CN101712938B

CN101712938B - 一种小菌核菌菌株及其用于生物除草的方法

Info

Publication number: CN101712938B
Application number: CN2009100307593A
Authority: CN
Inventors: 强胜; 唐伟; 朱云枝; 陈世国
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2009-04-15
Filing date: 2009-04-15
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2029-04-15
Also published as: CN101712938A

Abstract

本发明为一种小菌核菌菌株及其用于生物除草的方法，属于微生物应用于农业植物保护领域。小菌核菌菌株(SC64)CGMCC NO.2934。用该菌株进行固体发酵得到的除草菌颗粒使用剂量30至150g·m^-2，用在禾本科作物玉米、水稻、小麦、大麦、甘蔗、高粱、谷子以及禾本科草坪狗牙根、结缕草、高羊茅、早熟禾、剪股颖、地毯草、大叶油草、假俭草、雀稗，控制阔叶杂草。此外，还可以特别应用于控制危害严重的紫茎泽兰、加拿大一枝黄花、小飞蓬、苏门白酒草、黄顶菊、薇甘菊、一年蓬、飞机草等外来入侵性杂草。对目标杂草控制效果可以达到80％以上。具有安全、环保的特点。

Description

一种小菌核菌菌株及其用于生物除草的方法

技术领域

本发明涉及一种小菌核菌菌株及其用于生物除草的方法，属于微生物应用于农业植物保护、防除农作物杂草的技术领域，专用于禾本科作物田及草坪阔叶杂草的防除。

背景技术

随着人们生态意识的增强，近年来城乡绿化建设发展较快，特别是以禾本科草坪为主的绿地面积不断扩大。许多阔叶杂草，包括苏门白酒草(Conyza sumatrehsis(Reez)Walker)、蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)、一年蓬(Erigeron annuus(L.)Pers.)、刺儿菜(Cephalanoplos segetum(Bunge)Kitam.)、牛繁缕(Malachium aquaticum(L.)Fries)、波斯婆婆纳(Veronica persica Poir.)、车前草(Plantago asiatica L.)、大巢菜(Vicia sativa L.)、石龙芮(Ranunculus sceleratus L.)、碎米荠(Cardamine hirsuta L.)以及异型莎草(yperus difformis L.)阔叶杂草侵占了新铺植的草坪的露地空间，影响了草坪的质量和美观。随着水稻直播这一新型农业栽培措施的大面积运用，“干干湿湿”的稻田环境使得节节菜(Rotala indica(Willd.)Koehne)、通泉草(Mazus japonicus(Thunb.)O.Kuntze)、陌上菜(Lindernia procumbens(Krock.)Philcox)、耳叶水苋(Ammannia arenarid H.)、鳢肠(Eclipta prostrata L.)等阔叶杂草发生量较大，给水稻生产带来损失。此外在玉米田中马齿苋(Portulaca oleracea L.)、反枝苋(Amaranthusretroflexus L.)、铁苋菜(Acalypha australis L.)等阔叶杂草危害也较为严重。

紫茎泽兰、加拿大一枝黄花、小飞蓬、苏门白酒草、黄顶菊、薇甘菊、一年蓬、飞机草等外来入侵植物在我国已经逸生成为恶性杂草，常形成单优势群落，对当地的社会经济、自然生态系统和生物多样性均构成了一定威胁。已经被列入中国重要外来有害植物名录。目前对于这些杂草的主要防治办法还是采用人工和机械铲除、化学防治以及生态替代等等。这些防除措施要么防除成本高，或者会导致对环境的污染。研制生物除草剂防除外来恶性入侵杂草为外来入侵杂草的防除提供了新的防除途径，而且对环境安全性高。目前，国内外尚无十分成功有效的生物除草剂防除上述各种外来入侵杂草。显然将该菌株作为生物除草剂的开发会有极为显著的经济和社会效益。

当今人们对化学除草剂残留、环境污染以及耐药和抗药性杂草发展的认识逐渐清晰，越来越关注有毒有害化学物质在土壤和水体中的残留、对食品的污染、以及对非靶标生物的危害和人类健康的影响等。随着绿色食品和有机农业的大力推广，研制生物除草剂防除杂草已成为生产实际的迫切需求；也是一个新兴的技术和杂草防除最活跃的研究领域。它具有投资少、研制周期短、专一性强、对环境安全和不产生污染等优点。被认为是未来化学除草剂的替代产品。目前，商业化的生物除草剂品种有80年代初研制出的DeVine和Collego以及90年代末推出的Comperico和Biochon。这些除草剂在控制相应的目标杂草上起到了重要作用，甚至是唯一的选择。如DeVine的持效性可以保证使用一次，2-3年无须再除草。有希望商业化的生物除草剂项目有数十项，其中稗草、野荸荠等具有十分诱人的前景。但是，在国内目前还没有正在意义上商业化的生物除草剂。因此，要发展有机农业非常缺乏相应的除草配套产品和技术，而生物除草剂则是其中最理想的选择。

生防真菌又相对集中在半知菌亚门中以下几属：(1)炭疽菌属(Colletotrichum)；(2)疫霉属(Phytophthora)；(3)镰刀菌属(Fusarium)；(4)链格孢属(Alternaria)；(5)柄锈菌属(Puccinia)；(6)尾孢霉属(Cercospora)；(7)核盘菌属(Sclerotinia)；(8)叶黑粉菌属(Entyloma)；(9)壳单孢菌属(Ascochyta)。目前成功应用于作物生产并申请专利的主要有炭疽菌属(Colletotrichum species)(US 3,849,104和US 3,999,973)；镰刀菌属(Fusarium species)(US 4,419,120)；链格孢属(Alternaria species)(US 4,390,360)；壳单孢菌属(Ascochyta species)(US 4,915,724)以及核盘菌属(Sclerotinia species)(CA02,292,233)等。而国内还没有小菌核菌属，尤其小菌核菌菌株(Sclerotium rolfsii)(SC64)的申报，也无用在草坪、高尔夫球场、公园及禾本科作物田防除阔叶杂草的植物病原菌生物除草剂。

本发明从加拿大一枝黄花分离得到小菌核菌，试验证明该菌对加拿大一枝黄花及多种阔叶杂草致病性强，对禾本科植物安全。

发明内容

本发明的目的是针对旱直播水稻田的异型莎草、节节菜、鳢肠、陌上菜等，玉米等禾本科作物田的波斯婆婆纳、马齿苋等阔叶杂草及草坪的牛繁缕、繁缕、蒲公英、山莴苣等阔叶杂草，等以及水稻、玉米、草坪苗期及荒地等的恶性杂草加拿大一枝黄花(Solidago canadensis L.)以及阔叶杂草等，筛选一种小菌核菌菌株，用于生物除草，能安全有效地控制和防治阔叶杂草及异型莎草、恶性杂草加拿大一枝黄花等，成本低，无污染，对农作物安全。

本发明一种小菌核菌菌株及其用于生物除草的方法，其内容和实施方案如下：

罗氏白绢小菌核菌菌株Sclerotium rolfsii Sacc.(SC64)，(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2009年3月12日保藏号：CGMCC NO.2934)，小菌核菌CGMCC 2934属于半知菌类(Fungi Imperfecti)，无孢菌群(Mycelia Sterilia)，小菌核菌属(Sclerotium Tode ex Fr.)，罗氏白绢小菌核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)，PDA培养基上菌株SC64的菌落呈圆形，菌丝白色绢丝状，茂盛，有隔膜，多分枝，分枝不成直角，呈放射状扩散，菌丝致直径3.5～6.5μm。7～10d后菌落上菌丝集结产生菌核。菌核表生，球形，只要产生于PDA培养基边缘或培养皿盖上，先呈白色或乳白色后变浅黄色至茶褐色或棕褐色，球形至卵圆形，内部灰白色，表面光滑且具光泽，直径为0.5～0.8mm。菌核表层由3层细胞组成，外层棕褐色，表皮层下为假薄壁组织，中间为疏丝组织。

菌株(SC64)，只发现不孕性菌丝，产生菌核，但不在植物体内部产生，亦不产生子囊盘和子囊孢子，不产生分生孢子。罗氏白绢小菌核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)具有相对简单的侵染循环，菌核在土壤环境条件适宜情况下直接萌发产生侵染性菌丝，随后完成对植物的侵染并在植物体表面及周围形成更多的菌核。菌核的有性生殖萌发产生子囊孢子曾在自然条件下被观察和报道，但极少发生，因此对病菌的侵染循环无重大影响。

发明人在对加拿大一枝黄花的生物防治研究过程中发现了田间加拿大一枝黄花的自然发病现象，故对其寄生真菌进行分离研究并严格按照柯赫氏法则(Koch’spostulate)进行了致病性验证。首先分离获得罗氏白绢小菌核菌(Sclerotium rolfsiiSacc.)菌株SC64，小菌核菌菌株SC64纯培养产生的孢子在加拿大一枝黄花上的致病症状为：加拿大一枝黄花菌核病菌主要侵染其茎基部，引起茎基部表皮黄化腐坏，坏死高度为3～7cm。病菌侵染后5～7d植株叶片自顶部开始出现萎蔫下垂，15～20d即可引起高为1～1.5m的成株加拿大一枝黄花死亡。随后菌丝体迅速在土表靠近加拿大一枝黄花茎秆处产生了白色菌核，并很快转变为黄褐色。棉籽壳培养的菌体颗粒接种后结果显示所有加拿大一枝黄花在接种后5～7d即出现了明显的茎基部表皮坏死，引起的症状与自然患病情况类似，死亡率达95％以上。采集罹病加拿大一枝黄花植株，剪取病健交界处茎秆表皮及采集该病原菌的菌核，用1‰升汞溶液进行表面消毒，然后置于PDA培养基上，在28℃恒温箱中培养，观察到菌丝生长情况及菌核产生情况也与前面相似。说明所分离到的小菌核菌是加拿大一枝黄花的病原真菌，且为加拿大一枝黄花的强致病菌。

本发明的小菌核菌菌株(SC64)分离自加拿大一枝黄花，但它具有广谱的阔叶杂草致病力，同样它的另一个优点在于可以有效杀死阔叶杂草而不影响周边的禾本科植物。从这一点看，小菌核菌菌株(SC64)具有与化学除草剂2，4-D同样的专一性，但却对环境安全。

以上实验条件下的发病症状与自然病症相似。

按其特征鉴定为：半知菌类(Fungi Imperfecti)，无孢菌群(Mycelia Sterilia)，小菌核菌属(Sclerotium Tode ex Fr.)，罗氏白绢小菌核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)，该菌株能侵染菊科(Asteraceae)、豆科(Leguminosae)、大戟科(Euphorbiaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、车前科(Plantaginaceae)等的阔叶杂草，对水稻、小麦、玉米等主要禾本科作物和高羊茅等禾本科草坪草高度免疫，以及供试的其它19科32种植物，26种高度免疫、6种免疫(表1和表2)，故可以用于水稻、小麦、玉米等主要禾本科作物和草坪，防除阔叶杂草。

本发明小菌核菌Sclerotium rolfsii SC64用于生物除草的防除对象为：菊科、旋花科、唇形科、十字花科、玄参科、桑科、苋科、石竹科、锦葵科、鸭跖草科、莎草科、大戟科、蓼科、报春花科、豆科、马齿苋科、茄科、车前科、酢浆草科、毛茛科、千屈菜科的阔叶杂草；对禾本科作物玉米、水稻、小麦、大麦、甘蔗、高粱、谷子以及禾本科草坪狗牙根、结缕草、高羊茅、早熟禾、剪股颖、地毯草、大叶油草、假俭草、海滨雀稗安全；因而，可用于禾本科作物和草坪上，控制阔叶杂草；特别还可以控制外来杂草紫茎泽兰、加拿大一枝黄花、小飞蓬、苏门白酒草。

本发明的小菌核菌Sclerotium rolfsii SC64用于生物除草。具体的应用方法为：将菌种接种于基质，固体发酵后通风晾干制得除草菌颗粒；撒施于田间或杂草发生地，使用剂量为30至150g·m^-2。所说的基质是常规的基质，具体可以是棉籽壳、酒糟、醋糟、鸡粪、猪粪、中药药渣、麸皮、加拿大一枝黄花、紫茎泽兰、玉米或小麦秸秆粉碎基质。

其培养方法为：该菌采用液体-固体联合发酵的大批量生产方式，即先以液体发酵培养菌丝体，后在固体基质或培养基上固定发酵培养，生产真菌侵染的基质，基质在晾干过程中会产生菌核。

生产流程：实验室菌种→一级种子(培养皿平板)→液体接种发酵→固体培养基混匀(接种)→通风晾干→粉碎→干真菌侵染基质→助剂→剂型→室温(10～20℃阴凉干燥密封保存)→货架期活力检测。

可用下列培养基培养得到液体菌种：

PDA液体培养基一一马铃薯葡萄糖琼脂培养基

马铃薯 200g

葡萄糖 20g

水 1L

LEPDA培养基-一加拿大一枝黄花浸汁PDA液体培养基

加拿大一枝黄花茎叶60g(洗净晾干，粉碎，过滤)

马铃薯 200g

葡萄糖 20g

蒸馏水 1L

MSSA培养基一-玉米粉豆粉蔗糖固体培养基

玉米粉 15g

黄豆粉 15g

蔗糖 15g

琼脂 20g

水 1L

优化Richard液体

KH₂PO₄ 1g

KCl 0.5g

MgSO₄ 2.5g

FeCl₃ 0.01g

葡萄糖 25g

酵母膏 2.5g

水 1L

该菌固体发酵菌颗粒的大批量生产用液体-固体联合培养办法生产。其主要的步骤包括用PDA液体培养基或玉米粉豆粉蔗糖液体培养基，对小菌核菌进行培养约4天，以棉籽壳等为固体发酵基质，灭菌后接种液体菌种发酵7天。

i棉籽壳 1000g(晾干)

液体菌种 50ml

尿素(或其他氮源) 10g

水 600ml

ii酒糟 1000g(晾干)

液体菌种 50ml

尿素(或其他氮源) 10g

水 600ml

iii醋糟 1000g(晾干)

液体菌种 50ml

尿素(或其他氮源) 10g

水 600ml

iv麸皮 1000g(晾干)

液体菌种 50ml

尿素(或其他氮源) 10g

水 600ml

v猪粪 1000g(晾干)

液体菌种 50ml

尿素(或其他氮源) 5～10g

水 650ml

vi加拿大一枝黄花秸秆粉碎基质1000g(晾干，粉碎)

液体菌种 100ml

尿素(或其他氮源) 15～20g

水 1000～1200ml

vii紫茎泽兰秸秆粉碎基质1000g(晾干，粉碎)

液体菌种 100ml

尿素(或其他氮源) 15～20g

水 1000～1200ml

viii玉米秸秆粉碎基质1000g(晾干，粉碎)

液体菌种 80～100ml

尿素(或其他氮源) 10～15g

水 1000ml

ix小麦秸秆粉碎基质1000g(晾干，粉碎)

液体菌种 100ml

尿素(或其他氮源) 15～20g

水 1000ml

x稻草粉碎基质1000g(晾干，粉碎)

液体菌种 100～150ml

尿素(或其他氮源) 15～20g

水 1500～2000ml

xI鸡粪 1000g(晾干)

液体菌种 50ml

水 400-850ml

xI鸡粪500g+稻草粉碎基质500g

液体菌种 100～150ml

尿素(或其他氮源) 5～10g

水 800～2000ml

每天翻转培养基，待菌丝长满后将发酵菌颗粒于通风橱晾干得到除草菌颗粒。任何适合于小菌核菌生长的谷物及其他固体基质均可以按照同样的方法发酵得到除草菌颗粒。

此外，其他同属的小菌核菌亦可以采取同样的培养方式，开发作为生物除草剂。

本发明的主要优点和积极效果如下：

小菌核菌用于生物除草，可制成富含其菌丝体的除草菌颗粒，可以在禾本科作物与这些杂草间进行安全地选择。在供试的29科共82种植物中，对小菌核菌SC64菌株不敏感的(高度免疫)有20种，主要是禾本科、藜科、苋科的空心莲子草和牛膝；稍敏感的(免疫)有4种，敏感的有58种，主要分布在菊科、旋花科、大戟科、石竹科、玄参科、千屈菜科等。从形态角度看，菌丝主要侵染茎基部及靠近土壤的植株茎和叶，植物匍匐生长于地表更容易被侵染，植株茎秆含纤维素较多不容易被侵染，禾本科植物由于茎秆竖立，纤维含量高，不容易被侵染。从分类角度看，菊科的多种杂草对该菌也很敏感，大戟科、石竹科、玄参科等的阔叶杂草对该菌敏感。

表1供试杂草对小菌核菌菌株SC64的敏感性

注a：致病等级评价：0-不致病；1-1～25％的组织坏死；2-26～50％的组织坏死；3-51～75％的组织坏死；4-76～99％的组织坏死；5-植株整体坏死，下同。

表2供试作物对小菌核菌菌株SC64的敏感性情况

根据以上测试结果，小菌核菌菌株SC64对禾本科供试植物安全，对草坪草安全，对菊科、大戟科、石竹科、玄参科等阔叶杂草以及异型莎草等杂草敏感性较高，在旱直播水稻田、麦田、玉米田和草坪等可以安全使用，并能同时用于控制上述阔叶杂草。这再次表明了小菌核菌菌株SC64具有开发为防除阔叶杂草生物除草剂的潜力。

本发明用生物除草，是利用活的生物本身，该生物是直接采集于农田自然环境，是目标作物田间及其环境中发生的目标杂草的天然致病菌，由于环境中已经存在，故没有在使用过程中的生态风险，加之，该菌株对禾本科作物、草坪草及其它非目标植物安全性高，不会导致对环境的残留危害。其菌体死亡后迅速腐化降解，其降解产物均为可循环有机物，不会因使用导致污染，此外，小菌核菌菌株除草菌颗粒采用农业废弃物棉籽壳(或麸皮、酒糟、醋糟、玉米秸秆粉碎基质、小麦秸粉碎基质、加拿大一枝黄花粉碎基质等固体培养基)为发酵基质，可以有效进行废物利用，把秸秆等作为有机肥回归农田。因而，对环境安全，可用于生产出绿色或有机农产品。

具体实施方式

实施例1：从自然发生于南京的加拿大一枝黄花病害植株上采集分离出小菌核菌，对它的致病性进行了试验。

从野外采集到患病加拿大一枝黄花的茎和根，记录植株发病症状，镜检。用加拿大一枝黄花汁琼脂培养基进行病原真菌的分离。挑取菌株的单菌核，分别接种在PDA培养基上，于黑暗，28±1℃下培养，观察病原真菌纯培养的菌落特征并测量各菌落直径。

在温室条件下对比了不同小菌核菌对阔叶杂草的致病力。Sc085分离自秋海棠，Sc087分离自花生。测试的杂草包括小飞蓬(Conyza canadensis(L.)Cronq.)、续断菊(Sonchus asper(L.)Hill)、大巢菜(Vicia sativa L.)、波斯婆婆纳(Veronicapersica Poir.)和马唐(Ditaria sanguinalis(L.)Scop.)测试过程保持土壤湿润，温度在28±1℃，试验结果如3所示。

表3菌株SC64与其他小菌核菌分离系对不同杂草致病力的比较

实施例2：将棉籽壳固体基质按照1∶0.6加水混匀后，常规灭菌，冷却后接生长旺盛的PDA边缘的SC64菌种，每天翻转培养基，待菌丝长满后将发酵菌颗粒于通风橱晾干得到除草菌颗粒并及时用于试验，使用灭菌的棉籽壳基质作对照。室内测试了小菌核菌菌株SC64对鳢肠(第4对真叶期)、山莴苣(4叶期)、马齿苋(第4～5对真叶期)、加拿大一枝黄花(6叶期)和陌上菜(初花期)等几种目标杂草的防除效果，试验时期温度在22～30℃。

表4小菌核菌菌株SC64对几种主要目标杂草的防除效果

注：小写字母为0.05显著水平，大写字母为0.01显著水平(下同)。

实施例3：按实施例2的方法，测试了小菌核菌菌株SC64不同固体发酵除草菌颗粒对鳢肠2～4对真叶年龄的致病力。

表5菌株SC64不同固体发酵除草菌颗粒对鳢肠的致病效果

实施例4：在直径为20cm花盆种植玉米及波斯婆婆纳、马齿苋阔叶杂草。待杂草长至第4～5对真叶期按实施例2的方法施用除草菌颗粒。各3个重复。

表6小菌核菌菌株SC64对玉米田杂草的防除效果

实施例5：按实施例2的方法，生产出除草菌颗粒，测试了小菌核菌菌株SC64防除水稻田杂草室外初步试验。

试验地水田杂草以陌上菜为主。试验统计时把陌上菜以外杂草节节菜和异型莎草，少量耳叶水苋、通泉草一同进行防效分析。

表7SC64除草菌颗粒防除水稻田杂草的株防效(药后5天)

表8SC64除草菌颗粒防除水稻田杂草的株防效和鲜重防效(药后10天)

实施例6：按实施例2的方法，生产出除草菌颗粒，测试了小菌核菌菌株SC64防除草坪杂草室外初步试验。

试验地草坪杂草以酢浆草为主。试验统计时把酢浆草以外杂草一同进行防效分析。

表8SC64除草菌颗粒防除草坪杂草的株防效(药后10天)

Claims

1.一种小菌核菌菌株，其特征在于：它是罗氏白绢小菌核菌（Sclerotium rolfsii Sacc.） CGMCC NO.2934。

2.权利要求1所述小菌核菌菌株用于生物除草的方法，为：将所述菌种接种于基质，固体发酵后通风晾干制得除草菌颗粒；撒施于田间或杂草发生地。

3.根据权利要求2所述小菌核菌菌株用于生物除草的方法，其特征在于，所说的基质是棉籽壳、酒糟、醋糟、鸡粪、猪粪、中药药渣、麸皮、加拿大一枝黄花、紫茎泽兰、玉米或小麦秸秆粉碎基质。

4.根据权利要求2所述小菌核菌菌株用于生物除草的方法，其特征在于，用于禾本科作物或草坪上，控制阔叶杂草，所说的阔叶杂草是荠菜、碎米荠、反枝苋、异型莎草、粘毛蓼，以及菊科、旋花科、唇形科、玄参科、桑科、石竹科、锦葵科、鸭跖草科、大戟科、报春花科、豆科、马齿苋科、茄科、车前科、酢浆草科、毛茛科、千屈菜科的阔叶杂草。

5.根据权利要求2所述小菌核菌菌株用于生物除草的方法，其特征在于，用于控制紫茎泽兰、加拿大一枝黄花、小飞蓬、苏门白酒草、黄顶菊、薇甘菊、一年蓬、飞机草。

6.根据权利要求2所述小菌核菌菌株用于生物除草的方法，其特征在于，小菌核菌菌株除草菌颗粒使用剂量为30至150g·m^-2。