CN101702919B - 植物通过表达非哺乳动物糖基转移酶而表现出哺乳动物类型的糖基化作用 - Google Patents
植物通过表达非哺乳动物糖基转移酶而表现出哺乳动物类型的糖基化作用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及能以其野生型或修饰形式使用的非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶。本发明进一步涉及表达非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的转化的植物和植物细胞，和产生糖基化作用改变的并优选是哺乳动物类型的糖基化作用的糖蛋白的方法。本发明另外还提供非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的核酸分子和表达载体。
Description
技术领域
本发明涉及在转基因植物中加工糖蛋白的领域，尤其涉及在用于生产重组生物药剂学蛋白的植物中加工糖蛋白的领域。
背景技术
重组蛋白生产构成了转基因植物的重要应用。除了重组蛋白的生产领域成本和产量是有利的，转基因植物比其他生产系统，如细菌，酵母，和动物细胞具有一定的优势。事实上，它们对人无传染性，并能在存储组织，如种子或块茎中积累目的蛋白质。这有利于在环境温度下将其处理，运输和储存，而同时提供了随后提取的可能性。此外，转基因植物，或其某些部分，可以用来作为药物或疫苗的载体。
虽然植物的蛋白类物质工厂的优势主要是从生物制药的角度解释的，但植物也可用于生产其他蛋白质，例如，工业酶制剂等，因为它们的糖基化的能力，导致例如更高的稳定性。目前，研究了利用植物生产用于治疗和其他用途的异源蛋白，这些植物有大豆，烟草，马铃薯，水稻和油菜，以及其中生产的糖蛋白包括单克隆抗体，激素，疫苗的抗原，酶和血液蛋白。这些蛋白质有一些已经证明了它们在人体有效。
在植物生产糖蛋白的缺点涉及到植物生产的糖蛋白的糖基化模式。像其他异源表达系统一样，与哺乳动物相比，植物表现出不同的糖基化特征。与细菌(无N-连接的聚糖)和酵母(仅有高甘露糖型N-连接的聚糖)相比，植物能够生产具有复杂类型的N相连的聚糖的蛋白质。然而，植物糖蛋白具有复杂的N-连接的聚糖，后者含有在哺乳动物未发现的β1，2-木糖和α1，3-岩藻糖残基。此外，植物糖蛋白缺乏在哺乳动物中发现的特征性的含半乳糖的复杂的N-聚糖。
总之，植物的糖蛋白分析显示，尽管存在着相似之处，植物和哺乳动物的糖基化途径在几个步骤是不同的，特别是在复杂的聚糖合成中。植物的复杂聚糖通常要小得多，并且包含β-1，2木糖或α-1，3岩藻糖残基，连接至Man3(GlcNAc)2核心上。已知糖蛋白上这些残基是免疫源性残基，其导致带有这些糖类的重组蛋白在某些应用中存在一些问题。
发明内容
尽管已经提出了或正在使用一些以植物为基础的生产糖蛋白的系统，但是需要改进了的以植物为基础的系统用于人源化蛋白的生产。在某些具体实施方式中，本发明提供了这种改进了的以植物为基础的系统。
以前提出的以植物为基础的系统，例如，WO01/31045(全部内容纳入本文)所述，利用哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶用于人源化蛋白的生产。
现在已经发现，某些以前没有鉴定的糖基转移酶，如那些来自非哺乳动物，鸡和斑马鱼的糖基转移酶，显示出与已经鉴定的哺乳动物的β1，4-半乳糖转移酶的某些部分同源，这表明在人源化蛋白的生产方面相对于以前的方法有意料不到的改进。
根据本发明的一个方面，本发明提供的生产能将半乳糖残基以β-1，4-键加入到N-连接的聚糖中的转基因植物或转基因植物细胞的方法。这些方法包括将编码非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的核酸分子插入植物或植物细胞中，并选择摄入编码非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的核酸分子和表达这种核酸分子的转基因植物或转基因植物细胞，从而产生出能将β-1，4键上的半乳糖残基加入N-连接的聚糖中的转基因植物或转基因植物细胞。在某些具体实施方式中，非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶包含鸡或斑马鱼的β-1，4-半乳糖转移酶1。在某些具体实施方式中，鸡β-1，4-半乳糖转移酶1包含SEQ ID NO：2，而斑马鱼的β-1，4-半乳糖转移酶1包含SEQ IDNO：14。在某些具体实施方式中，鸡或斑马鱼的非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶可增加能指导非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶在高尔基体内定位的氨基酸序列。在某些具体实施方式中，非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶可在N-末端增加对应于哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶1的N-末端氨基酸序列的氨基酸序列。在某些具体实施方式中，N-末端氨基酸序列在前10个N-末端氨基酸中至少包含序列[K/R]-X-[K/R]，其中[K/R]代表赖氨酸或精氨酸残基，并且X能是任何氨基酸。在某些具体实施方式中，N-末端氨基酸序列是MRLREPLLSGSAA(SEQ ID NO：21)。在某些具体实施方式中，非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的胞浆-跨膜-茎区(CTS)被另一种定位在高尔基体的蛋白的CTS替代。在某些具体实施方式中，CTS来源于哺乳动物或植物的定位在高尔基体的蛋白。在某些具体实施方式中，CTS来源于哺乳动物唾液酸转移酶。在某些具体实施方式中，CTS来源于大鼠α2，6-唾液酸转移酶。
根据本发明的另一方面，本发明提供生产包含一种或多种半乳糖基化N-连接聚糖的异源性糖蛋白的方法，所述方法包含将编码非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的核酸分子和编码异源性糖蛋白的核酸分子插入植物或植物细胞中，从而产生转基因植物或转基因植物细胞，并且在适于该核酸分子表达的条件下维持转基因植物或转基因植物细胞，藉此产生包含一种或多种半乳糖基化的N-连接的聚糖的异源性糖蛋白。
在某些具体实施方式中，非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶是鸡β-1，4-半乳糖转移酶或斑马鱼β-1，4-半乳糖转移酶。在某些具体实施方式中，鸡β-1，4-半乳糖转移酶或斑马鱼β-1，4-半乳糖转移酶可在N-末端增加对应于哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶1的N-末端氨基酸序列。在某些具体实施方式中，鸡β-1，4-半乳糖转移酶或斑马鱼β-1，4-半乳糖转移酶的CTS被另一种定位于高尔基体的蛋白的CTS取代。
在某些具体实施方式中，方法进一步包含将异源性糖蛋白从转基因植物或转基因植物细胞中至少部分地分离出来。在某些具体实施方式中，糖蛋白在一个或多个N-聚糖上包含一个或多个半乳糖残基。在某些具体实施方式中，糖蛋白的N-聚糖基本上不含木糖或岩藻糖残基或这两个残基都不含。在某些具体实施方式中，编码异源性糖蛋白的核酸分子编码激素；细胞因子、疫苗；粘附分子或抗体或其功能片段。
在某些具体实施方式中，植物或植物细胞此外还包含编码至少一种在植物或植物细胞中表达的选择标记的核酸分子。在某些具体实施方式中，植物或植物细胞是或来源于烟草属的物种(Nicotiana ssp.)。在某些具体实施方式中，核酸分子经显微注射法，PEG转化法、土壤杆菌属介导的转化法，电穿孔法，基因枪法、直接基因转移法、脂质体融合、植物活体转化法(in planta transformation)、磷酸钙沉淀法、农杆菌浸润法(agro-filtration)或病毒传染法插入。
根据本发明的另一方面，本发明提供生产能将半乳糖残基以β-1，4-键加入到N-连接的聚糖的转基因植物或转基因植物细胞的方法，其中编码非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的核酸与鸡β1，4-半乳糖转移酶的核酸序列(SEQ ID NO：1)或斑马鱼的β1，4-半乳糖转移酶的核酸序列(SEQ ID NO：13)至少具有85％的同一性。在另一具体实施方式中，该核酸与鸡β1，4-半乳糖转移酶的核酸序列(SEQ ID NO：1)或斑马鱼的β1，4-半乳糖转移酶的核酸序列(SEQ ID NO：13)至少具有90％，95％或98％的同一性。
根据本发明的另一方面，本发明提供生产能将半乳糖残基以β-1，4-键加入到N-连接的聚糖的转基因植物或转基因植物细胞的方法，其中非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的酶活性结构域的氨基酸序列与鸡β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)或斑马鱼的β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)至少具有85％的同一性。在另一具体实施方式中，非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的酶活性结构域的氨基酸序列与鸡β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)或斑马鱼的β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)至少具有90％，95％或98％的同一性。在某些具体实施方式中，非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列此外还包含哺乳动物延长序列。在某些具体实施方式中，哺乳动物延长序列是MRLREPLLSGSAA(SEQ ID NO：21)。在某些具体实施方式中，非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的CTS被来自另一定位于高尔基体蛋白的CTS取代，并且其中非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的酶活性结构域的氨基酸序列与鸡β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)或斑马鱼的β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)有至少85％的同一性。在其他具体实施方式中，非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶酶活性结构域的氨基酸序列与鸡β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)或斑马鱼的β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ IDNO：14)有至少90％，95％或98％的同一性。在某些具体实施方式中，来自另一定位于高尔基体的蛋白的CTS是来自大鼠α2，6-唾液酸转移酶的CTS。
根据本发明的另一方面，本发明提供生产能将半乳糖残基以β-1，4-键加入到N-连接的聚糖的转基因植物或转基因植物细胞的方法，其中植物或植物细胞产生一种糖蛋白，其包含既无β1，2-木糖残基也无α1，3-岩藻糖残基的杂交类型的N-连接的聚糖。在某些具体实施方式中，产生的既无β1，2-木糖残基也无α1，3-岩藻糖残基的杂交类型的N-连接的聚糖的数量是表达野生型人β1，4-半乳糖转移酶的植物或植物细胞的产生的量的两倍。在另一具体实施方式中，产生的既无β1，2-木糖残基也无α1，3-岩藻糖残基的杂交类型的N-连接的聚糖的数量是表达野生型人β1，4-半乳糖转移酶的植物或植物细胞的产生的量的五倍，十倍或五十倍。在某些具体实施方式中，植物或植物细胞产生包含双触角的N-聚糖的糖蛋白，其中该N-聚糖包含至少一个半乳糖基化GlcNAc残基。在这些具体实施方式中，产生的包含至少一个半乳糖基化GlcNAc残基的双触角的N-聚糖的数量是表达野生型人β1，4-半乳糖转移酶的植物或植物细胞的产生的量的两倍，五倍，十倍或五十倍。
根据本发明的另一方面，本发明提供根据本文所述的方法产生的糖蛋白。
根据本发明的另一方面，本发明提供根据本文所述的方法产生的植物或这种植物的部分。在某些具体实施方式中，植物是选自种子、胚胎、愈伤组织、叶、根、芽、花粉或小孢子的植物部分。
根据本发明的另一方面，本发明提供根据本文所述的方法产生的植物细胞。在某些具体实施方式中，植物细胞悬浮培养方式生长。在某些具体实施方式中，悬浮培养的植物细胞选自烟草BY2、胡萝卜或拟南芥细胞悬液。在某些具体实施方式中，植物细胞是选自苔藓植物(Bryophytaea)、小立碗藓(Physcomitrellapatens)、葫芦藓(Funaria hygrometrica)或角齿藓(Ceratodon purpureus)的苔藓的部分。
根据本发明的另一方面，本发明提供编码多肽的核酸，所述的多肽含有鸡β1，4-半乳糖转移酶1(SEQ ID NO：2)或斑马鱼的β1，4-半乳糖转移酶1(SEQ ID NO：14)及其N-末端延长的氨基酸序列，其中延长的氨基酸序列是对应于哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶1的N-末端氨基酸序列的氨基酸序列，其中N-末端氨基酸序列在前10个N-末端氨基酸中至少包含序列[K/R]-X-[K/R]，其中[K/R]代表赖氨酸或精氨酸残基，并且X能是任何氨基酸。在某些具体实施方式中，氨基酸序列是MRLREPLLSGSAA(SEQ ID NO：21)。在某些具体实施方式中，氨基酸序列包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：15。在某些具体实施方式中，编码包含鸡β-1，4-半乳糖转移酶1(SEQ ID NO：2)或斑马鱼β-1，4-半乳糖转移酶1(SEQ ID NO：14)的多肽的核酸，其中鸡β-1，4-半乳糖转移酶或斑马鱼β-1，4-半乳糖转移酶的CTS被另一定位于高尔基体的蛋白的CTS取代。在某些具体实施方式中，CTS来源于哺乳动物或植物的定位于高尔基体的蛋白。在某些具体实施方式中，CTS来源于哺乳动物的唾液酸转移酶。在某些具体实施方式中，CTS来源于大鼠α2，6-唾液酸转移酶。在某些具体实施方式中，氨基酸序列包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：18。
根据本发明的另一方面，本发明提供编码多肽的核酸，所述的多肽包含非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列，其中非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的酶活性结构域的氨基酸序列与鸡β-1，4-半乳糖转移酶1(SEQ ID NO：2)或斑马鱼β-1，4-半乳糖转移酶1(SEQ ID NO：14)的酶活性结构域的氨基酸序列同一性至少是90％，以及其N末端延长序列，其中该延长序列的氨基酸序列对应于哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶1的N-末端氨基酸序列，其中N-末端氨基酸序列在其前10个N-末端氨基酸上至少包含序列[K/R]-X-[K/R]，其中[K/R]代表赖氨酸或精氨酸残基，并且X能是任何氨基酸。在另一具体实施方式中，该序列的同一性至少是95％或98％。
根据本发明的另一方面，本发明提供包含本文所述的核酸分子的表达载体。在某些具体实施方式中，核酸分子连接至对于核酸分子在真核或原核细胞内转录是足够的调节元件上。
根据本发明的另一方面，本发明提供宿主细胞，所述宿主细胞包含本文所述的连接至对于在植物细胞中转录是足够的异源性调节元件上的核酸分子或包含本文所述的载体。
附图说明
图1描述各种哺乳动物(人，小鼠，牛)和非哺乳动物(鸡，斑马鱼，蛙)起源的β1，4-半乳糖转移酶的序列比对(Clustal W)。“哺乳动物延长序列”是哺乳动物特异性的氨基末端区域，在非哺乳动物的β1，4-半乳糖转移酶的直系同源物上未发现该区(实线方框)。“TM”标记跨膜区(虚线方框)。
图2描述从表达鸡的基因的转基因植物中纯化的N-聚糖的Maldi-TOF分析结果。从顶端至底端，正常鸡的基因(鸡GalT)，13氨基酸N-末端人GalT-鸡GalT，和SialT-CTS-鸡GalT。
图3描述从表达斑马鱼GalT基因的转基因植物中纯化的N-聚糖的Maldi-TOF分析结果。从顶端至底端，正常斑马鱼的基因(斑马鱼GalT，2种植物)，13氨基酸N-末端人GalT-斑马鱼GalT，和SialT-CTS-斑马鱼GalT。
图4描述汇总了来自人，斑马鱼和鸡GalT的结果的柱形图，关于双触角的“野生型”植物N-聚糖(GlcNAc2-Man3-Xyl-Fuc-GlcNAc2-Asn)，带有一个半乳糖(并不含木糖和岩藻糖)杂交类型的N-聚糖，和带有两个半乳糖的双触角N-聚糖(从顶端至底端)。
图5描述Dgal(SEQ Dgal，SEQ ID NO：14)与推定的斑马鱼β1，4-GalT1(发表于文献：Machingo et al.，Dev Biol 297，471-82，2006；NM_001017730)之间的氨基酸序列比较。
具体实施方式
高尔基体是复杂的聚糖构型发生的场所的细胞器和糖基化机械装置的位点。糖基化的关键介质是糖基转移酶。最佳的研究高尔基体相关的糖基转移酶之一是β1，4-半乳糖转移酶1(GalT)。β1，4-半乳糖转移酶1由细胞浆中的尾部，跨膜结构域(TMD)和催化结构域构成。已经克隆多种哺乳动物糖基转移酶基因。转化植物系统的便宜性使得研究者能够将来自哺乳动物的糖基转移酶“补充”到植物的高尔基体中以将其产生的聚糖或糖蛋白进行“人源化”或“哺乳动物源化”。
迄今为止，尚未报道非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶(GalT)用于在植物中生产哺乳动物源化或人源化的糖蛋白的用途。
已经发现，某些以前未鉴定的非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶，如来自鸡和斑马鱼的β1，4-半乳糖转移酶，能用于在植物中进行N-连接的糖蛋白的末端半乳糖基化作用，并且这些非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶相对于以前的生产人源化蛋白的方法显示出出乎意料的改进。例如，鸡β1，4-半乳糖转移酶产生大多数不含β1，2-木糖和α1，3-岩藻糖残基的杂交型N-连接的聚糖。
进一步发现，来自鸡和斑马鱼的非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶比哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶短，并不含在哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶中含有的氨基末端区。这些非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶能在其氨基末端延长一段与哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶的氨基末端相对应的氨基酸序列，“哺乳动物延长序列”。这些修饰版本的非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶产生某些N-连接聚糖达到比人β1，4-半乳糖转移酶高的程度。例如，其氨基酸末端被大鼠的唾液酸转移酶的CTS区替换的斑马鱼GalT主要产生双触角，双半乳糖基化的N-聚糖。
在某些具体实施方式中，本发明提供用于在植物中产生哺乳动物化的糖蛋白的未修饰的或修饰的来自鸡或鱼的非哺乳动物GalT。某些具体实施方式还提供了在表达这种非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶的植物或植物细胞中产生的哺乳动物化的糖蛋白。
“定义”
本文所使用的术语“核酸”是指脱氧核糖核酸或核糖核酸多聚体，即单链或双链形式的多聚核苷酸，和除非另外限制，包含已知的类似物，在其与单链核酸以与天然存在的核酸(例如肽核酸)相似的方式杂交方面具有天然核苷酸的主要性质。多聚核苷酸能是天然的或异源的结构性或调节性基因的全长或子序列。除非另外限制，该术语是指特定序列以及与其互补的序列。因此，为了使其稳定或其它原因修饰其骨架的DNA或RNA是该术语所指的“多聚核苷酸”。此外，包含罕见的碱基(如肌苷)或修饰碱基(如三苯甲基化的碱基)(仅是两个例子)的DNA或RNA是该术语所指的“多聚核苷酸”。应理解，已经对DNA和RNA进行很多种修饰，这些修饰服务于对本领域技术人员已知的许多有用的目的。正如在本文所用的术语“多聚核苷酸”包含这种化学的，酶的或代谢修饰的多聚核苷酸的形式，以及具有病毒或细胞(包括其它物种中的简单和复杂细胞的)的特征的DNA和RNA的化学形式。
本文所用的“为……编码的核酸分子”或“编码……的核酸分子”并不限于个体或各个分子，例如作为各个实体的核酸分子，其中每个实体包含一种核酸分子，还包括一种或多种核酸分子可连接至一种连续的序列中，可被任何插入序列分开。在一种连续序列中的核酸分子的顺序和方向不限于任何特定构型，例如该核酸分子可连接至同一启动子或不同启动子上，可是单向或双向的，并可是直接相连或被插入序列分隔。本领域已知各种这种构型。此外，核酸分子可合并在一条连续的序列中，或可以各个实体提供。例如，在某些具体实施方式中，本发明提供包含核酸分子的植物或植物细胞，所述核酸分子包含非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶，异源性糖蛋白和一种或多种选择标记。这些核酸分子可以本文所述的一种，两种，三种，或多种载体的形式提供。
术语“多肽”，“肽”和“蛋白”本文可互换使用，是指氨基酸残基的多聚体。这些术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸多聚体人工化学类似物的氨基酸多聚体。这些天然存在的氨基酸多聚体的类似物的主要特性是，当掺入蛋白中时，该蛋白是特定响应于同一蛋白诱导产生的抗体，但是其完全由天然存在的氨基酸构成。术语“多肽”，“肽”和“蛋白”还包括修饰形式的“多肽”，“肽”和“蛋白”，其包括但不限于糖基化、连接脂质、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP核糖基化。
“编码”或“为……编码”的序列是部分编码蛋白的氨基酸序列的基因或编码功能性RNA(如tRNA或rRNA)的基因和特定指核酸序列包含翻译成特定蛋白的信息这一事实。编码蛋白的核酸可在核酸的翻译区内包含非翻译序列(例如内含子)，或可不含这种插入性非翻译序列(例如在cDNA内)。蛋白编码的信息通过使用密码子限定。通常，使用“通用”遗传密码子的核酸编码氨基酸序列。然而，通用密码子的变体，如在某些植物、动物和真菌线粒体，细菌山羊支原体(Mycoplasmacapricolum)或纤毛虫大核(the ciliate Macronucleus)中出现的变体可用于当核酸在其中表达时。当用合成方法制备或改变核酸时，采用在欲将核酸在其中表达的目的宿主中存在的已知密码子能是有优势的。例如，虽然本发明的核酸序列既可在单子叶植物物种中表达也可在双子叶植物物种中表达，但是序列能被修饰以产生特定密码子参数，并且单子叶植物或双子叶植物中的GC含量的参数如这些参数已经显示有区别。
“表达”是指基因转录成结构性RNA(rRNA，tRNA)或随后翻译成蛋白的信使RNA(mRNA)。
涉及蛋白或核酸的术语“非哺乳动物的”是指来源于非哺乳动物，包括例如非哺乳脊椎动物，如鸟类(例如鸡或鸭)或鱼，和非哺乳无脊椎动物的这种化合物。非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶(和编码序列)的非常合适的来源是鸡和鱼。
涉及蛋白或核酸的术语“哺乳动物的”是指来源于哺乳动物，例如人，非人的灵长类动物，小鼠，猪，牛，山羊，猫，家兔，大鼠，豚鼠，仓鼠，马，猴，绵羊，小袋鼠，鸭嘴兽或其他非人类的哺乳动物的这种化合物。
术语“β-1，4-半乳糖转移酶”是指糖基转移酶EC 2.4.1.38(β-1，4-GalT1)，其对于自2型链(Galβ1→4GlcNAc)的骨架结构的生物合成是必需的，2型链(Galβ1→4GlcNAc)的骨架结构似乎广泛出现在N-连接聚糖上，即该酶对于固有活性(i.a)的N-连接聚糖具有半乳糖基化活性。该2型链在合成分别在免疫系统和早期胚胎发生中发挥作用的唾液酸化的路易斯抗原(sialyl lewis x)和SSEA-1中尤其重要。本发明提供哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶(例如来自人，小鼠，大鼠)以及来自非哺乳动物物种如鸡和鱼的β-1，4-半乳糖转移酶的直系同源物。
本文所使用的术语“序列同一性”表示在两条或多条多聚核苷酸之间或在两条或多条多肽之间存在同一性。当与另一条多聚核苷酸或多肽进行最大相关性的比对时，如果一条多聚核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列是相同的，那么多聚核苷酸或多肽具有“同一性”序列。两条或多条多聚核苷酸或多肽之间的序列比较通常通过在比较窗口比较两条序列的部分进行，以鉴定和比较序列的局部区域的相似性。比较窗口通常是自大约20至200的连续核苷酸或是自大约7至70的连续氨基酸。对于多聚核苷酸或多肽的“序列同一性百分数”，如50，60，70，80，90，95，98，99或100百分数的序列同一性可通过将两条最佳比对系列经比较窗口进行比较而确定，其中在比较窗口中的多聚核苷酸或多肽序列部分可包括当与参考序列比较时的添加或缺失(即缝隙)，而用于两条序列的最佳比对的参考序列不包括添加或缺失。通过下列计算该百分数：(a)确定相同的核酸碱基或氨基酸残基在两条序列中都出现的位置的数目已产生出匹配位置数目；(b)将匹配位置数被比较窗口中的位置的总数除；且(c)结果乘以100以产生同源性序列百分数。进行比较的最佳比对可通过已知算法的计算机化的工具或通过检查进行。在比对进行比较的序列和计算序列同源性或同一性中适合使用的算法和软件对于本领域技术人员是已知的。这种工具的显著的例子是基于皮尔森和利波曼查找的FASTA和BLAST程序，这些程序详见文献(Altschul et al(1997)，Nucleic Acid Res.25：3389-3402；Altschul etal(1990)，J.Mol.Biol.215：403-10；Pearson and Lipman(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-8；Lipman and Pearson(1985)，Science 227：1435-41))。其它合适的程序包括PILEUP，LINEUP，GAP，BESTFIT和FASTA程序(威斯康辛软件包中)(the University of Wisconsin Genetics Computer Group，Madison，WI，USA)现在由Accelrys Inc.提供。在互联网上通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST或镜像站点和http://www.accelrys.com/products/gcg wisconsin package.可得到上述程序的细节。因此，这种同源性或同一性能使用公共或商业上可得到的软件包或通过互联网上的计算机服务器来确定。术语“同一性”是指，虽然事实是该系列可在需要将缝隙导入的位置含有缺失或添加以获得最高的氨基酸或碱基百分数，然而当序列进行最佳比对时，在参考序列的同一相对位置上发现的所主张的氨基酸序列或核酸系列的起始百分数。优选地，通过使用10或更少的缝隙进行比对，即导入两个序列中的缝隙的总数当加在一起时是10或更少。这种缝隙的长度不是特别重要，但是通常不超过10个氨基酸(优选不超过5个氨基酸)或30个碱基(优选不超过15个碱基)。
术语“遗传密码子的简并性”是指大量功能相同的核酸编码任何特定蛋白这一事实。例如，密码子GCA，GCC，GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每一个以密码子说明丙氨酸的位置，该密码子能变成描述的相应的密码子而未改变所编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”。通过引用遗传密码子，在此处的编码多肽的每一核酸序列也描述该核酸的每一可能的沉默变异。
在“互补链”中的术语“互补的”是指核酸链有一段核酸序列，该与核酸序列与另一核苷酸序列根据Watson-Crick碱基互补配对原则通过形成氢键而形成双链。例如，5′-AAGGCT-3′的互补碱基序列是3′-TTCCGA-5′。
术语“半乳糖基化N-连接的聚糖”是指糖蛋白中的N-连接寡糖单位的通用核心，所述的糖蛋白由壳二糖核心和至少3个甘露糖和至少1个N-乙酰葡糖胺残基组成，并进一步在其非还原末端上延伸出至少一个N-乙酰葡糖胺上的半乳糖残基。
术语“抗体”包括对抗体(例如Fab，F(ab)2)的抗原结合形式的引用。术语“抗体”经常是指实质上由免疫球蛋白基因或特异性结合并识别被分析物(抗原)免疫球蛋白或其片段编码的多肽。然而，当各种抗体片段能被一种完整抗体的消化的术语来限定时，本领域技术人员应理解这种片段可化学性地或通过使用重组DNA技术进行重新合成。因此，术语抗体，如在本文所用，也包括抗体片段，如单链Fv，嵌合抗体(即包含不同物种的恒定区和可变区)，人源化抗体(即包含非人来源的互补性决定区(CDR))和异源偶联(heteroconjugate)抗体(例如双特异性抗体)。
术语“抗体重链或轻链”使用其本领域公认的含义。
术语“功能片段”是指蛋白的截短了的版本，其是该蛋白的功能性变体或功能性衍生物。蛋白的“功能性变体”或“功能性衍生物”是蛋白的氨基酸序列，其来源于通过将原始蛋白的氨基酸序列进行取代，缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基而得到的蛋白的氨基酸序列，以这种方式，尽管氨基酸序列发生了变化，但是功能性变体保留了原始蛋白的至少一种生物活性的至少部分活性，该活性对于本领域技术人员来说是可检测的。功能性变体通常与其能衍生它的蛋白之间的同源性是至少50％同源(优选氨基酸序列至少50％相同)，至少70％同源或至少90％同源。功能性变体也可是蛋白的任何功能部分。在某些具体实施方式中，该功能是半乳糖转移酶活性。在某些具体实施方式中，区别于SEQ ID NO：2(鸡半乳糖转移酶的蛋白序列)或SEQ ID NO：14(斑马鱼半乳糖转移酶的蛋白序列)的氨基酸序列主要或仅通过保守性取代产生。在某些具体实施方式中，该蛋白包含与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：14具有65％或更高，75％或更高，85％或更高，90％或更高或95％或更高的序列同一性的氨基酸序列，且在某些具体实施方式中，与这些序列具有100％同一性。本文所用的“功能性的”还包括植物中的功能性。
所使用的术语“保守性取代”当用于氨基酸时涉及特定氨基酸被具有相似的生物化学特征的氨基酸取代。因此，在某些具体实施方式中，序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：14中的氨基酸具有疏水基团时，保守性取代是其被另一也具有疏水基团的氨基酸取代；其它这种生物化学相似性的氨基酸是那些其特征性基团是疏水、阳离子或阴离子的氨基酸或含有硫醇或硫醚的氨基酸。本领域技术人员已熟知这种取代(即见于美国专利No.5,380,712)。保守性氨基酸取代可在，例如在脂肪族非极性氨基酸组内(Gly，Ala，Pro，Ile，Leu，Val)，极性不带电氨基酸组内(Cys，Ser，Thr，Met，Asn，Gln)，极性不带电氨基酸组内(Asp，Glu，Lys，Arg)或芳香族氨基酸组内(His，Phe，Tyr，Trp)进行。
术语“选择标记”是指编码用于分离转基因和非转基因组织的代谢特征的多聚核苷酸序列，并可指提供抗生素抗性。选择标记例如是编码卡那霉素抗性标记的aphL1，nptII基因，编码潮霉素抗性的基因。其它抗性标记为本领域所熟知。其它选择标记是，例如报告基因，如氯霉素乙酰基转移酶，β-半乳糖苷酶，荧光素酶和绿色荧光蛋白。报告基因产物的鉴定方法包括但不限于酶学检测或荧光检测。报告基因和测定器产物的检测被本领域所熟知并见于(例如Current Protocols inMolecular Biology，eds.Ausubel et al.，Greene Publishing and Wiley-Interscience：NewYork(1987)及其定期更新资料)所述。
如本文所用，术语“载体”包括引用在转染宿主细胞中使用的核酸和能被插入多聚核苷酸的核酸。载体经常复制。表达载体可使插入其中的核酸转录。
如本文所用，术语“可通过操作连接”是指功能性连接或排列，其中所描述成分之间的关系使得它们以其预期的方式发挥功能。“可通过操作连接”至另一对照序列中和/或连接至编码序列中的对照序列以该编码序列在适合于对照序列的条件下达到转录或表达的这样的方式被连接起来。通常，可通过操作连接意味着被连接的核酸序列是连续的，当有必要连接两个蛋白编码区之间时是连续的并且位于同一读码框内。
术语“宿主细胞”是指含有载体并支持载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可是原核细胞如E.coli，或真核细胞如植物，酵母，昆虫，两栖动物或哺乳动物细胞。
如本文所使用“异源性”当引用核酸时是指来源于异源物种的核酸，或者如果是来自同一物种，是指其原始形式在成分和/或基因座通过插入修饰的核酸。例如，可通过操作连接至异源性结构基因上启动子是来源于与结构基因所来源的物种不同的物种，或者，如果来源于同一物种，其中一个或两个经自它们的原始来源形式修饰。异源蛋白可来源于外来物种或如果来源于同一物种，通过插入将其自欺原始形式进行修饰。
本文限定的术语“调节序列”或“控制序列”包括任何对于编码序列的表达是必要的或有利的成分。调节序列可是编码序列本身或外来的。这种调节序列包括但不限于引导序列(leader)，多腺苷酸化序列，前肽序列，启动子，信号序列和转录终止子。这种序列为本领域所熟知。最少，调节序列包括启动子或某些启动子元件和转录和翻译终止信号。调节序列可与为了将特定限制性位点导入的连接子一起提供，以简化调节序列与编码多肽的核酸序列的编码区的连接。
本文所使用的术语“启动子”是其本领域公认的含义，是指含有DNA序列的基因的一部分，该部分供RNA聚合酶结合和转录起始之用。通常但不总是发现启动子序列位于基因的5′非编码区。“植物启动子”是能在植物细胞中起始转录的启动子而不管其是否来源于植物细胞。示例性的植物启动子包括但不限于那些自植物，植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌(土壤杆菌属或根瘤菌属)中获得的启动子。合适的启动子的例子是花椰菜花叶病毒的35S启动子及其衍生物，铁氧化还原蛋白启动子，胆脂碱合酶(nos)，甘露碱合成酶(mas)和章鱼肉碱合酶(ocs)启动子(EP 0122791，EP 0126546，EP 0145338)，泛素启动子(EP 0342926)，木薯脉花叶病毒启动子和二磷酸核酮糖氧合酶/羧化酶(Rubisco)的短的亚基额菊花启动子。
术语“转基因植物或植物细胞”包括对基因组内包含异源多聚核苷酸的植物或植物细胞的引用。通常，异源多聚核苷酸稳定整合进基因组中，以至于多聚核苷酸能传递至下一代。异源多聚核苷酸可单独或作为部分重组表达盒整合进入基因组中。而且，有可能是异源多聚核苷酸不整合或不稳定整合进入被转化植物的基因组中。在这种情况下，该基因能瞬时表达，意味着表达一段特定时间，之后被导入的多聚核苷酸从细胞中丢失。为了本发明的目的，转基因植物或植物细胞还包括瞬时表达异源多肽的植物或植物细胞。本文所用的“转基因”包括任何基因型因存在异源核酸而改变的细胞，细胞系，愈伤组织，组织，植物部分或植物，包括那些起始就已改变的转基因以及起始转基因通过两性杂交或无性繁殖创造出来的转基因。本文所使用的术语“转基因”不包含(染色体基因组或染色体外基因组)通过常规植物育种方法或通过天然存在的事件如随机异体受精，非重组病毒感染，非重组细菌转化，非重组转座或自发性突变而使基因组发生的改变。
在将核酸导入细胞中的上下文中的术语“插入”意味着“转染”或“转化”或“转导”并包括引用使核酸掺入真核或原核细胞中，核酸在这些真核或原核细胞中可掺入细胞的基因组(例如染色体，质粒，质体或线粒体DNA)中，转化为自主复制或瞬时表达(例如转染的mRNA)。
如本文所使用，术语“植物”包括(引用)整个植物，植物器官(例如叶，茎，根等)，种子和植物细胞以及上述的子代。植物细胞，如本文所使用，包括但不限于种子，胚胎，分生组织区，愈伤组织，叶，根，芽，配子体，孢子体，花粉和小孢子。在某些具体实施方式中，植物细胞以悬浮培养方式生长。在某些具体实施方式中，植物细胞能够再生出整个植物。能在本发明所述的方法中使用的植物的类型通常很广泛，以至于能接受转化技术的高等植物都能使用，包括单子叶植物和双子叶植物。本文中所使用，当指植物时，除非另有说明，是指从藻类到树的范围的整个植物谱。优选的植物是烟草属的物种(Nicotiana ssp.)，优选普通烟草(N.tabacum)或本塞姆氏烟草(N.benthamiana)。
术语“特异性识别”包括引用抗体和具有被抗体的抗原结合位点识别的表位的蛋白之间的结合反应。这种结合反应由具有被识别的表位的蛋白决定，所述的表位是蛋白或其它生物分子的异质性群体之中存在的表位之一。因此，在特定的免疫检测条件下，特定的抗体与具有被识别的表位的被检测物的结合，实质上比与缺乏样本中存在的表位的所有被检测物的结合实质上达到更大的程度(例如至少是背景的2倍)。在这种条件下与抗体的特异性结合可需要选择对特定蛋白是特异性的抗体，例如，能选择抗本文所述的多肽(例如SEQ ID NOS.2，4，7，9，11，14，16，18和20)的抗体以获得特异性识别这些多肽的抗体。用作免疫原的蛋白或多肽能是天然形式或将其变性以产生线性表位。可使用各种免疫检测方法来选择特异性识别特定蛋白(或其它被检测物)的抗体。例如，常规使用固相ELISA免疫检测来选择与蛋白发生特异性免疫反应的单克隆抗体。文献描述了能用于确定选择性反应性的免疫检测方法和条件(见于Harlow and Lane，Antibodies，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Publications，New York(1988))。
核酸分子和细胞表达系统
尽管编码本发明所述的多肽的核酸分子能在任何细胞表达系统(如植物，酵母，细菌，非哺乳动物和哺乳动物细胞表达系统)中表达，该核酸分子优选在可悬浮生长的植物或植物细胞中表达。
在某些具体实施方式中，本发明提供包含能生物合成N-聚糖的功能蛋白的植物或植物细胞，其中该蛋白是非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶，例如是鸡或鱼起源。在其他具体实施方式中，所述的非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的N-末端延伸出N-末端延伸序列，该序列使其易于定位于高尔基体，以能够使该酶具有预期的功能。N-末端延伸序列通常构成包含高尔基体-定位信号序列和跨膜结构域的胞浆中的尾部。这种N-末端序列(命名为“CTS”)能来源于哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶，哺乳动物唾液酸转移酶或任何其它定位于高尔基体的蛋白，并与非哺乳动物GalT(例如鸡或鱼起源)的胞浆结构域融合，并在植物细胞或植物中表达。
糖基转移酶的N-末端胞浆区，跨膜区(本文“CTS区”)决定该酶在ER或高尔基体膜上定位。为了产生天然或所需的糖基化，糖基转移酶能在植物细胞中表达因其出现在哺乳细胞中，但是也能作为两种不同的糖基转移酶或两种不同的糖基转移酶的部分之间的融合蛋白表达。在这种情况下，定位由一种酶决定，催化活性由第二种决定。作为例子的是，大鼠唾液酸转移酶的胞浆区，跨膜区和茎区与哺乳动物半乳糖转移酶的催化结构域之间形成的融合蛋白，如例如在SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：17之间产生的融合蛋白，产生具有半乳糖转移酶活性和唾液酸转移酶的定位功能的酶。
哺乳动物GalT酶的有用的N-末端延伸序列经鉴定，其长约10-20氨基酸，并在其胞浆尾序列的前10个氨基末端的氨基酸上含有[K/R]-X-[K/R]基序(其中K/R意味着赖氨酸或精氨酸残基，并且X能是任何氨基酸)。
在某些具体实施方式中，N-末端氨基酸序列延伸序列包含人β-1，4-半乳糖转移酶多肽1序列前13个氨基酸残基，即MRLREPLLSGSAA(SEQ ID NO：21)(见图1)。在其他具体实施方式中，非哺乳动物GalT的CTS被置换为来自另一种定位于高尔基体的蛋白的CTS；置换能例如来源于大鼠α2，6-唾液酸转移酶的CTS(Genbank accession M18769)。
在某些具体实施方式中，植物细胞或植物表达功能性非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶，该酶与鸡β1，4-半乳糖转移酶核酸序列(SEQ ID NO：1)至少具有85％的同一性。在其他具体实施方式中，功能性非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶与鸡β1，4-半乳糖转移酶核酸序列(SEQ ID NO：1)的同一性是90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。
在某些具体实施方式中，本发明提供该酶的与鸡β1，4-半乳糖转移酶核酸序列(SEQ ID NO：1)的同一性是85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的核酸和载体。
在某些具体实施方式中，植物细胞或植物表达功能性非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶，该酶与鸡β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)至少具有65％的同一性。在其他具体实施方式中，功能性非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶与鸡β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的同一性是75％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。
在某些具体实施方式中，植物细胞或植物表达功能性非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶，该酶与鸡β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)具有至少65％的同一性，并包含带有哺乳动物延伸序列的N-末端。哺乳动物延伸序列可以包含，例如，人β-1，4-半乳糖转移酶多肽1序列的前13个氨基酸残基，即MRLREPLLSGSAA(SEQ ID NO：21)，或非哺乳动物GalT的CTS被置换为另一定位于高尔基体的蛋白的CTS；置换物能例如来源于大鼠α2，6-唾液酸转移酶的CTS(Genbank accession M18769)。在其它具体实施方式中，包含哺乳动物延伸序列的功能性非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶与鸡β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQID NO：2)的同一性是75％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。
在某些具体实施方式中，本发明提供核酸及其载体，所述核酸及其载体包含上述的哺乳动物延伸序列或改变的CTS区，它们仅在与鸡β1，4-半乳糖转移酶核酸序列相关的方面与鸡β1，4-半乳糖转移酶核酸序列(SEQ ID NO：1)的同一性是85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％；也就是说，序列同一性的确定不通过哺乳动物延伸序列或改变的CTS区。
在某些具体实施方式中，植物细胞或植物表达功能性非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶，该酶与斑马鱼β1，4-半乳糖转移酶的核酸序列(SEQ ID NO：13)的同一性是至少85％。在其它具体实施方式中，功能性非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶与斑马鱼β1，4-半乳糖转移酶的核酸序列(SEQ ID NO：13)的同一性是90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。
在某些具体实施方式中，本发明提供该酶的与斑马鱼β1，4-半乳糖转移酶的核酸序列(SEQ ID NO：13)的同一性是85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的核酸和载体。
在某些具体实施方式中，植物细胞或植物表达功能性非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶，该酶与斑马鱼β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)的同一性是至少65％。在其它具体实施方式中，功能性非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶与斑马鱼β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)的同一性是75％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％。
在某些具体实施方式中，植物细胞或植物表达非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶，该酶与斑马鱼β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)的同一性是至少65％并包含带有哺乳动物延伸序列的修饰N-末端。在其它具体实施方式中，包含哺乳动物延伸序列的功能性非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶与斑马鱼β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)的同一性是75％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。
在某些具体实施方式中，植物细胞或植物表达非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶，该酶与斑马鱼β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)的同一性是至少65％，其中斑马鱼β1，4-半乳糖转移酶的CTS被置换为另一定位于高尔基体的蛋白的CTS。在其它具体实施方式中，包含哺乳动物延伸序列的功能性非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶与斑马鱼β1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)的同一性是75％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。
在某些具体实施方式中，本发明提供核酸及其载体，所述核酸及其载体包含上述的哺乳动物延伸序列或改变的CTS区，它们仅在与斑马鱼β1，4-半乳糖转移酶的核酸序列相关的方面与斑马鱼β1，4-半乳糖转移酶的核酸序列(SEQ ID NO：13)的同一性是85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％；也就是说，序列同一性的确定不通过哺乳动物延伸序列或改变的CTS区。
在某些具体实施方式中，非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶是鸡或鱼的β-1，4-半乳糖转移酶，其N-末端延伸序列来自于人β-1，4-半乳糖转移酶基因或CTS来源于大鼠唾液酸转移酶。在某些具体实施方式中，鸡β-1，4-半乳糖转移酶的氨基酸序列是SEQ ID NO：2，鱼的β-1，4-半乳糖转移酶来源于斑马鱼(Danio rerio)，其氨基酸序列是SEQ ID NO：14。在某些具体实施方式中，该酶分别由SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：13核酸序列编码。
在某些具体实施方式中，本发明提供表达例如来自鸡或鱼的非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶的植物细胞或植物。在某些具体实施方式中，植物细胞或植物表达功能性野生型鸡β1，4-半乳糖转移酶(SEQ ID NO：2)。在某些具体实施方式中，上面提到的植物细胞或植物产生至少杂合类型N-连接的聚糖(即至少包含三甘露糖基化的壳二糖核心，一个另外的甘露糖和在N-连接的聚糖的α1，3-臂上的非还原末端的半乳糖基化GlcNAc残基)，不含β1，2-木糖和α1，3-岩藻糖残基。在某些具体实施方式中，不含β1，2-木糖和α1，3-岩藻糖残基的杂合类型N-连接的聚糖的总量较表达野生型人的β1，4-半乳糖转移酶的植物细胞或植物产生的量增加2倍。在某些具体实施方式中，所述的量增加3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，50，100，250，500，1000或10,000倍。
在其它具体实施方式中，植物细胞或植物表达包含N-末端的13个氨基酸的鸡β1，4-半乳糖转移酶(SEQ ID NO：9)。在某些具体实施方式中，上面提到的植物细胞或植物至少产生不含β1，2-木糖和α1，3-岩藻糖残基的杂合类型N-连接的聚糖。在某些具体实施方式中，不含β1，2-木糖和α1，3-岩藻糖残基的杂合类型N-连接的聚糖的总量较表达野生型人β1，4-半乳糖转移酶的植物细胞或植物产生的量增加2倍。在其它具体实施方式中，该量增加3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，50，100，250，500，1000或10,000倍。
在其它具体实施方式中，植物细胞或植物表达在N-末端包含唾液酸转移酶CTS延伸序列的鸡β1，4-半乳糖转移酶(SEQ ID NO：11)。在某些具体实施方式中，上面提到的植物细胞或植物至少产生不含β1，2-木糖和α1，3-岩藻糖残基的杂合类型N-连接的聚糖，以及包含至少一个半乳糖基化GlcNAc残基的双触角N-连接的聚糖(即除三甘露糖基化壳二糖核心外还在非还原末端带有至少一个半乳糖基化GlcNAc残基的N-连接的聚糖)。在某些具体实施方式中，不含β1，2-木糖和α1，3-岩藻糖残基的杂合类型N-连接的聚糖和/或包含至少一个半乳糖基化GlcNAc残基的双触角N-连接的聚糖的总量较表达野生型人β1，4-半乳糖转移酶的植物细胞或植物产生的量的增加2倍。在其它具体实施方式中，该量增加3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，50，100，250，500，1000或10,000倍。
在某些具体实施方式中，植物细胞或植物表达野生型斑马鱼β1，4-半乳糖转移酶(SEQ ID NO：14)。在某些具体实施方式中，上面提到的植物细胞或植物产生至少双触角N-连接的聚糖，以及包含至少一个半乳糖基化GlcNAc残基的双触角N-连接的聚糖。在某些具体实施方式中，双触角N-连接的聚糖或包含至少一个半乳糖基化GlcNAc残基的双触角N-连接的聚糖的总量较表达野生型人β1，4-半乳糖转移酶的植物细胞或植物产生的量的增加2倍。在其它具体实施方式中，该量增加3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，50，100，250，500，1000或10,000倍。
在其它具体实施方式中，植物细胞或植物表达N-末端包含13个氨基酸的斑马鱼β1，4-半乳糖转移酶(SEQ ID NO：16)。在某些具体实施方式中，上面提到的植物细胞或植物产生至少双触角N-连接的聚糖，以及包含至少一个半乳糖基化GlcNAc残基的双触角N-连接的聚糖。在某些具体实施方式中，双触角N-连接的聚糖和/或包含至少一个半乳糖基化GlcNAc残基的双触角N-连接的聚糖的总量较表达野生型人β1，4-半乳糖转移酶的植物细胞或植物产生的量的增加2倍。在其它具体实施方式中，该量增加3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，50，100，250，500，1000或10,000倍。
在其它具体实施方式中，植物细胞或植物表达N-末端包含唾液酸转移酶CTS延伸序列的斑马鱼β1，4-半乳糖转移酶(SEQ ID NO：16)。在某些具体实施方式中，上面提到的植物细胞或植物产生至少双触角N-连接的聚糖，以及包含至少一个半乳糖基化GlcNAc残基的双触角N-连接的聚糖。在某些具体实施方式中，双触角N-连接的聚糖和/或包含至少一个半乳糖基化GlcNAc残基的双触角N-连接的聚糖的总量较表达野生型人β1，4-半乳糖转移酶的植物细胞或植物产生的量的增加2倍。在其它具体实施方式中，该量增加3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，50，100，250，500，1000或10,000倍。
在某些具体实施方式中，编码非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的核酸，该核酸在其N-末端被延伸，延伸的序列为来源于哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶1的N-末端的序列或哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶或唾液酸转移酶(本文所描述的)的N-末端CTS序列，可替代性地被延伸为任何其它CTS序列，所述其它CTS序列来源于植物，动物或真菌的定位于高尔基体的蛋白，以使非哺乳动物GalT的催化结构域跨高尔基体定位表达到将其在C末端融合的位置。本发明提供这种核酸。
在某些具体实施方式中，植物细胞或植物除了表达非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶(本文所描述的)外，还表达第二种蛋白，优选哺乳动物蛋白以产生半乳糖基化的N-连接的聚糖，从而产生异质性糖蛋白，该糖蛋白的N-聚糖的β1，4-半乳糖基化，双触角或可以杂合形式替代令人感兴趣。本发明还提供在表达非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的植物细胞或植物中产生的这种糖蛋白。
在某些具体实施方式中，所述第二蛋白自编码抗体的重链和/或轻链或其功能片段的核酸表达。
技术人员熟知重组核酸在细胞表达系统中的表达，如例如能产生整个植物的植物细胞。表达载体可用于表达在细胞表达系统中表达重组核酸。在某些具体实施方式中，这种载体包含编码非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶或其酶学活性衍生物或部分的DNA，该DNA可选在N-末端延伸或其本身的CTS被置换为另一种定位于高尔基体的蛋白的N-末端CTS序列，以这种方式，该酶在N-连接的聚糖上具有半乳糖基化活性。合适的载体进一步包含调节元件，如启动子，并可选包含至少一种可在所述的细胞表达系统中表达的选择标记。该表达载体可进一步编码至少一种编码能糖基化的哺乳动物糖蛋白的进一步DNA。
在某些具体实施方式中，本发明提供产生功能性非哺乳动物的酶的植物或植物细胞该功能性非哺乳动物的酶可选在N-末端被延伸，延伸的序列为来源于哺乳动物GalT或其内源性CTS被另一种来源于植物的定位于高尔基体的蛋白的CTS置换，该植物或植物细胞能进行正常情况下在植物中不出现的N-聚糖的生物合成从而例如产生加入半乳糖后使N-连接的聚糖延伸的能力。在某些具体实施方式中，表达是瞬时的，而在其它具体实施方式中，表达非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶或其酶学活性衍生物或部分，和可选表达另外的可被糖基化的异源蛋白的植物或植物细胞中转染是稳定转染。在某些具体实施方式中，植物或植物细胞可另外表达第三种蛋白。这种第三种蛋白可是进一步将所述的半乳糖基化的第二种蛋白糖基化。在某些具体实施方式中，植物细胞或植物可包含两条核酸，其编码二聚体或多聚体蛋白的单体。在某些具体实施方式中，各个核酸是抗体的轻链和重链或其功能片段或是任何其它目的二聚体或多聚体蛋白。当然，不必要表达全长蛋白质。在某些具体实施方式中，本发明所述的植物细胞或植物仅表达片段，优选是所述第二种哺乳动物糖蛋白的功能片段，所述片段具有完整蛋白的至少一种活性并且其进一步特征是例如具有截短的多肽链或是未充分延伸的聚糖，例如仅延伸出半乳糖。本发明也提供这种糖蛋白或其片段。
将植物特异性残基如β1，2-木糖和α1，3-岩藻糖残基加至植物中产生的糖蛋白上使得这种糖蛋白较不适于药物用途，因为β1，2-木糖和α1，3-岩藻糖残基在哺乳动物体内产生非预期的抗原性和免疫原性特征。为了实质上限制β1，2-木糖和α1，3-岩藻糖残基在植物中产生的糖蛋白上的数目或为了达到完全不含这些残基，需要以合成显示人源化火哺乳动物源化特征的糖蛋白的方式修饰植物细胞基因组的策略。
在某些具体实施方式中，本发明提供这样的植物细胞或植物：其中第二种蛋白和优选第二种哺乳动物蛋白或其功能片段包含不含木糖和/或岩藻糖延伸出来的N-连接的聚糖。植物来源的半乳糖基化糖蛋白仍然可含有木糖和岩藻糖残基。在某些具体实施方式中，在本发明的别处所述的非哺乳动物β1，4-半乳糖转移酶或其修饰版本因此在植物中以下列方式表达：在高尔基体中酶作用于天然底物，也就是在N-乙酰葡糖胺基转移酶I，高尔基体-甘露糖苷酶II和N-乙酰葡糖胺基转移酶II的作用后，假如这些酶不在另一中途径中被抑制，在木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶作用之后。自植物中获得的半乳糖基化蛋白本文是指植物来源的。本文也提供这种植物来源的半乳糖基化蛋白。
为了在植物中产生定制的糖蛋白，使植物的糖基化作用最大化，可将木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶敲除或沉默，并且在几种哺乳动物的糖基转移酶中至少一种表达。如果木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶敲除并因此降低植物的非所需的糖基化潜力是可行的选择，因为例如编码N-乙酰葡糖胺基转移酶I的基因发生突变的拟南芥突变体是完全有活力的。由于N-乙酰葡糖胺基转移酶I是起始复杂聚糖的形成的酶，该植物完全缺乏含有复杂聚糖的木糖和岩藻糖残基。
在某些具体实施方式中，本发明提供这样的植物或植物细胞：其中可被糖基化的非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶或其酶学活性衍生物或部分，另外的异源蛋白，和可选另外提供进一步N-聚糖的生物合成的第三种蛋白被表达，并且其中编码负责添加木糖和/或岩藻糖的酶的基因被敲除，或者其中使用反义链或RNAi技术使这些基因沉默表达。在植物中进行基因敲除或通过RNAi使基因沉默的方法为本领域所熟知。
RNA干扰(RNAi)是抑制基因在翻译阶段表达或通过阻碍特定基因转录的机制。小干扰RNA链(siRNA)对于RNAi过程是关键的，并具有与靶RNA链互补的核酸链。特异性RNAi途径蛋白，如dicer(RISC)，被siRNA导向靶信使RNA(mRNA)，在此处它们将靶序列剪切成为不再能翻译成蛋白的小的部分。RNA干扰是对病毒和其它异源遗传物质的免疫应答的重要的部分，尤其是在植物中。
RNA干扰已经用于在植物生物技术的应用中，例如在工程化产生较低水平的天然植物毒素的农作物的应用中，在番茄植物降低变应原水平，和在番茄中强化含食用抗氧化剂的植物(Sunilkumar G.et al.(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103(48)：18054-9；Siritunga D，Sayre R(2003)Planta 217(3)：367-73；Le L.et al.(2006)PlantBiotechnol J 4(2)：231-42；Niggeweg R.et al.(2004)Nat Biotechnol 22(6)：746-54)。这种技术具有在植物家系中具有稳定的和可遗传的RNAi表型的优势。
在其它具体实施方式中，本发明提供将包含延伸的不含木糖和/或岩藻糖N-连接的聚糖的糖蛋白特异性分离和纯化的方法。有几种分离技术，如(免疫)亲和纯化或分子大小排除层析或电泳，以进行所需的纯化。这些方法为本领域所熟知(例如见US 2008/0003680)。
本领域技术人员将理解本发明不限于植物或植物细胞，还提供其它生物体，像动物，真菌或酵母，或细胞系，像哺乳动物细胞系或昆虫细胞系，能产生本发明所述的糖蛋白(基本上是非唾液酸化的)其中所述的N-连接的聚糖包含半乳糖。
在某些具体实施方式中，通过接种含有包含如本文所述的编码N-糖基化修饰的酶的核酸序列和编码商业目的异源糖蛋白基因的(二元)载体的带有土壤杆菌属品系的植物细胞或组织可建立产生定制的商业目的糖蛋白的产生瞬时或稳定转化的植物。可替代地，在某些具体实施方式中，产生定制商业目的糖蛋白的瞬时或稳定转化的植物可通过同时接种(共转化)两种或多种土壤杆菌属品系，每种带有包含编码N-糖基化修饰酶的核酸序列或编码异源的商业目的糖蛋白的核酸序列的载体而产生。可替代地，在某些具体实施方式中，产生定制商业目的糖蛋白的瞬时或稳定转化的植物能通过将修饰N-糖基化的植物与表达编码商业目的蛋白的多聚核苷酸的植物进行(多重)杂交而产生。在所有这些程序中，载体可还包含赋予其抗选择剂的抗性的核酸序列。
如本领域技术人员所知，为了获得涉及N-糖基化的蛋白和商业目的糖蛋白或多肽的满意表达，可使核酸系列适应于宿主植物中的特异性转录和翻译机制。例如，可在编码区内导入沉默突变以改进密码子用法，且可使用特异性启动子驱动所述基因在相关植物组织中的表达。可被发育中(developmentally)调节的或能随意诱导的启动子可用于确保在合适的时间表达，例如，仅在植物组织在从田地里收获后并被送进控制条件下后表达。在所有这些情况下，应选择在同一细胞中表达以使糖蛋白发生所需翻译后修饰的糖基化修饰蛋白的和商业目的糖蛋白的表达盒。
在某些具体实施方式中，本发明提供烟草植物或与烟草属物种相关的植物，优选是普通烟草(N.tabacum)或本塞姆氏烟草(N.benthamiana)。在其它具体实施方式中，可使用其它相对容易转化的植物，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)或玉米(Zea mays)，或与其有关的植物。对于重组糖蛋白的产生，使用浮萍具有特别的优势。该植物一般小，并通过营养体的出芽进行无性生殖。大多数浮萍物种具有大得多的植物的所有的组织和器官，包括根，茎，花，种子和叶。浮萍能在能轻易地将其收获的满的容器(containment)中在简单的液体溶液的表面以自由漂浮的植物廉价和非常快速地生长。在某些具体实施方式中，浮萍是重组的，其产生非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶或其修饰版本(本文中所描述的)和/或编码商业上的目的性异源糖蛋白的基因。浮萍植物可包含例如紫萍属(genus Spirodella)，无根萍属(genus Wolffia)，扁无根萍属(genus Wolffiella)或浮萍属(genus Lemna)，小浮萍(Lemna minor)，微小浮萍(Lemna miniscula)和圆浮萍(Lemna gibba)。
在某些具体实施方式中，表达在番茄果实中进行。番茄能容易地在含有(contained)和控制条件下在温室中生长，并且能在全年大量连续收获番茄果实生物量。能容易地将含有目的糖蛋白的水样部分从番茄果实的其余部分中分离以使糖蛋白的纯化更容易。在某些具体实施方式中，表达在其它作物的贮藏器官中进行，所述的贮藏器官包括但不限于玉米仁，马铃薯根茎和油菜籽或向日葵的种子，其是有吸引力的替代方法可产生巨大的生物量的器官以便于使用收获和加工技术。
在某些具体实施方式中，本发明提供产生转基因植物的方法，如转基因烟草亚种，优选普通烟草(N.tabacum)或本塞姆氏烟草(N.benthamiana)，拟南芥或玉米，马铃薯，番茄或浮萍，这些植物能表达能通过半乳糖延伸N-连接的聚糖的重组蛋白，所述方法包含将所述转基因植物与至少包含一种可选的功能性非哺乳动物蛋白的植物杂交，例如，能进行N-聚糖生物合成的运载体或酶正常不存在于植物中，自所述的杂交中收获子代并选择表达所述重组蛋白的子代和表达参与哺乳动物样N-聚糖的生物合成的功能性非哺乳动物的酶，该酶正常不存在于植物中。在一种具体实施方式中，该方法可进一步包含选择表达所述的包含延伸的N-连接的至少包含半乳糖的聚糖的重组蛋白的所需子代植物。
在某些具体实施方式中，本发明提供表达包含N-连接的聚糖的所述重组糖蛋白的植物和表达参与哺乳动物样N-聚糖的生物合成的非哺乳动物的酶的植物。在另外的具体实施方式中，本发明还提供转基因植物的产生所需糖蛋白或其功能片段的用途，尤其其中所述的糖蛋白或其功能片段包含延伸的N-连接的至少包含半乳糖的聚糖。
在某些具体实施方式中，本发明提供产生能表达能以半乳糖延伸N-连接的聚糖的重组蛋白的转基因植物细胞悬浮培养物的方法，所述的转基因植物细胞悬浮培养物如转基因烟草物种，优选BY2烟草，胡萝卜或拟南芥细胞悬浮物。
在某些具体实施方式中，本发明提供产生能表达能以半乳糖延伸N-连接的聚糖的重组蛋白的转基因苔藓的方法，所述的转基因苔藓如转基因苔藓植物(Bryophytaea)，优选小立碗藓(Physcomitrella patens)或葫芦藓(Funariahygrometrica)，角齿藓(Ceratodon purpureus)。
在某些具体实施方式中，本发明提供获得所需糖蛋白或其功能片段的方法，该方法包含例如至少包含半乳糖的聚糖延伸N-连接的聚糖。所述的方法包含将本发明所述的植物培养直至所述植物达到收获阶段，例如当长出足够的生物量时进行有盈利的收获，接着本领域已建立的已知技术收获所述的植物并将采用本领域已建立的已知技术分离所述的植物，以获得各部分植物材料和从所述的各部分植物材料中至少是部分分离所述糖蛋白。
在某些具体实施方式中，本发明提供植物来源的包含以至少包含半乳糖的聚糖延伸N-连接的聚糖的糖蛋白及其片段，例如通过上面解释的方法获得的及其片段。这种植物来源的带有以至少包含半乳糖的聚糖延伸的聚糖的糖蛋白实质上能是任何所需的能在植物中表达的糖蛋白。例如，抗体，疫苗，细胞因子，FSH，TSH和其它激素糖蛋白，其它激素像EPO，酶像抗胰蛋白酶或脂酶，细胞粘附分子像NCAM或胶原能在植物中产生并能产生实质上哺乳动物糖基化模式。
在某些具体实施方式中，本发明提供如上所述的这种植物来源的糖蛋白及其功能片段的用于产生药物组合物，例如用于产生用于以抗体，激素，细胞因子，疫苗抗原，酶等治疗患者的药物组合物的用途。本发明还提供这种包含糖蛋白及其功能片段的药物组合物。
植物的转化
能通过使用本领域已知方法表达蛋白，这些蛋白如例如产生N-聚糖的生物合成的非哺乳动物酶，以及糖蛋白，如抗体，细胞因子，疫苗，激素等。例如，通过土壤杆菌属介导的转化电穿孔或基因枪的稳定表达，或通过使用病毒载体如PVX，例如，或农业滤过作用或本领域其它已知方法的瞬时表达。本发明所述的能进行聚糖的生物合成糖基转移酶，和/或承担糖基化的糖蛋白可在特异性启动子的调控下表达，所述的特异性启动子能易化其在特定组织或器官中的表达。编码所需非哺乳动物糖基转移酶和/或本文所述的糖蛋白的多肽的DNA序列，例如编码蛋白全长的cDNA或基因组序列，可被用于构建能被导入所需植物中的重组表达盒。
如本文所述分离的核酸，例如包含如SEQ ID NO：1，8，10，13，15和17的序列，能根据本领域已知的技术导入植物中。通常，制备上述和适于转化植物细胞的重组表达盒。本文所述的分离核酸然后能用于转化。以这种方式，能获得遗传修饰植物，植物细胞，植物组织，种子等。
转化流程可依进行转化的植物细胞的类型，即单子叶植物或双子叶植物而不同。转化植物细胞的合适的方法包括显微注射法(Crossway et al.(1986)Biotechniques 4：320-334)，电穿孔法(Riggs et al(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)，土壤杆菌属介导的转化(见于例如Zhao et al.U.S.Patent 5,981,840；Hinchee et al.(1988)Biotechnology 6：915-921)，直接基因转移方法(Paszkowski et al(1984)EMBO J.3：27172722)，和基因枪法(见于例如Sanford et al.U.S.Patent4,945,050；Tomes et al.″Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via MicroprojectileBombardment″In Gamborg and Phillips(Eds.)Plant Cell，Tissue and Organ Culture：Fundamental Methods，Springer-Verlag，Berlin(1995)；and McCabe et al.(1988)Biotechnology 6：923-926)。
被转化的细胞根据常规方法在植物中生长。见于文献(例如McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports，5：81-84.)。然后，种植这些植物，并与同一转化品系或不同品系授粉，且所得杂交品系具有所需鉴定过的表型特征。可种植两代或多代以确保主题表型特征稳定保留并遗传，然后收获种子以确保所需表型或其它特性可得到。
转基因的再生
转化植物表达载体的植物细胞能再生，例如根据标准植物组织培养技术从单细胞中，愈伤组织或叶片中再生。本领域熟知，能成功地培养任何植物的几乎各种细胞，组织和器官以再生整个植物。从培养的原生质体重再生植物见于文献所述(Evans et al.，Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture，Macmillan Publishing Company，New York，pp.124 176(1983)；and Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，CRC Press，Boca Raton，pp.21-73(1985).)。
能实现从叶子分离体中使含有通过土壤杆菌属导入的异源基因的植物再生，(见Horsch et al.，Science，227：1229-1231(1985)所述)。在这个程序中，转化体生长在选择剂存在和在诱导被转化的植物物种的芽再生的培养基中(见Fraley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，80：4803(1983)所述)。该程序通常在两周至四周的时间内产生芽，并且然后将这些转化体芽转移至含有选择剂和预防细菌生长的抗生素的合适的芽-诱导培养基中。可使本发明所述的转基因植物增殖或使其不能增殖。
再生也能从植物的愈伤组织，移出物，器官或其部分。这种再生技术通常见文献所述(Klee et al.，Annu Rev Plant Phys.38：467-486(1987))。本领域熟知，从来自单一植物原生质体或各种移出物进行植物的再生(见，例如Methods for PlantMolecular Biology，A.Weissbach and H.Weissbach，eds.，Academic Press，Inc.，SanDiego，Calif.(1988))。这种再生和生长过程包括选择转化体细胞和芽，使转化体芽生根并在土壤中生长成小的植株的步骤。玉米细胞培养和再生通常见文献(TheMaize Handbook，Freeling and Walbot，Eds.，Springer，New York(1994)；Corn andCorn Improvement，3rd edition，Sprague and Dudley Eds.，American Society ofAgronomy，Madison，Wisconsin(1988))。
技术人员意识到重组表达盒稳定掺入转基因植物中并被证实是可操作的之后，其能通过性别杂交导入其它植物中。能使用任何数量的标准育种技术，这取决于待杂交物种。在营养体繁殖的作物中，成熟的转基因植物能通过取其切屑或通过组织培养技术繁殖以产生多个同一植物。
为商业用途选择所需转基因体，并获得新的品种并优选将其进行营养体繁殖。在种子繁殖作物中，成熟的转基因植物能自交以产生纯合的近亲交配植物。该近亲交配植物产生含有新导入的异源核酸的种子。这些种子能长成产生所选表型的生产植物。
本发明包括从再生植物获得的部分，如花，种子，叶，枝条，果实等，如果这些部分包含含有本文所述的分离核酸的细胞。再生植物的子代和变体和突变体也包括在本发明的范围内，如果这些部分包含导入的核酸序列。
表达选择标记的转基因植物能通过例如标准免疫印迹和DNA检测技术以筛选本文所说述的核酸的传递。通常还在异源核酸的表达水平上评价转基因品种。能在起初确定RNA水平上的表达以鉴定和定量表达阳性植物。能使用RNA分析的标准技术，这些技术包括使用设计用以仅扩增异源RNA模板的寡核苷酸引物的PCR扩增检测和使用异源核酸特异性探针的溶液杂交检测。然后能将RNA阳性植物通过Western免疫印迹检测进行蛋白表分析，该检测使用本文提供的特异性反应抗体。此外，根据标准流程，分别使用异源核酸特异性多聚核苷酸探针和抗体能进行原位杂交和免疫细胞化学检测来定位在转基因组织中的表达位点。通常，筛选多个转基因品种的掺入的核酸以鉴定和选择具有适合的表达谱的植物。
在某些具体实施方式中，本发明提供对于添加的异源核酸是纯合的转基因植物；即含有两种添加的核酸序列，在每对染色体的每条染色体上同一基因座上各有一个基因的转基因植物。能通过将含有单添加的异源核酸进行性别交配(自交)，使所产生的种子中的一些发芽，并分析本文所述的多聚核酸表达相对于对照植物(即天然非转基因植物)发生改变所产生的所得植物获得纯合转基因植物。本发明也关注与亲代植物回交和与非转基因植物异型杂交。
在某些具体实施方式中，本发明提供转基因植物或转基因植物细胞的生产过程，该过程包含(a)将DNA插入植物或植物细胞的基因组中，所述的DNA包含编码非哺乳动物β-1，4-半乳糖转移酶的核酸序列(其可选以哺乳动物N-末端序列衍生，如本文所述)或编码所述GalT的核酸序列(其中它的CTS被置换为另一定位于高尔基体的蛋白的CTS，如本文所述)或其酶学活性衍生物或部分，且此外优选至少一种需将其N-连接的聚糖半乳糖基化的哺乳动物蛋白的核酸序列，该DNA另外编码至少一种在所述植物或所述植物细胞中表达的选择标记，(b)选择已经摄入(a)所述的DNA的植物或植物细胞；和(c)在合适的培养基中培养所需的转基因植物或所需的转基因植物细胞。技术人员应理解术语“包含半乳糖基化的N-连接的聚糖的蛋白”与编码所述蛋白的核酸分子之间的关系，该核酸分子仅编码多肽，然而半乳糖基化N-连接的聚糖是该蛋白在高尔基体中的加工的结果。
在某些具体实施方式中，本发明提供生产表达重组GalT蛋白和包含半乳糖基化N-连接的聚糖的蛋白的转基因植物的另外的方法。这种方法可例如包含将本文所述的转基因植物与另一种植物杂交，收获所述杂交的子代，并选择所需表达重组GalT蛋白和表达重组哺乳动物糖蛋白，尤其是包含半乳糖基化N-聚糖或其功能片段的蛋白的子代植物。
蛋白纯化
在某些具体实施方式中，本发明提供获得所需糖蛋白或其功能片段的方法，该方法包含将本文所述的植物培养直到所述植物达到可以收获的阶段，收获并将植物分割以获得分割的植物材料，并从所述分割的植物材料中至少部分分离所述糖蛋白。在某些具体实施方式中，获得所需糖蛋白或其功能片段的方法包括在发酵罐中在细胞培养中使植物细胞生长直到所述的细胞培养已经达到可以收获的阶段或能从培养基中将所需糖蛋白收集起来。本文所述的糖蛋白，如例如抗体，疫苗，细胞因子和激素，可通过本领域技术人员所熟知的标准技术纯化。重组蛋白通过联合使用细胞裂解(例如超声裂解法，法国出版社)和亲和层析或其它基于亲和力的方法纯化。对于融合产物，融合蛋白以合适的蛋白水解酶进行后续消化，释放出所需重组蛋白。
本文所述蛋白，重组蛋白或合成蛋白，可通过本领域熟知的标准技术将其纯化至实质上是纯净的(程度)，这些方法包括去污剂增溶溶解，以如硫酸胺的物质进行选择沉淀，柱层析，免疫纯化方法及其他(见例如R.Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，Springer-Verlag：New York(1982)；Deutscher，Guide toProtein Purification，Academic Press(1990))。例如，可产生抗本文所述的蛋白的抗体。遵循美国专利No.4,511,503所述的程序能达到从E.coli中纯化。然后，从表达该蛋白的细胞中分离该蛋白，并通过本文所述的标准蛋白质化学技术将其进一步纯化。通过本领域已知的方达到检测表达蛋白，这些方法包括，例如放射性免疫检测方法，Western印迹技术活免疫沉淀方法。
实施例
实施例1：
鉴定推定的非哺乳动物β1，4GalT
β-1，4-半乳糖转移酶(GalT)家族包含至少七个成员，其中数个已经被克隆出来但仅有少数几个被鉴定出来。人和牛起源的β-1，4-半乳糖转移酶已经被最佳地鉴定出来，并显示出能以β-1，4-键将半乳糖残基加至N-聚糖的末端GlcNAc残基上。非哺乳动物物种基因序列中推定的参与N-糖基化的GalT基因基于同源性而被鉴定。图1显示，哺乳动物GalT基因序列(人，小鼠和牛)和非哺乳动物推定的GalT基因序列(鸡，斑马鱼和蛙)之间的Clustal W比对。显著地，哺乳动物的氨基末端(位于实线方框内，位于细胞浆内并与跨膜区相连(TM，虚线方框内)且推定其参与高尔基体-定位过程)在非哺乳动物起源的如例如鸡和斑马鱼(见图1)的GalT直系同源物中不保守。
认为高尔基体-定位过程对于GalT活性是重要的，GalT活性能是“晚期”(可能跨高尔基体)，这意味着GalT的催化活性出现在其它糖基转移酶的作用之后，这些糖基转移酶产生双触角N-聚糖，如例如植物中的Man-I，GnT-I，Man-II，GnT-II，XylT和FucT，或GalT的催化活性出现在“早期”(顺式/中间-高尔基体)，其出现在Man-II，XylT和FucT活性之前，从而预防在不含岩藻糖和木糖的杂合类型N-聚糖的植物中产生的这些酶的活性。
非哺乳动物GalT直系同源物，例如来源于鸡和斑马鱼的GalT直系同源物，以前未就其将半乳糖残基以β-1，4-键加到N-聚糖的末端GlcNAc残基上的能力进行鉴定，尤其是没有就在植物中表达的异源性GalT直系同源物的这种能力进行鉴定。尚未研究当其在植物中与非哺乳动物GalT直系同源物融合表达时，不同哺乳动物氨基末端对双触角或杂合类型的N-聚糖的产生的影响(其可影响细胞内的定位)和对在N-聚糖上添加植物特异性岩藻糖和木糖残基的效应。
克隆和检测了鸡和斑马鱼中每一种的三个GalT构建体的N-糖基化活性：a)野生型非哺乳动物鸡和斑马鱼β-1，4-GalT1；b)将有13个氨基酸的保守的哺乳动物(人)氨基末端(见图1)延伸序列与非哺乳动物鸡和斑马鱼β-1，4-GalT1融合；和c)哺乳动物胞浆尾和大鼠唾液酸转移酶基因来源的跨膜结构域(CTS)与非哺乳动物鸡和斑马鱼β-1，4-GalT1形成的融合蛋白，置换带有大鼠唾液酸转移酶的CTS的鸡和斑马鱼β-1，4-GalT1的氨基末端(见实施例2和3).
实施例2：
编码全长鸡β1，4-GalT1酶及其变体的基因的克隆和表达
推定的鸡β1，4-GalT1(GGal；GenBank accession U19890；SEQ Ggal，SEQ IDNO：2)克隆得较早，尽管未显示能将N-聚糖半乳糖基化(Shaper et al.，J Biol Chem272，31389-31399，1997)。在我们实验室，以引物GgalLEEVAST和GgGaldw用RT-PCR将包含114至362残基的cDNA片段(SEQ GgGal114-362，SEQ ID NO：3)从鸡脾脏总RNA中扩增出来(见表1)。所得的含有C-末端的片段用XhoI和BamHI进行消化，请然后将其克隆进质粒pCASeco中，后者是pUC19衍生物，其中多克隆位点两翼的Hin dIII和Eco RI位点用于插入序列SEQ CASeco，同时将骨架中的这两个位点和Eco 31I-位点删除。该质粒pCASeco用XhoI和Bam HI消化以适应于产生C-末端GGal片段的克隆GgGalC。
含有GGal的N-末端的cDNA片段和包含1至113残基的cDNA片段使用基于PCR的方法从长寡核苷酸中合成性产生。天然cDNA片段的富含GC的特性阻碍了直接RT-PCR克隆的进行，并且该片段的与野生型序列相比无氨基酸改变的密码子优化版本(SEQ GgGalsyn，SEQ ID NO：6)与编码SEQ GgGal114-362的克隆GgGalC以产生编码野生型GGal氨基酸序列(SEQ Ggal，SEQ ID NO：2)的基因(SEQ GgGalhybr，SEQ ID NO：1)的方式合并。然后将文中称为SEQ GgGalhybr的基因用作起始材料以产生两种变体，一种变体是其N-末端以编码全长人β1，4-GalT1(GenBank accession NM_001497)的13个氨基酸残基的序列延伸，且另一种是其编码包含GGal的催化结构域的40至362残基的片段与N-末端结构域包含1-53残基的大鼠α2，6-唾液酸转移酶的C-末端融合，因此包括胞浆尾，跨膜结构域和部分茎区。大鼠SialT-来源序列包含相对于野生型序列的一个沉默突变。
带有13个氨基酸的N-末端延伸序列的GGal使用PCR以寡核苷酸HsGgGalstart和M13上游引物从编码GGal的杂合克隆中制备出来(表1)。所得PCR片段用Bpi I和Xba I消化并克隆进进行同样消化的GGal克隆。所得的克隆含有带SEQ HsGGal(SEQ ID NO：8)的基因。
带有大鼠SialT N-末端结构域的变体使用PCR以寡核苷酸GgGal142和M13上游引物从编码完整GGal的克隆(SEQ GgGalhybr，SEQ ID NO：1)中制备出来(表1)。所得的片段用Eco 31I和Bam HI消化，并克隆进经Nco I和Bam HI消化的含有大鼠序列的pCASeco质粒。所得的克隆含有带SEQ sialGGal(SEQ ID NO：10)的基因。
含有三种不同GGal基因的植物转化载体的制备过程如下：首先将用Eco 31I和Bam HI消化的基因克隆进用Nco I和Bam HI消化的pRAP40载体中，使该基因位于增强的CaMV 35S启动子和AMV翻译增强子的下游。pRAP40是pUC19衍生物，其含有增强的CaMV 35S启动子和两翼的nos终止子，其借助Asc I位点位于该启动子的上游，借助Pac I位点位于该终止子的下游；包括两翼的限制性位点的完整盒被称作SEQ RAP40(SEQ ID NO：12)。然后将这三个包含启动子，三个基因中的一个基因和终止子的盒中的每一个盒分别转移至二元载体pMOG22的修饰版本中，所述版本中多克隆位点中的Eco RI和Hin dIII位点已分别被Pac I和Asc I置换(Goddijn et al.，1993，Plant J 4：863-873)。为了达到这个目的，pRAP来源克隆用Pac I和Asc I消化，然后克隆进Asc-Pac消化的双元载体中，假使三种不同载体适于进行植物转化。在根瘤土壤杆菌介导转化烟草之后，表达GGal及其变体的转基因植物通过分析通过转化体合成的N-聚糖进行选择，使用的方法如前所述(例如Bakker et al.Proc Natl Acad Sci USA 98：2899-904，2001 and Proc NatlAcad Sci USA 103：7577-82，2006)。
从表达鸡的基因的转基因植物中纯化的N-聚糖的MALDI-TOF分析结果(见图2，并在图4右栏和表3中总结)显示仅鸡的带有13个氨基酸延伸序列(HsGGal，SEQ ID NO：8)或SialT-CTS(sialGGal，SEQ ID NO：10)的基因序列的表达导致带有半乳糖残基的全部双触角N-聚糖的产生。野生型鸡GalT基因的表达仅导致杂合类型的N-聚糖的产生。鸡GalT的13个氨基酸延伸序列(HsGGal，SEQ ID NO：8)或SialT-CTS(sialGGal，SEQ ID NO：10)也都有某些杂合类型半乳糖基化N-聚糖。
显著地，三种不同GGal基因的表达导致几乎完全不含末端是两个GlcNAc残基的双触角N-聚糖(见表3和图4，上行，右栏)占优势，而不是带有一个半乳糖切不含木糖和岩藻糖的杂合类型半乳糖基化的N-聚糖，尤其是对于表达野生型鸡GalT(见图4，中行，右栏)。这个N-聚糖产生模式显著不同于以人GalT或斑马鱼GalT转化的植物中获得的模式(分别见表3和图4，左和中栏，且见下文)。
植物特异性木糖和岩藻糖残基减少或完全不含，如当在植物中表达野生型鸡GalT时，见于杂合类型半乳糖基化N-聚糖，当产生例如异源性治疗性糖蛋白时，由于β1，2-木糖和β1，3-岩藻糖残基不连接至哺乳动物的糖蛋白上而作为变应原，是所需的。
实施例3：编码全长斑马鱼β1，4-GalT1酶及其变体的基因的克隆和表达。
已经鉴定了推定的斑马鱼β1，4-GalT1(Machingo et al.，Dev Biol 297，471-82，2006；NM_001017730)，但其功能尚未证实，且本发明人相信，鉴定是不正确的。从整体斑马鱼总RNA开始，全长DGal基因(SEQ Dgal，SEQ ID NO：13)使用RT-PCR以引物DrGalup和DrGaldw(见表2)进行扩增。所得的片段用Xba I和BamHI消化，然后克隆进同样消化的质粒pCASeco(见上文)中。序列测定显示，其事实上与未鉴定的Genbank登录号为001077259相同，尽管有三个突变如此处所示(自+1开始，且非沉默突变下划线)：T126C，T230G，G862C。Dgal(SEQ Dgal，SEQID NO：14)与推定的斑马鱼β1，4-GalT1之间的氨基酸序列比较(如已发表于Machingo et al.，Dev Biol 297，471-82，2006；NM_001017730)显示在氨基酸水平上有少数序列同源性，尤其是在N-末端，假设N-末端参与高尔基体-定位过程，且在我们的克隆中的C-末端显著延长(见图5)。
带有13个氨基酸的N-末端延伸序列的DGal从编码DGal的克隆(SEQ Dgal，SEQ ID NO：13)中使用PCR以寡核苷酸HsDrup和DrGaldw(表2)制备出来。所得PCR片段用Acc I和Bpi I消化，并克隆进同样消化的DGal克隆中。所得的克隆含有带SEQ HsDGal(SEQ ID NO：15)的基因。
带有大鼠SialT N-末端结构域的变体从编码完整DGal的克隆(SEQ Dgal，SEQID NO：13)中使用PCR以寡核苷酸DrGal160和DrGaldw(见表2)制备出来。所得片段用Bpi I和Bam HI消化，并克隆进含有大鼠序列的用Nco I和Bam HI消化的pCASeco质粒中。所得克隆含有与大鼠的SialT基因(SEQ sialDGal，SEQ ID NO：17)的N-末端融合的DGal催化结构域。
含有三个不同DGal基因的植物转化载体的制备过程如下：首先将用Eco 31I和Bam HI消化的该基因克隆进用消化的pRAP40载体中，造成该基因在增强的CaMV 35S启动子的下游。然后这三个包含启动子，这三个基因之一和终止子的盒中每一个盒分别转移至二元载体pMOG22的修饰版本中，其中多克隆位点中的EcoRI和Hin dIII位点被分别置换为Pac I和Asc I(Goddijn et al.，1993，Plant J4：863-873)。为了达到这个目的，pRAP来源克隆用Pac I和Asc I消化，然后克隆进用Asc-Pac消化的二元载体中，加入三中不同载体适于进行植物转化。在根瘤土壤杆菌介导下转化烟草后，表达DGal或其变体的转基因植物通过分析由转化体合成的N-聚糖进行选择，所用的方法见前所述(例如Bakker et al.，Proc Natl Acad SciUSA 98：2899-904，2001and Proc Natl Acad Sci USA 103：7577-82，2006)。
表达斑马鱼GalT基因序列的转基因植物中纯化的N-聚糖的MALDI-TOF分析结果(见图3，并总结于图4的中栏和表3)显示，野生型斑马鱼GalT基因序列的表达产生某些杂合类型的半乳糖基化N-聚糖，和完全的带有两个半乳糖的双触角N-聚糖。取决于植物，某些植物表达野生型斑马鱼GalT基因序列后仅有半乳糖基化双触角N-聚糖(见图3，最上端与从顶端行数第二行进行比较)。双半乳糖基化双触角N-聚糖能显著地通过13个氨基酸N-末端人GalT(HsDGal，SEQ ID NO：15)或SialT-CTS-GalT(sialDGal，SEQ ID NO：17)而增加，后者具有最高的量的半乳糖基化双触角N-聚糖(见表3和图4的底端行中间栏)。
显著地，通过在烟草中表达Sial-CTS-斑马鱼GalT而获得的双-半乳糖基化双触角N-聚糖的半乳糖基化在SialT-CTS-斑马鱼GalT中较SialT-CTS-人GalT增加50％(分别见表3和图4的底端行，中间栏和左栏)。Sial-CTS-斑马鱼GalT产生高达有一个或多个半乳糖残基的总的N-聚糖的45％(见表3)。
当生产例如异源性治疗性糖蛋白时，高产量的有一个或多个半乳糖残基的总的N-聚糖是需要的，如在当Sial-CTS-斑马鱼GalT在植物中表达时产生的双触角N-聚糖中所见。表1.实施例1中使用的寡核苷酸(5’至3’)
表1.实施例1中使用的寡核苷酸(5’至3’)
表2.实施例2中使用的寡核苷酸(5’至3’)
表3，MALDI-TOF分析结果总结
| 构建体 | 品系 | 1617.5 | 1622.6 | 1941.7 | 总半乳糖 |
| 斑马鱼GalT | D1 | 2.6 | 4.7 | 1.7 | 32.9 |
| 斑马鱼GalT | D2 | 10.2 | 0.8 | 3.4 | 23.5 |
| 斑马鱼GalT | D3 | 4.7 | 4.3 | 1.4 | 34.2 |
| 斑马鱼GalT | D4 | 17.4 | 0.7 | 3.4 | 23.9 |
| 斑马鱼GalT+13aa | HD1 | 18.8 | 0.5 | 5.9 | 25.2 |
| 斑马鱼GalT+13aa | HD2 | 15.9 | 0.3 | 5.1 | 23.5 |
| 斑马鱼GalT+13aa | HD4 | 24.5 | ＜0.1 | 4.5 | 30.1 |
| 带有CTSsialT的斑马鱼GalT | SDa | 11.9 | 0.5 | 9.1 | 44.8 |
| 带有CTSsialT的斑马鱼GalT | SDb | 13.6 | 0.4 | 7.6 | 29.4 |
| 带有CTSsialT的斑马鱼GalT | SDc | 11.5 | 0.5 | 7.7 | 29.4 |
| 鸡GalT | Ga | ND | 11.2 | ND | 30.5 |
| 鸡GalT | Gb | ND | 15.7 | ND | 33.3 |
| 鸡GalT | Gc | ND | 11.8 | ND | 30.6 |
| 鸡GalT+13aa | HG1 | 2.1 | 5.6 | 0.8 | 31.4 |
| 鸡GalT+13aa | HG2 | 1.5 | 7.1 | 0.4 | 29.4 |
| 鸡GalT+13aa | HG4 | 3.7 | 3.6 | 1.1 | 26.9 |
| 鸡GalT+13aa | HG5 | 2.1 | 9 | ＜0.1 | 30.4 |
| 带有CTSsialT的鸡GalT | SG1 | 1.1 | 3.6 | 1.9 | 35.5 |
| 带有CTSsialT的鸡GalT | SG2 | 0.7 | 2.5 | 1.6 | 30.4 |
| ND＝未检测 |
数字是3-5栏的总峰面积的％；总的半乳糖是带有一个或多个半乳糖残基的总N-聚糖的％(6栏)。
SEQ GgGalhybr(SEQ ID NO：1)：
ATGAAGGAGCCAGCCCTCCCAGGTACATCACTTCAGAGGGCTTGCAGGCTC
CTCGTCGCTTTCTGTGCACTTCACCTCTCTGCAACTCTGCTCTACTACCTCGC
AGGTAGTTCTCTCACGCCACCTAGAAGTCCTGAACCTCCACCTAGACGACC
ACCTCCAGCTAACCTCTCTCTTCCACCATCTAGACCACCTCCTCCACCTGCT
GCACGTCCACGACCTGGACCTGTTTCAGCACAACCACGTAACCTCCCAGAC
TCTGCTCCATCTGGACTTTGTCCTGACCCTTCTCCACTTCTCGTCGGACCAC
TTAGAGTTGAGTTCTCTCAGCCTGTGAACCTCGAGGAGGTGGCGAGCACAA
ACCCTGAGGTCAGGGAGGGAGGTCGTTTTGCTCCAAAGGACTGCAAGGCG
CTGCAGAAAGTAGCAATCATCATCCCGTTCCGAAACCGAGAGGAGCATCTG
AAGTACTGGCTCTATTACATGCACCCAATTCTTCAAAGGCAGCAGCTAGATT
ATGGAGTGTATGTCATCAACCAGGATGGAGACGAAGAATTTAACCGTGCTAA
ACTGCTGAATGTAGGATTCACGGAAGCTTTGAAGGAGTATGACTATGACTGC
TTTGTGTTTAGTGATGTAGACCTGATCCCAATGGATGACAGGAACACCTACA
AGTGCTACAGCCAACCAAGGCACCTTTCTGTCTCCATGGATAAATTCGGATT
TCGGTTACCCTACAATCAGTATTTTGGAGGTGTGTCTGCCTTGAGCAAAGAA
CAATTCACGAAGATCAATGGGTTCCCAAACAATTACTGGGGCTGGGGAGGC
GAAGATGATGACATCTACAACAGGCTGGTGTTCAAAGGCATGGGCATATCTC
GGCCAGATGCTGTCATTGGGAAATGCAGAATGATTCGCCACTCGCGTGATCG
GAAGAACGAGCCCAACCCGGAGAGGTTTGACCGTATTGCTCACACCAGGG
AGACGATGAGCTCTGATGGCTTGAACTCGCTCTCCTACGAGGTGCTAAGGA
CTGACAGGTTCCCTCTGTACACGAGGATCACAGTGGATATCGGAGCGCCCG
GCAGCTGA
SEQ Ggal(SEQ ID NO：2)：
MKEPALPGTSLQRACRLLVAFCALHLSATLLYYLAGSSLTPPRSPEPPPRRPPPA
NLSLPPSRPPPPPAARPRPGPVSAQPRNLPDSAPSGLCPDPSPLLVGPLRVEFSQP
VNLEEVASTNPEVREGGRFAPKDCKALQKVAIIIPFRNREEHLKYWLYYMHPIL
QRQQLDYGVYVINQDGDEEFNRAKLLNVGFTEALKEYDYDCFVFSDVDLIPM
DDRNTYKCYSQPRHLSVSMDKFGFRLPYNQYFGGVSALSKEQFTKINGFPNN
YWGWGGEDDDIYNRLVFKGMGISRPDAVIGKCRMIRHSRDRKNEPNPERFDRI
AHTRETMSSDGLNSLSYEVLRTDRFPLYTRITVDIGAPGS
SEQ GgGal114-362(SEQ ID NO：3)：
CTCGAGGAGGTGGCGAGCACAAACCCTGAGGTCAGGGAGGGAGGTCGTTT
TGCTCCAAAGGACTGCAAGGCGCTGCAGAAAGTAGCAATCATCATCCCGTT
CCGAAACCGAGAGGAGCATCTGAAGTACTGGCTCTATTACATGCACCCAATT
CTTCAAAGGCAGCAGCTAGATTATGGAGTGTATGTCATCAACCAGGATGGAG
ACGAAGAATTTAACCGTGCTAAACTGCTGAATGTAGGATTCACGGAAGCTTT
GAAGGAGTATGACTATGACTGCTTTGTGTTTAGTGATGTAGACCTGATCCCA
ATGGATGACAGGAACACCTACAAGTGCTACAGCCAACCAAGGCACCTTTCT
GTCTCCATGGATAAATTCGGATTTCGGTTACCCTACAATCAGTATTTTGGAGG
TGTGTCTGCCTTGAGCAAAGAACAATTCACGAAGATCAATGGGTTTCCAAA
CAATTACTGGGGCTGGGGAGGCGAAGATGATGACATCTACAACAGGCTGGT
GTTCAAAGGCATGGGCATATCTCGGCCAGATGCTGTCATTGGGAAATGCAGA
ATGATTCGCCACTCGCGTGATCGGAAGAACGAGCCCAACCCGGAGAGGTTT
GACCGTATTGCTCACACCAGGGAGACGATGAGCTCTGATGGCTTGAACTCG
CTCTCCTACGAGGTGCTAAGGACTGACAGGTTCCCTCTGTACACGAGGATC
ACAGTGGATATCGGAGCGCCCGGCAGCTGA
SEQ GgGal114-362(SEQ ID NO：4)：
LEEVASTNPEVREGGRFAPKDCKALQKVAIIIPFRNREEHLKYWLYYMHPILQR
QQLDYGVYVINQDGDEEFNRAKLLNVGFTEALKEYDYDCFVFSDVDLIPMDD
RNTYKCYSQPRHLSVSMDKFGFRLPYNQYFGGVSALSKEQFTKINGFPNNYW
GWGGEDDDIYNRLVFKGMGISRPDAVIGKCRMIRHSRDRKNEPNPERFDRIAH
TRETMSSDGLNSLSYEVLRTDRFPLYTRITVDIGAPGS
SEQ CASeco(SEQ ID NO：5)：
GGCGCGCCTCGAGGCGATCGCAGATCTATCGATGCATGCCATGGTACCCGGG
AGCTCGAATTCTAGAAGCTTCTGCAGACGCGTCGACGTCATATGGATCCGCG
AGAGACCTCTTAATTAA
SEQ GgGalsyn(SEQ ID NO：6)：
CTCGAGGAGACCGAAGACAACATGAAGGAGCCAGCCCTCCCAGGTACATC
ACTTCAGAGGGCTTGCAGGCTCCTCGTCGCTTTCTGTGCACTTCACCTCTCT
GCAACTCTGCTCTACTACCTCGCAGGTAGTTCTCTCACGCCACCTAGAAGTC
CTGAACCTCCACCTAGACGACCACCTCCAGCTAACCTCTCTCTTCCACCATC
TAGACCACCTCCTCCACCTGCTGCACGTCCACGACCTGGACCTGTTTCAGC
ACAACCACGTAACCTCCCAGACTCTGCTCCATCTGGACTTTGTCCTGACCCT
TCTCCACTTCTCGTCGGACCACTTAGAGTTGAGTTCTCTCAGCCTGTGAACC
TCGAG
SEQ GgGalsyn(SEQ ID NO：7)：
MKEPALPGTSLQRACRLLVAFCALHLSATLLYYLAGSSLTPPRSPEPPPRRPPPA
NLSLPPSRPPPPPAARPRPGPVSAQPRNLPDSAPSGLCPDPSPLLVGPLRVEFSQP
VNLE
SEQ HsGGal(SEQ ID NO：8)：
ATGAGGCTTCGGGAGCCTCTCCTCAGCGGCAGCGCCGCTATGAAGGAGCCA
GCCCTCCCAGGTACATCACTTCAGAGGGCTTGCAGGCTCCTCGTCGCTTTCT
GTGCACTTCACCTCTCTGCAACTCTGCTCTACTACCTCGCAGGTAGTTCTCT
CACGCCACCTAGAAGTCCTGAACCTCCACCTAGACGACCACCTCCAGCTAA
CCTCTCTCTTCCACCATCTAGACCACCTCCTCCACCTGCTGCACGTCCACGA
CCTGGACCTGTTTCAGCACAACCACGTAACCTCCCAGACTCTGCTCCATCTG
GACTTTGTCCTGACCCTTCTCCACTTCTCGTCGGACCACTTAGAGTTGAGTT
CTCTCAGCCTGTGAACCTCGAGGAGGTGGCGAGCACAAACCCTGAGGTCA
GGGAGGGAGGTCGTTTTGCTCCAAAGGACTGCAAGGCGCTGCAGAAAGTA
GCAATCATCATCCCGTTCCGAAACCGAGAGGAGCATCTGAAGTACTGGCTCT
ATTACATGCACCCAATTCTTCAAAGGCAGCAGCTAGATTATGGAGTGTATGT
CATCAACCAGGATGGAGACGAAGAATTTAACCGTGCTAAACTGCTGAATGT
AGGATTCACGGAAGCTTTGAAGGAGTATGACTATGACTGCTTTGTGTTTAGT
GATGTAGACCTGATCCCAATGGATGACAGGAACACCTACAAGTGCTACAGC
CAACCAAGGCACCTTTCTGTCTCCATGGATAAATTCGGATTTCGGTTACCCTA
CAATCAGTATTTTGGAGGTGTGTCTGCCTTGAGCAAAGAACAATTCACGAA
GATCAATGGGTTCCCAAACAATTACTGGGGCTGGGGAGGCGAAGATGATGA
CATCTACAACAGGCTGGTGTTCAAAGGCATGGGCATATCTCGGCCAGATGCT
GTCATTGGGAAATGCAGAATGATTCGCCACTCGCGTGATCGGAAGAACGAG
CCCAACCCGGAGAGGTTTGACCGTATTGCTCACACCAGGGAGACGATGAGC
TCTGATGGCTTGAACTCGCTCTCCTACGAGGTGCTAAGGACTGACAGGTTCC
CTCTGTACACGAGGATCACAGTGGATATCGGAGCGCCCGGCAGCTGA
SEQ HsGgGal(SEQ ID NO：9)：
MRLREPLLSGSAAMKEPALPGTSLQRACRLLVAFCALHLSATLLYYLAGSSLTP
PRSPEPPPRRPPPANLSLPPSRPPPPPAARPRPGPVSAQPRNLPDSAPSGLCPDPSP
LLVGPLRVEFSQPVNLEEVASTNPEVREGGRFAPKDCKALQKVAIIIPFRNREEH
LKYWLYYMHPILQRQQLDYGVYVINQDGDEEFNRAKLLNVGFTEALKEYDY
DCFVFSDVDLIPMDDRNTYKCYSQPRHLSVSMDKFGFRLPYNQYFGGVSALS
KEQFTKINGFPNNYWGWGGEDDDIYNRLVFKGMGISRPDAVIGKCRMIRHSRD
RKNEPNPERFDRIAHTRETMSSDGLNSLSYEVLRTDRFPLYTRITVDIGAPGS
SEQ sialGGal(SEQ ID NO：10)：
ATGATTCATACCAACTTGAAGAAAAAGTTCAGCCTCTTCATCCTGGTCTTTC
TCCTGTTCGCAGTCATCTGTGTTTGGAAGAAAGGGAGCGACTATGAGGCCC
TTACACTGCAAGCCAAGGAGTTCCAGATGCCCAAGAGCCAGGAGAAAGTG
GCCATGACGCCACCTAGAAGTCCTGAACCTCCACCTAGACGACCACCTCCA
GCTAACCTCTCTCTTCCACCATCTAGACCACCTCCTCCACCTGCTGCACGTC
CACGACCTGGACCTGTTTCAGCACAACCACGTAACCTCCCAGACTCTGCTC
CATCTGGACTTTGTCCTGACCCTTCTCCACTTCTCGTCGGACCACTTAGAGT
TGAGTTCTCTCAGCCTGTGAACCTCGAGGAGGTGGCGAGCACAAACCCTGA
GGTCAGGGAGGGAGGTCGTTTTGCTCCAAAGGACTGCAAGGCGCTGCAGA
AAGTAGCAATCATCATCCCGTTCCGAAACCGAGAGGAGCATCTGAAGTACT
GGCTCTATTACATGCACCCAATTCTTCAAAGGCAGCAGCTAGATTATGGAGT
GTATGTCATCAACCAGGATGGAGACGAAGAATTTAACCGTGCTAAACTGCTG
AATGTAGGATTCACGGAAGCTTTGAAGGAGTATGACTATGACTGCTTTGTGT
TTAGTGATGTAGACCTGATCCCAATGGATGACAGGAACACCTACAAGTGCTA
CAGCCAACCAAGGCACCTTTCTGTCTCCATGGATAAATTCGGATTTCGGTTA
CCCTACAATCAGTATTTTGGAGGTGTGTCTGCCTTGAGCAAAGAACAATTCA
CGAAGATCAATGGGTTTCCAAACAATTACTGGGGCTGGGGAGGCGAAGATG
ATGACATCTACAACAGGCTGGTGTTCAAAGGCATGGGCATATCTCGGCCAGA
TGCTGTCATTGGGAAATGCAGAATGATTCGCCACTCGCGTGATCGGAAGAA
CGAGCCCAACCCGGAGAGGTTTGACCGTATTGCTCACACCAGGGAGACGAT
GAGCTCTGATGGCTTGAACTCGCTCTCCTACGAGGTGCTAAGGACTGACAG
GTTCCCTCTGTACACGAGGATCACAGTGGATATCGGAGCGCCCGGCAGCTG
A
SEQ sialGGal(SEQ ID NO：11)：
MIHTNLKKKFSLFILVFLLFAVICVWKKGSDYEALTLQAKEFQMPKSQEKVAM
TPPRSPEPPPRRPPPANLSLPPSRPPPPPAARPRPGPVSAQPRNLPDSAPSGLCPDP
SPLLVGPLRVEFSQPVNLEEVASTNPEVREGGRFAPKDCKALQKVAIIIPFRNREE
HLKYWLYYMHPILQRQQLDYGVYVINQDGDEEFNRAKLLNVGFTEALKEYD
YDCFVFSDVDLIPMDDRNTYKCYSQPRHLSVSMDKFGFRLPYNQYFGGVSAL
SKEQFTKINGFPNNYWGWGGEDDDIYNRLVFKGMGISRPDAVIGKCRMIRHSR
DRKNEPNPERFDRIAHTRETMSSDGLNSLSYEVLRTDRFPLYTRITVDIGAPGS
SEQ RAP40(SEQ ID NO：12)：
GGCGCGCCAAGCTTGAATTAATTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCT
CAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAA
ACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTG
GAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCC
ATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCC
ACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCA
AGTGGATTGATGTGATAATTCCGCATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACC
TAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTAC
GACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACAC
TTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAA
TTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTG
CCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCC
TACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTG
CCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAA
AAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATC
TCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTT
CCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTTATTTTTAATTTTC
TTTCAAATACTTCCACCATGGGCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCCGGGTAC
CGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAG
ATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTA
CGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGG
TTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAA
ATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACT
AGATCGGGAATTCCAGATCTGCGGCCGCTTAATTAA
SEQ Dgal(SEQ ID NO：13)：
TCTAGAAGACAACATGCCGGACTCCACCGGGAACTTCAGCCTCCTGCAGCG
GACCTGCTCTCTGGTGGTGCTGCTGTGCTTCTTACACATCTTTGTCACCGTCA
TTTACTACATGAGGAACTCGGACTCTCGGCCAGCCTTCGCCCAGAACCAGC
AGCAGAGACCGACGATACACAGGAAACTGGCGGAGCAGAGGGGCACCACT
GAGGACAGCAGACCCGCGGCCAACGCCTCGAGCAACGGCCAGGAGCTGCA
GATCTGCCCAGAGGAGCCGCCGCGCCTGGTGGGTCCTCTGCGTGTGGAGTT
CTCAGACCCGATCACGTTAGAAATGGTGCGGACAGAGAACAGTGTTCTGCA
AGAGGGCGGACGCTTCAGACCCCCAGACTGCATAGCTCGGCAGAAGGTGG
CCATGATCATCCCCTTCCGGAACCGAGACGAGCACCTGAAGTTCTGGCTCTA
TTACCTGCACCCCATCCTGCAGCGCCAACAGCTCGACTACGGCGTCTACGTC
ATCAACCAGGATGGCGAGGACACGTTTAATCGAGCTAAACTCCTGAACATC
GGCTATGCGGAGGCGCTGAAGGAGTACGATTACGACTGTTTTGTGTTCAGC
GACGTGGACCTGATCCCGATGGATGACCGCAACATCTACAAGTGCTACAATC
AGCCCAGACACCTGGCCGTCTCCATGGACAAGTTCGGCTTCAGGCTGCCGT
ACACACAGTATTTCGGTGGCGTTTCGTCGCTCAGCAAAGAGCAGTTCCTGA
AGATCAACGGATTCCCCAACAACTACTGGGGCTGGGGCGGAGAGGACGAC
GACATCTTCAACAGGATCTCCTCCAGAGGGATGTCGATATCTAGGCCTGACG
GACTCCTGGGTCGCTGTAGGATGATCCGGCATGAGAGAGACAAGCAGAACG
ACCCAAACCCTCAAAGATTTGACCGAATCGCGCACACAAGGGAAACCATGG
CAACTGATGGGATCAATTCGCTAAAATATAACGTGGTAAAAATCGAGAAAGA
CCTGCTCTTCACCAAAATCACAGTGGACGTGGGCAAACCCTGA
SEQ Dgal(SEQ ID NO：14)：
MPDSTGNFSLLQRTCSLVVLLCFLHIFVTVIYYMRNSDSRPAFAQNQQQRPTIH
RKLAEQRGTTEDSRPAANASSNGQELQICPEEPPRLVGPLRVEFSDPITLEMVRT
ENSVLQEGGRFRPPDCIARQKVAMIIPFRNRDEHLKFWLYYLHPILQRQQLDYG
VYVINQDGEDTFNRAKLLNIGYAEALKEYDYDCFVF SDVDLIPMDDRNIYKCY
NQPRHLAVSMDKFGFRLPYTQYFGGVSSLSKEQFLKINGFPNNYWGWGGEDD
DIFNRISSRGMSISRPDGLLGRCRMIRHERDKQNDPNPQRFDRIAHTRETMATD
GINSLKYNVVKIEKDLLFTKITVDVGKP
SEQ HsDGal(SEQ ID NO：15)：
TCTAGAAGACAACATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCTGAGCGGCAGCGCCGC
GATGCCGGACTCCACCGGGAACTTCAGCCTCCTGCAGCGGACCTGCTCTCT
GGTGGTGCTGCTGTGCTTCTTACACATCTTTGTCACCGTCATTTACTACATGA
GGAACTCGGACTCTCGGCCAGCCTTCGCCCAGAACCAGCAGCAGAGACCG
ACGATACACAGGAAACTGGCGGAGCAGAGGGGCACCACTGAGGACAGCAG
ACCCGCGGCCAACGCCTCGAGCAACGGCCAGGAGCTGCAGATCTGCCCAG
AGGAGCCGCCGCGCCTGGTGGGTCCTCTGCGTGTGGAGTTCTCAGACCCGA
TCACGTTAGAAATGGTGCGGACAGAGAACAGTGTTCTGCAAGAGGGCGGA
CGCTTCAGACCCCCAGACTGCATAGCTCGGCAGAAGGTGGCCATGATCATC
CCCTTCCGGAACCGAGACGAGCACCTGAAGTTCTGGCTCTATTACCTGCAC
CCCATCCTGCAGCGCCAACAGCTCGACTACGGCGTCTACGTCATCAACCAG
GATGGCGAGGACACGTTTAATCGAGCTAAACTCCTGAACATCGGCTATGCGG
AGGCGCTGAAGGAGTACGATTACGACTGTTTTGTGTTCAGCGACGTGGACC
TGATCCCGATGGATGACCGCAACATCTACAAGTGCTACAATCAGCCCAGACA
CCTGGCCGTCTCCATGGACAAGTTCGGCTTCAGGCTGCCGTACACACAGTAT
TTCGGTGGCGTTTCGTCGCTCAGCAAAGAGCAGTTCCTGAAGATCAACGGA
TTCCCCAACAACTACTGGGGCTGGGGCGGAGAGGACGACGACATCTTCAAC
AGGATCTCCTCCAGAGGGATGTCGATATCTAGGCCTGACGGACTCCTGGGTC
GCTGTAGGATGATCCGGCATGAGAGAGACAAGCAGAACGACCCAAACCCTC
AAAGATTTGACCGAATCGCGCACACAAGGGAAACCATGGCAACTGATGGGA
TCAATTCGCTAAAATATAACGTGGTAAAAATCGAGAAAGACCTGCTCTTCAC
CAAAATCACAGTGGACGTGGGCAAACCCTGA
SEQ HsDGal(SEQ ID NO：16)：
MRLREPLLSGSAAMPDSTGNFSLLQRTCSLVVLLCFLHIFVTVIYYMRNSDSRP
AFAQNQQQRPTIHRKLAEQRGTTEDSRPAANASSNGQELQICPEEPPRLVGPLR
VEFSDPITLEMVRTENSVLQEGGRFRPPDCIARQKVAMIIPFRNRDEHLKFWLY
YLHPILQRQQLDYGVYVINQDGEDTFNRAKLLNIGYAEALKEYDYDCFVFSDV
DLIPMDDRNIYKCYNQPRHLAVSMDKFGFRLPYTQYFGGVSSLSKEQFLKING
FPNNYWGWGGEDDDIFNRISSRGMSISRPDGLLGRCRMIRHERDKQNDPNPQR
FDRIAHTRETMATDGINSLKYNVVKIEKDLLFTKITVDVGKP
SEQ sialDGal(SEQ ID NO：17)：
ATGATTCATACCAACTTGAAGAAAAAGTTCAGCCTCTTCATCCTGGTCTTTC
TCCTGTTCGCAGTCATCTGTGTTTGGAAGAAAGGGAGCGACTATGAGGCCC
TTACACTGCAAGCCAAGGAGTTCCAGATGCCCAAGAGCCAGGAGAAAGTG
GCCATGCACAGGAAACTGGCGGAGCAGAGGGGCACCACTGAGGACAGCAG
ACCCGCGGCCAACGCCTCGAGCAACGGCCAGGAGCTGCAGATCTGCCCAG
AGGAGCCGCCGCGCCTGGTGGGTCCTCTGCGTGTGGAGTTCTCAGACCCGA
TCACGTTAGAAATGGTGCGGACAGAGAACAGTGTTCTGCAAGAGGGCGGA
CGCTTCAGACCCCCAGACTGCATAGCTCGGCAGAAGGTGGCCATGATCATC
CCCTTCCGGAACCGAGACGAGCACCTGAAGTTCTGGCTCTATTACCTGCAC
CCCATCCTGCAGCGCCAACAGCTCGACTACGGCGTCTACGTCATCAACCAG
GATGGCGAGGACACGTTTAATCGAGCTAAACTCCTGAACATCGGCTATGCGG
AGGCGCTGAAGGAGTACGATTACGACTGTTTTGTGTTCAGCGACGTGGACC
TGATCCCGATGGATGACCGCAACATCTACAAGTGCTACAATCAGCCCAGACA
CCTGGCCGTCTCCATGGACAAGTTCGGCTTCAGGCTGCCGTACACACAGTAT
TTCGGTGGCGTTTCGTCGCTCAGCAAAGAGCAGTTCCTGAAGATCAACGGA
TTCCCCAACAACTACTGGGGCTGGGGCGGAGAGGACGACGACATCTTCAAC
AGGATCTCCTCCAGAGGGATGTCGATATCTAGGCCTGACGGACTCCTGGGTC
GCTGTAGGATGATCCGGCATGAGAGAGACAAGCAGAACGACCCAAACCCTC
AAAGATTTGACCGAATCGCGCACACAAGGGAAACCATGGCAACTGATGGGA
TCAATTCGCTAAAATATAACGTGGTAAAAATCGAGAAAGACCTGCTCTTCAC
CAAAATCACAGTGGACGTGGGCAAACCCTGA
SEQ sialDGal(SEQ ID NO：18)：
MIHTNLKKKFSLFILVFLLFAVICVWKKGSDYEALTLQAKEFQMPKSQEKVAM
HRKLAEQRGTTEDSRPAANASSNGQELQICPEEPPRLVGPLRVEFSDPITLEMVR
TENSVLQEGGRFRPPDCIARQKVAMIIPFRNRDEHLKFWLYYLHPILQRQQLDY
GVYVINQDGEDTFNRAKLLNIGYAEALKEYDYDCFVFSDVDLIPMDDRNIYKC
YNQPRHLAVSMDKFGFRLPYTQYFGGVSSLSKEQFLKINGFPNNYWGWGGED
DDIFNRISSRGMSISRPDGLLGRCRMIRHERDKQNDPNPQRFDRIAHTRETMAT
DGINSLKYNVVKIEKDLLFTKITVDVGKP
SEQ CTS sialT(SEQ ID NO：19)：
ATGATTCATACCAACTTGAAGAAAAAGTTCAGCCTCTTCATCCTGGTCTTTC
TCCTGTTCGCAGTCATCTGTGTTTGGAAGAAAGGGAGCGACTATGAGGCCC
TTACACTGCAAGCCAAGGAATTCCAGATGCCCAAGAGCCAGGAGAAAGTG
GCCATG
SEQ CTS sialT(SEQ ID NO：20)：
MIHTNLKKKFSLFILVFLLFAVICVWKKGSDYEALTLQAKEFQMPKSQEKVAM
N-末端的13个氨基酸残基，人β-1，4-半乳糖转移酶1(SEQ ID NO：21)
MRLREPLLSGSAA
Claims (15)
1.一种产生能将半乳糖残基以β1,4-键加至N-连接的聚糖上的转基因烟草或转基因烟草细胞的方法，该方法包含：
(a)将编码鸡β1,4-半乳糖转移酶1的核酸分子插入烟草或烟草细胞中；并且
(b)选择摄入(a)中所述核酸分子并表达所述核酸分子的转基因烟草或转基因烟草细胞，
从而产生出能将半乳糖残基以β1,4-键加至N-连接的聚糖上的转基因烟草或转基因烟草细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中鸡β1,4-半乳糖转移酶1的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其中鸡β1,4-半乳糖转移酶1在其N-末端带有哺乳动物β1,4-半乳糖转移酶1的N末端片段延伸，且其中哺乳动物β1,4-半乳糖转移酶1的N末端片段如SEQ ID NO:21：MRLREPLLSGSAA所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其中鸡β1,4-半乳糖转移酶1中的胞浆-跨膜-茎区CTS由来源于哺乳动物唾液酸转移酶的CTS取代，且其中鸡β1,4-半乳糖转移酶1如SEQ ID NO:11所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述转基因烟草或转基因烟草细胞产生包含杂合类型的N-连接的聚糖的糖蛋白，所述N-连接的聚糖不含β1,2-木糖残基和α1,3-岩藻糖残基。
6.根据权利要求5所述的方法，其中产生的不含β1,2-木糖和α1,3-岩藻糖残基的杂合类型的N-连接的聚糖的量是表达野生型人β1,4-半乳糖转移酶的植物细胞或植物产生的量的至少两倍。
7.一种产生包含一种或多种杂合类型的半乳糖基化N-连接的聚糖的异源糖蛋白的方法，该方法包含：
(a)将编码鸡β1,4-半乳糖转移酶1的第一核酸分子和编码异源糖蛋白的第二核酸分子插入烟草或烟草细胞中，从而产生转基因烟草或转基因烟草细胞；并且
(b)在适合所述的第一和第二核酸分子表达的条件下维持所述的转基因烟草或转基因烟草细胞，从而产生出包含一种或多种杂合类型的半乳糖基化的N-连接的聚糖的异源糖蛋白。
8.根据权利要求7的方法，其中所述方法进一步包含从转基因烟草或转基因烟草细胞中分离异源糖蛋白。
9.根据权利要求7所述的方法，其中异源糖蛋白选自抗体、疫苗抗原、细胞因子、激素、酶、细胞粘附分子和胶原。
10.根据权利要求7所述的方法，其中鸡β1,4-半乳糖转移酶1在其N-末端带有哺乳动物β1,4-半乳糖转移酶1的N末端片段延伸，且其中哺乳动物β1,4-半乳糖转移酶1的N末端片段如SEQ ID NO:21：MRLREPLLSGSAA所示，且其中鸡β1,4-半乳糖转移酶1如SEQ ID NO:2所示。
11.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述糖蛋白的N-聚糖不含β1,2木糖和α1,3-岩藻糖残基。
12.一种编码多肽的核酸，所述的多肽由以下组成：
(a)鸡β1,4-半乳糖转移酶1的氨基酸序列，和
(b)其N-末端延伸，其中该延伸是哺乳动物β1,4-半乳糖转移酶1的N末端片段，且其中该哺乳动物β1,4-半乳糖转移酶1的N末端片段如SEQ ID NO:21：MRLREPLLSGSAA所示，且其中鸡β1,4-半乳糖转移酶1如SEQ ID NO:2所示。
13.根据权利要求12的核酸，其中该核酸编码SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
14.编码如SEQ ID NO：11所示的鸡β1,4-半乳糖转移酶1的核酸。
15.根据权利要求14的核酸，其中核酸如SEQ ID NO：10所示。
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