CN101723874A - 花菁类化合物及其在生物样品染色中的用途 - Google Patents

花菁类化合物及其在生物样品染色中的用途 Download PDF

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Abstract

提供了一种用于生物样品染色的式I表示的花菁类化合物，其中R1、R2、X、Y、A1和A2如说明书中的定义。该类化合物具有良好的光照稳定性，最大吸收峰位置在640nm附近，且不随环境温度的变化而变化，与核酸结合后化合物/核酸复合物荧光强度增加迅速，光谱在近红外区，在流式细胞分析仪中作为核酸染色剂使用可以有效降低背景荧光的干扰，提高检测的精度。同时所提供的化合物可以作为血液中有核红细胞的染色剂使用。
Figure 200810217140.9_AB_0

Description

花菁类化合物及其在生物样品染色中的用途
技术领域
本发明涉及荧光染料。具体地讲，本发明涉及适合用于生物样品染色的花菁类化合物，包含所述花菁类化合物的组合物及其在生物样品染色中的用途。
背景技术
有核红细胞(Nucleated red blood cells，NRBC)是未完全成熟的红细胞，可以分为早、中、晚有核红细胞，通常存在于骨髓等造血组织或器官中。当外周血中有核红细胞数量增加时，可能是机体贫血、缺氧等生理和病理代偿反应。最近的研究证实，母体外周血中存在少量胎儿的有核红细胞。同时发现，在某些妊娠病理状态下，如发热、妊娠高血压征、胎儿宫内缺氧等，母体外周血中的胎儿有核红细胞有增多的情况。因此，测量NRBC具有重要的临床意义。
以往，临床中采用手工镜检法分析和鉴定有核红细胞。该方法费时且在较大程度上依赖检验员的经验和主观判断。
70年代发展了流式细胞术(Flow Cytometry，简称为FCM)，该技术利用流式细胞仪可对细胞等生物粒子进行定量、快速、客观多参数相关检测分析。血液自动分析装置应用了流式细胞术，利用核染色技术可以将NRBC与其他细胞类型区分开。这样，可以在一般检查室进行血液细胞的分类和计数，大大提高了检测的效率。
美国专利US5298426公开了一种两步法分析NRBC的荧光法。采用两步法降低了测试了效率。
美国专利US5559037提出了基于流式细胞技术的NRBC和白细胞分析方法。在该方法中利用的核酸染料为溴化乙锭，它和核酸形成的复合物在光照过程中容易产生光漂白，同时该物质能诱发癌变，灵敏度较低，对仪器的操作者和环境构成了一定的威胁。
美国专利US5879900公开了基于流式细胞技术对血液中NRBC、破坏的白细胞及白细胞分类的方法。该方法包括先向待测血液样本中加入荧光标记的抗体，不仅增加了检测的成本，也使检测步骤复杂。
美国专利US6197593提出了一种采用SYTO系列作为核酸染料，对血液样品中的网织红细胞、有核红细胞和红细胞进行分类的方法。这类染料的合成工艺路线长。
因此，需要继续开发出新的荧光染料，以满足对生物样品进行准确、快速检测的需要。
发明内容
本发明一方面提供了一种具有通式I结构的化合物：
Figure G2008102171409D0000021
其中
R1、R2各自独立选自C1-18烷基COOR6、C1-18烷基OR6和苄基，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基和羧基，并且R1和R2不同时为苄基；
R6每次出现时独立为H、C1-18烷基或者苯基，其中苯基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基和羧基；
X为CH2、C(CH3)2、O、S或Se；
Y为-CH2-CH＝CH-、
Figure G2008102171409D0000031
或
Figure G2008102171409D0000032
Figure G2008102171409D0000033
和
Figure G2008102171409D0000034
各自独立为
Figure G2008102171409D0000035
Figure G2008102171409D0000036
或
Figure G2008102171409D0000037
R3、R4和R5各自独立选自H、卤素、氰基、羟基、C1-18烷基、C1-18烷基磺酸基、磺酸基和C1-5烷基COOR7；
R7为H或C1-6的烷基；
Z-为阴离子。
本发明还一方面提供一种缀合物，所述缀合物包含上述式I化合物。
本发明另一个方面还提供用于生物样品染色的组合物，所述组合物包含上述式I化合物或其缀合物。
本发明再一方面还提供了本发明式I化合物或其缀合物在对生物样品进行染色中的用途。
本发明的化合物具有以下性质：无核酸时自身几乎没有荧光，与核酸形成复合物后时荧光强度迅速增加并且光谱在近红外区，避免背景荧光的干扰，有助于提高检测结果的精确度，同时可在流式细胞分析仪上用作各种生物样品的染色剂；可以在640nm附近被激发且其波长在40℃可以保持稳定，与使用的半导体激光器工作波长相匹配；具有良好的光照稳定性，在水溶液中可以较快的降解，对仪器操作者和环境均友好；合成工艺路线较短，原料易得，成本低。
本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图和本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。
附图说明
图1是化合物Dye-1在不同环境温度下放置48小时后的吸收光谱。使用仪器为紫外可见光分光光度计，型号为Uvmini-1240。
图2是化合物Dye-1在醇溶液中光照不同时间后的吸收光谱。使用仪器为紫外可见光分光光度计，型号为Uvmini-1240。
图3是化合物Dye-1在磷酸盐缓冲液中光照不同时间后的吸收光谱。使用仪器为紫外可见光分光光度计，型号为Uvmini-1240。
图4是用化合物Dye-1作为有核红细胞测定试剂，测定血液的前方散射光强度及荧光强度时的散射图。横坐标为荧光强度，纵坐标为前向散射光强度。
图5是用化合物Dye-2作为有核红细胞测定试剂，测定血液的前方散射光强度及荧光强度时的散射图。横坐标为荧光强度，纵坐标为前向散射光强度。
图6是用化合物Dye-3作为有核红细胞测定试剂，测定血液的前方散射光强度及荧光强度时的散射图。横坐标为荧光强度，纵坐标为前向散射光强度。
图7是用化合物Dye-4作为有核红细胞测定试剂，测定血液的前方散射光强度及荧光强度时的散射图。横坐标为荧光强度，纵坐标为前向散射光强度。
图8是用化合物Dye-5作为有核红细胞测定试剂，测定血液的前方散射光强度及荧光强度时的散射图。横坐标为荧光强度，纵坐标为前向散射光强度。
图9是用化合物Dye-6作为有核红细胞测定试剂，测定血液的前方散射光强度及荧光强度时的散射图。横坐标为荧光强度，纵坐标为前向散射光强度。
具体实施方式
定义
除另有说明外，否则本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“烷基”，无论是单独使用还是与其他基团结合使用，指包含1-18、优选1-12、更优选1-8、最优选1-6个碳原子的直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“正丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
本文中使用的术语“生物样品”包括但不限于肽、蛋白质、核酸和血液中的有核红细胞。
本文中使用的术语“芳基”是指含有3至20个碳原子的芳族单环或2或3环稠环基团，任选还含有1至3个选自N、O和S的杂原子。
本文中使用的术语“杂环基”是指含有3至20个碳原子的非芳族单环或2或3环稠环基团，任选还含有1至3个选自N、O和S的杂原子。
本文中使用的术语“磺酸基”是指-SO3H基团或-SO3 -M基团，其中M为相反离子，包括例如碱金属离子(例如K+离子)或碱土金属离子。
“烷基磺酸基”是指上述“磺酸基”通过上述“烷基”与分子的其他部分连接的基团。
本发明的化合物
本发明一方面提供了一种具有通式I结构的化合物：
Figure G2008102171409D0000061
其中
R1、R2各自独立选自C1-18烷基COOR6、C1-18烷基OR6和苄基，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基和羧基，并且R1和R2不同时为苄基；
R6每次出现时独立为H、C1-18烷基或者苯基，其中苯基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基和羧基；
X为CH2、C(CH3)2、O、S或Se；
Y为-CH2-CH＝CH-
Figure G2008102171409D0000062
或
Figure G2008102171409D0000071
Figure G2008102171409D0000072
和
Figure G2008102171409D0000073
各自独立为
Figure G2008102171409D0000074
Figure G2008102171409D0000075
或
Figure G2008102171409D0000076
R3、R4和R5各自独立选自H、卤素、氰基、羟基、C1-18烷基、C1-18烷基磺酸基、磺酸基和C1-5烷基COOR7；
R7为H或C1-6的烷基；
Z-为阴离子。
优选R1、R2各自独立选自C1-6烷基COOR6、C1-6烷基OR6和苄基，且R1和R2不同时为苄基。
优选R6每次出现时独立为H、C1-6烷基或者苯基。
优选R3、R4和R5各自独立为H、卤素、氰基、羟基、C1-6烷基、C1-6烷基磺酸基、磺酸基或C1-5烷基COOR7。
优选X为C(CH3)2、O或S。
优选
Figure G2008102171409D0000077
和
Figure G2008102171409D0000078
各自独立选自
Figure G2008102171409D0000079
和
Figure G2008102171409D0000081
优选Z-为选自卤素离子、ClO4 -、PF6 -、CF3SO3 -、BF4 -、乙酸根或对甲苯磺酸根负离子的阴离子。
优选本发明的化合物为：
Figure G2008102171409D0000082
Figure G2008102171409D0000091
Figure G2008102171409D0000101
本发明实施例的化合物可作为本文中所述的盐形式直接用于生物样品的染色。或者，在一个实施方案中，本发明实施例化合物可作为式I化合物的衍生物的形式使用，所述衍生物包括但不限于缀合物。
典型地，缀合物在荧光激活细胞分选仪(FACS)中使用。本文中使用的“缀合物”是指本发明化合物通过共价键与其它分子连接而形成的化合物。可与本发明化合物缀合的分子可为与细胞或细胞成分特异性结合的分子，包括但不限于抗体、抗原、受体、配体、酶、底物、辅酶等。通常，测试样品与缀合物温育一段时间，使得该缀合物与测试样品中的某些细胞或细胞成分特异性结合，该缀合物与细胞或细胞成分的结合也可被称为染色。该染色步骤可依次进行多次，或用多种缀合物同时进行多种染色。染色完成后，样品在荧光激活细胞分选仪中进行分析，其中激发光源激发缀合物中的本发明化合物，而测定装置测定由激发的化合物产生的发射光。
或者，在另一个实施方案中，该缀合物还可用于固相免疫测试，例如夹心型免疫测试。固相免疫测试的技术是本领域公知的，可由标准教科书获得。本发明的缀合物可用作固相免疫测试中的各种合适成分。
本发明的化合物的制备方法
本发明化合物可通过本领域熟知的通用方法合成得到。具体地讲，本发明化合物部分中间体可通过如下流程合成得到。
由未取代或取代的式II或III化合物为原料，分别与式R1X或R2X(X为F、Cl、Br或I)的卤化物反应：
式II    式III
得到式IV和式V的季铵盐中间体：
Figure G2008102171409D0000112
式IV    式V
其中R1、R2、X、A1环和A2环分别如式I化合物中所述定义。
例如，通过如下反应得到各种相应的季铵盐中间体。
Figure G2008102171409D0000121
然后，将制得的式IV和式V的季铵盐中间体与连接分子缩合，可得到式I化合物：
Figure G2008102171409D0000131
式I
其中X、Y、R1、R2、Z-、A1环和A2环如上定义，连接分子可为方酸、异佛尔酮等化合物。
例如，本发明部分目标化合物可通过如下流程合成：
Figure G2008102171409D0000132
Figure G2008102171409D0000141
所得化合物可通过本领域公知的分离和纯化技术回收，以达到需要的纯度。
本发明中使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单地制备得到。
本发明的组合物
本发明一个实施方案还提供包含上述式I化合物或其缀合物的组合物，所述组合物用于生物样品的染色。
所述生物样品选自肽、蛋白质、核酸和血液中的有核红细胞。所述蛋白质选自抗体、抗体片断和单链抗体。所述核酸选自脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、适体和肽核酸(PNA)。
本发明的组合物除包含式I化合物或其缀合物外，还可包含生物样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、渗透压调节剂、pH调节剂、表面活性剂等。本发明的组合物可作为水溶液形式存在，或者可作为临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。
本发明化合物或组合物的应用
本发明一个实施方案还提供使用上述式I化合物或包含式I化合物的组合物以染色生物样品的方法，该方法包括使上述式I化合物或其缀合物或包含式I化合物的组合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”可包括在溶液或固相中接触。
特点
由以上描述以及本领域技术人员公知的常识，可了解本发明化合物的各种优点，包括但不限于以下：
(1)本发明提供的化合物最大激发波长在640nm左右，且不随着温度变化而变化，与使用的红色半导体激光器的波长相匹配。
(2)本发明化合物/核酸复合物发射波长在600nm-900nm的近红外区，避免了生物自身的荧光背景干扰，有助于提高检测结果的精确度。
(3)本发明提供的化合物具有一定的光照稳定性。
(4)本发明提供的化合物可在流式细胞分析仪上用做血液中有核红细胞染色剂。
(5)本发明提供的化合物在水溶液中具有快速降解的特点，对仪器的操作者和环境均友好。
实施例
以下通过具体实施例对本发明作出详细说明，但本领域技术人员会理解，本发明不限于此。
实施例1
Dye-1的合成
Figure G2008102171409D0000161
向配有回流冷凝器、磁力加热搅拌器的100mL三口烧瓶中加入0.1mol 2，3，3-三甲基吲哚、0.25mol 6-溴己酸乙酯和25mL邻二氯苯作为溶剂，在氩气保护下回流反应24小时。反应体系冷却至室温后向其中加入适量乙酸乙酯，超声振荡使产物析出，在乙酸乙酯中研磨后过滤，得到深棕红色块状物，直接用于下步反应。
取该棕红色产物0.01mol、方酸0.005mol和8mL苯、6mL正丁醇、6mL吡啶作为溶剂一起放入50mL三口烧瓶中，在氩气保护下搅拌并加热至回流，反应6小时后停止。冷却至室温后向其中加入过量乙醚使产物析出，过滤，并用适量乙醚洗涤后干燥，得到深蓝色固体。该深蓝色固体通过硅胶柱层析的方法进行纯化，用洗脱液乙酸乙酯∶石油醚＝5∶0～5∶1梯度洗脱，收集蓝色组分，旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，为蓝色具金黄色金属光泽的固体物，收率33％。
最大吸收峰：637nm(甲醇/乙二醇)
MS(EI)C42H53BrN2O6m/z：681.9[M-Br]+。
实施例2
Dye-2的合成
Figure G2008102171409D0000171
精确称量0.002mol 1-苄基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉氯盐、丙二醛缩二苯胺盐酸盐0.0022mol加入到25mL三口烧瓶中，分别加入醋酸和醋酸酐各4mL，在氩气保护下搅拌并加热到回流，反应4小时后停止，冷却至室温，旋转蒸发除去部分溶剂后向其中加入过量乙醚使产物析出，过滤，固体物用少量乙酸乙酯淋洗三次以除去未反应的丙二醛缩二苯胺盐酸盐，得到棕色固体。
取该棕色产物0.001mol和0.0012mol 1-(己酸乙酯基)-2，3，3-三甲基-3H-吲哚邻溴盐放入三口烧瓶中，加入醋酸酐和吡啶各3mL作为溶剂，在氩气保护下搅拌并加热到回流，40分钟后停止反应，向其中加入0.0011mol的氟硼化钠溶于3mLDMF中得到的溶液，再加热搅拌15分钟。冷却至室温后向其中加入过量乙醚，产物析出，过滤后干燥，得到深蓝色固体。该深蓝色固体通过硅胶柱层析的方法进行纯化，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝5∶0～5∶1梯度洗脱，收集蓝色组分，旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，收率36％。
最大吸收峰：641nm(甲醇/乙二醇)
MS(EI)C40H47BF4N2O2m/z：587.8[M-BF4]+。
实施例3
Dye-3的合成
Figure G2008102171409D0000181
向配有回流冷凝器、磁力加热搅拌器的250mL三口烧瓶中加入0.05mol 2，3，3-三甲基吲哚，0.20mol 4-溴丁酸乙酯和10mL甲苯作为溶剂，在氩气保护下回流反应24小时。反应体系冷却至室温后向其中加入适量乙酸乙酯，超声波振荡使产物析出，在乙酸乙酯中研磨后过滤，得到深棕红色块状物，直接用于下一步反应。
取该棕红色产物0.08mol、异佛尔酮0.004mol和5mL醋酸酐、5mL吡啶作为溶剂一起放入25mL三口烧瓶中，在氩气保护下搅拌并加热至回流，反应4小时后停止。冷却至室温后向其中加入过量乙醚使产物析出，过滤，并用适量乙醚洗涤后干燥，得到深蓝色固体。该深蓝色固体通过硅胶柱层析的方法进行纯化，用洗脱液乙酸乙酯∶石油醚＝100∶0～100∶15梯度洗脱，收集蓝色组分，旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，收率40％。
最大吸收峰：639nm(甲醇/乙二醇)
MS(EI)C42H55BrN2O4m/z：651.9[M-Br]+。
实施例4
Dye-4的合成
Figure G2008102171409D0000191
向配有回流冷凝器、磁力加热搅拌器的100mL三口烧瓶中加入0.1mol 5-磺酸钾基-2，3，3-三甲基吲哚、0.25mol 6-溴己酸乙酯和25mL邻二氯苯作为溶剂，在氩气保护下回流反应36小时。反应体系冷却至室温后向其中加入适量乙醚，超声振荡使产物析出，在乙酸乙酯中研磨后过滤，得到深棕红色块状物，直接用于下步反应。
取该深棕红色产物0.08mol，克酮酸0.004mol和6mL苯、4mL正丁醇、4mL吡啶作为溶剂一起放入50mL三口烧瓶中，在氩气保护下搅拌并加热至回流，反应6小时后停止。冷却至室温后向其中加入过量乙醚使产物析出，过滤，并用适量乙醚洗涤后干燥，得到深蓝绿色固体。该深蓝绿色固体通过反相C18硅胶柱层析的方法进行纯化，用洗脱液甲醇∶水＝0∶100～1∶4梯度洗脱，收集蓝色组分，旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，为蓝色具金属光泽固体，收率37％。
最大吸收峰：637nm(甲醇/乙二醇)
MS(EI)C43H51KN2O13S2m/z：868.1[M-K]。
实施例5
Dye-5的制备
Figure G2008102171409D0000201
精确称量0.002mol 5-磺酸钾基-1-(4-甲氧基苄基)-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉盐，丙二醛缩二苯胺盐酸盐0.0022mol加入到25mL单口烧瓶中，分别加入醋酸和醋酸酐各4mL，在氩气保护下搅拌并加热到回流，反应4小时后停止，冷却至室温，旋转蒸发除去部分溶剂后向其中加入过量乙醚使产物析出，过滤，固体物用少量乙酸乙酯淋洗三次以除去未反应的缩合剂，得到棕黄色固体。
取该棕黄色产物0.001mol和0.0012mol 3-(己酸乙酯基)-1，1，2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚溴盐放入三口烧瓶中，加入醋酸酐和吡啶各4mL作为溶剂，在氩气保护下搅拌并加热到回流，40分钟后停止反应，向其中加入含有0.0012mol氟硼化钠的3mLDMF溶液，继续反应20分钟，冷却至室温后向其中加入过量乙醚，产物析出，过滤后干燥，得到得到深蓝色固体。该深蓝色固体通过硅胶柱层析的方法进行纯化，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝5∶0～5∶1梯度洗脱，收集蓝色组分，旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，为具有金属光泽的蓝色固体，收率29％。
最大吸收峰：642nm(甲醇/乙二醇)
MS(EI)C45H50BF4KN2O6S  m/z：747.0[M-BF4]+。
实施例6
Dye-6的制备
Figure G2008102171409D0000211
向配有回流冷凝器、磁力加热搅拌器的250mL三口烧瓶中加入0.05mol2，3，3-三甲基吲哚、0.10mol 2-溴乙氧基苯和10mL邻二氯苯作为溶剂，在氩气保护下回流反应28小时。反应体系冷却至室温后向其中加入适量乙酸乙酯，超声波振荡使产物析出，在乙酸乙酯中研磨后过滤，得到棕红色块状物，直接用于下步反应。
取该棕红色产物0.005mol，异佛尔酮0.0025mol和4mL苯、3mL正丁醇、3mL吡啶作为溶剂一起放入50mL三口烧瓶中，在氩气保护下搅拌并加热至回流，反应6小时后停止。冷却至室温后向其中加入过量乙醚使产物析出，过滤，并用适量乙醚洗涤后干燥，得到深蓝色固体。该深蓝色固体通过硅胶柱层析的方法进行纯化，用洗脱液乙酸乙酯∶石油醚＝5∶0～5∶1梯度洗脱，收集蓝色组分，旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，收率33％。
最大吸收峰：638nm(甲醇/乙二醇)
MS(EI)C46H51BrN2O2m/z：663.9[M-Br]+。
实施例7
本发明实施例化合物吸收峰测定
精确称取一定量的本发明实施例化合物充分溶解在2.5mL甲醇/乙二醇(体积比例50∶50)中，配制成浓度为5mM的溶液，取5uL该溶液稀释在2mL甲醇/乙二醇溶液中，遮光密闭条件下分别放置在0℃、20℃和40℃和60℃环境中48小时，然后在紫外-可见光分光光度计(型号：Uvmini-1240)上测定其最大吸收峰位置。Dye-1在不同温度下放置后的吸收峰如图1所示。从图中可以得知，其最大吸收峰位置不随温度的变化而发生漂移，从而可以很好的与激光器的激发波长相匹配。
表1给出dye-1、dye-2、dye-4、dye-5、dye-6在不同温度下放置48小时后的最大吸收峰-变化。
表1
对比表中的数据得知，本发明实施例化合物在不同的温度下放置48小时后最大吸收峰不发生变化。
实施例8
本发明实施例化合物在乙醇溶液中的光稳定性测定
将化合物Dye-1配成1×10-5M的乙醇溶液装入可以密封的石英比色皿中。使用50g/L的亚硝酸钠溶液盛于一个长方体玻璃缸中做截止滤光器，滤去波长小于400nm的紫外光。另外，亚硝酸钠溶液也能起到冷阱的作用，使样品的温度保持常温。测定样品的初始吸光度值后，选用500W碘钨灯作为光源，距离样品20cm处，通电光照，计时。间隔2、4、8、12、20、40小时后，分别测量样品光照后的吸光度值。如图2所示，经过一段时间的光照后，化合物Dye-1没有显示明显的褪色现象，这说明该化合物具有一定的光稳定性，可以稳定的在乙醇溶液中储存。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号为Uvmini-1240。
实施例9
本发明实施例化合物在磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中的光稳定性测定
将化合物Dye-1配成1×10-5M的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液装入可以密封的比色皿中。使用50g/L的亚硝酸钠溶液盛于一个长方体玻璃缸中做截止滤光器，滤去波长小于400nm的紫外光。另外，亚硝酸钠溶液也能起到冷阱的作用，使样品的温度保持常温。测定样品的初始吸光度值后，选用500W碘钨灯作为光源，距离样品20cm处，通电光照，计时。间隔2、4、6、8、10、20小时后，分别测量样品光照后的吸光度值。如图3所示，该化合物在PBS溶液中光照2小时褪色率就达到了73％，光照4小时后褪色率为87％，光照6小时后褪色率超过了90％，说明在磷酸盐缓冲液中该化合物的稳定性较差，在很短的时间内就可以分解成无色的物质。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号为Uvmini-1240。
结合实施例8可以看出，该类化合物固体颗粒以及在醇溶液中具有良好的光稳定性，有利于稳定的保存和使用。使用后化合物处于磷酸盐缓冲溶液体系中，则表现出良好的光不稳定性，可以在较短的时间内分解成无色的物质，从而显示出对使用者和环境的友好性。
实施例10
化合物Dye-1作为有核红细胞测试试剂
Figure G2008102171409D0000241
在2mL含有化合物Dye-1的有核红细胞测定试剂中加入10uL经过抗凝剂处理的血液，调制成测试样品，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪(中国专利CN 101000306A深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，测定样品的前方低角散射光强度和荧光强度。根据荧光强度和散射光强度辨别试样中的嗜碱性细胞、有核红细胞和白细胞并分类计数，算出它们的细胞比率。有核红细胞比率通常用每100个白细胞出现的有核红细胞的百分率标示，单位记为“个/100WBC”。图4显示了有核红细胞荧光与白细胞荧光的对比，其中有核红细胞在总白细胞中所占的比例为5.9％。
实施例11
化合物Dye-2作为有核红细胞测试试剂
Figure G2008102171409D0000251
在2mL含有化合物Dye-2的有核红细胞测定试剂中加入10uL经过抗凝剂处理的血液，调制成测试样品，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪(中国专利CN 101000306A深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，测定样品的前方低角散射光强度和荧光强度。根据荧光强度和散射光强度辨别试样中的嗜碱性细胞、有核红细胞和白细胞并分类计数，算出它们的细胞比率。有核红细胞比率通常用每100个白细胞出现的有核红细胞的百分率标示，单位记为“个/100WBC”。图5显示了有核红细胞荧光与白细胞荧光的对比，其中有核红细胞在总白细胞中所占的比例为3.2％。
实施例12
化合物Dye-3作为有核红细胞测试试剂
Figure G2008102171409D0000261
在2mL含有化合物Dye-3的有核红细胞测定试剂中加入10uL经过抗凝剂处理的血液，调制成测试样品，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪(中国专利CN 101000306A深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，测定样品的前方低角散射光强度和荧光强度。根据荧光强度和散射光强度辨别试样中的嗜碱性细胞、有核红细胞和白细胞并分类计数，算出它们的细胞比率。有核红细胞比率通常用每100个白细胞出现的有核红细胞的百分率标示，单位记为“个/100WBC”。图6显示了有核红细胞荧光与白细胞荧光的对比，其中有核红细胞在总白细胞中所占的比例为1.3％。
实施例13
化合物Dye-4作为有核红细胞测试试剂
Figure G2008102171409D0000271
在2mL含有化合物Dye-4的有核红细胞测定试剂中加入10uL经过抗凝剂处理的血液，调制成测试样品，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪(中国专利CN 101000306A深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，测定样品的前方低角散射光强度和荧光强度。根据荧光强度和散射光强度辨别试样中的嗜碱性细胞、有核红细胞和白细胞并分类计数，算出它们的细胞比率。有核红细胞比率通常用每100个白细胞出现的有核红细胞的百分率标示，单位记为“个/100WBC”。图7显示了有核红细胞荧光与白细胞荧光的对比，其中有核红细胞在总白细胞中所占的比例为0.9％。
实施例14
化合物Dye-5作为有核红细胞测试试剂
Figure G2008102171409D0000281
在2mL含有化合物Dye-5的有核红细胞测定试剂中加入10uL经过抗凝剂处理的血液，调制成测试样品，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪(中国专利CN 101000306A深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，测定样品的前方低角散射光强度和荧光强度。根据荧光强度和散射光强度辨别试样中的嗜碱性细胞、有核红细胞和白细胞并分类计数，算出它们的细胞比率。有核红细胞比率通常用每100个白细胞出现的有核红细胞的百分率标示，单位记为“个/100WBC”。图8显示了有核红细胞荧光与白细胞荧光的对比，其中有核红细胞在总白细胞中所占的比例为2.5％。
实施例15
化合物Dye-6作为有核红细胞测试试剂
Figure G2008102171409D0000291
在2mL含有化合物Dye-6的有核红细胞测定试剂中加入10uL经过抗凝剂处理的血液，调制成测试样品，吸入经过适当改造的流式细胞分析仪(中国专利CN 101000306A深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，测定样品的前方低角散射光强度和荧光强度。根据荧光强度和散射光强度辨别试样中的嗜碱性细胞、有核红细胞和白细胞并分类计数，算出它们的细胞比率。有核红细胞比率通常用每100个白细胞出现的有核红细胞的百分率标示，单位记为“个/100WBC”。图9显示了有核红细胞荧光与白细胞荧光的对比，其中有核红细胞在总白细胞中所占的比例为2.3％。
已通过上述各实施方案和具体实施例对本发明作出说明，但本领域技术人员会理解，在不偏离本发明宗旨和范围的情况下，可对本发明作出各种修改、变更和替换。

Claims (14)

1.一种具有通式I结构的化合物：
Figure F2008102171409C0000011
其中
R1、R2各自独立选自C1-18烷基COOR6、C1-18烷基OR6和苄基，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基和羧基，并且R1和R2不同时为苄基；
R6每次出现时独立为H、C1-18烷基或者苯基，其中苯基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基和羧基；
X为CH2、C(CH3)2、O、S或Se；
Y为-CH2-CH＝CH-、
Figure F2008102171409C0000012
Figure F2008102171409C0000013
Figure F2008102171409C0000021
各自独立为
Figure F2008102171409C0000022
Figure F2008102171409C0000023
R3、R4和R5各自独立选自H、卤素、氰基、羟基、C1-18烷基、C1-18烷基磺酸基、磺酸基和C1-5烷基COOR7；
R7为H或C1-6的烷基；
Z-为阴离子。
2.权利要求1的化合物，其中R1、R2各自独立选自C1-6烷基COOR6、C1-6烷基OR6和苄基，且R1和R2不同时为苄基。
3.权利要求1-2中任一项的化合物，其中R6每次出现时独立为H、C1-6烷基或者苯基。
4.权利要求1-3中任一项的化合物，其中R3、R4和R5各自独立为H、卤素、氰基、羟基、C1-6烷基、C1-6烷基磺酸基、磺酸基或C1 -5烷基COOR7。
5.权利要求1-4中任一项的化合物，其中X为C(CH3)2、O或S。
6.权利要求1-5中任一项的化合物，其中
Figure F2008102171409C0000024
和
Figure F2008102171409C0000025
各自独立选自
7.权利要求1-6中任一项的化合物，其中Z-为选自卤素离子、ClO4 -、PF6 -、CF3SO3 -、BF4 -、乙酸根或对甲苯磺酸根负离子的阴离子。
8.权利要求1-7中任一项的化合物，所述化合物为：
Figure F2008102171409C0000031
Figure F2008102171409C0000041
Figure F2008102171409C0000051
9.一种缀合物，所述缀合物包含权利要求1-8中任一项的化合物。
10.一种用于生物样品染色的组合物，其中所述组合物包含权利要求1-8中任一项的化合物或权利要求9的缀合物。
11.权利要求10的组合物，其中所述生物样品选自肽、蛋白质、核酸和血液中的有核红细胞。
12.权利要求11的组合物，其中所述蛋白质选自抗体、抗体片断和单链抗体。
13.权利要求11的组合物，其中所述核酸选自脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、适体和肽核酸(PNA)。
14.权利要求1-8中任一项的化合物、权利要求9的缀合物或权利要求10-13中任一项的组合物在对生物样品进行染色中的用途。
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