CN117126394A - 单一分子量聚乙二醇、制备方法及其应用 - Google Patents

单一分子量聚乙二醇、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一种单一分子量聚乙二醇、制备方法及其应用，其中，单一分子量聚乙二醇的制备方法包括：将一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇与多元醇进行缩合反应，使得多元醇键连所述直链寡聚乙二醇；对键连有直链寡聚乙二醇的多元醇进行水解反应，以去除疏水性封端基团，得到单一分子量聚乙二醇；将单一分子量聚乙二醇迭代为新的多元醇，重复缩合反应和水解反应的操作，直至得到具有目标分子量的单一分子量聚乙二醇，目标分子量为250～100000。

Description

单一分子量聚乙二醇、制备方法及其应用
技术领域
本公开涉及高分子合成化学的技术领域，尤其涉及一种单一分子量聚乙二醇、制备方法及其应用，具体地，涉及一种具有疏水性封端基团的寡聚乙二醇与多元醇进行缩合反应后，进行水解反应得到的单一分子量聚乙二醇。
背景技术
聚乙二醇(PEG)是一种典型的水溶性聚合物，具有优异的润滑性、保湿性、分散性和粘结性，广泛应用于化妆品、生物医药、农药、食品加工等行业。在相关研究中，许多使用聚乙二醇(PEG)修饰治疗性生物大分子的产品已经上市。近年来，美国食品和药物管理局批准了一种用于治疗腺苷脱氨酶缺乏症的聚乙二醇化蛋白治疗药物，以及一系列聚乙二醇脂质体，如用于治疗肿瘤的阿霉素脂质体用于治疗丙型肝炎的/>(聚乙二醇干扰素α-2a；先灵葆雅公司)和/>(聚乙二醇干扰素α-2b；瑞士罗氏大药厂)，用于临床超声成像的/>及用于新型冠状病毒疫苗的/>(辉瑞公司)，这些脂质体内均含有聚乙二醇化成分。根据统计，美国食品和药物管理局已经批准了将近30种聚乙二醇化药物，正在开发的相关项目超过2000个。
聚乙二醇作为修饰药物的生物偶联剂，其分散性将影响理化性质和生物活性(如临界胶束浓度、生物毒性和有效性)，因此，聚乙二醇明确的结构至关重要。然而，高纯度、单一分子量、高精度聚乙二醇(n>8)目前缺乏可靠的商业来源，市面上的低纯度产品价格昂贵(例如纯度为95％的PEG8价格可达100欧元/g)。由于聚乙二醇产品的化学分子量不确定、批间差异等多分散性质，给临床应用和监管审批带来了许多障碍。
有鉴于此，人们一直在努力开发和优化合成离散的聚乙二醇的方案，有相关技术报道了以乙二醇为原料，通过六步双向增长，合成了单分散PEG29，产率达36％；开发氟化单分散聚乙二醇，并将其应用于19F磁共振成像；提供了制备单一分子量八(乙二醇)对甲苯磺酸酯的详细合成工艺，完全不需要色谱的检测和纯化方法；利用原子转移自由基聚合(ATRP聚合)方法合成了侧链数目离散的乙二醇单元，并通过色谱柱分离得到了具有不同PEG重复单元数目的单一分子量聚乙二醇-二甲酸甲酯(PEG-DMG)。进一步地，有研究报道了A+B+A型成醚反应，成功制备了聚合度为12的单分散PEG12，并提出成醚反应中乙二醇末端对甲苯磺酸酯容易发生消除反应；另有相关研究采用大环硫酸酯为基础的方法，避免了复杂的保护/脱保护步骤，合成了聚合度为64的末端甲氧基单分散PEG(MeO-PEG64-OH)，然而，并没有使用传统的聚合物表征方法进行表征，如凝胶色谱法(GPC)。
因此，随着精准医学的快速发展，迫切需要开发一种适用于工业化生产且分子量可控的制备方法来制备具有精确分子结构及分子量的聚乙二醇及其相关化合物。
发明内容
针对上述技术问题，本公开提供了一种单一分子量聚乙二醇、制备方法及其应用，以期至少部分地解决上述提及的技术问题。
为了解决上述技术问题，本公开提供的技术方案如下：
作为本公开的第一个方面，提供了一种单一分子量聚乙二醇的制备方法，包括：
将一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇与多元醇进行缩合反应，使得多元醇键连直链寡聚乙二醇；
对键连有直链寡聚乙二醇的多元醇进行水解反应，以去除疏水性封端基团，得到单一分子量聚乙二醇；
将单一分子量聚乙二醇迭代为新的多元醇，重复缩合反应和水解反应的操作，直至得到具有目标分子量的单一分子量聚乙二醇，目标分子量为250～100000。
在其中一个实施例中，单一分子量精确聚乙二醇包括式(A1)～(A3)所示结构中的任意一种：
其中，i为4～500，优选为40～200，k为0或正整数。
在其中一个实施例中，多元醇包括式(g1)～(g3)所示结构中的任意一种：
其中，j为1～16，k为0或正整数。
在其中一个实施例中，上述制备方法，还包括：
由疏水性封端化合物和直链寡聚乙二醇HO-PEG-OH在碱催化剂催化反应得到中间体，再与对甲苯磺酰氯反应生成一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇；
其中，一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇的结构为TG-PEG-OTs；
TG表示疏水性封端基团，包括以下结构中的任意一种：
其中，
n各自独立地为0～100，m各自独立地为0～201，l各自独立地为0～10；
CnHm相同或不同，各自独立地选自氢、C1～C100的烷基、C2～C100的烯基、C2～C100的炔基；
CnHmOl相同或不同，各自独立地选自氢、羟基、C1～C100的烷基、C2～C100的烯基、C2～C100的炔基、C1～C100烷氧基。
在其中一个实施例中，缩合反应使用的溶剂为N，N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃中的任意一种；
缩合反应的温度为0～40℃，时间为4～72h；
水解反应的溶剂为甲醇；
水解反应的温度为25～80℃，时间为2～24h。
在其中一个实施例中，疏水性封端化合物的末端反应基团为卤素或羧基，：
具有下式B1～B6所示结构中的任意一种：
其中，R1为卤素原子Cl、Br、I中的任意一种。
作为本公开的第二个方面，提供了一种由上述方法制备得到的单一分子量聚乙二醇。
作为本公开的第三个方面，提供了一种具有疏水性封端基团的单一分子量聚乙二醇，包括：
由上述单一分子量聚乙二醇结构的一端或两端键连疏水性封端基团而获得；
具有疏水性封端基团的单一分子量聚乙二醇，具有下式C1～C3所示结构：
TG’包括以下结构中的任意一种，且不全为羟基：
其中，i为4～500，优选为40～200，k为0或正整数；
其中，
n各自独立地为0～100，m各自独立地为0～201，l各自独立地为0～10；
CnHm相同或不同，各自独立地选自氢、C1～C100的烷基、C2～C100的烯基、C2～C100的炔基；
CnHmOl相同或不同，各自独立地选自氢、羟基、C1～C100的烷基、C2～C100的烯基、C2～C100的炔基、C1～C100烷氧基。
作为本公开的第四个方面，提供了一种异官能团化的单一分子量聚乙二醇，由上述单一分子量聚乙二醇经功能性官能团修饰得到，具有下式D1～D3所示结构：
其中，i为4～500，k为任意正整数；
R3、R4、R5和R6为功能修饰基团，R3、R4、R5和R6各自独立地选自以下结构中的任意一种：
R7选自以下结构中的任意一种：
R8为氢原子、C1～C100烷基、Cl、Br、I中的任意一种。
作为本公开的第五个方面，提供了一种上述单一分子量聚乙二醇在药物修饰中的应用，其中，药物为短肽或蛋白。
基于上述技术方案，本公开提供的单一分子量聚乙二醇、制备方法及其应用，通过疏水性封端化合物与聚乙二醇基团结合制备一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇，设计并和合成制备得到不同拓扑结构、不同末端官能团的单一分子量精确聚乙二醇。疏水性的封端基团可以与聚乙二醇末端基团结合改变聚乙二醇的溶解性与极性，使得制备得到的化合物便于纯化分离，得到单一分子量精确聚乙二醇，聚合度可以达到40～200，纯度较高，能够进行大量制备，应用于高级诊断和药物递送系统中时，可以增强药效，降低免疫原性，具有较为宽广的应用前景。
附图说明
图1为本公开实施例中示例性制备单一分子量聚乙二醇的流程图；
图2为本公开实施例1中制备疏水性封端化合物的合成图；
图3为本公开实施例1中疏水性封端化合物的核磁共振氢谱图；
图4为本公开实施例2中制备单一分子量聚乙二醇HO-PEG8-OH的合成流程图；
图5为本公开实施例2中制备单一分子量聚乙二醇HO-PEG16-OH的合成流程图；
图6为本公开实施例2中单一分子量聚乙二醇的高分辨率质谱(MALDI-TOF)图；
图7为本公开实施例2中单一分子量聚乙二醇的电喷雾电离质谱(ESI)图；
图8为本公开实施例2中单一分子量聚乙二醇的核磁共振氢谱图；
图9为本公开实施例3中制备单一分子量聚乙二醇的合成流程图
图10为本公开实施例4中单一分子量聚乙二醇的电喷雾电离质谱(ESI)图；
图11为本公开实施例4中单一分子量聚乙二醇的核磁共振氢谱图；
图12为本公开实施例4中单一分子量聚乙二醇的凝胶渗透色谱(GPC)图；
图13为本公开实施例5中具有疏水性封端基团的单一分子量聚乙二醇的合成图；
图14为本公开实施例5中具有疏水性封端基团的单一分子量聚乙二醇的核磁共振氢谱图；
图15为本公开实施例6中单一分子量聚乙二醇化短肽的合成图；
图16为本公开实施例6中单一分子量聚乙二醇化短肽的高分辨率质谱(MALDI-TOPMS)图。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开作进一步的详细说明。
目前，相关领域技术人员不断研究开发优化合成单分散聚乙二醇(dPEG)的方案，发现使用迭代逐步合成方法已经产生了有希望的结果。但是，制备保持其单一分子量特性的高分子量大分子需要特殊的努力，包括使用保护基团和过量的起始材料以获得最大产量。大多数研究人员都开发了基于威廉姆森醚合成法的迭代生长方法，但反应条件苛刻，且存在自发的末端重复单元消除反应，导致每一步反应后的分离纯化过程繁琐，产率较低。
基于相关研究的发展，研究人员注意到传统多分散聚乙二醇与单一分子量精确聚乙二醇生物活性的差异。单一分子量的精确寡聚乙二醇制备的聚多卡醇具有较低的细胞毒性和较高的生物安全性，精确聚乙二醇修饰的表面可以更有效地抵抗蛋白质和细胞的粘附。在实现本公开的过程中发现，单一分子量聚乙二醇化产物具有唯一的结构和分子量，可以精确微调物理化学性质。迄今为止，高分子量的对称和不对称功能化单分散聚乙二醇的合成仍然是一个关键的挑战，虽然多分散的聚乙二醇和单分散聚乙二醇具有完全相同的重复单元，但近年来的研究发现，单分散聚乙二醇在抗蛋白冠吸附、降低生物毒性、提高药物疗效、改善纳米组装形状等方面具有独特的优势。
此外，在实现本公开的过程中发现，脂类聚乙二醇衍生物，侧链上含有多个离散的乙二醇基元，与商业多分散线性DMG-PEG2000相比，它可以用于高效的纳米颗粒组装，同时减少抗PEG抗体的识别，通过调整聚乙二醇单元数、末端基团和骨架总长度，可以精确地调整自组装性能。这些结果说明了离散聚乙二醇组分相对于传统的多分散聚乙二醇组分的优势。这些初步结果不仅证实了聚乙二醇链长度的多分散性对其生物学效应的重要影响，而且揭示了利用精确聚乙二醇来降低常规多分散聚乙二醇的免疫原性和抗原性的可能性和潜在优势。
因此，需要制定精确的单一分子量聚乙二醇及其官能化衍生物的合成策略，解决传统PEG的免疫原性和抗原性。
鉴于相关技术中存在的技术问题，本公开提供了一种单一分子量聚乙二醇、制备方法及其应用，通过将一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇与多元醇进行缩合反应，使得多元醇键连直链寡聚乙二醇，在进行水解反应，除去疏水性封端基团，得到单一分子量聚乙二醇，还可将单一分子量聚乙二醇迭代为新的多元醇，累积较高分子量。通过研究PEG周围蛋白质冠组成规律和抗PEG抗体产生规律，可以促进PEG生物功能材料的基础研究和应用转化，避免了在已获批的PEG药物和制剂中引入新成分，将为PEG的新药和给药功能体系提供重要的临床应用前景。
具体地，作为本公开的第一个方面，提供了一种单一分子量聚乙二醇的制备方法，包括：
将一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇与多元醇进行缩合反应，使得多元醇键连直链寡聚乙二醇；带有疏水性封端基团的聚乙二醇极性和溶解性与常规的聚乙二醇相比，降低了聚乙二醇的水溶解性和聚乙二醇的极性，有利于将带有疏水性封端基团的产物进行纯化分离，否则将无法纯化分离。
对键连有直链寡聚乙二醇的多元醇进行水解反应，以去除疏水性封端基团，得到单一分子量聚乙二醇；
将单一分子量聚乙二醇迭代为新的多元醇，重复缩合反应和水解反应的操作，直至得到具有目标分子量的单一分子量聚乙二醇，目标分子量为250～100000。
根据本公开的实施例，一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇由疏水性单体与聚乙二醇在碱催化反应下生成，其与具有精确结构的多元醇进行缩合反应，得到键连有疏水性封端基团的聚乙二醇结构，对其进行水解，使大分子结构的疏水性封端结构从酯键断裂，以脱去疏水性封端基团，得到得到单一分子量聚乙二醇；单一分子量聚乙二醇还可以迭代形成新的多元醇，重复进行缩合反应和水解反应，可以累积叠加得到具有较高分子量且精确的单一分子量聚乙二醇，目标分子量为250～100000，例如可以是250、5000、10000、40000、60000、80000、100000等，作为优选，目标分子量选为250～50000，例如可以是1000、4000、8000、15000、21000、32000、48000等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。不同分子量的聚乙二醇有不同的功能，比如分子量在250-1000，适合在化妆品中使用，增加润滑作用；分子量在2000-20000，合适使用在生物医药体系，作为各个药物的亲水性部分提高药物在水中的溶解性和稳定性；分子量更大的，比如到达50000-100000，适合作用电池的电解质，可以有效提高电池的效果。
根据本公开的实施例，为了便于对上述制备方法进行说明，以基于具体疏水性封端基团迭代合成直链型聚乙二醇为例，图1为本公开实施例中制备单一分子量聚乙二醇的流程图，如图1所示，通过疏水性封端化合物直链寡聚乙二醇HO-PEG-OH在甲苯溶剂中与碱性催化剂作用下合成聚乙二醇化中间体，再与对甲苯磺酰氯反应生成一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇，将具有疏水性封端基团的直链寡聚乙二醇与作为多元醇的具有精确结构的单一分子量聚乙二醇进行缩合反应(可以使用较低分子量的精确聚乙二醇，也可以迭代使用通过本公开制备得到的较高分子量的单一分子量聚乙二醇)，得到键连有疏水性封端基团的聚乙二醇，再在碱性条件下进行水解反应，脱去聚乙二醇连接的疏水性封端结构，得到目标产物。由于直链寡聚乙二醇和多元醇都为单一分子量的化合物，因此目标产物为具有目标分子量的单一分子量聚乙二醇。
根据本公开的实施例，单一分子量聚乙二醇包括式(A1)～(A3)所示结构中的任意一种：
其中，i为4～500，例如为50、100、200、250、300、350、400、450、500；优选为40～200，例如为40、60、80、100、150、180、200；k为0或正整数，作为优选，k为0～50，例如为5、10、15、20、25、30、35、40、50。但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。制备单一分子量聚乙二醇的聚合度过高时，应用场景有限，制备困难且成本过高。
根据本公开的实施例，多元醇具有两个以上醇羟基，例如可以是如图1所示的单一分子量聚乙二醇，例如还可以是支链状的含三个或四个以上醇羟基的多元醇，举例而言，多元醇包括式(g1)～(g3)所示结构中的任意一种：
其中，j为1～16，例如为2、4、8、12、16；k为0或正整数，作为优选，k为0～50，例如为5、10、15、20、25、30、35、40、50。但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
根据本公开的实施例，通过具有上述结构的多元醇与一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇进行缩合反应及水解反应，形成具有相应结构的单一分子量聚乙二醇。
根据本公开的实施例，上述制备方法，还包括：
由疏水性封端化合物和直链寡聚乙二醇HO-PEG-OH在碱催化剂催化反应得到中间体，再与对甲苯磺酰氯反应生成一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇；
其中，一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇的结构为TG-PEG-OTs；
TG表示疏水性封端基团，包括以下结构中的任意一种：
其中，
n各自独立地为0～100，例如为5、12、24、36、48、50、69、72、86、98；m各自独立地为0～201，例如为40、60、80、100、150、180、200；l各自独立地为0～10，例如为4、6、8、10。但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
根据本公开的实施例，CnHm相同或不同，各自独立地选自氢、C1～C100的烷基、C2～C100的烯基、C2～C100的炔基；CnHmOl相同或不同，各自独立地选自氢、羟基、C1～C100的烷基、C2～C100的烯基、C2～C100的炔基、C1～C100烷氧基。CnHm可以是C18H37，CnHmOl可以是C20H41O。
根据本公开的实施例，C1～C100的烷基例如可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、正庚烷基等，C2～C100的烯基例如可以是乙烯基、烯丙基、3-丁烯基等，C2～C100的炔基例如可以是乙炔基，炔丙基，3-丁炔基等，C1～C100烷氧基例如可以是甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正庚烷氧基等。
根据本公开的实施例，缩合反应使用的溶剂为N，N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃中的任意一种；缩合反应的温度为0～40℃，例如可以是5℃、10℃、15℃、20℃、30℃、45℃等；时间为4～72h，例如可以是4h、6h、10h、25h、36h、42h、56h、68h等。但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
根据本公开的实施例，水解反应的溶剂为甲醇；水解反应的温度为25～80℃，例如可以是25℃、30℃、35℃、40℃、50℃、65℃、75℃等；时间为2～24h，例如可以是4h、6h、10h、24h等。但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
根据本公开的实施例，缩合反应与水解反应的温度会影响化学反应的进程，也会影响反应的结果。当温度较高时会加速反应速度，也会对反应物的性质造成影响，使聚合物链节会发生断裂和热裂解；当温度降低会使反应速度变慢，造成化学反应不彻底，影响聚合反应或水解反应的顺利进行。
根据本公开的实施例，疏水性封端化合物的末端反应基团为卤素或羧基：
具有下式B1～B6所示结构中的任意一种：
其中，R1为卤素原子Cl、Br、I中的任意一种。
根据本公开的实施例，末端反应基团为卤素的疏水性封端化合物(B1)、(B2)、(B4)由具有如(b1)、(b2)、(b4)所示结构分别与反应后，加入卤化氢的水溶液后反应生成；
末端反应基团为卤素的疏水性封端化合物(B3)由与三光气和4-二甲氨基吡啶反应生成。
末端基团为羧基的疏水性封端化合物(B5)由具有如(b5)所示结构与反应后，加入氢氧化钠后反应生成。/>
其中，上述各个n为0～100，m为0～201，l为0～50；
CnHmOl相同或不同，各自独立地选自氢、羟基、C1～C100的烷基、C2～C100的烯基、C2～C100的炔基、C1～C100烷氧基；卤化氢的水溶液包括氢氯酸(盐酸)、氢溴酸、氢碘酸中的任意一种。
作为本公开的第二个方面，提供了一种由上述方法制备得到的单一分子量聚乙二醇。
根据本公开的实施例，上述制备得到的单一分子量聚乙二醇的拓扑结构及分子量可控，纯度较高，末端的羟基可以通过不同功能性基团修饰，从而得以应用于高级诊断和药物递送系统等。
作为本公开的第三个方面，提供了一种具有疏水性封端基团的单一分子量聚乙二醇，包括：
由上述单一分子量聚乙二醇结构的一端或两端键连疏水性封端基团而获得；
具有疏水性封端基团的单一分子量聚乙二醇，具有下式C1～C3所示结构：
TG’包括以下结构中的任意一种，且不全为羟基：
其中，i为4～500，优选为40～200，k为0或正整数；
其中，
n各自独立地为0～100，m各自独立地为0～201，l各自独立地为0～10；
CnHm相同或不同，各自独立地选自氢、C1～C100的烷基、C2～C100的烯基、C2～C100的炔基；
CnHmOl相同或不同，各自独立地选自氢、羟基、C1～C100的烷基、C2～C100的烯基、C2～C100的炔基、C1～C100烷氧基。
根据本公开的实施例，通过疏水性封端化合物取代单一分子量聚乙二醇结构的一端或两端，使其键连疏水性封端基团，得到具有疏水性封端基团的单一分子量聚乙二醇。疏水性封端基团可以与聚乙二醇末端基团结合改变聚乙二醇的溶解性与极性，在使用具有一端疏水性封端基团的单一分子量聚乙二醇进行成醚反应，进而合成更大分子量的聚乙二醇时，方便产物的纯化与分离，如果没有疏水性封端基团，从低分子量(250-1000)到高分子量(1000-100000)的制备过程是无法实现的。
作为本公开的第四个方面，提供了一种异官能团化的单一分子量聚乙二醇，由上述单一分子量聚乙二醇经功能性官能团修饰得到，具有下式D1～D3所示结构：
其中，i为4～500，k为任意正整数；
R3、R4、R5和R6为功能修饰基团，R3、R4、R5和R6各自独立地选自以下结构中的任意一种：
/>
R7选自以下结构中的任意一种：
R8为氢原子、C1～C100烷基、Cl、Br、I中的任意一种。
根据本公开的实施例，通过功能性基团修饰单一分子量聚乙二醇结构，得到异官能团化的单一分子量聚乙二醇，用于连接各种蛋白或者其他小分子结构，不同基团可分别于连接特定的蛋白结合。
作为本公开的第五个方面，提供了一种上述单一分子量聚乙二醇在药物修饰中的应用，其中，药物为短肽或蛋白。
根据本公开的实施例，由单一分子量聚乙二醇化修饰的短肽或蛋白具有如下式(M)或(N)所示结构：
其中，R3选自以下结构中的任意一种：
R7选自以下结构中的任意一种：
R8为氢原子、C1～C100烷基、Cl、Br、I中的任意一种，i选自4～500。
为了使本公开的目的、技术方案和优点更加的清晰明确，以下通过具体实施例结合附图对本公开的技术方案和原理做进一步阐述说明。需要注意的是，下述的具体实施例仅是作为举例说明，本公开的保护范围并不限于此。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法，可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
本公开实施例中所采用的原料说明如下：
从Pure-Solv 400溶剂净化系统中取用无水THF，MeCN，DCM和甲苯，马来酰亚胺(MI)、马来酰亚胺(MI)、4-溴甲基苯甲酸叔丁酯、无水N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、叠氮磷酸二苯酯(DPPA)、二乙醇胺N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(DCM)、甲醇、甲酸(HCOOH)、甲苯(C7H8)、二氯甲烷(DCM)、石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)、乙醇、乙醚(Et2O)均购自国药化学试剂有限公司；(Trt-OEG4-OTs)和(Trt-OEG4-OH)、氢化钠、碘甲烷、硬脂基溴、没食子酸甲酯、对甲苯磺酰氯和三苯甲基氯甲烷购买自安耐吉化学；(MMAE-MI)购买自吉林中科研伸；使用MILI-Q SP试剂水系统(微孔)制备去离子水，去离子水的比电阻率为18.4MΩcm。其他的试剂均购自国药化学试剂有限公司，除另外有说明外，均按原样使用。
实施例1
制备疏水性封端化合物的方法：
图2为本公开实施例1中制备疏水性封端化合物的合成图，如图2所示，将硬脂基溴(10g，30mmol)、没食子酸甲酯(1.65g，9mmol)、碳酸钾(6.9g，50mmol)溶解在50mL无水N，N二甲基甲酰胺中。用氩气置换空气，在氩气的氛围下在90℃反应12小时。加入120mL PE:EA＝1:1的溶剂，用50mL水洗涤有机相3次后将有机相旋干。通过柱色谱法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)，得到固体产物7.5g具有如式(1-1)所示结构，反应转化率为89％。
再将式(1-1)所示化合物(8.6g，10mmol)溶解在50mL四氢呋喃中。冰浴下加入氢化铝锂(76g，20mmol)继续冰浴下反应12小时。加入20mL水进行淬灭反应，旋蒸除去四氢呋喃，再使用50mL乙醚萃取水相3次，合并有机相，旋蒸除去溶剂，得到固体产物8.4g，固体产物具有如式(1-2)所示结构，反应转化率为99％。
将式(1-2)所示化合物(8.4g，10mmol)溶解在50mL甲苯中。加入乙酰氯(7.85g，100mmol)后90℃回流反应2小时。旋蒸除去溶剂和多余的乙酰氯，得到固体产物8.5g，具有如式(1-3)所示结构，反应转化率为98％。
将式(1-3)所示化合物(8.5g，10mmol)、没食子酸甲酯(0.55g，3mmol)、碳酸钾(6.9g，50mmol)溶解在50mL无水N，N二甲基甲酰胺中。用氩气置换空气，在氩气的氛围下在90℃反应12小时。加入120mLPE:EA＝1:1的溶剂，用50mL水洗涤有机相3次后将有机相旋干。通过柱色谱法纯化(石油醚:乙酸乙酯＝10:1)，得到固体产物6.0g具有如式(1-4)所示结构，反应转化率为77％。
将具有式(1-4)所示结合的化合物(1g，0.35mmol)溶解于50mL甲醇中，加入氢氧化钾(4.5g，80mmol)，加热回流18小时后。旋蒸除去甲醇，加入50mL水，使用1M盐酸调节pH至3左右，使用100mL的乙酸乙酯萃取3次水相，将有机相旋干，得到疏水性封端化合物0.95g，为苯甲酸衍生物，其结构如式(1-5)所示，其反应转化率为94％。
通过采用核磁共振波谱法(NMR)对制备得到的疏水性封端化合物进行测试，其测试结果如图3所示，图3为本公开实施例1中疏水性封端化合物的核磁共振氢谱图。
实施例2
图4为本公开实施例2中制备单一分子量聚乙二醇HO-PEG8-OH的合成流程图，如图4所示，通过一步成醚反应后再使用盐酸脱除三苯甲基保护制备单一分子量聚乙二醇HO-PEG8-OH，首先，将Trt-OEG4-OTs(11.8g，20mmol)和Trt-OEG4-OH(8.7g，20mmol)溶解在50mL四氢呋喃(THF)中，再加入氢化钠(0.72g，30mmol)，室温下搅拌6小时后，旋蒸除去大部分溶剂后使用柱层析纯化，淋洗剂为石油醚(PE)：乙酸乙酯(EA)＝3:1，得到油状聚乙二醇衍生物13.1g，结构如式(2-1)所示，转化率为75％。再将式(2-1)所示的聚乙二醇衍生物(8.7g，10mmol)溶解在100mL 4M盐酸甲醇溶液中，在室温下搅拌12小时，进行旋蒸将溶剂浓缩到大约20mL后沉降到200mL乙醚中，得到重复单元为8的单一分子量聚乙二醇(2.8g，7.6mmol)，即为HO-PEG8-OH，以便作为后续实验的原料。
制备具有如式(2-2)聚乙二醇衍生物：
将式(1-5)所示化合物(1g，0.35mmol)、四甘醇(0.68g，3.5mmol)、4-二甲氨基吡啶(24mg，0.2mmol)、N，N'-二环己基碳二亚胺(144mg，0.7mmol)溶解在10mL无水二氯甲烷中。在氩气的氛围下室温反应12小时。抽滤除去不溶性物质，旋蒸除去二氯甲烷，加入50mL PE:EA＝1:1的溶剂，用50mL水洗涤有机相3次后将有机相旋干。得到固体产物1.0g具有如式(2-2)所示结构，反应转化率为93％。
利用HO-PEG8-OH制备具有目标分子量的单一分子量聚乙二醇HO-PEG16-OH：
图5为本公开实施例2中制备单一分子量聚乙二醇HO-PEG16-OH的合成流程图，如图5所示，将具有如式(2-2)所示结构的聚乙二醇衍生物(2-2)(3g，1mmol)和对甲苯磺酰氯(0.19g，1mmol)在20mL四氢呋喃和含有氢氧化钠(0.2g，5mmol)的10mL水溶液溶解并冰浴下搅拌6小时，随后加入200毫升乙酸乙酯分层取有机相旋干得到中间产物，结构如式(2-3)所示，并将中间产物(2-3)(1.4g，0.45mmol)、以及上述制备得到的八甘醇HO-PEG8-OH(74mg，0.2mmol)溶解在20mL四氢呋喃中，加入氢化钠(12mg，0.5mmol)，室温下搅拌12小时。抽滤后使用石油醚：乙酸乙酯＝4：1对滤液进行柱层析纯化，得到产物为键连有直链寡聚乙二醇的多元醇(2-4)，其结构如式(2-4)所示。
将键连有直链寡聚乙二醇的多元醇(2-4)(1.15g，0.18mmol)在含有2克氢氧化钠的20毫升甲醇溶液中回流6小时得到十六甘醇(0.13g，0.18mmol)，即为单一分子量聚乙二醇HO-PEG16-OH。
通过采用高分辨率质谱法(MALDI-TOF)，电喷雾电离质谱法(ESI)，核磁共振波谱法(NMR)对实施例2制备得到的单一分子量聚乙二醇进行测试，测试结果如图6～图8所示，其中，图6为本公开实施例2中单一分子量聚乙二醇的高分辨率质谱(MALDI-TOF)图；图7为本公开实施例2中单一分子量聚乙二醇的电喷雾电离质谱(ESI)图；图8为本公开实施例2中单一分子量聚乙二醇的核磁共振氢谱图。
实施例3
如图9所示，图9为本公开实施例3中制备单一分子量聚乙二醇的合成流程图，将三羟甲基乙烷(1.2g，10mmol)和Trt-OEG4-OTs(20.7g，35mmol)溶解在80mL四氢呋喃中，加入氢化钠(0.84g，35mmol)室温下搅拌6小时，随后加入200毫升乙酸乙酯分层取有机相旋干后，使用石油醚：乙酸乙酯＝2：1对进行柱层析纯化，得到产物为支化聚乙二醇的衍生物(3-1)，其结构如式(3-1)所示。
将式(3-1)所示化合物(13.7g，10mmol)溶解在100mL甲醇中。加入对甲苯磺酸(0.19g，1mmol)后室温反应12小时。旋蒸除去甲醇，加入50mL水，每次使用50mL PE:EA＝10:1的洗涤水相2次，随后使用50mL二氯甲烷萃取水相3次后将有机相合并并旋干。得到无色油状产物6.0g，具有如式(3-2)所示结构，反应转化率为88％.
实施例4
采用与实施例2相同的方法迭代制备具有较高聚合度高分子量的单一分子量聚乙二醇PEG32，单一分子量聚乙二醇PEG45，单一分子量聚乙二醇PEG64，单一分子量聚乙二醇PEG96，单一分子量聚乙二醇PEG128，单一分子量聚乙二醇PEG192。
通过采用电喷雾电离质谱法(ESI)、核磁共振氢谱法(NMR)以及凝胶渗透色谱法(GPC)对单一分子量精确聚乙二醇进行测试，其结果如图9～图11所示，图10为本公开实施例4中单一分子量聚乙二醇的电喷雾电离质谱(ESI)图；图11为本公开实施例4中单一分子量聚乙二醇的核磁共振氢谱图；图12为本公开实施例4中单一分子量聚乙二醇的凝胶渗透色谱(GPC)图。
实施例5
制备具有疏水性封端基团的单一分子量聚乙二醇：
图13为本公开实施例5中具有疏水性封端基团的单一分子量聚乙二醇的合成图。
如图13所示，将实施例1中制备得到的苯甲酸衍生物(0.95g，0.33mmol)和实施例4中制备得到的单一分子量聚乙二醇PEG45(0.66g，0.33mmol)以及二甲氨基吡啶(40mg，0.33mmol)溶解于20mL甲苯中，共沸至干，加入含有N，N'-二环己基碳二亚胺(0.14g，0.66mmol)的无水二氯甲烷10mL，室温搅拌48小时后。进行抽滤，将滤液进行柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝10：1)，得到无色透明油状产物0.89g，即为具有疏水性封端基团的单一分子量聚乙二醇，其结构如式(5-1)所示，反应转化率为56％。
通过采用核磁共振波谱法(NMR)对制备得到的具有疏水性封端基团的单一分子量聚乙二醇进行测试，其测试结果如图14所示，图14为本公开实施例5中具有疏水性封端基团的单一分子量聚乙二醇的核磁共振氢谱图。
实施例6
采用单一分子量聚乙二醇制备单一分子量聚乙二醇化短肽：
图15为本公开实施例6中单一分子量聚乙二醇化短肽的合成图，如图15所示，将MMAE-MI(91mg，0.1mmol)和HO-PEG45-SH(220mg，0.1mmol)溶解于2mL pH＝7.4的磷酸缓冲液中，室温搅拌2小时后。使用循环制备凝胶渗透色谱(GPC)分离纯化产物，得到固体产物299mg，即为单一分子量聚乙二醇化短肽，其结构如式(6-1)所示，反应转化率为96％。
通过采用高分辨率质谱(MALDI-TOP MS)法对制备得到的上述短肽进行测试，如图16所示，图16为本公开实施例6中单一分子量聚乙二醇化短肽的高分辨率质谱(MALDI-TOPMS)图。
采用本公开提供的单一分子量聚乙二醇、制备方法及其应用，通过将一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇与多元醇进行缩合反应，在进行水解去除疏水性封端基团，可设计并合成具有目标分子量的单一分子量聚乙二醇，纯度较高，能够进行大量制备；同时，可根据需要在单一分子量聚乙二醇的一端或两端修饰功能性基团，用于连接特定的蛋白或其他小分子化合物，应用于高级诊断和药物递送系统中时，可以增强药效，降低免疫原性，具有较为宽广的应用前景。
以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种单一分子量聚乙二醇的制备方法，包括：
将一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇与多元醇进行缩合反应，使得所述多元醇键连所述直链寡聚乙二醇；
对键连有所述直链寡聚乙二醇的多元醇进行水解反应，以去除疏水性封端基团，得到单一分子量聚乙二醇；
将所述单一分子量聚乙二醇迭代为新的多元醇，重复所述缩合反应和水解反应的操作，直至得到具有目标分子量的单一分子量聚乙二醇，所述目标分子量为250～100000。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，
所述单一分子量精确聚乙二醇包括式(A1)～(A3)所示结构中的任意一种：
其中，i为4～500，优选为40～200，k为0或正整数。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，
所述多元醇包括式(g1)～(g3)所示结构中的任意一种：
其中，j为1～16，k为0或正整数。
4.根据权利要求1所述的制备方法，还包括：
由疏水性封端化合物和直链寡聚乙二醇HO-PEG-OH在碱催化剂催化反应得到中间体，再与对甲苯磺酰氯反应生成所述一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇；
其中，所述一端被疏水性封端的直链寡聚乙二醇的结构为TG-PEG-OTs；
TG表示疏水性封端基团，包括以下结构中的任意一种：
其中，
n各自独立地为0～100，m各自独立地为0～201，l各自独立地为0～10；
CnHm相同或不同，各自独立地选自氢、C1～C100的烷基、C2～C100的烯基、C2～C100的炔基；
CnHmOl相同或不同，各自独立地选自氢、羟基、C1～C100的烷基、C2～C100的烯基、C2～C100的炔基、C1～C100烷氧基。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，
所述缩合反应使用的溶剂为N，N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃中的任意一种；
所述缩合反应的温度为0～40℃，时间为4～72h；
所述水解反应的溶剂为甲醇；
所述水解反应的温度为25～80℃，时间为2～24h。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其中，
所述疏水性封端化合物的末端反应基团为卤素或羧基，：
具有下式B1～B6所示结构中的任意一种：
其中，R1为卤素原子Cl、Br、I中的任意一种。
7.一种如权利要求1～6中任意一项所述的方法制备得到的单一分子量聚乙二醇。
8.一种具有疏水性封端基团的单一分子量聚乙二醇，包括：
由如权利要求7所述单一分子量聚乙二醇结构的一端或两端键连疏水性封端基团而获得；
所述具有疏水性封端基团的单一分子量聚乙二醇，具有下式C1～C3所示结构：
TG’包括以下结构中的任意一种，且不全为羟基：
其中，i为4～500，优选为40～200，k为0或正整数；
其中，
n各自独立地为0～100，m各自独立地为0～201，l各自独立地为0～10；
CnHm相同或不同，各自独立地选自氢、C1～C100的烷基、C2～C100的烯基、C2～C100的炔基；
CnHmOl相同或不同，各自独立地选自氢、羟基、C1～C100的烷基、C2～C100的烯基、C2～C100的炔基、C1～C100烷氧基。
9.一种异官能团化的单一分子量聚乙二醇，由权利要求7所述的单一分子量聚乙二醇经功能性官能团修饰得到，具有下式D1～D3所示结构：
其中，i为4-500，k为任意正整数；
R3、R4、R5和R6为功能修饰基团，R3、R4、R5和R6各自独立地选自以下结构中的任意一种：
R7选自以下结构中的任意一种：
R8为氢原子、C1～C100烷基、Cl、Br、I中的任意一种。
10.一种如权利要求7所述的单一分子量聚乙二醇在药物修饰中的应用，其中，所述药物为短肽或蛋白。
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