JP5698974B2 - ニューロステロイド化合物 - Google Patents

Description

本発明は、内分泌作用はないが、強い抗アポトーシス特性、神経保護特性および神経原性特性を持つスピロニューロステロイドアナログを含むニューロステロイド化合物と、以下に限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、網膜変性および網膜剥離などの神経変性疾患の症状の処置、予防または寛解、ならびに良性健忘症、および老年認知症に見られたり、神経変性疾患に関連して見られたりする記憶障害の軽減におけるその使用とに関する。非限定的な例として、このステロイド化合物の、神経系に対する直接作用が示される。さらに、これらニューロステロイド化合物は、ニューロパチー、特に、遺伝子異常，さらには、糖尿病，ポリオ，疱疹，ＡＩＤＳ，化学療法，脳外傷，または虚血と脳卒中等の他の状態によって引き起こされる末梢神経障害の処置に適応がある。

本明細書で神経変性という語を使用した場合、それは、加齢と、以下に限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症およびハンチントン病などの神経変性障害と、脳卒中、頭部脊椎外傷とで起こる神経細胞の進行性消失をいう(Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 1, 120 (2000))。主として、こうした疾患は、脳または末梢神経の限局された部位でのニューロンの慢性かつ進行的な消失を特徴とし、認知症、記憶喪失、感覚または運動能力の喪失、生活の質および健康状態の全体的な低下、機能障害などの衰弱性症状の原因となり、最終的に若年死を引き起こす。ほとんどの神経変性疾患では、処置法がほとんどないか、まったくないのが現状であり、せいぜい対症的性格の療法であり、疾患の進行を予防したり遅延させたりすることができない。

本明細書でアポトーシスによる神経細胞死という語を使用した場合、それは、以下に限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病、脳卒中／外傷、多発性および筋萎縮性側索硬化症など、多くのヒトの神経障害の「終点」をいう(Trends Neurosci 28, 670 (2006))。海馬および皮質ニューロンのアポトーシス死はアルツハイマー病の症状に関与しており；神経伝達物質ドーパミンを使用する中脳ニューロンの死はパーキンソン病の根底にあり；身体の運動を制御する線条体のニューロンの死はハンチントン病に関与しており；下位運動ニューロンの死は筋萎縮性側索硬化症として現れる。さらに、脳虚血および外傷は、脳の小さな領域の壊死を引き起こし、その後、壊死細胞が放出する細胞毒物質によって、アポトーシスによる神経細胞消失が脳の大きな領域に拡がる。また、アポトーシス性の神経細胞消失は、生理的プロセスとして老化脳でも観察される。

本明細書で天然のニューロステロイドという語を使用した場合、それは、脳で生成されるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）またはアロプレグナノロンなどのコレステロール骨格を持つ分子をいう(Proc Natl Acad Sci USA 95, 4089 (1998))。これまでの研究から、こうした天然由来の内因性ニューロステロイドは、神経栄養因子の欠乏によるアポトーシスに対してニューロンを保護しうることが明らかにされている(Proc Natl Acad Sci USA 101, 8209 (2004))。こうしたニューロステロイドの神経保護的で抗アポトーシス性の神経保護効果は、極低ナノモル濃度（１ｎＭ）で生じ、特異的膜受容体の活性化および、それに続く抗アポトーシス性のＢｃｌ−２タンパク質の生成により媒介される(FASEB J 20,577 (2006))。さらに、こうした天然のニューロステロイドはナノモル濃度で、神経保護作用があるドーパミンの分泌および生成を刺激する(Endocrinology146, 3309 (2005))。

成人の中枢神経系（ＣＮＳ）は、再生能力が非常に限られた構造であることが古くから知られている。しかしながら、虚血、癲癇および外傷など、いくつかの病態では、脳室下帯および歯状回の神経幹細胞の活性が上方制御されることが明らかになっている。こうした知見からは、成人の脳ではシグナルが存在し、限定的な神経細胞の再生が起こり得ることが示唆される。この基礎的な観察結果により我々の神経変性および脳の再生能力に対する考えが変わり、特定の脳領域を再生できるのではないかと考えた。このほど、２つの天然由来のニューロステロイド（ＤＨＥＡおよびアロプレグナノロン）は、様々な実験モデルで神経発生を誘導することが明らかにされた(Proc Natl Acad Sci USA 101, 3202 (2004) and J Neurosci 25, 4706 (2005))。

重度の神経変性疾患は有効な処置がないため、重篤な機能障害および死を招く神経機能の進行性消失を予防ないし処置できる神経保護手段の開発に大きな関心が向けられてきた。神経細胞の保護、修復および救出のための新規な化合物、神経細胞アポトーシスを標的とする新規な化合物、および生存または神経発生のための新規な化合物の開発が引き続き求められている。ＤＨＥＡなどの天然のニューロステロイドは、実験動物のインビトロおよびインビボで重要な神経保護および神経原性特性を有する。しかしながら、天然由来のニューロステロイドは、ヒトでは、ホルモン依存性腫瘍など、全身性の重大な内分泌副作用を発現するエストロゲン、アンドロゲンまたはプロゲスチンに代謝され(Front Neuroendocrinol 21, 1 (2000))、したがって、臨床での使用が制限されている。

ＧＢ１，０７９，８４０号（１９６６年）には、ある種のステロイドラクトン化合物の合成の中間体として３β−ヒドロキシ−１７−スピロオキシラニル−アンドロスト−５−エンが開示されている。

ＵＳ３，３２０，２４２号（１９６７年）には、１７β，２０−エポキシステロイドおよびその製造方法が開示されている。１７β，２０−エポキシ−１７α−メチルアンドロスト−５−エン−３β−オール（１）および１７β，２０−エポキシ−１７α−メチルアンドロスト−４−エン−３−オン（２）が具体的に特許請求されている。

ＵＳ３，３００，４８９号（１９６７年）には、ステロイドＣ−１７スピロラクトンと、その調製方法と、調製に使用する中間体とが開示されている。以下の化合物３および４が中間体として開示されている。

式中、ＸはＣ−Ｃ単結合またはメチレン基である。
ＵＳ３，４１３，２８８号（１９６８年）およびＵＳ３，５０６，６５２号には、下記式の、ステロイドエポキシド化合物を中間体として用いたステロイドＣ−１７スピロラクトンの製造方法が開示されている。

式中、Ｗがヒドロキシル基であるとき、Ｙは単結合を表す。
ＵＳ３，３６５，４７５号（１９６８年）には、１７α−（３’−ヒドロキシ−プロピル）−４−アンドロステン−３β，１７β−ジオールの調製方法が開示されている。この化合物はアルドステロン阻害剤として有用な治療特性を有するステロイド１７スピロテトラヒドロフランの調製に役立つ。

ＵＳ３，３６４，２３８号（１９６８年）には、３−酸素化スピロ［アンドロステン−１７，１’−シクロプロプ−２’−エン］、および下記構造式で表されるその２’，３’−ジヒドロ誘導体が開示されている。

式中、Ｒは水素でも低級アルカノイル基でもよく、Ｒ’およびＲ’’は水素でも低級アルキル基でもよく、点線は二重結合が任意に存在することを示す。
ＵＳ４，０２６，９１８号（１９７７年）には、抗炎症性活性を持つとされるいくつかのＤ−ホモステロイドの調製が記載されている。化学中間体として（３β，１１α，１７α）−スピロ［アンドロスト−５−エン−１７，２’−オキシラン］−３，１１−ジオールが開示されている。

ＵＳ４，０５４，５６３号（１９７７年）には、下記一般式の１７−スピロ−（２’−オキサシクロペンタン）ステロイド化合物の製造方法が開示されている。

式中、Ｒ_１は水素原子または低級アルキル基を表し、５位に二重結合および１０位にメチル基を含むか、または１，３および５（１０）位に３つの二重結合を含み、９（１１）位にさらに二重結合を含んでもよい。この化合物は、アルドステロンアンタゴニストの調製に有用な中間体とされている。

ＷＯ９８／３３５０６号には、前立腺癌および良性の前立腺肥大の処置に有用とされる、アンドロゲン合成を阻害するいくつかの化合物の使用が開示されている。記載されている類似化合物の１つに１７β，２０β−アジリジニル−プレグン−５−エン−３β−オールがある。

Helvetica Chimica Acta 34, 756-767 (1951)には、１７，２０−エポキシ−１７α−アロプレグナン−３β，２１−ジオールジアセテートの２０α−および２０β−立体異性体を形成できる反応スキームが開示されている。

Journal of Medicinal Chemistry 10(4), 546-551 (1967)には、抗エストロゲン特性を持つステロイド化合物を調製する際の中間体として下記式５のステロイド環状エーテルが言及されている。

Tetrahedron 29, 883-889 (1973)には、あるステロイド合成経路が開示されおり、その中間体は、（３β，１７β）−３’−エチニルスピロ［アンドロスト−５−エン−１７，２’オキシラン］−３−オールアセテートおよび（３β，１７β）−３’−［（トリメチルシリル）エチニル］スピロ［アンドロスト−５−エン−１７，２’オキシラン］−３−オールアセテートである。

Tetrahedron 43, 631-641 (1987)には、下記式６および７の化合物およびその５α−Ｈアナログの調製が記載されている。

第１の態様では、本発明は、式Ｉの化合物およびその薬学的に許容されるエステル、塩および酸付加塩に関する。

式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ａ、Ｂ、Ｘ、ＹおよびＺは以下の詳細な説明で定義される通りである。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容されるキャリア、希釈液またはアジュバントと共に、活性成分としての式Ｉの少なくとも１種の化合物、またはその薬学的に許容されるエステル、塩または酸付加塩を含む組成物に関する。

別の態様では、本発明は、神経細胞アポトーシスまたはニューロン損傷に関連した神経変性状態を予防ないし処置する方法であって、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容されるエステル、塩または酸付加塩を、有効量患者に投与することを含む方法に関する。前記状態として、単に例示に過ぎないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、網膜変性症、網膜剥離、または、
遺伝子異常，糖尿病，ポリオ，疱疹，ＡＩＤＳ，脳外傷，虚血，脳卒中によって引き起こされる末梢神経障害、が挙げられる。

別の態様では、本発明は、治療に使用される、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容されるエステル、塩または酸付加塩に関する。
別の態様では、本発明は、神経細胞アポトーシスまたはニューロン損傷に関連した神経変性状態の予防ないし処置に使用される、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容されるエステル、塩または酸付加塩に関する。前記状態は、たとえば、上述の状態のいずれでもよい。

別の態様では、本発明は、神経細胞アポトーシスまたはニューロン損傷に関連した神経変性状態を予防ないし処置する薬物を製造するための、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容されるエステル、塩または酸付加塩の使用に関する。前記状態は、たとえば、上述の状態のいずれでもよい。

別の態様では、本発明は、中枢神経系および末梢神経系を含む様々な器官および組織の神経幹細胞および神経前駆細胞の増殖、分化、遊走および再生を制御するための、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容されるエステル、塩または酸付加塩の使用に関する。

別の態様では、本発明は、上皮細胞、内皮細胞、間葉系細胞、リンパ球細胞、赤血球細胞および単核細胞の増殖、分化、遊走および再生を制御するための、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容されるエステル、塩または酸付加塩の使用に関する。

別の態様では、本発明は、ＴｒｋＡおよびｐ７５ＮＴＲ受容体などの神経成長因子（ＮＧＦ）受容体に結合、活性化または阻害するための、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容されるエステル、塩または酸付加塩の使用に関する。

物品（article）、および所望の特徴、特性、特色に関する以下の詳細な説明と、その説明および例示的な実施形態に記載し例示する各要素およびプロセスステップの相互の関係とから、本発明の理解が深まるであろう。

アッセイ手法を用いた実験的研究における、神経冠由来のＰＣ１２細胞のアポトーシスに対するいくつかのステロイド化合物の作用を示す棒グラフである。 図２は、アッセイ手法を用いた実験的研究における、神経冠由来のＰＣ１２細胞のアポトーシスの、いくつかのステロイド化合物の濃度に対する依存性（比色計を使用して光学密度で測定）を示す複数のグラフからなる。 神経冠由来のＰＣ１２細胞のアポトーシスに対するいくつかのステロイド化合物の作用についての、ＦＡＣＳ分析を用いた実験的研究の結果を示す。 神経冠由来のＰＣ１２細胞中の抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２タンパク質およびＢｃｌ−ｘｌタンパク質のレベルに対する、いくつかのステロイド化合物の作用についての実験的研究の結果を示す。 ラットＰＣ１２交感神経副腎細胞から単離した膜に対するいくつかのステロイド化合物の結合についての、濃度依存性実験的研究の結果を示す。 神経冠由来のドーパミン作動性ＰＣ１２細胞に対するいくつかのステロイド化合物の作用に関する実験的研究の結果を示す。 野生型マウスから生成された１次皮質神経球に対するいくつかの化合物の作用に関する実験的研究の結果を示す。 マウス胎仔脳から単離した神経前駆細胞に対する合成ニューロステロイドの、対照と比較した作用の実験的研究の結果を示す。 トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の神経成長因子に対する合成ニューロステロイドの結合能、活性化能または阻害能の実験的研究の結果を示す。

図面のより詳細な考察は、下記の実施例７〜１３に記載される。

本発明は、式Ｉの化合物に関する。

式中
Ｒ¹はヒドロキシル、アルコキシ、アルカノイルオキシ、アミノカルボニルオキシまたはアルコキシカルボニルオキシであり；
Ｒ²は水素、任意に置換されているアルキル、任意に置換されているアルケニル、任意に置換されているアルコキシアルキル、任意に置換されているアミノアルキル、シアノ、任意に置換されているシアノアルキル、任意に置換されているチオシアノアルキル、イソチオシアノ、任意に置換されているアジドアルキル、任意に置換されているアルカノイルオキシアルキル、任意に置換されているアリールアルキル、任意に置換されているヘテロアリールアルキル、任意に置換されているアリールアルケニル、任意に置換されているヘテロアリールアルケニル、任意に置換されているアリール、任意に置換されているアリールキニル、任意に置換されているアリールキルアルキニル、任意に置換されているアルカノイルオキシアルキニル、任意に置換されているヘテロアリールオキシアルキニル、任意に置換されているオキソアルキニルまたはそのケタール、任意に置換されているシアノアルキニル、任意に置換されているヘテロアリールアルキニル、任意に置換されているヒドロキシアルキニル、任意に置換されているアルコキシアルキニル、任意に置換されているアミノアルキニル、任意に置換されているアシルアミノアルキニル、任意に置換されているメルカプトアルキニル、任意に置換されているヒドロキシアルキニル二酸ヘミエステルもしくはその塩、または任意に置換されているアルキニルオキシアルキニルであり；
あるいは
Ｒ¹は酸素であり、Ｒ²はＲ¹に結合したアルキル基またはアルケニル基またはアルキニル基であり、任意に置換されていてもよい含酸素環を形成し；
Ｒ³は水素であるか、あるいは、ステロイド環系のＣ５とＣ６の間に二重結合が存在する場合、Ｒ³は存在せず；
Ｒ⁴は水素または低級アルキルであり；
Ｒ⁵は水素、アミノ、任意に置換されているアルキルアミノ、任意に置換されているジアルキルアミノ、任意に置換されているアルケニルアミノ、任意に置換されているジアルケニルアミノ、任意に置換されているアルキニルアミノ、任意に置換されているジアルキニルアミノ、アミド、チオ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、ハロゲン、ヒドロキシル、任意に置換されているアルコキシ、任意に置換されているアルケニルオキシ、任意に置換されているアルキニルオキシアルキル、任意に置換されているアルケニル、任意に置換されているアルキニル、任意に置換されているアリール、アジド、任意に置換されているヘテロアリール、オキシム＝Ｎ−Ｏ−Ｒ⁸、カルボキシメチルオキシム、カルボキシエチルオキシムまたはカルボキシプロピルオキシムであり；
Ｒ⁶は水素、アミノ、チオ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、ハロゲン、ヒドロキシル、任意に置換されているアルコキシ、任意に置換されているアルキル、任意に置換されているアルケニルまたは任意に置換されているアルキニルであり；
Ｒ⁷は水素、アミノ、任意に置換されているアルキルアミノ、任意に置換されているジアルキルアミノ、任意に置換されているアルケニルアミノ、任意に置換されているジアルケニルアミノ、任意に置換されているアルキニルアミノ、任意に置換されているジアルキニルアミノ、アミド、チオ、スルフィニル、スルホニル、スルホンアミド、ハロゲン、ヒドロキシル、任意に置換されているアルコキシ、任意に置換されているアルケニルオキシ、任意に置換されているアルキニルオキシアルキル、任意に置換されているアルケニル、任意に置換されているアルキニル、任意に置換されているアリール、アジド、任意に置換されているヘテロアリール、オキシム＝Ｎ−Ｏ−Ｒ⁸、カルボキシメチルオキシム、カルボキシエチルオキシムまたはカルボキシプロピルオキシムであり；
Ｘは原子価結合、メチレン基（−ＣＨ₂−）または酸素、硫黄から選択されるヘテロ原子、または−ＮＨ、−Ｓ（Ｏ）、−ＳＯ₂、−ＮＲ⁸、−ＮＣ（Ｏ）Ｒ⁸、−Ｎ−トルエン−４−スルホニルオキシであり；
Ａは−（ＣＨ₂）_n−、Ｃ_2-5アルケニレン基またはＣ_2-5アルキニレン基であり、ｎは整数であり、０または１または２または３または４または５の値をとることができ；
Ｂは−（ＣＨ₂）_y−、Ｃ_2-5アルケニレン基またはＣ_2-5アルキニレン基であり、ｙは整数であり、１または２または３または４または５の値をとることができ；
Ｙは、ステロイド骨格のＣ１７のスピロ環置換基の任意の炭素に結合していてもよく、独立にＨ、任意に置換されているＣ_1-10アルキル、任意に置換されている縮合二環式環系、任意に置換されている架橋二環式環系、任意に置換されている架橋三環式環系、任意に置換されているＣ_2-10アルケニル、任意に置換されているＣ_2-10アルキニル、任意に置換されているアリール、任意に置換されているアリールアルキル、任意に置換されているヘテロアリール、任意に置換されているヘテロアリールアルキル、ホルミル、カルボキシ、−ＮＣ（Ｏ）Ｒ⁸、ＮＣ（Ｓ）Ｒ⁸、−ＮＲ⁸Ｒ⁹、任意に置換されているＣ（Ｏ）−Ｗ、任意に置換されているＣ（Ｏ）Ｏ−Ｗ、または任意に置換されているＣ（Ｓ）Ｏ−Ｗであり；
Ｚは、ステロイド骨格のＣ１７のスピロ環置換基の任意の炭素に結合していてもよく、独立にＨ、任意に置換されているＣ_1-10アルキル、任意に置換されている縮合二環式環系、任意に置換されている架橋二環式環系、任意に置換されている架橋三環式環系、任意に置換されているＣ_2-10アルケニル、任意に置換されているＣ_2-10アルキニル、任意に置換されているアリール、任意に置換されているアリールアルキル、任意に置換されているヘテロアリール、任意に置換されているヘテロアリールアルキル、ホルミル、カルボキシ、−ＮＣ（Ｏ）Ｒ⁸、ＮＣ（Ｓ）Ｒ⁸、−ＮＲ⁸Ｒ⁹、任意に置換されているＣ（Ｏ）−Ｗ、任意に置換されているＣ（Ｏ）Ｏ−Ｗ、任意に置換されているＣ（Ｓ）Ｏ−Ｗであり；
ＹおよびＺは、Ｃ１７のスピロ環置換基の同じ炭素に結合していてもよく
Ｗは、任意に置換されているＣ_1-10アルキル、任意に置換されているヘテロシクロアルキル、任意に置換されている縮合二環式環系、任意に置換されている架橋二環式環系、任意に置換されている架橋三環式環系、任意に置換されているＣ_2-10アルケニル、任意に置換されているヘテロシクロアケニル、任意に置換されているＣ_2-10アルキニル、任意に置換されているヘテロシクロアルキニル、任意に置換されているアリールまたは任意に置換されているヘテロアリールであり；
Ｒ⁸およびＲ⁹は独立に、任意に置換されているＣ_1-10アルキル、任意に置換されているヘテロシクロアルキル、任意に置換されている縮合二環式環系、任意に置換されている架橋二環式環系、任意に置換されている架橋三環式環系、任意に置換されているＣ_2-10アルケニル、任意に置換されているヘテロシクロアケニル、任意に置換されているＣ_2-10アルキニル、任意に置換されているヘテロシクロアルキニル、任意に置換されているアリールまたは任意に置換されているヘテロアリールであり；
点線は、単結合または二重結合が存在することを示す。

本発明はさらに、薬学的に許容されるキャリア、希釈液またはアジュバントと共に、活性成分としての式Ｉの少なくとも１種の化合物、またはその薬学的に許容されるエステル、塩または酸付加塩を含む組成物に関する。

式Ｉの化合物およびその薬学的に許容されるエステル、塩または酸付加塩については、神経変性疾患の症状の処置、予防または寛解のために、老年性認知症に見られるか、または神経変性疾患に関連する良性の物忘れおよび記憶障害の緩和のために、いくつかの原因によるニューロパチーの処置のために、さらに脳外傷でのアポトーシスによるニューロン消失の予防のために使用することができる。処置できる状態として、単に例示に過ぎないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、網膜変性症、網膜剥離、または、
遺伝子異常，糖尿病，ポリオ，疱疹，ＡＩＤＳ，虚血，脳卒中によって引き起こされる末梢神経障害、が挙げられる。

本発明の実施形態は、上記の式Ｉ中、Ｘがメチレン基、酸素原子または−ＮＨであることが好ましい。一層好ましくは、Ｘは酸素原子である。
また、本発明の実施形態は、上記の式Ｉ中、ステロイド環系のＣ５とＣ６の間に二重結合が存在し、Ｒ³が存在しないことが好ましい。

さらに、本発明の実施形態は、上記の式Ｉ中、Ｒ¹＝ＯＨであり；Ｒ²＝Ｒ⁵＝Ｒ⁶＝Ｒ⁷＝Ｙ＝Ｈ、Ｒ⁴＝Ｍｅであることが好ましい。
本発明の実施形態は、上記の式Ｉ中、Ｒ¹＝ＯＨであり；Ｒ²＝Ｒ⁵＝Ｒ⁶＝Ｒ⁷＝Ｙ＝Ｈ、Ａ＝−（ＣＨ₂）_n−、Ｂ＝−（ＣＨ₂）_y−であり；ステロイド環系のＣ１とＣ２の間に二重結合が存在せず；ステロイド環系のＣ５とＣ６の間に二重結合が存在し、Ｒ³は存在せず；Ｒ⁴＝Ｍｅであることがより好ましい。なお一層好ましくは、式中、ｎ＝０、ｙ＝１である化合物である。

本発明の実施形態では、その薬学的に許容されるエステル、塩および酸付加塩を含め、下記から選択される式Ｉの化合物であることが最も好ましい：
１７β−スピロ−［５−アンドロステン−１７，２’−オキシラン］−３β−オール；
（２０Ｓ）−３β，２１−ジヒドロキシ−１７β，２０−エポキシ−５−プレグネン；
（２０Ｓ）−３β−ヒドロキシ−１７β，２０−エポキシ−２０−（２−ブロモエチニル）−５−アンドロステン；および
３β，２１−ジヒドロキシ−１７α，２０−エポキシ−５−プレグネン。

上記の式Ｉの以下の化合物はそれ自体既知であるため、本発明の範囲内に含まれない：
１）Ｒ¹＝ＯＨであり；Ｒ²＝Ｒ⁵＝Ｒ⁶＝Ｒ⁷＝Ｙ＝Ｚ＝Ｈ、Ａ＝−（ＣＨ₂）_n−、Ｂ＝−（ＣＨ₂）_y−であり；ステロイド環系のＣ１とＣ２の間に二重結合が存在せず；ステロイド環系のＣ５とＣ６の間に二重結合が存在し、Ｒ³は存在せず；Ｒ⁴＝Ｍｅであり；Ｘ＝Ｏ、ｎ＝０、ｙ＝１である化合物；
２）Ｒ¹はヒドロキシまたはアルコキシであり；Ｒ²＝Ｒ⁵＝Ｒ⁶＝Ｒ⁷＝Ｙ＝Ｚ＝Ｈ、Ａ＝−（ＣＨ₂）_n−、Ｂ＝（ＣＨ₂）_y−であり；ステロイド環系のＣ１とＣ２の間に二重結合が存在せず；ステロイド環系のＣ５とＣ６の間に二重結合が存在し、Ｒ³は存在せず；Ｒ^４＝Ｍｅであり；Ｘ＝Ｏ、ｎ＝０、ｙ＝３であり；Ｘは１７β位にある化合物；
３）３’，４’，５’，６’−テトラヒドロスピロ［アンドロスト−５−エン−１７，２’−（２’Ｈ）−ピラン］３β−オール、すなわち、式Ｉにおいて、Ｒ¹＝ＯＨであり；Ｒ²＝Ｒ⁵＝Ｒ⁶＝Ｒ⁷＝Ｙ＝Ｚ＝Ｈ、Ａ＝−（ＣＨ₂）_n−、Ｂ＝−（ＣＨ₂）_y−であり；ステロイド環系のＣ１とＣ２の間に二重結合が存在せず；ステロイド環系のＣ５とＣ６の間に二重結合が存在し、Ｒ³は存在せず；Ｒ⁴＝Ｍｅであり；Ｘ＝Ｏ、ｎ＝０、ｙ＝４であり；Ｘは１７β位にある化合物；
４）Ｒ¹はヒドロキシまたはアルカノイルオキシであり；Ｒ²＝Ｒ⁵＝Ｒ⁶＝Ｒ⁷＝Ｈ、Ａ＝−（ＣＨ₂）_n−、Ｂ＝−（ＣＨ₂）_y−であり；ステロイド環系のＣ１とＣ２の間に二重結合が存在せず；ステロイド環系のＣ５とＣ６の間に二重結合が存在し、Ｒ³は存在せず；Ｒ⁴＝Ｍｅであり；Ｘ＝−ＣＨ₂−であり、ＹおよびＺは独立にＨまたはＣ₁〜Ｃ₇アルキルであり、ｎ＝０、ｙ＝１である化合物；
５）Ｒ¹＝ＯＡｃであり；Ｒ²＝Ｒ⁵＝Ｒ⁶＝Ｒ⁷＝Ｚ＝Ｈ、Ａ＝−（ＣＨ₂）_n−、Ｂ＝−（ＣＨ₂）_y−であり；ステロイド環系のＣ１とＣ２の間に二重結合が存在せず；Ｒ³はＨであるか、または存在せずステロイド環系のＣ５とＣ６の間に二重結合が存在し；Ｒ⁴＝Ｍｅであり；Ｘ＝Ｏ、Ｙ＝２−ピリジル、ｎ＝０、ｙ＝１である化合物；
６）１７β，２０β−アジリジニル−プレグン−５−エン−３β−オール、すなわち、式Ｉにおいて、Ｒ¹＝ＯＨであり；Ｒ²＝Ｒ⁵＝Ｒ⁶＝Ｒ⁷＝Ｚ＝Ｈであり；Ｙ＝ＣＨ₃であり；Ａ＝−（ＣＨ₂）_n−、Ｂ＝−（ＣＨ₂）_y−であり；ステロイド環系のＣ１とＣ２の間に二重結合が存在せず；ステロイド環系のＣ５とＣ６の間に二重結合が存在し、Ｒ³は存在せず；Ｒ⁴＝Ｍｅであり；Ｘ＝−ＮＨ−、ｎ＝０、ｙ＝１であり；Ｘは１７β位にある化合物；
７）（３β，１１α，１７α）−スピロ［アンドロスト−５−エン−１７，２’−オキシラン］−３，１１−ジオール、すなわち、式Ｉにおいて、Ｒ¹＝ＯＨであり；Ｒ²＝Ｒ⁵＝Ｒ⁶＝Ｙ＝Ｚ＝Ｈであり；Ｒ⁷＝ＯＨであり；Ａ＝−（ＣＨ₂）_n−、Ｂ＝−（ＣＨ₂）_y−であり；ステロイド環系のＣ１とＣ２の間に二重結合が存在せず；ステロイド環系のＣ５とＣ６の間に二重結合が存在し、Ｒ³は存在せず；Ｒ⁴＝Ｍｅであり；Ｘ＝Ｏ、ｎ＝０、ｙ＝１であり；Ｒ¹は１１α位にあり、Ｘは、１７α位にある化合物；
８）１７，２０−エポキシ−１７α−アロプレグナン−３β，２１−ジオールジアセテート、すなわち、式Ｉにおいて、Ｒ¹＝ＯＡｃであり；Ｒ²＝Ｒ³＝Ｒ⁵＝Ｒ⁶＝Ｒ⁷＝Ｚ＝Ｈ、Ａ＝−（ＣＨ₂）_n−、Ｂ＝−（ＣＨ₂）_y−であり；ステロイド環系のＣ１とＣ２の間に二重結合が存在せず；ステロイド環系のＣ５とＣ６の間に二重結合が存在せず；Ｒ⁴＝Ｍｅであり；Ｘ＝Ｏ、Ｙ＝−ＣＨ₂ＯＡｃ、ｎ＝０、ｙ＝１である化合物；および
９）（３β，１７β）−３’−エチニルスピロ［アンドロスト−５−エン−１７，２’オキシラン］−３−オールアセテートおよび（３β，１７β）−３’−［（トリメチルシリル）エチニル］スピロ［アンドロスト−５−エン−１７，２’オキシラン］−３−オールアセテート、すなわち、式Ｉにおいて、Ｒ¹＝ＯＡｃであり；Ｒ²＝Ｒ⁵＝Ｒ⁶＝Ｒ⁷＝Ｚ＝Ｈ、Ａ＝−（ＣＨ₂）_n−、Ｂ＝−（ＣＨ₂）_y−であり；ステロイド環系のＣ１とＣ２の間に二重結合が存在せず；ステロイド環系のＣ５とＣ６の間に二重結合が存在し、Ｒ³は存在せず；Ｒ⁴＝Ｍｅであり；Ｘ＝Ｏ、Ｙ＝−Ｃ≡ＣＨまたは−Ｃ≡Ｃ−ＳｉＭｅ₃、ｎ＝０、ｙ＝１であり；式中、Ｘは１７β位にある化合物。

こうした化合物はそれ自体既知ではあるが、それらがニューロン損傷または神経細胞死に関係した疾患もしくは状態または本明細書で言及する他の状態において使用されること、あるいはそれらと関連することについては知られていない。したがって、本発明の他の態様（組成物、方法、使用など）から、こうした化合物を排除するものではない。

本明細書では、以下の個々の用語またはその組み合わせを以下の通り定義する。
本明細書では、「アルキル」という語は、直鎖または分枝鎖または環状飽和炭化水素基を指す。好ましいのは、Ｃ₁〜Ｃ₁₆アルキル基である。特に他に限定しない限り、アルキル基は、非置換であっても、任意の可能な位置で置換基にて単置換されていても、可能な場合には、複数置換されていてもよい。特に他に限定しない限り、環状アルキル基は、たとえば、アダマンチル、ノルボルニルおよび関係するテルペン類のような単環式、二環式、三環式および多環式環を含む。

本明細書では、「ヘテロシクロアルキル」という語は、１、２、３または４個のＯ、ＮまたはＳ原子あるいはＯ、Ｎ、Ｓ原子の組み合わせを含む環状炭化水素基を指し、たとえば、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニル、モルホリニル、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロ−２Ｈ−チオピラニルがある。特に他に限定しない限り、ヘテロシクロアルキル基は、非置換であっても、任意の可能な位置で置換基にて単置換されていても、可能な場合には、複数置換されていてもよい。

本明細書では、「ハロアルキル」という語は、１つ以上のハロゲンで置換されているアルキル基を指す。
本明細書では、「アルケニル」という語は、単独あるいは組み合わせて、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む直鎖または分枝鎖または環状の不飽和炭化水素基を指す。特に他に限定しない限り、アルケニル基は、非置換であっても、任意の可能な位置で置換基にて単置換されていても、可能な場合には、複数置換されていてもよい。好ましいのはＣ₂〜Ｃ_１6アルケニル基である。アルケニルは、２個の連続した二重結合を有するアレニル基を含むものとする。

本明細書では、「ヘテロシクロアルケニル」という語は、１、２、３または４個のＯ、ＮまたはＳ原子あるいはＯ、Ｎ、Ｓ原子の組み合わせを含有し、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む環状不飽和炭化水素基を指す。特に他に限定しない限り、ヘテロシクロアルケニル基は、非置換であっても、任意の可能な位置で置換基にて単置換されていても、可能な場合には、複数置換されていてもよい。

本明細書では、「アルキニル」という語は、単独あるいは組み合わせて、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含む直鎖または分枝鎖または環状の不飽和基を指す。特に他に限定しない限り、アルキニル基は、非置換であっても、任意の可能な位置で置換基にて単置換されていても、可能な場合には、複数置換されていてもよい。好ましいのはＣ₂〜Ｃ₁₆アルキニル基である。

本明細書では、「アリール」という語は、単独あるいは組み合わせて、共役π電子を持つ少なくとも１個の環を含む芳香族基、炭素環式アリール基およびビアリール基を指し、これらは非置換であっても、任意の可能な位置で置換基にて単置換されていても、可能な場合には、複数置換されていてもよい。好ましいのはＣ₂〜Ｃ₁₀アリール基である。典型的なアリール基として、フェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、アントラシル基、インデニル基、アズレニル基、ビフェニル基、ビフェニレニル基およびフルオレニル基が挙げられる。

「ビアリール」という語は、他のアリール基で置換されているアリール基を表す。
「炭素環式アリール」という語は、芳香族環の環原子が炭素原子である基をいう。
本明細書では、「チオ」という語は、−ＳＲ¹⁰を指し、Ｒ¹⁰は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールであり、いずれも任意に置換されていてもよい。

本明細書では、「スルフィニル」という語は、−ＳＯＲ¹⁰を指し、Ｒ¹⁰は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールであり、いずれも任意に置換されていてもよい。

本明細書では、「スルホニル」という語は、−ＳＯ₂Ｒ¹⁰を指し、Ｒ¹⁰は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールであり、いずれも任意に置換されていてもよい。

本明細書では、「スルホンアミド」という語は、−ＳＯ₂ＮＲ¹⁰Ｒ¹¹を指し、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹は独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールであり、いずれも任意に置換されていてもよい。

「任意に置換されている」または「置換されている」という語は、任意の可能な位置で以下に記載する置換基により置換されている基をいう。本発明に有用な上述の残基の置換基は、本発明の化合物の生物活性を大きく減弱しない基である。本発明の化合物の生物活性を大きく減弱しない置換基として、たとえば、低級アルキル（非環状および環状）、アリール（炭素環式アリールおよびヘテロアリール）、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、メルカプト、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、ニトロ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アルカノイルオキシアルカノイル、アルコキシカルボキシ、カルボアルコキシ、カルボキサミド、ホルミル、カルボキシ、ヒドロキシ、シアノ、アジド、イソシアノ、イソチオシアノ、オキシム、ケトおよびその環状ケタール、アルカノイルアミド、ヘテロアリールオキシ、Ｏ−アロイル、ＯアルキルＯＨ、ＯアルケニルＯＨ、ＯアルキニルＯＨ、ＯアルキルＮＸ₁Ｘ₂、ＯアルケニルＮＸ₁Ｘ₂、ＯアルキニルＮＸ₁Ｘ₂、ＮＨ−アシル、ＮＨ−アロイル、ＣＦ₃、ＣＯＯＸ₃、ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｘ₁Ｘ₂、ＯＰＯ₃Ｘ₁Ｘ₂、、ＳＯ₂ＮＸ₁Ｘ₂、ＣＯＮＸ₁Ｘ₂が挙げられ、Ｘ₁およびＸ₂は各々独立にＨまたはアルキルまたはアルケニルまたはアルキニルを指し、あるいはＸ₁およびＸ₂は共に、約４〜約７個の環原子、および任意にＯ、ＮまたはＳから選択される１個の追加のヘテロ原子を持つ複素環の一部を含むか、あるいはＸ₁およびＸ₂は共に、約５〜６個の環原子を持つイミド環の一部を含み、Ｘ₃は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ−低級アルキルまたはアルキル−ＮＸ₁Ｘ₂を指す。

本明細書では、「低級」という語は、１〜６個の炭素原子を含む有機基または化合物に関していう。こうした基は直鎖でも、分枝鎖でも、環状でもよい。
「ヘテロアリール」という語は、１、２、３または４個のＯ、ＮまたはＳ原子を含み、かつ１つ以上の環に非局在化している６、１０または１４個のπ電子を持つ５〜１４員環状不飽和基を含む炭素をいい、たとえば、チエニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ナフタ［２，３−ｂ］チエニル、チアントレニル、フリル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサンチニル、２Ｈ−ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、インドイル、インダゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、イソキノリル、キノリル、フタジニル、ナフチリジニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテルジニル、５ａＨ−カルバゾイル、カルボゾイル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリンジニル、オキサゾリル、ピリミジニル、ベンズイミダゾリル、トリアゾリルがあり、各々は、上記で論じたように任意に置換されていてもよい。

本発明はまた、酸付加塩を含め、式Ｉの化合物の薬学的に許容されるエステルおよび塩を含む。
当業者であれば、式Ｉの化合物に立体中心が存在することを認識するであろう。したがって、本発明は、混合物または純粋なジアステレオマーとして、式Ｉのあらゆる可能な立体異性体および幾何異性体を含む。式Ｉの化合物の単一のジアステレオマーが望ましい場合、最終生成物を分離するか、異性体的に純粋な出発原料あるいは任意の適切な中間体からの立体特異的合成により得ることができる。

本明細書に定義する式Ｉの化合物の結晶体（たとえば、多形体）、エナンチオマー体および互変異性体およびその薬学的に許容される塩または酸付加塩は、本発明（化合物、医薬組成物、方法、使用など）の範囲内に含まれる。

式Ｉの化合物は、当業者によく知られた従来の合成反応により、市販されているステロイド化合物から調製しうる。式中、Ｘが酸素原子である、好ましい本発明の実施形態は、適切な順序で一連の合成ステップを用いて、重要な中間体（２０Ｓ）−３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−２１−ヒドロキシ−１７β，２０−エポキシ−５−プレグネンから調製することができる。前記合成ステップとしては、酸化、Ｗｉｔｔｉｇ反応、還元、水素化、オキシム形成、ハロゲン化、炭素−炭素カップリング反応およびＣ３の保護基の除去があるが、これに限定されるものではない。ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ以外の好適なヒドロキシル保護基を用いてもよい。以下の実施例は、好適に用いることができる調製技法の一部を説明する。

本発明の化合物は、ＣＮＳおよび末梢神経系に作用する。本発明の医薬組成物および方法は、神経細胞アポトーシスまたはニューロン損傷に関係した神経変性疾患または障害の処置および／または予防を対象とすることが望ましい。そうした疾患または障害として、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、網膜変性症および網膜剥離、
遺伝子異常，糖尿病，ポリオ，疱疹，ＡＩＤＳと化学療法，脳外傷もしくは虚血と脳卒中によって引き起こされる末梢神経障害、
中枢もしくは末梢神経系の神経細胞の変性および／またはアポトーシスを引き起こす他の任意の状態が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本明細書で使用する場合、「処置する」または「処置」という語は、被検体の神経細胞アポトーシスまたはニューロン損傷に関係した障害または疾患の任意の処置をいい、まだ障害または疾患があると診断されていない被検体に障害または疾患が発症することを予防すること、障害または疾患の発症を食い止めるなど、障害または疾患を抑制すること、障害または疾患を退行させるなど、障害または疾患を軽減すること、あるいは障害または疾患の症状を止めるなど、疾患または障害に起因する状態を緩和することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の製剤については、以下に限定されるものではないが、経口投与、非経口投与、舌下投与、経皮投与、直腸投与または吸入投与もしくは頬粘膜投与など、上記した疾患の処置の標準的な方法で投与すればよい。加えて、本発明の組成物は、注射による非経口投与用にも持続注入用にも製剤化することができる。本発明にかかる組成物は、徐放型またはデポー製剤として製剤化してもよい。投与経路は、活性化合物が抗アポトーシス作用を発揮する所望の部位に効率的に送達されるならば、どの経路でもよい。当業者であれば、前述の説明を、被投与者に有害な影響が生じない任意の他の投与方法まで拡張しうる。

本発明の医薬組成物は、受け入れられた手順に従って、被検体、動物またはヒトにおいて所望の薬力学的活性を発揮するに足る無毒性量で、本発明の活性化合物またはそうした化合物の混合物を無毒の薬学的担体と組み合わせることで、従来の投薬単位形態で調製される。好ましくは、前記組成物は、活性量だが、無毒性量の活性成分を含み、その量は、具体的な所望の生物活性および患者の状態によって決まる。

使用する薬学的担体は、たとえば、固体でも、あるいは、液体でもよい。代表的な固体担体には、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、微結晶性セルロース、ポリマーヒドロゲルなどがある。典型的な液体担体には、プロピレングリコール、β−シクロデキストリンの水溶液、シロップ、ピーナッツ油およびオリーブ油および同種のエマルジョンがある。同様に、担体または希釈液は、グリセロールモノステアレートまたはグリセロールジステアレート単独、あるいは、ワックス、マイクロカプセル、ミクロスフェア、リポソームおよび／またはヒドロゲルとの組み合わせなど、当該技術分野で公知の任意の時間遅延材料を含んでもよい。

固体担体の場合、製剤は、油中で単純粉砕化、微粉化またはナノサイズ化を行っても、微粉末またはペレット状のまま錠剤化しても、硬ゼラチンまたは腸溶性カプセルに加えても、あるいは、トローチ、薬用キャンディまたは坐剤の形態であってもよい。液体担体の場合、製剤は、アンプルなどの液体形態でも、薬学的に許容される防腐剤などと混合した水性または非水性液体懸濁液などの液体形態でもよい。少量の投薬量が求められる場合、鼻スプレー、舌下投与および時間放出性皮膚パッチも、局所投与に好適な医薬品形態である。

以下に式Ｉのいくつかの具体的な化合物を示す。化合物の合成は、以下に記載する実施例セクションに従って行った。これらの実施例は、本発明の理解を深めるために記載するものであり、いかなる意味でも本発明の範囲を限定するものとみなしてはならない。

１）１７β−スピロ−［５−アンドロステン−１７，２’−オキシラン］−３β−オール（「ＢＮＮ−５０」）
２）（２０Ｓ）−３β，２１−ジヒドロキシ−１７β，２０−エポキシ−５−プレグネン（「ＢＮＮ−１２４」）
３）（２０Ｓ）−３β−ヒドロキシ−１７β，２０−エポキシ−２０−（２−ブロモエチニル）−５−アンドロステン
４）３β，２１−ジヒドロキシ−１７α，２０−エポキシ−５−プレグネン（「ＢＮＮ−９３」）。

¹Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＣ３００分光計を用いて３００ＭＨｚで記録し、¹³Ｃについては、７５．４３ＭＨｚで記録した。¹Ｈ ＮＭＲスペクトルは、７．２４ｐｐｍの内部ＣＨＣｌ₃と比較したδ単位で報告してある。¹³Ｃ ＮＭＲシフトは、７７．０ｐｐｍのＣＤＣｌ₃と比較したδ単位で表してある。¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルは、プロトンノイズデカップリングを行った。ＮＭＲスペクトルはすべてＣＤＣｌ₃中で記録した。シリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ Ｆ２５４）を薄層クロマトグラフィーに用いた。クロマトグラフィー精製は、シリカゲル（２００〜４００メッシュ）で行った。

［実施例１］
１７β−スピロ−［５−アンドロステン−１７，２’−オキシラン］−３β−オールの調製

無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶かしたデヒドロエピアンドロステロン（５００ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ）の溶液に、ヨウ化トリメチルスルホニウム（５３０ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）およびｔ−ＢｕＯＫ（２９２ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）を０℃で加え、得られた混合液を室温で２時間撹拌した。反応の終了後、水を加え、得られた混合液をジエチルエーテルで抽出した。有機層をかん水で洗浄し、次いで無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、溶媒を減圧蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：石油エーテル４０°〜６０℃／アセトン８：２）で精製して、実施例１の化合物を白色結晶性固体として得た。収量：３１０ｍｇ（５９％）；ｍ．ｐ．１７０〜１７３℃；

¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：５．３５（ｓ，１Ｈ，６−ＣＨ），３．４７−３．５４（ｍ，１Ｈ，３ａ−Ｈ），２．８９（ｄ，Ｊ＝４．８８Ｈｚ，１Ｈ），２．５９（ｄ，Ｊ＝４．８８Ｈｚ，１Ｈ），２．２−０．９（ｍ，２０Ｈ），１．００（ｓ，３Ｈ，１８−ＣＨ₃），０．８８（ｓ，３Ｈ，１９−ＣＨ₃），¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：１４．１４，１９．３８，２０．４１，２３．５８，２８．９９，３１．３５，３１．５４，３１．９９，３３．８４，３６．５９，３７．２３，３９．８９，４２．１８，５０．１４，５３．１２，５３．６３，７０．５２，７１．５９，１２１．２１，１４０．８８。

［実施例２］
（２０Ｓ）−３β，２１−ジヒドロキシ−１７β，２０−エポキシ−５−プレグネンの調製
１７α−ビニル−５−アンドロステン−３β，１７β−ジオール

無水テトラヒドロフラン（７ｍＬ）に溶かしたデヒドロエピアンドロステロン（２５０ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）の溶液に、ビニルマグネシウムブロミドの溶液（テトラヒドロフランに溶解しており、１Μ、４．３５ｍＬ、４．３５ｍｍｏｌ）を−７８℃で滴下して加え、得られた混合液を室温で１２時間撹拌した。反応の終了後、飽和塩化アンモニウムを加え、得られた混合液を酢酸エチルで抽出した。有機層をかん水で洗浄し、次いで無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、溶媒を減圧蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：シクロヘキサン／アセトン９：１）で精製して、１７α−ビニル−５−アンドロステン−３β，１７β−ジオールを白色結晶性固体として得た。
収量：２００ｍｇ（７４％）；ｍ．ｐ．１８０〜１８３℃；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：６．０１（ｑ，Ｊ＝１０．９９Ｈｚ，１Ｈ），５．３１（ｓ，１Ｈ，），５．０９（ｔ，Ｊ＝１０．９９Ｈｚ，２Ｈ），３．４７−３．５１（ｍ，１Ｈ，３ａ−Ｈ），１．１８−２．４８（ｍ，２１Ｈ），０．９９（ｓ，３Ｈ），０．９０（ｓ，３Ｈ）；¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：１３．９５，１９．３８，２０．６４，２３．６５，３１．６１，３２．０９，３２．５８，３６．１４，３７．２４，４２．２２，４６．１０，４９．９５，５０．３１，７１．６９，８４．１８，１１１．８７，１２１．３１，１４０．８２，１４３．０２。

３β，１７β−ジヒドロキシ−２０，２１−エポキシ−５−アンドロステン

無水ジクロロメタン（５ｍＬ）に溶かした１７α−ビニル−５−アンドロステン−３β，１７β−ジオール（１５０ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）の溶液に、バナジウムアセチルアセトネート（２．５ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）および７０％ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（０．１４ｍＬ、０．９４ｍｍｏｌ）を−１０℃で連続的に加えた。得られた混合液を０℃で１２時間撹拌した。反応の終了後、この混合液をジクロロメタンで希釈し、有機層をＨ₂Ｏ、飽和Ｎａ₂ＳＯ₃およびかん水で抽出してから、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、溶媒を減圧蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ジクロロメタン／酢酸エチル６：１）で精製して、３β，１７β−ジヒドロキシ−２０，２１−エポキシ−５−アンドロステンを白色結晶性固体として得た。収量：５０ｍｇ（３２％）；ｍ．ｐ．１６５〜１６８℃；

¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：５．３５（ｓ，１Ｈ），３．０８（ｔ，Ｊ＝４．２７Ｈｚ，１Ｈ），２．８７（ｑ，Ｊ＝３．０５Ｈｚ，１Ｈ），２．７６（ｄ，Ｊ＝３．０５Ｈｚ，１Ｈ），１．２４−２．２９（ｍ，１９Ｈ），１．０２（ｓ，３Ｈ₃），０．９２（ｓ，３Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：１３．９１，１９．３８，２０．５４，２４．０４，３１．６１，３２．３８，３６．０１，３６．５９，３７．２７，４２．２２，４３．１９，４５．４８，５０．１１，５１．４４，５１．７９，５４．８３，５６．２２，７１．６９，７９．６８，１２１．２４，１４０．８１。

（２０Ｓ）−３β，２１−ジヒドロキシ−１７β，２０−エポキシ−５−プレグネン

無水ＭｅＯＨ（２ｍＬ）に溶かした３β，１７β−ジヒドロキシ−２０，２１−エポキシ−５−アンドロステン（４０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ₂ＣＯ₃（４１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合液を室温で１２時間撹拌した。反応の終了後、この混合液を酢酸エチルで希釈し、有機層をＨ₂Ｏおよびかん水で抽出し、次いで無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。溶媒を減圧蒸発させ、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ジクロロメタン／酢酸エチル３：１）で精製して、（２０Ｓ）−３β，２１−ジヒドロキシ−１７β，２０−エポキシ−５−アンドロステンを白色結晶性固体として得た。収量：３２ｍｇ（８０％）；

¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：５．２８（ｓ，１Ｈ），３．６３（ｑ，Ｊ＝４．２７Ｈｚ，１Ｈ），３．４０−３．４９（ｍ，２Ｈ），３．１２（ｑ，Ｊ＝３．６６Ｈｚ），１．３６−２．２１（ｍ，２１Ｈ），０．９５（ｓ，３Ｈ），０．８１（ｓ，３Ｈ）。

［実施例３］
（２０Ｓ）−３β−ヒドロキシ−１７β，２０−エポキシ−２０−（２−ブロモエチニル）−５−アンドロステンの調製
３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−５−アンドロステン−１７−オン

乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶かしたデヒドロエピアンドロステロン（１ｇ、３．４７ｍｍｏｌ）の溶液にイミダゾール（５９１ｍｇ、８．９８１ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。得られた混合液を３０分間撹拌し、ｔ−ブチル−ジフェニルシリルクロリド（２．２２ｍＬ、８．６８１ｍｍｏｌ）を加え、反応液を５０℃で一晩撹拌した。反応の終了後、２０ｍＬの飽和ＮＨ₄Ｃｌを加え、得られた混合液を３０分間撹拌し、溶媒を減圧蒸発させた。残留物に酢酸エチルを加え、有機層をＨ₂Ｏおよびかん水で抽出し、次いで無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。溶媒を減圧蒸発させ、残留物を４０〜６０℃のＥｔＯＨ／石油エーテルで再結晶した。この固体を濾過してから、母液をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ９５：５）で精製した。収量：１２８２ｍｇ（７０％）；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：７．８０−７．７４（ｍ，４Ｈ），７．４２−７．４０（ｍ，６Ｈ），５．２２（ｂｓ，１Ｈ），３．６２（ｂｓ，１Ｈ），２．５０−０．９０（ｍ，１９Ｈ），１．１４（ｓ，９Ｈ），１．０７（ｓ ３Ｈ），０．８９（ｓ，３Ｈ）。

３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１７α−ビニル−５−アンドロステン−１７β−オール

乾燥ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶かした３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−５−アンドロステン−１７−オン（８６１ｍｇ、１．６３５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦに溶かしたビニルマグネシウムブロミド１Ｍの溶液（１６．３５ｍＬ、１６．３５ｍｍｏｌ）を−７８℃で滴下して加えた。混合液を−２０℃で２時間、次いで室温で一晩撹拌した。飽和ＮＨ₄Ｃｌ（２５ｍＬ）を反応槽に流し込み、この混合液を３０分間撹拌し、溶媒を減圧蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ９５：５）で精製して、３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１７α−ビニル−５−アンドロステン−１７β−オールを収率６０％で得た。

¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：７．６７−７．６５（ｍ，４Ｈ），７．３９−７．２５（ｍ，６Ｈ），６．００（ｄｄ，Ｊ＝１０．９８，１７．７０Ｈｚ，１Ｈ），５．１４−５．０５（ｍ，３Ｈ），３．５０−３．４６（ｍ，１Ｈ），２．３２−０．８７（ｍ，１９Ｈ），１．０５（ｓ，９Ｈ），０．９９（ｓ ３Ｈ），０．８８（ｓ，３Ｈ）。

３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１７β−ヒドロキシ−２０，２１−エポキシ−５−アンドロステン

乾燥ジクロロメタン（３．７ｍＬ）に溶かした３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１７α−ビニル−５−アンドロステン−１７β−オール（１９１ｍｇ、０．３４５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＶＯ（ａｃａｃ）₂（１．９５ｍｇ、０．０２１当量）および０．２９３６ｍＬのｔ−ＢｕＯＯＨ（０．６９ｍｍｏｌ、１，２−ジクロロエタンに溶かした約２．３５Ｍ溶液）を−１０℃で連続的に加えた。この反応混合液を０℃で一晩撹拌し、次いで１５ｍＬのジクロロメタンで希釈し、水、Ｎａ₂ＳＯ₃およびかん水（１×１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、溶媒を減圧蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：石油エーテル：ジエチルエーテル９５：５）で精製して、３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１７β−ヒドロキシ−２０，２１−エポキシ−５−アンドロステンを得た。収量：１２７ｍｇ（６５％）；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：７．７３−７．６９（ｍ，４Ｈ），７．４３−７．３６（ｍ，６Ｈ），５．１７−５．１５（ｍ，１Ｈ），３．５９−３．５３（ｍ，１Ｈ），３．０９−３．０７（ｍ，１Ｈ），２．８９−２．８７（ｍ，１Ｈ），２．７６−２．７３（ｍ，１Ｈ），２．４２−２．３４（ｍ，１Ｈ），２．２１−０．８４（ｍ，１８Ｈ），１．０９（ｓ，９Ｈ），１．０４（ｓ，３Ｈ），０．９３（ｓ，３Ｈ）。

（２０Ｓ）−３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−２１−ヒドロキシ−１７β，２０−エポキシ−５−プレグネン

乾燥ＭｅＯＨ：乾燥ＴＨＦ（１．５：１．５ｍＬ）の混合液に溶かした３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１７β−ヒドロキシ−２０，２１−エポキシ−５−アンドロステン（５１ｍｇ、０．０８９４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ₂ＣＯ₃（３１ｍｇ、０．２２３５ｍｍｏｌ）を室温で加えた。この反応混合液を室温で一晩撹拌し、次いでＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）で希釈し、水およびかん水で洗浄した。有機層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、溶媒を減圧蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：シクロヘキサン：ＥｔＯＡｃ８：２）で精製して（２０Ｓ）−３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−２１−ヒドロキシ−１７β，２０−エポキシ−５−アンドロステンを収率８０％で得た。

¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：７．６９−７．６５（ｍ，４Ｈ），７．４２−７．３３（ｍ，６Ｈ），５．１３−５．１２（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｄｄ，Ｊ＝３．６６，１２，２０Ｈｚ，１Ｈ）３．５８−３．４９（ｍ，２Ｈ），３．１７（ｄｄ，Ｊ＝４．２７，６．７１Ｈｚ，１Ｈ），２．３７−２．２９（ｍ，１Ｈ），２．１７−２．１１（ｍ，１Ｈ），１．９９−０．８１（ｍ，１７Ｈ），１．０５（ｓ，９Ｈ），０．９９（ｓ ３Ｈ），０．８５（ｓ，３Ｈ）。

（２０Ｓ）−３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１７β，２０−エポキシ−５−アンドロステン−２１−カルボキシアルデヒド

乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）に溶かした３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−２１−ヒドロキシ−１７β，２０−エポキシ−５−アンドロステン（５１ｍｇ、０．０８９４ｍｍｏｌ）の溶液に、デス−マーチンペリオジナン（Dess-Martin Periodinane）（７５．８ｍｇ、０．１７８２ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。この混合液を室温で１時間撹拌した。反応混合液をジエチルエーテル（１０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ₃：飽和Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₃ １：２の混合液（１０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ₃（１０ｍＬ）およびかん水（１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、溶媒を減圧蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：シクロヘキサン：ＥｔＯＡｃ９：１）で精製して（２０Ｓ）−３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１７β，２０−エポキシ−５−アンドロステン−２１−カルボキシアルデヒドを得た。収量４６．６ｍｇ（９８％）。¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：９．２６（ｄ，Ｊ＝５．４９Ｈｚ，１Ｈ），７．６９−７．６７（ｍ，４Ｈ），７．４２−７．３４（ｍ，６Ｈ），５．１４−５．１２（ｍ，１Ｈ），３．５６−３．５１（ｍ，１Ｈ），３．３３（ｄ，Ｊ＝４．８８Ｈｚ，１Ｈ），２．３７−２．２９（ｍ，１Ｈ），２．１８−０．８６（ｍ，１８Ｈ），１．０６（ｓ，９Ｈ），０．９９（ｓ ３Ｈ），０．９１（ｓ，３Ｈ）。

３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，３，３−トリブロモアリル）−５−アンドロステン

乾燥ジクロロメタン（２ｍＬ）に溶かした（２０Ｓ）−３β−（ｔ−ブチルジフェニル−シリルオキシ）−１７β，２０−エポキシ−５−アンドロステン−２１−カルボキシアルデヒド（４５ｍｇ、０．０７９２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｈ₃Ｐ（１１３．８ｍｇ、０．４３４ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。０℃で１０分間撹拌した後、ＣＢｒ₄（７０．７８ｍｇ、０．２１３ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合液を０℃で１時間撹拌した後、水（１ｍＬ）を加えた。反応混合液をジクロロメタンで抽出し、有機層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させてから、溶媒を減圧蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：シクロヘキサン：ＥｔＯＡｃ９８：２）で精製して３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，３，３−トリブロモ−アリル）−５−アンドロステンを得た。

収量３２．８ｍｇ（５２％）；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：７．６８−７．６６（ｍ，４Ｈ），７．４１−７．３６（ｍ，６Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝９．７７Ｈｚ，１Ｈ），５．１１（ｂｓ，１Ｈ），４．８５（ｄ，Ｊ＝１０．３７Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｂｓ，１Ｈ），２．４３−０．８７（ｍ，１９Ｈ），１．０６（ｓ，９Ｈ），０．９９（ｓ ３Ｈ），０．９５（ｓ，３Ｈ）。

（２０Ｓ）−３β−（ｔ−ブチルジフェニルシリルオキシ）−１７β，２０−エポキシ−２０−（２，２−ジブロモビニル）−５−アンドロステン

乾燥ＴＨＦ（１ｍＬ）に溶かした３β−（ｔ−ブチルジフェニル−シリルオキシ）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，３，３−トリブロモ−アリル）−５−アンドロステン（３２．８ｍｇ、０．０４１３６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦに溶かした１Ｍ溶液０．０８２７１ｍＬ、０．０８２７１ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。０℃で１分間撹拌した後、この温度で反応液に水（２ｍＬ）を加えた。反応混合液をジエチルエーテルで抽出し、有機層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させてから、溶媒を減圧蒸発させた。残留物は、さらに次の反応に用いるのに十分に純粋であった。収量：３０ｍｇ（定量的）；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：７．６９−７．６５（ｍ，４Ｈ），７．４４−７．３３（ｍ，６Ｈ），６．１９（ｄ，Ｊ＝６．７１Ｈｚ，１Ｈ），５．１４−５．１２（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｄ，Ｊ＝６．７１Ｈｚ，１Ｈ），３．５９−３．４７（ｍ，１Ｈ），２．３８−２．２９（ｍ，１Ｈ），２．１６−２．１０（ｍ，１Ｈ），１．９９−１．９２（ｍ，１Ｈ），１．７９−０．８５（ｍ，１６Ｈ），１．０５（ｓ，９Ｈ），０．９９（ｓ ３Ｈ），０．８５（ｓ，３Ｈ）。

（２０Ｓ）−３β−ヒドロキシ−１７β，２０−エポキシ−２０−（２−ブロモエチニル）−５−アンドロステン

乾燥ＴＨＦ（１ｍＬ）に溶かした（２０Ｓ）−３β−（ｔ−ブチルジフェニル−シリルオキシ）−１７β，２０−エポキシ−２０−（２，２−ジブロモビニル）−５−アンドロステン（３０ｍｇ、０．０４２１２ｍｍｏｌ）の０℃の溶液に、ＴＨＦに溶かしたＴＢＡＦの１Ｍ溶液（０．０８４２４ｍＬ、０．０８４２４ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で１０時間撹拌し、水を加えた。この反応混合液をジエチルエーテルで抽出し、有機物を無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させてから、溶媒を減圧蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：シクロヘキサン：ＥｔＯＡｃ９８：２）で精製して（２０Ｓ）−３β−ヒドロキシ−１７β，２０−エポキシ−２０−（２−ブロモエチニル）−５−アンドロステンを得た。収量：１８ｍｇ（定量的）；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：５．３７（ｂｓ，１Ｈ），３．６０−３．４６（ｍ，１Ｈ），３．４７（ｓ，１Ｈ），２．３８−０．８６（ｍ，１９Ｈ），１．０２（ｓ，３Ｈ），０．８９（ｓ，３Ｈ）。

［実施例４］
３β，２１−ジヒドロキシ−１７α，２０−エポキシ−５−プレグネンの調製
（３β−ヒドロキシ−５−アンドロステン−１７−イリデン）−アセトニトリル

乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶かしたｔ−ＢｕＯＫ（４．１４ｍｍｏｌ、４６５ｍｇ）の０℃の溶液に、ジエチルシアノメチルホスホネート（２．７６ｍｍｏｌ、０．４４ｍＬ）を加え、反応液を１時間撹拌した。上記混合液に、乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶かしたＤＨＥＡ（０．６９ｍｍｏｌ、２００ｍｇ）の溶液を滴下して加え、反応が終了するまでこの混合液を室温で撹拌した。飽和ＮＨ₄Ｃｌを添加して反応をクエンチし、酢酸エチルで抽出し、有機層をかん水で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させてから、溶媒を減圧蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：石油エーテル：ＥｔＯＡｃ６：４）で精製して上記の化合物を得た。収量：１７５ｍｇ（８１．５％）。¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：５．２８（ｂｓ，１Ｈ），５．０６（ｓ，０．３Ｈ），４．９６（ｓ，０．７Ｈ），３．４９−３．４１（ｍ，１Ｈ），２．７−０．９（ｍ，１９Ｈ），０．９９（ｓ，３Ｈ），０．９１（ｓ），０．７９（ｓ，３Ｈ）。¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：１８０．９，１７９．２，１４１．１，１４０．９，１２０．９，１２０．８，１１７．４，１１６．６，８７．９，８７．８，７１．３，６０．４，５５．２，５４．１，４９．９，４６．４，４５．９，４２．１，３７．２，３６．５，３４．５，３２．４，３１．５，３１．４，３０．２，２３．８，２０．８，２０．７，１９．４，１７．７，１６．６。

（３β−ヒドロキシ−５−アンドロステン−１７−イリデン）−アセトアルデヒド

乾燥ジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶かした（３β−ヒドロキシ−５−アンドロステン−１７−イリデン）−アセトニトリル（１５０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＢＡＬ−Ｈ（ジクロロメタンに溶解しており、１Ｍ、１．４４ｍｍｏｌ）の溶液を−７８℃で加え、この反応混合液を−７８℃で３０分および室温で５時間撹拌した。反応混合液をジクロロメタンで希釈し、Ｎａ−Ｋ酒石酸溶液を加えた。有機層をかん水で抽出し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させてから、溶媒を減圧蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：石油エーテル：アセトン８：２）で精製して上記化合物を得た。収量：１５１ｍｇ（９３％）。

¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：１０．０２（ｄ，Ｊ＝８．５４Ｈｚ，０．６３Ｈ），９．７４（ｄ，Ｊ＝７．９３，０．３７Ｈ），５．７４−５．７１（ｍ，０．６３Ｈ），５．６７−５．６４（ｍ，０．３７Ｈ），５．２５−５．２１（ｍ，１Ｈ），３．４４−３．３９（ｍ，１Ｈ），２．８９−０．９３（ｍ，１９Ｈ），０．９９（ｓ）および０．９３（ｓ）および０．７８（ｓ）（３つはすべて６Ｈ）；¹³Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：１９２．４，１９０．７，１８０．５，１７９．４，１４０．９，１２４．０，１２０．８，１１９．３，７１．２，６５．０，５５．６，５３．３，５０．１，４９．４，４６．９，４６．３，４２．０，３８．６，３７．１，３６．６，３６．５，３６．４，３４．７，３３．５，３１．５，３１．３，２７．７，２４．３，２３．９，２１．３，２０．８，１９．３，１８．８，１７．８。

１７−（２−ヒドロキシ−エチリデン）−５−アンドロステン−３β−オール

ＭｅＯＨ（２．５ｍＬ）に溶かした（３β−ヒドロキシ−５−アンドロステン−１７−イリデン）−アセトアルデヒド（０．２４ｍｍｏｌ、７５ｍｇ）の溶液に、ＣｅＣｌ₃−７Ｈ₂Ｏ（０．２４ｍｍｏｌ、８９ｍｇ）およびＮａＢＨ₄（０．２４ｍｍｏｌ、１０ｍｇ）を連続的に加えた。反応の終了後、飽和ＮＨ₄ＣｌをｐＨ７まで加えた。この混合液を酢酸エチルで希釈し、有機層をかん水で抽出し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させてから、溶媒を減圧蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：石油エーテル：アセトン８：２）で精製して上記化合物を得た。収量：７０ｍｇ（９２％）。

¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：５．３６−５．２４（ｍ，２Ｈ），４．３３−３．９９（ｍ，２Ｈ），３．４２−３．３９（ｍ，１Ｈ），２．４−０．９（ｍ，１９Ｈ），１．０２（ｓ）および０．９４（ｓ）（共に３Ｈ），０．９０（ｓ）および０．７７（ｓ）共に３Ｈ。

３β，２１−ジヒドロキシ−１７α，２０−エポキシ−５−プレグネン

乾燥ジクロロメタン（２．２ｍＬ）に溶かした１７−（２−ヒドロキシ−エチリデン）−５−アンドロステン−３β−オール（０．２２ｍｍｏｌ、７０ｍｇ）の溶液に、Ｋ₂ＣＯ₃（０．２６ｍｍｏｌ、３６ｍｇ）および５５％ｍ−クロロ過安息香酸（０．２２ｍｍｏｌ、６１ｍｇ）を加え、反応が終了するまでこの混合液を室温で撹拌した。固体を濾別し、濾液を減圧蒸発させ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：石油エーテル：酢酸エチル１：１）で精製して上記化合物を収率７５％で得た。

¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：５．３６−５．３４（ｍ，１Ｈ），３．９０−３．５３（ｍ，３Ｈ），３．１５−３．１１（ｍ，１Ｈ），２．４−０．９（ｍ，１９Ｈ），０．９９（ｓ，３Ｈ），０．８３（ｓ，３Ｈ）。

［実施例５］
３β，２２−ジヒドロキシ−１７β，２１−オキセタニル−５−プレグネンの調製
１７α−アリル−５−アンドロステン−３β，１７β−ジオール

無水テトラヒドロフラン（４ｍＬ）に溶かした３β−アセチル−５−アンドロステン−１７−オン（２００ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液に、アリルマグネシウムブロミド（テトラヒドロフランに溶解しており、１．７Μ、３．５２ｍＬ、６ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で滴下して加え、得られた混合液を室温で１２時間撹拌した。反応の終了後、飽和アンモニウムクロリドを加え、得られた混合液を酢酸エチルで抽出した。有機層をかん水で洗浄し、次いで無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、溶媒を減圧蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：シクロヘキサン／酢酸エチル８５：１５）で精製して、１７α−アリル−５−アンドロステン−３β，１７β−ジオールを白色結晶性固体として得た。収量：１９０ｍｇ（９５％）。

３β，１７β−ジヒドロキシ−２１，２２−エポキシ−５−アンドロステン

無水ジクロロメタン（６ｍＬ）に溶かした１７α−アリル−５−アンドロステン−３β，１７β−ジオール（１９０ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）の溶液に、バナジウムアセチルアセトネート（６．６ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）および７０％ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（０．７４ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）を−１０℃で連続的に加えた。得られた混合液を０℃で１２時間撹拌した。反応の終了後、この混合液をジクロロメタンで希釈し、有機層をＨ₂Ｏ、飽和Ｎａ₂ＳＯ₃およびかん水で抽出し、次いで無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させてから、溶媒を減圧蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ジクロロメタン／酢酸エチル６：１）で精製して、３β，１７β−ジヒドロキシ−２０，２１−エポキシ−５−アンドロステンを白色結晶性固体として得た。収量：６９ｍｇ（３５％）；¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：５．３５（ｂｓ，１Ｈ），３．５３（ｍ，１Ｈ），３．２６（ｍ，１Ｈ），２．８４−２．９７（ｍ，１Ｈ），２．５２−２．４９（ｍ，１Ｈ），２．２８−１．０１（ｍ，Ｈ），１．０２（ｓ，３Ｈ），０．９０および０．８９（ｓ，３Ｈ）。

３β，２２−ジヒドロキシ−１７β，２１−オキセタニル−５−プレグネン

無水塩化メチレン（１２ｍＬ）に溶かした３β，１７β−ジヒドロキシ−２１，２２−エポキシ−５−アンドロステン（４０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、ｐ−ＴｓＯＨ（０．６ｍｍｏｌ、１１４ｍｇ）を加え、得られた混合液を室温で１２時間撹拌した。反応の終了後、固体を濾過で除去し、濾液を減圧蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して目的の１７−スピロ−オキセタン誘導体を得た。

［実施例６］
１７β−スピロ−［３β−ヒドロキシ−５−アンドロステン−１７，２’−オキシラン−７−イリデンアミノオキシ］−酢酸の調製

無水ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶かしたデヒドロエピアンドロステロン−７−カルボキシメチルオキシム（２０ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）の溶液に、ヨウ化トリメチルスルホニウム（３２ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）およびｔ−ＢｕＯＫ（１８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を０℃で加え、得られた混合液を室温で１０時間撹拌した。反応の終了後、水を加え、この溶液を希ＨＣｌでｐＨ５まで酸性化し、得られた混合液をジクロロメタンで抽出した。有機層をかん水で洗浄し、次いで無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、溶媒を減圧蒸発させた。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：石油エーテル４０°〜６０℃／アセトン８：２）で精製して表題の化合物を得た。

［実施例７］
神経冠由来のＰＣ１２細胞を、血清除去により惹起された細胞アポトーシスから保護するための、合成スピロニューロステロイドの使用
方法
神経冠由来のＰＣ１２細胞を、５％ＣＯ₂、３７℃で、２ｍＭのＬ−グルタミン、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００単位／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％ウマ血清および５％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養維持した。無血清培地に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充した。様々な濃度で使用した複数のステロイドを、エタノールを用いて最初に希釈した。対照を含む各ウェルのエタノールの最終濃度は０．０１％とした。コンジュゲートＤＨＥＡ−ＢＳＡをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で最初に希釈した。

細胞を血清の非存在下で１２時間培養し、ＤＨＥＡおよび１０ｎＭの様々な合成スピロニューロステロイドを補充した。細胞アポトーシスを以下の２通りの方法を用いて定量した。ＡＰＯＰｅｒｃｅｎｔａｇｅアポトーシスアッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社、Ｂｅｌｆａｓｔ、北アイルランド）を用いて、製造業者の指示書に従いアポトーシスを定量した。細胞溶解後に、カラーフィルターマイクロプレート比色計（Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭｉｃｒｏＥｌｉｓａ ｒｅａｄｅｒ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、バージニア州）を用いて５５０ｎｍ（参照フィルター６２０ｎｍ）でアポトーシス細胞に取り込まれた色素を測定して、アポトーシスを定量した（図１および図２を参照）。ＦＡＣＳ分析：アポトーシス細胞のＦＡＣＳ分析を、我々のプロトコル(Proc Natl Acad Sci USA 101,8209 (2004))に従い行った。ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）を用いてフローサイトメトリーを行い、結果をＦＡＣＳｃａｎおよびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェアで解析した（図３を参照）。

ＡｐｏＰｅｒｃｅｎｔａｇｅアッセイ（図１）に示すように、血清の非存在下でのＰＣ１２細胞の培養では、血清を補充した細胞培養に比べてアポトーシスが強く誘導された。ＤＨＥＡ、非透過性ＤＨＥＡ−ＢＳＡコンジュゲートおよびスピロニューロステロイドは、血清除去により惹起されたアポトーシスをほぼ５０％抑制し、アポトーシスからＰＣ１２細胞を保護し、そのＩＣ₅₀は０．１５ｎＭであった（図２）。また、合成１７−スピロニューロステロイドも強力な抗アポトーシス作用による細胞保護効果を示し、ＢＮＮ−５０、ＢＮＮ−９３およびＢＮＮ−１２４のＩＣ₅₀はそれぞれ０．０８８、４．１６および６８．４ｎＭであった（図２）。合成スピロニューロステロイドの抗アポトーシス作用はＦＡＣＳ分析でも確認された（図３）。

［実施例８］
神経冠由来のＰＣ１２細胞中で、神経保護効果がある抗アポトーシス性のＢｃｌ−２タンパク質を誘導することによる、合成スピロニューロステロイドの神経保護・抗アポトーシス作用に関する研究
方法
神経冠由来のＰＣ１２細胞を、１０ｎＭの様々なニューロステロイドを補充し、血清の非存在下で８時間培養した。インキュベーションの終了時に、細胞のライセートを１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけた。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、それを標準的なウエスタンブロット手順に従い処理した。タンパク質レベルを検出するため、膜を適切な抗体、Ｂｃｌ−２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カリフォルニア州、希釈度１：１００）、Ｂｃｌ−ｘＬ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチューセッツ州、希釈度１：１００）とインキュベートした。ＰＣベースの画像解析プログラムを用いて各バンドの強度を定量した（Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ社）、Ｏｎｔａｒｉｏ、カナダ）。タンパク質量を標準化するため、ブロットを剥がし、抗アクチン抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州、希釈度１：４００）で染色し、各標的タンパク質の濃度をアクチンに対して標準化した。

こうした実験の結果を図４に示す。ＰＣ１２細胞の血清除去（ＳＦ）により、抗アポトーシス性のＢｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬタンパク質のレベルが強く抑制された。ＤＨＥＡと、３種類のすべての合成スピロニューロステロイド（ＢＮＮ−５０、ＢＮＮ−９３およびＢＮＮ−１２４）とはこの作用を阻止し、１２時間で早くもタンパク質レベルが血清補充のレベル（Ｓ）と同程度になった。

［実施例９］
ＤＨＥＡ特異的膜受容体への結合後における合成スピロニューロステロイドの神経保護的・抗アポトーシス性作用に関する研究
方法
ラットＰＣ１２交感神経副腎細胞を２２５ｃｍ²のフラスコで培養し、ＰＢＳで２回洗浄した後、激しく振盪してフラスコから剥離させた。１５００ｇで遠心分離後、この細胞を、新たに加えたプロテアーゼ阻害剤（１ｍＭのＰＭＳＦおよび１μｇ／ｍｌのアプロチニン）を含むｐＨ７．４、４℃の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液中で超音波処理によりホモジナイズした。破砕されなかった細胞を１５００ｇで遠心分離（４℃で１０分）により除去し、１０２，０００ｇ、４℃で１時間遠心して膜を回収した。膜をトリス−ＨＣｌで１回洗浄し、５０ｍＭのグリシン（ｐＨ５．０）で４℃にて短時間（３分間）で酸性化させ、同じ緩衝液に再懸濁した。タンパク質量をＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）社製の試薬を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ法でアッセイした。１０^-12〜１０^-6Ｍの様々な濃度で最終容量を１００μｌとした、トリス−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）に加えた非標識のニューロステロイドおよびその合成スピロアナログの非存在下（全結合量の判定のため）または存在下で、膜（最終濃度２ｍｇ／ｍｌ）を５ｎＭの［³Ｈ］ＤＨＥＡとインキュベートした。水浴中にて３７℃で３０分インキュベーションした後、４℃の０．５％ＰＥＩ溶液で予め湿らせたＧＦ／Ｂフィルターで膜を回収した。フィルターを氷冷トリス−ＨＣｌで３回洗浄し、乾燥させ、シンチレーション媒体（Ｓｉｇｍａ Ｈｅｌｌａｓ、Ａｔｈｅｎｓ、ギリシャ）を補充し、β−シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）でトリチウムの効率（efficiency）を６０％としてカウントした。

結果を図５に示す。非標識のＤＨＥＡは、単離したＰＣ１２細胞膜に結合している［³Ｈ］ＤＨＥＡに対して競合し、そのＫ_Ｄは１．１ｎＭであった。１μＭでは、ほぼ完全に競合した（図５）。合成スピロニューロステロイドＢＮＮ−５０、ＢＮＮ−９３およびＢＮＮ−１２４では、顕著な置換（１μＭの特異的結合の約６０％）が実証され、見かけのＫ_Dはそれぞれ０．０１６、１１．２および０．３３ｎＭであったことから、３種の合成ニューロステロイドはどれも膜ＤＨＥＡ結合と強く相互作用すると考えられる。

［実施例１０］
合成スピロニューロステロイドを用いて、神経冠由来ドパミン作動性細胞からのドーパミンの産生および分泌を刺激する研究
方法
神経冠由来のドパミン作動性ＰＣ１２細胞を、１０⁶細胞／ウェルの濃度で、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングした６ウェルプレート中で増殖させた。細胞をニューロステロイドまたはビヒクルと複数の時間枠でインキュベートした。短時間の実験のインキュベーション時間は５〜３０分とし、長時間の場合は、３〜４８時間とした。１ｍＬの上清を、ドーパミン測定のため０．１ＭのＨＣｌ２００μｌを含むチューブに移し、¹²⁵Ｉをトレーサーとしてラジオイムノアッセイ（ＴｒｉＣａｔ（商標）ＲＩＡ、ＲＥ２９３９５、ＩＢＬ Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂ.、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）で測定した。この方法の分析感度は３０ｐｇ／ｍｌであり、そのアッセイ内ＣＶは９．５％で、そのアッセイ間ＣＶは１６．７％であった。ドーパミンとノルエピネフリンとの交差反応性は、＜０．０１３％であった。

チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）ＲＴ−ＰＣＲ：ドパミン作動性ＰＣ１２細胞からＴｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州）を用いて全ＲＮＡを抽出した。総容量２０μｌにて、ランダム六量体を用いたＴｈｅｒｍｏ−Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、１マイクログラムの全ＲＮＡを逆転写した。２マイクロリットルのＲＴ産物をテンプレートとして使用し、最終反応容量５０μｌで２ｍＭのＭｇＣｌ₂、１濃度(one strength)のＰＣＲ緩衝液、０．２ｍＭのセンスおよびアンチセンスプライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰおよび２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＢＤ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒで行った。ＴＨのプライマーは５’−ＴＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡ−３’（センス）、および５−ＣＣＴＣＧＡＡＧＣＧＣＡＣＡＡＡＡＴＡＣ−３（アンチセンス）であり、Ｇ３ＰＤＨでは５’−ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴ−３’（センス）、および５’−ＣＡＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ−３’（アンチセンス）であった。オリゴヌクレオチドはＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ（Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）により合成した。逆転写後、ｃＤＮＡ産物をＰＣＲで３３サイクル増幅した。サイクル数（３３）については、ｃＤＮＡの投入量に対して産物の増幅が直線の範囲内になるように選択した。ＲＮＡおよびｃＤＮＡ調製物の質が良好であることを保証するため、Ｇ３ＰＤＨのＰＣＲを並行して行った。各サイクルは、変性に９２℃で６０秒、アニーリングに５３℃で１２０秒、伸長に７２℃で１８０秒（Ｇ３ＰＤＨではそれぞれ９８℃で６０秒、５５℃で９０秒、７２℃で１５０秒）、からなる。１０μｌの増幅産物（ＴＨは３６８ｂｐ、Ｇ３ＰＤＨは９８３ｂｐ）を２％アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。

ドパミン作動性ＰＣ１２細胞をＤＨＥＡまたは合成スピロニューロステロイドＢＮＮ−５０およびＢＮＮ−９３（１０^-7Ｍ）に短時間（５〜３０分）曝露し、培養液中のドーパミンの濃度を、上記の通りラジオイムノアッセイで測定した。試験対象の３種のステロイドはどれも、速やかにかつ統計学的に有意にドーパミン分泌を刺激し、培養液中のレベルが１０分以内に２倍になった（図６Ａを参照）。我々はさらに、長時間のステロイドの作用も試験した。より具体的には、ＰＣ１２細胞をＤＨＥＡＳまたは合成スピロニューロステロイドＢＮＮ−５０およびＢＮＮ−９３（１０^-7Ｍ）と３〜４８時間インキュベートし、培養液中のドーパミンの濃度を測定した。ＰＣ１２細胞とＤＨＥＡＳまたは合成ニューロステロイドとのインキュベーションの結果、ドーパミンレベルが上昇し、２４時間でピークに達した（図６Ｂを参照）。こうしたＤＨＥＡＳおよび合成ニューロステロイドの長時間の作用から、それらが、ドーパミン分泌に対する急性作用（図６Ａ）ばかりでなく、ドパミン作動性ニューロンにおけるドーパミンの新たな産生にも影響を与えることが示唆される。実際に、３種のニューロステロイドはどれも、ドーパミン生合成の律速酵素チロシンヒドロキシラーゼのｍＲＮＡを強力に誘導した（図６Ｃを参照）。

［実施例１１］
合成スピロニューロステロイドの神経原性特性
方法
野生型マウスから生成された皮質の１次神経球（２１ｄ）を、ＥＧＦおよびｂＦＧＦ（最終濃度はそれぞれ２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、無血清培地中でＰＬＬおよびラミニンコートしたカバーガラスに付着させて培養した。スクリーニングのため、この培地に、１０^-7Ｍの最終濃度でエタノール、レチノイン酸（ａｔ−ＲＡ）、ＤＨＥＡまたは合成スピロニューロステロイドＢＮＮ−９３を補充した。

ＢＮＮ−９３およびＤＨＥＡを補充した神経球では、培養から２４〜４８時間以内に、他の化合物およびエタノール対照に比べて神経細胞が神経球の周辺に広く遊走することが実証された（図７を参照）。この作用は、ＥＧＦ／ｂＦＧＦ依存性のようであった。６日目までには、培養したすべての神経球で、カバーガラス上の神経細胞の遊走の程度が同じになった。培養液中の１日目の遊走の程度については、ほとんどの条件下で細胞が球（sphere）から周辺に遊走したため、大部分を標準化した。示した写真（図７）は、培養液の６日目のものであり、遊走作用はそれ程劇的でないものの、やはり明らかである。さらに、マウス胎仔脳から単離された神経前駆細胞を１００ｎＭのＢＮＮ−９３またはビヒクル（対照）に２４時間曝露した。ＢＮＮ−９３は、前駆細胞の神経発生および神経細胞への分化を刺激し、神経突起の形成を促進する（図８の矢印を参照）。

［実施例１２］
合成スピロニューロステロイドのエストロゲン特性
閉経後症候群を１７β−エストラジオール（Ｅ２）で処置すると、乳癌および／または子宮内膜癌の発症リスクの上昇が認められる(Arch Intern Med. 166, 1027 (2006))。Ｅ２による癌細胞の増殖の刺激作用は、エストロゲン受容体α（ＥＲα）により誘導される(Mol Endocrinol. 13, 969 (1999))。ＢＮＮ−５０、ＢＮＮ−９３およびＢＮＮ−１２４はＯ−Ｏ距離が１０．９〜１２．５Åで２個の水素結合を形成し、したがって、ＥＲα結合部位（binding cavity）に結合しうるため(Chem. Biol. 11, 397 (2004))、レポーターとして乳房（ＭＣＦ−７細胞）および子宮（Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞）由来のヒト腺癌細胞を用いて、これらのニューロステロイドのエストロゲンアゴニズム／アンタゴニズム特性を調べることは不可欠であった。完全なエストロゲンアゴニズム（Ｅ２≧０．１ｎＭ）およびアゴニズム無し（ビヒクルのみ）の対照を用いて、ニューロステロイドを、そのエストロゲン効力がＥ２のそれ（１００と同じに設定）に対して、＞１００％、７６〜１００％、２６〜７５％、１０〜２５％および１〜１０％であるかに応じて、スーパーアゴニスト、完全なアゴニスト、部分的なアゴニスト、弱いアゴニストおよび微弱なアゴニストに分類した。同様に、ＩＣＩ１８２，７８０によるＥ２（０．１ｎＭ）作用の完全なアンタゴニズム（≧１０ｎＭ）およびアンタゴニズム無し（ビヒクルのみ）の対照を用いて、ニューロステロイドを、そのＥ２作用の抑制が、ＩＣＩ１８２，７８０のそれの７６〜１００％、２６〜７５％、１０〜２５％および１〜１０％であるかに応じて、完全なアンタゴニスト、部分的なアンタゴニスト、弱いアンタゴニストおよび微弱なアンタゴニストに分類した。対照とニューロステロイド処置した細胞との差を、１元配置ＡＮＯＶＡを用いて評価した。ｐ値が＜０．０５の場合に有意と判定した。

方法
ＭＣＦ−７ヒト乳腺癌細胞（ＡＴＣＣ由来）およびＩｓｈｉｋａｗａ子宮内膜腺癌細胞（ＥＣＡＣＣ由来）の増殖に対するニューロステロイドの作用を判定するため、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ製）を補充したダルベッコ最小基礎培地（ＤＭＥＭ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ₂で細胞を培養し、トリプシン０．２５％−ＥＤＴＡ０．０２％溶液を使用して継代した。細胞増殖に対するニューロステロイドの作用をＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］および標準的な手法(Chem. Biol. 11, 397 (2004))を用いて判定した。簡単に説明すると、９６ウェル平底マイクロプレートの、１％デキストラン被覆チャコール処理ＦＢＳ（ＤＣＣ−ＦＢＳ）を補充したフェノールレッド不含培地中に、細胞を１０，０００細胞／ウェルの密度で蒔いた。２４時間後、被検化合物の希釈系列を加え（最初の希釈にはＤＭＳＯを用い、その後は培養液で希釈）、被検化合物を含む新鮮な培地を４８時間ごとに加え、６日後、培地を除去し、無血清フェノールレッド不含培地で細胞を１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（Sigma製）と４時間インキュベートした。生成されたＭＴＴ−ホルマザンをイソプロパノールで可溶化し、Ｓａｆｉｒｅプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ製）を用いて５５０ｎｍと６９０ｎｍの吸光度をモニターして測定した。培地のみを加えた細胞をアゴニズム無しの対照とし、ＩＣＩ１８２，７８０（Tocris製）および／またはＥ２（Sigma製）で処理したものをそれぞれ完全なアンタゴニズムおよびアゴニズム対照とした。

天然および商品化学物質の中からＥ２アゴニスト／アンタゴニストを検出するのに非常に感度の良い手段である(Planta Med. 72, 488 (2006))Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞のアルカリホスファターゼ活性を誘導するＥ２に対するニューロステロイドの作用を判定するため、上記のように細胞を培養し、継代した。次いで、９６ウェル平底マイクロ培養プレートの、５％ＤＣＣ−ＦＢＳを補充したフェノールレッド不含培地中に、１ウェル当たり１２，０００細胞の密度で細胞を蒔いた。２４時間後、新鮮培地を加え、続いて被検化合物（最初の希釈にはＤＭＳＯを用い、その後は培養液で希釈）を加え、細胞を７２時間培養し、次いでＰＢＳで洗浄し、プレートを反転させ、ペーパータオル上に優しくブロットさせ、−８０℃で少なくとも１５分間置き、室温で５〜１０分間解凍してから、氷上に移した。次いで、５ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェート、０．２４ｍＭのＭｇＣｌ₂および１Ｍのジエタノールアミン（ｐＨ９．８）を含む５０μｌの氷冷溶液を加え、細胞を室温まで昇温し（時間ゼロ）、黄色のｐ−ニトロフェノールを時間と共に蓄積させた。培地のみを加えた細胞をアゴニズム無しの対照とし、ＩＣＩ１８２，７８０および／またはＥ２で処理した細胞をそれぞれ完全なアンタゴニズムおよびアゴニズムの対照とした。陽性対照が約１．２の吸光度（Ａ_４０５）を示すまで、Ｓａｆｉｒｅプレートリーダーを用いて３０分ごとに４０５ｎｍで色をモニターした。様々な試験系におけるスピロニューロステロイドのエストロゲンアゴニスト／アンタゴニスト特性を表１に報告する。

［実施例１３］
神経成長因子受容体ＴｒｋＡおよびｐ７５ＮＴＲに対する合成スピロニューロステロイドの結合能、活性化能または阻害能の研究
方法
神経成長因子（ＮＧＦ）の高親和性受容体ＴｒｋＡおよび低親和性受容体ｐ７５ＮＴＲのｃＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした(Ann Rev Biochem 72:604, 2003)。この２つのＮＧＦ受容体サブタイプを発現している形質移入体をフラスコで培養し、ＰＢＳで２回洗浄した後、フラスコから剥離させた。１５００ｇで遠心分離後、それらを、新たに加えたプロテアーゼ阻害剤（１ｍＭのＰＭＳＦおよび１μｇ／ｍｌのアプロチニン）を含むｐＨ７．４、４℃の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液中で超音波処理によりホモジナイズした。破砕されなかった細胞を１５００ｇで遠心分離（４℃で１０分）により除去し、膜を、１０２，０００ｇ、４℃で１時間遠心して回収した。膜をトリス−ＨＣｌで１回洗浄し、５０ｍＭのグリシン（ｐＨ５．０）で４℃にて短時間（３分間）酸性化させ、同じ緩衝液に再懸濁した。タンパク質量をBio-Rad（Hercules、カリフォルニア州）製の試薬を用いてBradford法でアッセイした。１０^-12〜１０^-6Ｍの様々な濃度の非標識のＢＮＮ−１２４の非存在下（全結合量の判定のため）または存在下で、最終容量１００μｌで、トリス−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）中で、膜（最終濃度２ｍｇ／ｍｌ）を５ｎＭの［³Ｈ］ＤＨＥＡとインキュベートした。水浴中にて３７℃で３０分インキュベーション後、４℃の０．５％ＰＥＩ溶液で予め湿らせたＧＦ／Ｂフィルター上に膜を回収した。フィルターを氷冷トリス−ＨＣｌで３回洗浄し、乾燥させ、β−シンチレーションカウンター（Perkin Elmer、Foster City、カリフォルニア州）でトリチウムの効率（efficiency）を６０％としてカウントした。

結果を図９に示す。非標識のＢＮＮ−１２４は、ＴｒｋＡ ＮＧＦ受容体を発現するＨＥＫ２９３ ＴｒｋＡ細胞から単離した膜に結合している［³Ｈ］ＤＨＥＡに対して競合した。この結合の親和性は、Ｋ_Ｄ：０．２９ｎＭ、すなわち、ＮＧＦと類似していた。同様に、非標識のＢＮＮ−１２４は、ｐ７５ＮＴＲ ＮＧＦ受容体を発現するＨＥＫ２９３ ｐ７５ＮＴＲ細胞から単離した膜に結合している［³Ｈ］ＤＨＥＡに対して競合した。この結合の親和性は、Ｋ_Ｄ：１．０ｎＭ、すなわち、ＮＧＦと類似していた。ＴｒｋＡのｃＤＮＡを含まないベクターをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞または非トランスフェクト細胞では結合が見られなかった。さらに、ＴｒｋＡ ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の膜染色は、膜不透過性ＤＨＥＡ−ＢＳＡ−フルオレセインコンジュゲートにおいて認められた。こうした知見から、合成スピロニューロステロイドとＮＧＦ膜受容体との結合および相互作用が強いことが示唆される。

神経冠由来のＰＣ１２細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦの合成ニューロステロイド１０ｎＭを補充し、血清の非存在下で８時間培養した。インキュベーションの終了時に、細胞ライセートを１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけた。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、標準的なウエスタンブロットの手順に従い処理した。タンパク質レベルを検出するため、膜を適切な抗体、Ｂｃｌ−２（Santa Cruz Biotechnology社、Santa Cruz、カリフォルニア州、希釈度１：１００）、リン酸化ＥＲＫ１／２（Cell Signalling Technology社、Beverly、マサチューセッツ州、希釈度１：１００）とインキュベートした。タンパク質量に標準化するため、このブロットを剥がし、抗アクチンまたは抗総ＥＲＫ１／２抗体（Chemicon、Temecula、カリフォルニア州、希釈度１：４００）で染色した。

ＢＮＮ−１２４の挙動は、血清除去ＰＣ１２細胞中において、ＮＧＦのそれと類似しており、抗アポトーシス性のＢｃｌ−２タンパク質を誘導し、ＥＲＫ１／２キナーゼをリン酸化した。実際に、１０ｎＭのＢＮＮ−１２４は、Ｂｃｌ−２にもＥＲＫ１／２にも２０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦと同じ作用を発揮した（図９）。ＮＧＦによるＢｃｌ−２活性化は、ニューロンをアポトーシスから救出する。この作用には、ＥＲＫ１／２キナーゼシグナル伝達のリン酸化を介した活性化が関与している。

Claims (8)

1. 下記式Ｉで表される化合物、その塩もしくは酸付加塩：
   （式中
   Ｒ¹＝ＯＨであり；Ｒ²＝Ｒ⁵＝Ｒ⁶＝Ｒ⁷＝Ｙ＝Ｈ、Ｒ⁴＝Ｍｅであり；
   Ｒ³は水素であるか、あるいは、ステロイド環系のＣ５とＣ６の間に二重結合が存在する場合、Ｒ³は存在せず；
   Ｘは酸素であり；
   Ａは−（ＣＨ₂）_n−、Ｃ_2-5アルケニレン基またはＣ_2-5アルキニレン基であり、ｎは整数であり、０または１または２または３または４または５の値をとることができ；
   Ｂは−（ＣＨ₂）_y−、Ｃ_2-5アルケニレン基またはＣ_2-5アルキニレン基であり、式中、ｙは整数であり、１または２または３または４または５の値をとることができ；
   Ｚは、ステロイド骨格のＣ１７のスピロ環置換基の任意の炭素に結合していてもよく、独立に任意に置換されているＣ_1-10アルキル、任意に置換されている縮合二環式環系、任意に置換されている架橋二環式環系、任意に置換されている架橋三環式環系、任意に置換されているＣ_2-10アルケニル、任意に置換されているＣ_2-10アルキニル、任意に置換されているアリール、任意に置換されているアリールアルキル、任意に置換されているヘテロアリール、任意に置換されているヘテロアリールアルキル、ホルミル、カルボキシ、−ＮＣ（Ｏ）Ｒ⁸、ＮＣ（Ｓ）Ｒ⁸、−ＮＲ⁸Ｒ⁹、任意に置換されているＣ（Ｏ）−Ｗ、任意に置換されているＣ（Ｏ）Ｏ−Ｗ、任意に置換されているＣ（Ｓ）Ｏ−Ｗであり；
   ＹおよびＺは、Ｃ１７のスピロ環置換基の同じ炭素に結合していてもよく
   Ｗは、任意に置換されているＣ_1-10アルキル、任意に置換されているヘテロシクロアルキル、任意に置換されている縮合二環式環系、任意に置換されている架橋二環式環系、任意に置換されている架橋三環式環系、任意に置換されているＣ_2-10アルケニル、任意に置換されているヘテロシクロアケニル、任意に置換されているＣ_2-10アルキニル、任意に置換されているヘテロシクロアルキニル、任意に置換されているアリールまたは任意に置換されているヘテロアリールであり；
   Ｒ⁸およびＲ⁹は、独立に、任意に置換されているＣ_1-10アルキル、任意に置換されているヘテロシクロアルキル、任意に置換されている縮合二環式環系、任意に置換されている架橋二環式環系、任意に置換されている架橋三環式環系、任意に置換されているＣ_2-10アルケニル、任意に置換されているヘテロシクロアケニル、任意に置換されているＣ_2-10アルキニル、任意に置換されているヘテロシクロアルキニル、任意に置換されているアリールまたは任意に置換されているヘテロアリールであり；
   点線は、単結合または二重結合が存在することを示す。）
   但し、次の化合物を除く：
   ；
   ；
   ３β−ヒドロキシ−１７α，２０α−エポキシ−１７β−ピコリル−５−アンドロステン；及び
   ３β−ヒドロキシ−１７β，２０β−エポキシ−１７α−ピコリル−５−アンドロステン。
2. ステロイド環系のＣ５とＣ６の間に二重結合が存在し、Ｒ³は存在しない、請求項１に記載の化合物。
3. Ｒ¹＝ＯＨであり；Ｒ²＝Ｒ⁵＝Ｒ⁶＝Ｒ⁷＝Ｙ＝Ｈ、Ａ＝−（ＣＨ₂）_n−、Ｂ＝−（ＣＨ₂）_y−であり；ステロイド環系のＣ１とＣ２の間に二重結合が存在せず；ステロイド環系のＣ５とＣ６の間に二重結合が存在し、Ｒ³は存在せず；Ｒ⁴＝Ｍｅであり；ｎ＝０、ｙ＝１である、請求項１または２に記載の化合物。
4. 式Ｉの化合物は、以下のものから選択され、その塩および酸付加塩を含む、請求項１に記載の化合物：
   （２０Ｓ）−３β，２１−ジヒドロキシ−１７β，２０−エポキシ−５−プレグネン；
   （２０Ｓ）−３β−ヒドロキシ−１７β，２０−エポキシ−２０−（２−ブロモエチニル）−５−アンドロステン；
   ３β，２１−ジヒドロキシ−１７α，２０−エポキシ−５−プレグネン。
5. 薬学的に許容される担体、希釈液またはアジュバントと共に、活性成分としての請求項１〜４のいずれか一項で定義された式Ｉで表される化合物、またはその塩もしくは酸付加塩を含む組成物。
6. 請求項１〜４のいずれか１項にて定義された式Ｉの化合物またはその塩もしくは酸付加塩からなる医薬。
7. 下記式Ｉ'の化合物またはその塩もしくは酸付加塩からなる、神経細胞アポトーシスまたはニューロン損傷に関連した神経変性状態の予防ないし処置に使用される医薬。
   （式中
   Ｒ¹＝ＯＨであり；Ｒ²＝Ｒ⁵＝Ｒ⁶＝Ｒ⁷＝Ｙ＝Ｈ、Ｒ⁴＝Ｍｅであり；
   Ｒ³は水素であるか、あるいは、ステロイド環系のＣ５とＣ６の間に二重結合が存在する場合、Ｒ³は存在せず；
   Ｘはメチレン基（−ＣＨ₂−）または酸素であり；
   Ａは−（ＣＨ₂）_n−、Ｃ_2-5アルケニレン基またはＣ_2-5アルキニレン基であり、ｎは整数であり、０または１または２または３または４または５の値をとることができ；
   Ｂは−（ＣＨ₂）_y−、Ｃ_2-5アルケニレン基またはＣ_2-5アルキニレン基であり、式中、ｙは整数であり、１または２または３または４または５の値をとることができ；
   Ｚは、ステロイド骨格のＣ１７のスピロ環置換基の任意の炭素に結合していてもよく、独立にＨ、任意に置換されているＣ_1-10アルキル、任意に置換されている縮合二環式環系、任意に置換されている架橋二環式環系、任意に置換されている架橋三環式環系、任意に置換されているＣ_2-10アルケニル、任意に置換されているＣ_2-10アルキニル、任意に置換されているアリール、任意に置換されているアリールアルキル、任意に置換されているヘテロアリール、任意に置換されているヘテロアリールアルキル、ホルミル、カルボキシ、−ＮＣ（Ｏ）Ｒ⁸、ＮＣ（Ｓ）Ｒ⁸、−ＮＲ⁸Ｒ⁹、任意に置換されているＣ（Ｏ）−Ｗ、任意に置換されているＣ（Ｏ）Ｏ−Ｗ、任意に置換されているＣ（Ｓ）Ｏ−Ｗであり；
   ＹおよびＺは、Ｃ１７のスピロ環置換基の同じ炭素に結合していてもよく
   Ｗは、任意に置換されているＣ_1-10アルキル、任意に置換されているヘテロシクロアルキル、任意に置換されている縮合二環式環系、任意に置換されている架橋二環式環系、任意に置換されている架橋三環式環系、任意に置換されているＣ_2-10アルケニル、任意に置換されているヘテロシクロアケニル、任意に置換されているＣ_2-10アルキニル、任意に置換されているヘテロシクロアルキニル、任意に置換されているアリールまたは任意に置換されているヘテロアリールであり；
   Ｒ⁸およびＲ⁹は独立に、任意に置換されているＣ_1-10アルキル、任意に置換されているヘテロシクロアルキル、任意に置換されている縮合二環式環系、任意に置換されている架橋二環式環系、任意に置換されている架橋三環式環系、任意に置換されているＣ_2-10アルケニル、任意に置換されているヘテロシクロアケニル、任意に置換されているＣ_2-10アルキニル、任意に置換されているヘテロシクロアルキニル、任意に置換されているアリールまたは任意に置換されているヘテロアリールであり；
   点線は、単結合または二重結合が存在することを示す。）。
8. 下記の群から選択される神経細胞アポトーシスまたはニューロン損傷に関係した神経変性状態の予防ないし処置に使用され、請求項７にて定義された式Ｉ’の化合物からなる医薬；
   アルツハイマー病、
   パーキンソン病、
   ハンチントン病、
   多発性硬化症、
   筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、
   網膜変性症、
   網膜剥離、
   遺伝子異常,糖尿病,ポリオ,疱疹,ＡＩＤＳ,脳外傷,虚血または脳卒中によって引き起こされる末梢神経障害；あるいは、
   中枢もしくは末梢神経系の神経細胞の変性および／またはアポトーシスを引き起こす任意の他の状態。