在1μM下获得了几乎完全的竞争(图5)。证实了合成螺环神经甾体BNN-50、BNN-93和BNN-124的明显取代(1μM下大约60％的特异性结合)，分别具有0.016、11.2和0.33nM的表观KD，表明所有三种合成神经甾体与细胞膜DHEA结合的强相互作用。
实施例10
合成螺环神经甾体用于刺激来自多巴胺能神经嵴衍生细胞的多巴胺的产生和分泌的研究
方法
在包被聚-L-赖氨酸的6-孔板中培养多巴胺能神经嵴衍生的PC12细胞，浓度为106个细胞/孔。将细胞与神经甾体或载体温育不同的时间期限；对于短期实验，温育时间为5-30分钟，对于长期实验则为3-48小时。将1mL上清液转移到含有200μl 0.1M HCl的试管中用于测定多巴胺，通过使用125I作为示踪剂的放射性免疫测定(TriCatTM RIA，RE29395，IBL Immuno BiologicalLab.，Hamburg，Germany)进行该测定。该方法的分析灵敏度为30pg/ml，其批内分析CV是9.5％，批间分析CV是16.7％。多巴胺和去甲肾上腺素的交叉反应性＜0.013％。
酪氨酸羟化酶(TH)RT-PCR：使用Trizol试剂(Invitrogen Lifetechnologies，CA)从多巴胺能PC12细胞中提取总RNA。通过总体积20μl的使用随机六聚体的Thermo-Script RT-PCR System(Invitrogen)反转录1微克总RNA。将通过PCR扩增的2微升RT产物用作模板，该PCR使用了2mMMgCl2、单强度PCR缓冲液、0.2mM的正义和反义引物、0.2mM dNTPs和2.5U AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Perkin Elmer ABD，Foster City，CA)，反应终体积为50μl。PCR在Perkin Elmer DNA热循环仪中进行。用于TH的引物是5′-TCGCCACAGCCCAAGGGCTTCAGAA-3′(正义)，和5-CCTCGAAGCGCACAAAATAC-3(反义)；用于G3PDH的引物是5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′(正义)，和5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′(反义)。通过MWG-Biotech AG(Munich，Germany)合成寡核苷酸。反转录后，通过33轮循环的PCR扩增cDNA产物。选择循环数(33)，使得产物的扩增处于相对于输入cDNA量的线性范围内。平行进行对于G3PDH的PCR，以确保RNA和cDNA制备的良好品质。每一循环由92℃60s变性、53℃120s退火、和72℃180s延伸组成(对于G3PDH分别为98℃60s变性、55℃90s退火、和72℃150s延伸)。在2％琼脂糖凝胶上分离10μl扩增产物(对于TH，368bp，和对于G3PDH，983bp)，并通过溴乙啶染色观测。
将多巴胺能PC12细胞暴露于DHEA或合成螺环神经甾体BNN-50和BNN-93(10-7M)，持续一段短时间(5-30min)，并如上所述使用放射性免疫测定法测量培养基中的多巴胺浓度。所有三种受试甾体都引起了快速且统计学上显著的多巴胺分泌刺激，在10min内它们在培养基中的水平翻倍(见图6A)。我们还检测了甾体的长期效应。更具体地说，将PC12细胞与DHEA或合成螺环神经甾体BNN-50和BNN-93(10-7M)温育3-48小时，并测定培养基中的多巴胺浓度。PC12细胞与DHEA或合成螺环神经甾体的温育引起了多巴胺水平的增加，在24h时出现峰值(见图6B)。DHEA和合成神经甾体的这些长期效应暗示它们除对于多巴胺分泌具有急性效应(图6A)之外，还能够影响多巴胺能神经元中的多巴胺的重新合成。实际上，所有三种神经甾体都强烈诱导了多巴胺生物合成中的限速酶--酪氨酸羟化酶的mRNA(见图6C)。
实施例11
合成螺环神经甾体的神经源性
方法
在EGF和bFGF(各20ng/ml终浓度)存在或不存在下，在无血清培养基中，将来自野生型小鼠的原发性外皮神经球(21d)附着于PLL和层粘连蛋白包被的盖玻片上进行培养。为了进行筛选，培养基补充有乙醇、视黄酸(at-RA)、DHEA、或合成螺环神经甾体BNN-93，终浓度10-7M。
在24-48hr的培养过程中，与其它化合物和乙醇对照相比，补充有BNN-93和DHEA的神经球显示神经细胞向神经球边缘大量迁移(见图7)。该效应似乎是EGF/bFGF依赖的。到第6天，所有培养的神经球在盖玻片上均显示相同程度的神经细胞迁移。在培养的第1天迁移程度大部分是正常的，因为在大多数情况下细胞迁移出球体，到达边缘。照片所显示(图7)的是在培养第6天得到的，其中迁移效应并不是如此引人注目，但还是很明显。另外，将分离自小鼠胎脑的神经祖细胞暴露于100nM的BNN-93或载体(对照)24小时。BNN-93刺激了神经发生和祖细胞向神经细胞的分化，扩展至神经突形成(见图8，箭头)。
实施例12
合成螺环神经甾体的雌激素性质
使用17β-雌二醇(E2)进行绝经后综合症的治疗伴随有发展成乳腺癌和/或子宫内膜癌症(Arch Intern Med.166，1027(2006))的较高风险。雌激素受体α(ERα)驱动了癌细胞的E2刺激增殖(Mol Endocrinol.13，969(1999))。由于BNN-50、BNN-93和BNN-124能够形成具有10.9 12.5
Figure G2008800210996D00311
的O O间距的两个氢键，可能符合ERα结合空穴(Chem.Biol.11，397(2004))，因此有必要使用来自人乳腺(MCF-7细胞)和子宫(Ishikawa细胞)的腺癌细胞作为报告物，来调查这些神经甾体的雌激素激动/拮抗性质。将完全雌激素激动(E2≥0.1nM)和非激动(仅载体)对照用于分类神经甾体，根据其雌激素效力是否是E2(设定为100)的＞100、76-100、26-75、10-25和1-10％，从而将其分为超、完全、部分、弱和临界级别的激动剂。类似地，将ICI 182，780(≥10nM)对E2(0.1nM)作用的完全拮抗和非拮抗(仅载体)对照用作分类神经甾体，根据其抑制E2作用是否是ICI 182，780的76-100、26-75、10-25和1-10％，从而将其分为完全、部分、弱和临界级别的拮抗剂。使用单向方差分析(one-way AN0VA)评估对照组和神经甾体治疗的细胞之间的差异。可接受的显著性值为p＜0.05。
方法
为确定神经甾体对MCF-7人乳腺细胞(来自ATCC)和Ishikawa子宫内膜腺癌细胞(来自ECACC)生长的影响，在37℃，在5％CO2下补充有10％胎牛血清(FBS，来自Biochrom)的Dulbecco氏最低必需培养基(DMEM)中培养细胞，并使用胰蛋白酶0.25％-EDTA 0.02％溶液进行传代培养。使用MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴盐]和标准方法(Chem.Biol.11，397(2004))评估神经甾体对细胞生长的影响。简言之，将细胞以10,000个细胞/孔的密度置于96-孔平底微量培养板中，在补充有1％葡聚糖包被的活性炭处理的FBS(DCC-FBS)的无酚红培养基中进行培养。24小时后，添加连续稀释的受试化合物(起初稀释于DMSO中，进一步稀释于培养基中)，每48小时添加含有受试化合物的新鲜培养基，6天后移除培养基，并在无血清、无酚红的培养基中，将细胞与1mg/ml MTT(来自Sigma)温育4小时。将产生的MTT-甲臜溶解于异丙醇中，并通过使用Safire酶标仪(来自Tecan)监测相对于690nm其在550nm下的吸光度从而进行测量。将只接触培养基的细胞用作非激动对照，而那些用ICI 182，780(来自Tocris)和/或E2(来自Sigma)处理的细胞则分别作为完全拮抗和激动对照。
为确定神经甾体对Ishikawa细胞的E2诱导的碱性磷酸酶活性的影响--一种从天然和大量生产的化学品中检测E2激动剂/拮抗剂的非常灵敏的方法(Planta Med.72，488(2006))，如上所述进行细胞的培养和传代培养。然后以12,000个细胞/孔的密度将细胞置于96-孔平底微量培养板中，在补充有5％的DCC-FBS的无酚红培养基中进行培养。24小时后，添加新鲜培养基，然后加入受试化合物(起初稀释于DMSO中，进一步稀释于培养基中)，细胞培养72h，然后用PBS洗涤，将板倒置，轻轻在纸巾上吸干，置于-80℃至少15min，室温解冻5-10min，然后转移到冰上。接着，加入50μl含5mM对-硝基苯基磷酸酯、0.24mM MgCl2和1M二乙醇胺(pH 9.8)的冰冷溶液，将细胞加热至室温(计时起点)，使黄色的对-硝基苯酚随时间而积累。将只接触培养基的细胞用作非激动对照，而那些用ICI 182，780和/或E2处理的细胞则分别作为完全拮抗和激动对照。使用Safire酶标仪在405nm处每30min监测颜色，直至阳性对照显示约1.2的吸光度(A405)。螺环神经甾体在不同检测系统中的雌激素激动/拮抗特性报道于表1。
表1：BNN-50的雌激素激动/拮抗
  雌激素响应  E2激动(在1uM下)   E2拮抗(在1uM下)
  MCF-7细胞生长   不显著   不显著
  Ishikawa细胞生长   不显著   不显著
  Ishikawa AlkP   不显著   临界
实施例13
合成螺环神经甾体对神经生长因子受体TrkA和p75NTR的结合、激活或抑制能力的研究
方法
用神经生长因子(NGF)的高亲和力和低亲和力受体--TrkA和p75NTR的cDNA转染HEK293细胞(Ann Rev Biochem 72：604，2003)。在烧瓶中培养表达两种NGF受体亚型的转染子，在用PBS洗涤两次后，将它们从烧瓶上分离下来。在1500g离心后，通过超声处理均质化细胞，该均质化过程在4℃于50mM Tris-HCl缓冲液pH 7.4中进行，缓冲液包含新鲜添加的蛋白酶抑制剂(1mM PMSF和1μg/ml抑肽酶)。在1500g离心(10min，4℃)除去未破裂的细胞，通过在4℃于102,000g离心1hr收集细胞膜。细胞膜用Tris-HCl洗涤一次，用50mM甘氨酸(pH 5.0)在4℃简单进行酸化(持续3min)，重悬于相同的缓冲液中。通过Bradford方法测定蛋白含量，其中使用了来自Bio-Rad(Hercules，CA)的试剂。在Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 7.4)中，在10-12-10-6M浓度和100μl终体积的未标记的BNN-124不存在(测定总结合)或存在下，将细胞膜(终浓度为2mg/ml)与5nM[3H]DHEA温育。在37℃水浴中温育30min后，在于4℃用0.5％PEI溶液中预湿的GF/B滤纸上收集细胞膜。使用冰预冷的Tris-HCl洗涤滤纸三次，干燥并在对于氚具有60％效率的β-闪烁计数器(Perkin Elmer，Foster City，CA)上计数。
结果如图9所示。未标记的BNN-124与[3H]DHEA竞争结合表达TrkANGF受体的HEK293TrkA细胞的分离的细胞膜。该结合的亲和力为KD：0.29nM，即类似于NGF。类似地，未标记的BNN-124与[3H]DHEA竞争结合表达p75NTR NGF受体的HEK293p75NTR细胞的分离的细胞膜。该结合的亲和力为KD：1.0nM，即类似于NGF。在用不含TrkA cDNA的载体转染的或不转染的HEK293细胞中没有表现出结合。此外，使用不能渗透的DHEA-BSA-荧光素缀合物膜，显示了转染TrkA cDNA的HEK293细胞的膜染色。这些发现表明合成螺环神经甾体与细胞膜NGF受体之间存在强结合和相互作用。
在无血清但补充有10nM合成神经甾体的20ng/ml的NGF溶液的条件下培养神经嵴衍生的PC12细胞8小时。温育结束时，通过12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶对细胞裂解物进行电泳。然后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，按照标准的蛋白质印迹步骤进行处理。为检测蛋白水平，将膜与合适的抗体：Bcl-2(Santa Cruz Biotechnology Inc.，Santa Cruz，CA，稀释度1∶100)、磷酸化的ERK1/2(Cell Signalling Technology Inc.，Beverly，MA，稀释度1∶100)进行温育。为归一化蛋白含量，剥下印迹并用抗肌动蛋白或抗总ERK1/2抗体(Chemicon，Temecula，CA，稀释度1∶400)染色。
在去血清的PC12细胞中，在诱导抗细胞凋亡的Bcl-2蛋白和ERK1/2激酶磷酸化方面，BNN-124的表现与NGF相似。事实上，10nM的BNN-124和20ng/ml的NGF对于Bcl-2和ERK1/2产生了相同的效果(图9)。Bcl-2通过NGF激活将神经元从细胞凋亡中拯救出来，该效应是由ERK1/2激酶信号传导的磷酸化激活所介导的。

Claims (28)

1.一种组合物，包含作为活性成分的至少一种式I所示的化合物或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐；以及药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂
Figure F2008800210996C00011
其中
R1是羟基、烷氧基、烷酰氧基、氨基羰酰氧基或烷氧基羰酰氧基；
R2是氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的烷氧基烷基、任选取代的氨烷基、氰基、任选取代的氰烷基、任选取代的硫氰烷基、异硫氰基、任选取代的叠氮烷基、任选取代的烷酰氧烷基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基烷基、任选取代的芳基烯基、任选取代的杂芳基烯基、任选取代的芳基、任选取代的芳基炔基、任选取代的芳基烷基炔基、任选取代的烷酰氧炔基、任选取代的杂芳基氧基炔基、任选取代的酮炔基或其缩酮、任选取代的氰基炔基、任选取代的杂芳基炔基、任选取代的羟基炔基、任选取代的烷氧基炔基、任选取代的氨基炔基、任选取代的酰氨基炔基、任选取代的巯基炔基、任选取代的羟基炔基二酸半酯或其盐、或任选取代的炔氧基炔基；
或
R1是氧，且R2是烷基或烯基或炔基，其与R1键合形成可被任选取代的氧化环；
R3是氢，或当甾环系统的C5和C6之间存在双键时，R3不存在；
R4是氢或低级烷基；
R5是氢、氨基、任选取代的烷基氨基、任选取代的二烷基氨基、任选取代的烯基氨基、任选取代的二烯基氨基、任选取代的炔基氨基、任选取代的二炔基氨基、氨基、硫代、亚磺酰基、磺酰基、亚磺酰氨基、卤素、羟基、任选取代的烷氧基、任选取代的烯基氧基、任选取代的炔基氧基烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基、叠氮基、任选取代的杂芳基、肟＝N-O-R8、羧甲基肟、羧乙基肟、或羧丙基肟；
R6是氢、氨基、硫代、亚磺酰基、磺酰基、亚磺酰氨基、卤素、羟基、任选取代的烷氧基、任选取代的烷基、任选取代的烯基、或任选取代的炔基；
R7是氢、氨基、任选取代的烷基氨基、任选取代的二烷基氨基、任选取代的烯基氨基、任选取代的二烯基氨基、任选取代的炔基氨基、任选取代的二炔基氨基、氨基、硫、亚磺酰基、磺酰基、亚磺酰氨基、卤素、羟基、任选取代的烷氧基、任选取代的烯基氧基、任选取代的炔基氧基烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基、叠氮基、任选取代的杂芳基、肟＝N-O-R8、羧甲基肟、羧乙基肟、或羧丙基肟；
X是化合价键，亚甲基(-CH2-)或选自氧、硫的杂原子，或-NH、-S(O)、-SO2、-NR8、-NC(O)R8、-N-甲苯-4-磺酰基氧；
A是-(CH2)n-、C2-5亚烯基、或C2-5亚炔基，其中n是整数，且可取值为0或1或2或3或4或5；
B是-(CH2)y-、C2-5亚烯基、或C2-5亚炔基，其中y是整数，且可取值为1或2或3或4或5；
Y可键合到甾体骨架C17处螺环取代基的任何碳原子上，且独立地是H、任选取代的C1-10烷基、任选取代的稠双环系统、任选取代的桥双环系统、任选取代的桥三环系统、任选取代的C2-10烯基、任选取代的C2-10炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基烷基、甲酰基、羧基、-NC(O)R8、NC(S)R8、-NR8R9、任选取代的C(O)-W、任选取代的C(O)O-W、或任选取代的C(S)O-W；
Z可键合到甾体骨架C17处螺环取代基的任何碳原子上，且独立地是H、任选取代的C1-10烷基、任选取代的稠双环系统、任选取代的桥双环系统、任选取代的桥三环系统、任选取代的C2-10烯基、任选取代的C2-10炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基烷基、甲酰基、羧基、-NC(O)R8、NC(S)R8、-NR8R9、任选取代的C(O)-W、任选取代的C(O)O-W、任选取代的C(S)O-W；
Y和Z可键合到C17处螺环取代基的同一碳原子上；
W是任选取代的C1-10烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的稠双环系统、任选取代的桥双环系统、任选取代的桥三环系统、任选取代的C2-10烯基、任选取代的杂环烯基、任选取代的C2-10炔基、任选取代的杂环炔基、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基；
R8和R9独立地是任选取代的C1-10烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的稠双环系统、任选取代的桥双环系统、任选取代的桥三环系统、任选取代的C2-10烯基、任选取代的杂环烯基、任选取代的C2-10炔基、任选取代的杂环炔基、任选取代的芳基、或任选取代的杂芳基；
以及点线表示可能存在的单键或双键。
2.根据权利要求1的组合物，其中X是氧原子。
3.根据权利要求1的组合物，其中X是亚甲基。
4.根据权利要求1的组合物，其中X是-NH。
5.根据前述权利要求任一项的组合物，其中甾环系统的C5和C6之间存在双键，从而R3不存在。
6.根据前述权利要求任一项的组合物，其中R1＝OH；R2＝R5＝R6＝R7＝Y＝H且R4＝Me。
7.根据权利要求1-4任一项的组合物，其中R1＝OH；R2＝R5＝R6＝R7＝Y＝H，A＝-(CH2)n-，B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；甾环系统的C5和C6之间存在双键，从而R3不存在；R4＝Me；n＝0且y＝1。
8.根据权利要求1的组合物，其中式I的化合物选自下述化合物，包括其药学上可接受的酯、盐及酸加成盐：
17β-螺环-[5-雄甾烯-17，2’-环氧基]-3β-醇；
(20S)-3β，21-二羟基-17β，20-环氧-5-孕烯；
(20S)-3β-羟基-17β，20-环氧-20-(2-溴乙炔基)-5-雄甾烯；
3β，21-二羟基-17α，20-环氧-5-孕烯。
9.一种如权利要求1中定义的式I所示的化合物，或其药学上可接受的酯、盐及酸加成盐；
但不包括以下式I的化合物，其中：
1)R1＝OH；R2＝R5＝R6＝R7＝Y＝Z＝H，A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；双键位于甾环系统的C5和C6之间，从而R3不存在；R4＝Me；X＝O，n＝0且y＝1；
2)R1是羟基或烷氧基；R2＝R5＝R6＝R7＝Y＝Z＝H，A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；双键位于甾环系统的C5和C6之间，从而R3不存在；R4＝Me；X＝O，n＝0且y＝3；其中X位于17β-位；
3)R1＝OH；R2＝R5＝R6＝R7＝Y＝Z＝H，A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；双键位于甾环系统的C5和C6之间，从而R3不存在；R4＝Me；X＝O，n＝0且y＝4；其中X位于17β-位；
4)R1是羟基或烷酰氧基；R2＝R5＝R6＝R7＝H，A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；双键位于甾环系统的C5和C6之间，从而R3不存在；R4＝Me；X＝-CH2-，Y和Z独立地是H或C1-C7烷基，n＝0且y＝1；
5)R1＝OAc；R2＝R5＝R6＝R7＝Z＝H，A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；R3＝H，或不存在，且甾环系统的C5和C6之间存在双键；R4＝Me；X＝O，Y＝2-吡啶基，n＝0且y＝1；
6)R1＝OH；R2＝R5＝R6＝R7＝Z＝H；Y＝CH3；A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；双键位于甾环系统的C5和C6之间，从而R3不存在；R4＝Me；X＝-NH-，n＝0且y＝1；其中X位于17β-位；
7)R1＝OH；R2＝R5＝R6＝Y＝Z＝H；R7＝OH；A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；双键位于甾环系统的C5和C6之间，从而R3不存在；R4＝Me；X＝O，n＝0且y＝1；其中R1位于11α-位，且X位于17α-位；
8)R1＝OAc；R2＝R3＝R5＝R6＝R7＝Z＝H，A＝-(CH2)n-和B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；甾环系统的C5和C6之间不存在双键；R4＝Me；X＝O，Y＝-CH2OAc，n＝0且y＝1；以及
9)R1＝OAc；R2＝R5＝R6＝R7＝Z＝H，A＝-(CH2)n-且B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；双键位于甾环系统的C5和C6之间，从而R3不存在；R4＝Me；X＝O，Y＝-C≡CH或-C≡C-SiMe3，n＝0且y＝1；其中X位于17β-位。
10.根据权利要求7的化合物，其中X是氧原子。
11.根据权利要求7的化合物，其中X是亚甲基。
12.根据权利要求7的化合物，其中X是-NH。
13.根据权利要求9-12任一项的化合物，其中甾环系统的C5和C6之间存在双键，从而R3不存在。
14.根据权利要求9-13任一项的化合物，其中R1＝OH；R2＝R5＝R6＝R7＝Y＝H且R4＝Me。
15.根据权利要求9-12任一项的化合物，其中R1＝OH；R2＝R5＝R6＝R7＝Y＝H，A＝-(CH2)n-，B＝-(CH2)y-；甾环系统的C1和C2之间不存在双键；甾环系统的C5和C6之间存在双键，从而R3不存在；R4＝Me；n＝0且y＝1。
16.根据权利要求9的化合物，其选自以下一种化合物，包括其药学上可接受的酯、盐及酸加成盐：
(20S)-3β，21-二羟基-17β，20-环氧-5-孕烯；
(20S)-3β-羟基-17β，20-环氧-20-(2-溴乙炔基)-5-雄甾烯；
3β，21-二羟基-17α，20-环氧-5-雄甾烯。
17.一种预防或治疗与神经元细胞凋亡或神经元损伤相关的神经变性病症的方法，包括对患者施用有效量的如权利要求1-8任一项定义的式I的化合物，或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐。
18.根据权利要求17的方法，其中所述病症选自阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(ALS)、视网膜变性、视网膜脱离、由遗传异常导致的周围神经病变、糖尿病、脊髓灰质炎、疱疹、艾滋病、脑外伤、局部缺血和中风。
19.如权利要求1-8任一项定义的式I的化合物，或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐，用于治疗。
20.如权利要求1-8任一项定义的式I的化合物，或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐，用于预防或治疗与神经元细胞凋亡或神经元损伤相关的神经变性病症中。
21.如权利要求1-8任一项定义的式I的化合物，或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐，用于预防或治疗阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(ALS)、视网膜变性、视网膜脱离、由遗传异常导致的周围神经病变、糖尿病、脊髓灰质炎、疱疹、艾滋病、脑外伤、局部缺血或中风、或其它任何导致中枢或周围神经系统的神经细胞变性和/或细胞凋亡的病症中。
22.如权利要求1-8任一项定义的式I的化合物，或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐在制造用于预防或治疗与神经元细胞凋亡或神经元损伤相关的神经变性病症的药物中的应用。
23.如权利要求1-8任一项定义的式I的化合物，或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐在制造用于预防或治疗阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(ALS)、视网膜变性、视网膜脱离、由遗传异常导致的周围神经病变、糖尿病、脊髓灰质炎、疱疹、艾滋病、脑外伤、局部缺血或中风、或其它任何导致中枢或周围神经系统的神经细胞变性和/或细胞凋亡的病症的药物中的应用。
24.如权利要求1-8任一项定义的式I的化合物，或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐在控制神经干细胞和神经祖细胞于包括中枢神经系统和周围神经系统的不同器官和组织中增殖、分化、迁移和再生中的应用。
25.如权利要求1-8任一项定义的式I的化合物，或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐在控制上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、淋巴样细胞、红细胞系细胞和单核细胞增殖、分化、迁移和再生中的应用。
26.如权利要求1-8任一项定义的式I的化合物，或其药学上可接受的酯、盐或酸加成盐在通过结合、激活或抑制包括TrkA和p75NTR受体的神经生长因子(NGF)受体用于预防、改善或治疗NGF相关的病症或疾病中的应用。
27.一种基本上如在此任一实施例中所描述的如权利要求1中定义的式I的化合物，但不包括17β-螺环-[5-雄甾烯-17，2’-环氧基]-3β-醇。
28.一种制备基本上如在本说明书任一实施例中所描述的如权利要求1中定义的式I的化合物的方法。
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