CN101754995A - 甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺的新型制备方法 - Google Patents

甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺的新型制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及高纯度的甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺(简写为“mPEG-乙基马来酰亚胺”)及其衍生物的制备方法，以及由所述方法制备的甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺。

Description

甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺的新型制备方法
技术领域
本发明涉及高纯度的甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺(下文中称为“mPEG-乙基马来酰亚胺”)及其衍生物的制备方法。
背景技术
已知PEG作为代表性亲水大分子可连同天然大分子和合成大分子一起与水分子形成氢键。
此外，PEG还可溶于各种有机溶剂中，并具有极小人类毒性或没有人类毒性。由于PEG在水中具有十分细长的构型，因此与其它药物(蛋白、肽、酶或基因等)结合可依靠空间位阻而使得药物分子的毒性降低，从而给予其保护而免受免疫系统的影响。因此，PEG作为延长药物在人类血浆中的半衰期的手段可应用于多种药物。
此外，PEG可以与具有优异活性但毒性高、溶解性差的难以应用的药物组合，以提高PEG-药物的溶解性和降低毒性，从而改善活性。
为将PEG结合至另一药物，可采用向PEG链的末端添加各种官能团以将其与药物组合的方法。
mPEG-乙基马来酰亚胺是可与各种药物组合以提高其溶解性和活性的物质之一。
通常，mPEG-乙基马来酰亚胺可以通过以下两种方法中的一种获得：一种是包括从mPEG-乙基马来酰胺酸进行分离和提纯、氯化或酯化然后环化的步骤的方法(反应式1)；另一种是使用MCM(甲氧基羰基马来酰亚胺)从mPEG-胺经环化来制备mPEG-乙基马来酰亚胺的方法(反应式2)。
第一种方法制备的mPEG-乙基马来酰亚胺具有比第二种方法制备的mPEG-乙基马来酰亚胺低得多的测定纯度。在第一种方法的反应过程中，可能发生PEG链的分解从而导致最终产物分子量分布的增加。根据所述第二种mPEG-乙基马来酰亚胺制备方法，通过迄今为止的手段尚无法预计确切的反应终点。此外，由于在重结晶中使用二乙醚，因此在将该方法应用于商业方法时，该方法可能会产生人类毒性和爆炸的危险。另外，由于最终产物中含有难以除去的副产物(mPEG-酰胺-酰亚胺、mPEG马来酰胺酸)，因此该产物不适于用在药物输送系统中。
[反应式1]
Figure G2008800249604D00021
[反应式2]
虽然美国专利第6,602,498号(Shearwater Corporation)描述了如上所述的两种方法，但是并没有详细说明关于反应终点的具体反应条件(搅拌器速率对于反应转化率的影响和分析方法)、适于经济商业化的结晶方法和最终产物中可能含有的副产物的类型。
根据美国专利第6,875,841号(NOF Corporation)，使甲氧基聚乙二醇(mPEG)进行氰化和胺化以制备mPEG-丙胺，然后使其与马来酸酐反应以获得mPEG-丙基马来酰胺酸。在乙酸酐/乙酸的条件下，使如此获得的mPEG-丙基马来酰胺酸成环以制备mPEG-丙基马来酰亚胺。如此制备的mPEG-丙基马来酰亚胺的结构中在PEG骨架和马来酰亚胺之间包含三个碳，因而不同于mPEG-乙基马来酰亚胺的结构。此外，该方法包括复杂的反应步骤，即从mPEG开始的四(4)个步骤(氰化→胺化→制备马来酰胺酸→马来酰亚胺环的形成)。由于该方法涉及高压和高温条件(＞4MPa，＞130℃)，因此最终产物的纯度会因PEG链发生分解而低于其它方法的最终产物的纯度。
根据美国专利第6,828,401号(SunBio Inc.)，首先制备mPEG-乙基马来酰胺酸，然后在二异丙基乙胺/三氟乙酸五氟苯酯/DMF条件下制备mPEG-乙基马来酰亚胺。然而，该方法的缺点在于因使用昂贵的反应物并且产生许多杂质而带来的商业上的限制。
发明内容
技术问题
为克服上述问题，本发明提供了一种以高产率制备mPEG-乙基马来酰亚胺的方法。
本发明的另一主题是提供一种产生极少中间体或杂质的mPEG-乙基马来酰亚胺的新型制备方法。
本发明的再一主题是通过开发使mPEG-乙基马来酰亚胺在反应进程中水解而转化为mPEG-乙基马来酰胺酸的量最小化的工艺而提供一种高纯度mPEG-乙基马来酰亚胺的制备方法。
本发明的又一主题是提供一种mPEG-乙基马来酰亚胺的生产方法，所述mPEG-乙基马来酰亚胺含有不超过10摩尔％的反应中间体化合物和不超过10摩尔％的作为目标化合物水解产生的副产物的mPEG-乙基马来酰胺酸。
另外，本发明还为从反应介质中产生的mPEG-乙基马来酰亚胺提供了有效的萃取和结晶方法。
技术方案
本发明涉及通过mPEG-乙胺与N-甲氧基羰基马来酰亚胺的反应制备高纯度mPEG-乙基马来酰亚胺的步骤。
本发明提供一种mPEG-乙基马来酰亚胺制备方法，所述方法使作为中间体的mPEG-酰胺-酰亚胺和作为副产物的mPEG-乙基马来酰胺酸的含量最小化，所述方法的特征在于在反应过程中利用NMR发现反应终点。
本发明还提供一种mPEG-乙基马来酰亚胺的新型制备方法，其中使作为mPEG-乙基马来酰亚胺产物水解产生的副产物的mPEG-乙基马来酰胺酸的含量最小化。
根据另一方面，本发明的特征在于，使甲氧基聚乙二醇乙胺与N-甲氧基羰基马来酰亚胺在水溶液中反应。
根据又一方面，本发明提供了一种mPEG-乙基马来酰亚胺的新型制备方法，其中，在通过NMR确定反应终点之后，使用商购溶剂通过相分离萃取或结晶所产生的mPEG-乙基马来酰亚胺。
本发明还提供一种mPEG-乙基马来酰亚胺的新型制备方法，其中通过使用PAA(聚丙烯酸)确定萃取程度以确认相分离步骤期间的相分离程度。
根据mPEG-乙基马来酰亚胺的常规制备方法，会产生过多的副产物以致不能有效地获得纯的产物。这是因为在中间体mPEG-酰胺-酰亚胺完全转化为产物之前，产物mPEG-马来酰亚胺在水溶液中水解，使得产物mPEG-乙基马来酰亚胺转化为mPEG-乙基马来酰胺酸，由此导致副产物的增加。因此，本发明人发现，为制备高纯度的mPEG-乙基马来酰亚胺，应该提高中间体向产物的转化率，同时使产物经水解向mPEG-乙基马来酰胺酸的转化最小化，还发现反应终点确定方法在制备高纯度mPEG-乙基马来酰亚胺中非常重要；从而完成了本发明。
据分析，本发明的反应机理如下进行：在0℃～10℃、优选在0℃～5℃的低温使商购的高纯度mPEG-OCH2CH2NH2与N-甲氧基羰基马来酰亚胺反应，并使用烃溶剂或如二氯甲烷等卤代烃、优选用二氯甲烷萃取反应混合物以制备高纯度的mPEG-乙基马来酰亚胺。为产生最少的中间体和副产物，在反应过程中使用NMR来测定转化率。反应早期产生的中间体(mPEG-酰胺-酰亚胺)具有两个特征峰(6.37ppm处的双峰和6.18ppm处的双峰)。随着反应时间的推移，高纯度的mPEG-乙基马来酰亚胺的特征峰(6.71ppm处的单峰)面积增大。从大部分中间体特征峰消失时开始，水解快速进行且所产生的副产物(mPEG-乙基马来酰胺酸)的特征峰(6.31ppm处的双峰和6.48ppm处的单峰)面积开始增大。基于高纯度mPEG-乙基马来酰亚胺的特征峰(6.71ppm处的单峰)面积，当中间体和副产物的特征峰面积变得不超过10摩尔％时反应完成。
在反应器中停止搅拌的同时于低温(-10℃～5℃)进行NMR分析。令人惊讶的是，停止搅拌时反应没有进行，因此，优选在分析期间不进行独立搅拌而进行分析。
本发明的特征在于制备如下的高纯度的mPEG-乙基马来酰亚胺：其端基活性通过NMR测得为至少80％、优选为80％～99.99％，聚乙二醇单元的分子量范围为350～100,000，并且分子量分布不超过1.05。
Figure G2008800249604D00051
在本发明的方法中，可能存在源自人体或空气的微生物的各种污染。如果其中含有内毒素，则当本发明的产物mPEG-乙基马来酰亚胺与其它药物(蛋白、肽、酶或基因等)结合时所述污染会造成毒性。因而需要排除来自mPEG-乙基马来酰亚胺的制备方法中的内毒素的步骤。因此，需要引入使用活性炭除去内毒素的步骤，以生产安全的产物。
下面具体描述制备步骤。
1)在常温经氮气吹扫的反应器中加入NaHCO3和去离子水(D/W)，将反应器内的温度调节为0℃～10℃、优选为0℃～5℃。向反应器中加入作为原料的分子量为100～100,000的mPEG-OCH2CH2NH2。
2)然后，向反应器中加入基于1当量mPEG-OCH2CH2NH2其量为0.9当量～10当量、优选1当量～5当量的N-甲氧基羰基马来酰亚胺。在控制搅拌速率的同时将该混合物搅拌0.5小时～1小时。为加速反应进程，可另外加入冷却至0℃～3℃的D/W(50kg～55kg)。在每小时利用NMR确认反应转化率的同时进行反应。由于当反应时间被延长时产生的mPEG-乙基马来酰亚胺可能水解而转化为mPEG-乙基马来酰胺酸，因此反应持续时间的控制非常重要。出乎意料的是，本发明人发现在反应器中受到搅拌的反应物与不受搅拌的相同反应物在反应速率上存在非常明显的差异。本发明人还发现以下事实：如果不进行搅拌，则反应不会明显进行，因此可以通过在反应过程中停止搅拌的同时对反应物取样，从而利用1H-NMR分析来控制终点而不会在分析过程中进行任何特定反应。
mPEG-酰胺-酰亚胺(500MHz，1H-NMR)：(d，6.37ppm)，(d，6.18ppm)
mPEG-乙基马来酰亚胺：(s，6.71ppm)
mPEG-乙基马来酰胺酸：(d，6.31ppm)，(d，6.48ppm)
含量计算如下：
mPEG-乙基马来酰亚胺(500MHz，1H-NMR)：以甲氧基在3.29ppm处的特征峰面积的标准值为3，计算6.20ppm、6.32ppm、6.71ppm处的特征峰面积。
Figure G2008800249604D00061
Figure G2008800249604D00062
Figure G2008800249604D00063
Figure G2008800249604D00064
Figure G2008800249604D00065
Figure G2008800249604D00066
3)确定终点后，加入选自烃或卤代烃的有机溶剂(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、二氯甲烷和氯仿)并将产物从水层萃取至有机层中。通过将聚丙烯酸水溶液加入水层时是否发生乳化来确认mPEG型反应物、中间体、产物和副产物是否从水层被萃取至有机层中。因此，可采用额外加入有机溶剂或甲醇作为促进相分离的手段。优选且可有效使用甲醇作为通过促进相分离而提高萃取效率的额外溶剂。优选将聚丙烯酸水溶液在向1000cP～30000cP的聚合物水溶液中加入部分盐酸之后使用而不是单独使用，以便能够确切观察萃取进程。例如，可将聚丙烯酸(Wako，25％水溶液，8,000cP～12,000cP(30℃))作为与浓HCl(10ml)和H2O(105ml)经震荡30分钟后的混合物使用。
4)然后，通过添加等量的水来洗涤分离的有机层。在需要时重复进行步骤3)。
5)进行PAA测试。如果不再能从水层中检测到PEG，则进行相分离。用MgSO4(6kg)干燥MC层，并过滤以回收产物溶液。
6)然后，浓缩有机层，向其中加入预先冷却至-5℃～0℃的IPA/庚烷(体积比约为1∶2)以使产物结晶。可以单独使用MTBE、IPA和庚烷也可以使用两种以上溶剂的组合作为结晶溶剂。
7)向获得的湿滤饼中加入MC，并使固体完全溶解。然后，添加活性炭并搅拌混合物以使内毒素含量最小化(标准：2EU/g，测试方法：USP24<85>细菌内毒素测试(Bacterial Endotoxins Test))。目标化合物在MC溶剂中具有优异的溶解性，并且内毒素被吸附在活性炭上，因而可以回收到大部分目标化合物。然后，使用填充有硅藻土(Celite)微粒的过滤器除去活性炭，并重复步骤6)以结晶产物。在过滤和干燥后获得最终产物。
具体实施方式
实施例
以下对实施例进行描述以便更具体地对本发明进行说明，但本发明不限于这些实施例。除非另外指出，否则此处所述的百分比是指摩尔％。
[实施例1]
在常温经氮气吹扫的300L反应器中加入NaHCO3(5.13kg)和D/W(56kg)。将反应器内的温度冷却至0℃～1℃后，向其中加入分子量5000的mPEG-NH2(6kg)并使其溶解。然后，向其中加入N-甲氧基羰基马来酰亚胺，并将该混合物在50rpm搅拌1小时。加入额外的D/W(52kg)，并在每小时使用NMR确认反应转化率的同时进行反应。
反应持续时间(小时)   目标化合物(摩尔％)   中间体(酰胺-酰亚胺，％)   副产物(马来酰胺酸，％)
  1   24.25   75.75   未检测到
  2   72.82   27.18   未检测到
  3   76.32   23.68   痕量
  4   76.42   19.59   3.99
  4.5   87.19   7.36   5.45
反应完成后(4.5小时)，加入二氯甲烷(55L)，充分搅拌该混合物并进行萃取。为确认是否从水层中萃取出了所有产物，向50ml水层中加入PAA[通过混合聚丙烯酸(Wako，25％，8,000cP～12,000cP(30℃)，5ml)、浓盐酸(10ml)和H2O(105ml)并将该混合物震荡30分钟而制备]溶液(0.5ml)，由此确认水层中残留的mPEG-Mal(5k)的存在。未出现悬浮，因此确认产物被二氯甲烷完全萃取至有机相中。当使用D/W(55L)洗涤分离的MC层时，水层中出现乳化和悬浮。另外加入甲醇(12L)作为分散剂来引发完全的相分离。然后，通过PAA测试，确认在水层中未再检测到PEG衍生物。进行相分离并向MC层中加入MgSO4(6kg)，搅拌和过滤该混合物。减压浓缩以使有机层的总体积为10L，其后将产物逐滴加入预先冷却至-5℃～0℃的IPA/庚烷(21kg/41kg)溶液中，并搅拌该混合物以结晶产物。向过滤后获得的白色晶体湿滤饼中再次加入50L的MC。完全溶解后，向其中加入活性炭(1kg)，并将该混合物搅拌30分钟以最小化内毒素含量。用硅藻土除去活性炭，减压浓缩该溶液以得到10L的总体积。将该溶液逐滴加入IPA/庚烷(21kg/41kg)中，并搅拌和结晶所得混合物。通过过滤和干燥获得最终产物。产率：95摩尔％。通过1H-NMR[(500MHz，CDCl3)：-CH＝CH-6.71ppm，PEG骨架3.45ppm～3.8ppm，-OCH33.29ppm]确认产物，其特征在于以下性质：
内毒素(标准：＜2.0EU/g)：0.25，mPEG亚乙基马来酰亚胺(通过1H-NMR测定)：87.19％，mPEG-酰胺-酰亚胺(通过NMR测定)：7.36％，mPEG-马来酰胺酸(通过NMR测定)：5.45％。
[实施例2]
重复与实施例1中所述相同的步骤，但是搅拌速率为80rpm而非50rpm，并且反应持续时间为2小时。结果显示如下：
产率(93摩尔％)
内毒素(标准：＜2.0EU/g)：0.5
mPEG亚乙基马来酰亚胺(通过1H-NMR测定)(86.7％)，mPEG酰胺-酰亚胺(通过NMR测定)(6.3％)，mPEG马来酰胺酸(通过NMR测定)(7.0％)
[实施例3]
重复与实施例1中所述相同的步骤，但是搅拌速率为100rpm而非50rpm，并且反应持续时间为4.5小时。结果显示如下：
产率(92摩尔％)，
内毒素(标准：＜2.0EU/g)：0.5
mPEG乙烯基马来酰亚胺(通过1H-NMR测定)(82.2％)，mPEG酰胺-酰亚胺(通过NMR测定)(4.1％)，mPEG马来酰胺酸(通过NMR测定)(13.7％)
[实施例4]
重复与实施例1中所述相同的步骤，但是搅拌速率为150rpm而非50rpm，并且反应持续时间为6.5小时。结果显示如下：
产率(94摩尔％)，
内毒素(标准：＜2.0EU/g)：0.25
mPEG亚乙基马来酰亚胺(通过1H-NMR测定)(78.3％)，mPEG酰胺-酰亚胺(通过NMR测定)(未检测到)，mPEG马来酰胺酸(通过NMR测定)(21.2％)
工业实用性
如上所述，可根据本发明的方法制备高纯度(至少80％)的mPEG-乙基马来酰亚胺，并保持中间体和副产物的含量分别低至不超过10％。

Claims (11)

1.一种甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺的制备方法，所述方法包括以下步骤
1)在碱存在下的水溶液中使甲氧基聚乙二醇乙胺与N-甲氧基羰基马来酰亚胺反应；
2)通过NMR测定来确定反应过程中产物的终点；
3)反应完成后使用有机溶液通过相分离萃取产物；和
4)浓缩萃取的有机相并重结晶来自所述有机相的甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺。
2.如权利要求1所述的甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺制备方法，其中，反应温度为0℃～10℃。
3.如权利要求1所述的甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺制备方法，其中，所述重结晶通过使用异丙醇和庚烷的混合溶剂来进行。
4.如权利要求1所述的甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺制备方法，其中，所述甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺的纯度为80％以上。
5.如权利要求4所述的甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺制备方法，所述方法的特征在于，所述纯度通过经由NMR测定来确定反应终点的方法而获得，其中，基于甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺的特征峰面积，作为中间体的mPEG-酰胺-酰亚胺和作为水解产物的mPEG-乙基马来酰胺酸各自的特征峰面积分别不超过10摩尔％。
6.如权利要求1所述的甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺制备方法，所述方法还包括通过加入活性炭来从重结晶产物中除去内毒素的步骤。
7.如权利要求6所述的甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺制备方法，所述方法还包括在加入活性炭之前将所述重结晶产物溶解在二氯甲烷中的步骤。
8.如权利要求1所述的甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺制备方法，所述方法还包括通过萃取过程中的PAA测试步骤确定是否必须进行通过相分离的额外萃取的步骤。
9.如权利要求8所述的甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺制备方法，其中，在根据PAA测试而需要进行额外萃取时加入甲醇以促进相分离。
10.如权利要求1～9中任一项所述的甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺制备方法，其中，所述NMR测定是用于确定反应终点的方法，其中，基于甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺的特征峰面积，作为中间体的mPEG-酰胺-酰亚胺和作为水解产物的mPEG-乙基马来酰胺酸各自的特征峰面积分别不超过10摩尔％。
11.如权利要求10所述的甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺制备方法，其中，所述甲氧基聚乙二醇乙基马来酰亚胺的分子量为350～100,000。
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