JP6523748B2 - 糖タンパク質の製造方法および糖タンパク質 - Google Patents
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Description
本発明は、糖タンパク質の製造方法および該製造方法によって得られた糖タンパク質に関する。より具体的には、本発明は、非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つタンパク質の製造方法および該製造方法によって得られたタンパク質に関する。
生体内において発現されるタンパク質は、多くの場合、数本〜数十本の比較的短い糖鎖が付加された糖タンパク質の形態にあり、これら糖タンパク質の多くは、糖鎖を付加されていることによって、それらに特異的な性質を発揮することが知られている。近年、糖タンパク質の糖鎖成分が癌の転移や免疫等において重要な役割を担うことが明らかとなり、その潜在的な有用性に着目した研究に関心が集まっている。例えば、癌に特有な糖鎖を有する糖タンパク質を用いて、強い抗体依存性細胞傷害(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity)活性を単独で示す抗体医薬をスクリーニングできれば、化学療法に対する依存性が低くなり、副作用の少ない新たな癌治療法を提供できると考えられている。
糖鎖研究の発展のためには、所望の糖鎖が付加された糖タンパク質の量産が必須である。近年、哺乳動物型糖鎖を有する糖タンパク質量産のために、昆虫系を用いることについての研究が進められている。しかし、昆虫において、発現したタンパク質に付加される糖鎖は、多くの場合、マンノースコア型のN-結合型糖鎖である。このマンノースコア型のN-結合型糖鎖は、還元末端に存在するジアセチルキトビオース部位にβ1,4結合したマンノースの3位および6位の各々に、別の２つのマンノースがそれぞれβ1,3結合およびβ1,6結合した構造を有する。昆虫においては、糖鎖の形成過程において、マンノースコア型糖鎖の非還元末端にN-アセチルグルコサミンが結合した糖鎖も形成され得るが、これは最終的にはN-アセチルグルコサミニダーゼの作用によりN-アセチルグルコサミンを失い、マンノースコア型の糖鎖となる。
一方、ヒト等の哺乳動物の血清タンパク質において見られる糖鎖は、主に複合型のN-結合型糖鎖である。これは、マンノースコア型糖鎖の非還元末端にN-アセチルグルコサミンが結合した糖鎖、それにガラクトースが結合した糖鎖、更にそれにシアル酸が結合した糖鎖等である。したがって、哺乳動物型糖鎖を有する糖タンパク質を昆虫系で製造する場合、昆虫にガラクトース転移酵素、シアル酸転移酵素等を導入する必要がある。
非特許文献１および２には、昆虫培養細胞にガラクトース転移酵素を導入することによって、昆虫において哺乳動物型の糖鎖を有する糖タンパク質を産生することが記載されている。これらの文献には、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)由来の昆虫培養細胞Tn5においてGnT II及びGalTを発現させることによって、非還元末端にガラクトースを有するN-結合型糖鎖を持つタンパク質が得られることが記載されている。
Tomiya N. Trends in Glycoscience and Glycotechnology Vol. 21 No. 118 (2009) pp. 71-86
Tomiya N.ら Glycobiology, vol.13 ,no.1 pp. 23-34, 2003
しかしながら、非特許文献１および２において用いられる昆虫培養細胞でタンパク質を量産するためには、大規模な設備が必要である。タンパク質製造に昆虫生体を用いる場合には、このような大規模な設備は必要なく、また、昆虫培養細胞よりも優れたタンパク質発現量を望み得る。
そこで、本発明は、昆虫生体を用いる、哺乳動物型糖鎖を有する糖タンパク質の新たな製造方法を提供することを課題とする。
そこで、本発明は、昆虫生体を用いる、哺乳動物型糖鎖を有する糖タンパク質の新たな製造方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子が導入された昆虫生体に特定の物質を投与することによって糖タンパク質の産生量が増大されることを意外にも見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明によれば、鱗翅目昆虫生体に、ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子と所望のタンパク質をコードする遺伝子とを導入する工程と、導入工程で得られた昆虫生体に、デオキシガラクトノジリマイシン、メチルβ-ガラクトピラノシドおよびラクトースからなる群より選択される１種類以上の物質を投与して、非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つ所望のタンパク質を取得する工程とを含む糖タンパク質の製造方法が提供される。
本発明による糖タンパク質の製造方法(以下、単に「製造方法」ともいう)では、鱗翅目昆虫生体に、ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子と所望のタンパク質をコードする遺伝子とを導入する。
鱗翅目昆虫は、組換えタンパク質の発現に適する公知の鱗翅目(Lepidoptera)昆虫であれば特に限定されない。例えば、カイコガ科(Bombycidae)、ヤガ科(Noctuidae)、ヒトリガ科(Arctiidae)およびヤママユガ科(Saturniidae)からなる群より選択される鱗翅目昆虫等が挙げられる。より具体的な生物種としては、カイコ(Bombyx mori)、クワゴマダラヒトリ(Spilosoma imparilis)、サクサン(Antheraea pernyi)、スポドプテラ フルギペルーダ(Spodoptera frugiperda)、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)等が挙げられる。それらの中でもカイコが特に好ましい。
鱗翅目昆虫は、組換えタンパク質の発現に適する公知の鱗翅目(Lepidoptera)昆虫であれば特に限定されない。例えば、カイコガ科(Bombycidae)、ヤガ科(Noctuidae)、ヒトリガ科(Arctiidae)およびヤママユガ科(Saturniidae)からなる群より選択される鱗翅目昆虫等が挙げられる。より具体的な生物種としては、カイコ(Bombyx mori)、クワゴマダラヒトリ(Spilosoma imparilis)、サクサン(Antheraea pernyi)、スポドプテラ フルギペルーダ(Spodoptera frugiperda)、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)等が挙げられる。それらの中でもカイコが特に好ましい。
昆虫生体は、成虫、蛹および幼虫のいずれの形態であってよい。好ましくは、蛹または幼虫であり得る。
ガラクトース転移酵素は、糖供与体から糖鎖にガラクトースを転移できる酵素であれば特に限定されない。好ましくはβ-1,4-ガラクトース転移酵素、より好ましくはβ-1,4-ガラクトース転移酵素I (GalT I)、β-1,4-ガラクトース転移酵素II (GalT II)、β-1,4-ガラクトース転移酵素III(GalT III)、β-1,4-ガラクトース転移酵素IV (GalT IV)等であり得る。ガラクトース転移酵素の由来は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物由来である。本実施形態においては、ハツカネズミ(Mus musculus)由来のGalT III（mGalT3）が用いられ得る。
ガラクトース転移酵素は、他の糖鎖修飾酵素と同時に発現させてもよい。このような糖鎖修飾酵素としては、糖供与体から糖鎖に所望の糖を転移できる酵素であれば特に限定されない。例えば、N-アセチルグルコサミンを転移できるN-アセチルグルコサミン転移酵素IまたはN-アセチルグルコサミン転移酵素II、フコースを転移できるα1,6フコース転移酵素等が挙げられる。
本実施形態においては、N-アセチルグルコサミン転移酵素III、IV、VおよびVIからなる群より選択される少なくとも１つの転移酵素の機能により、バイセクティング糖鎖、３〜５本鎖分岐の非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つタンパク質を製造することも可能である。
ガラクトースを付加することが意図される所望のタンパク質は、糖鎖が付加され得るタンパク質であれば特に限定されない。本実施形態においては、アルカリホスファターゼ(ALP)またはインターロイキン18結合タンパク質(IL18BP)等が用いられ得る。
鱗翅目昆虫生体へのガラクトース転移酵素をコードする遺伝子および所望のタンパク質をコードする遺伝子の導入は、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。このような方法としては、例えばウイルス、プラスミド、コスミド、フォスミド等のベクターを用いる方法が挙げられる。なかでも、ウイルスベクターを用いることが好ましく、バキュロウイルスベクターを用いることが特に好ましい。具体的なバキュロウイルスとしては、BmNPV、AcNPV、HycuNPV、AnpeNPV等が挙げられる。本実施形態においては、バキュロウイルスベクターを用いて、上記の遺伝子が鱗翅目昆虫生体に導入され得る。ベクターは、導入された遺伝子が一過性に発現されるように導入してもよいし、トランスジェニック技術等によって持続的に発現されるように導入してもよい。
本発明の製造方法においては、上記のようにして得られた昆虫生体に特定の物質を投与することにより、上記の昆虫生体から、非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つ所望のタンパク質を取得する。
昆虫生体に投与される上記特定の物質は、デオキシガラクトノジリマイシン、メチルβ-ガラクトピラノシドおよびラクトースからなる群より選択される１種類以上の物質、それらの異性体、またはそれらの塩である。好ましくは、デオキシガラクトノジリマイシンが投与され得る。
デオキシガラクトノジリマイシンは、CAS番号75172-81-5の下公知の化合物である。この化合物は、1-デオキシガラクトノジリマイシン等とも称され得る。デオキシガラクトノジリマイシンは、当業者に公知の方法によって製造することができる。デオキシガラクトノジリマイシンは、商業的に入手することもできる。例えば、Toronto Research Chemicals社製等が挙げられる。
メチルβ-ガラクトピラノシドは、CAS番号1824-94-8の下公知の化合物である。この化合物は、メチル-β-D-ガラクトピラノシド、1-O-メチル-β-D-ガラクトピラノシド等とも称され得る。メチルβ-ガラクトピラノシドは、当業者に公知の方法によって製造することができる。メチルβ-ガラクトピラノシドは、商業的に入手することもできる。例えば、東京化成工業社製等が挙げられる。
ラクトースは、当業者に公知の方法によって製造することができる。ラクトースは、商業的に入手することもできる。例えば、和光純薬工業社製等が挙げられる。
上記の特定の物質は、溶液として投与されてもよいし、固体として投与されてもよい。好ましくは、溶液として投与され得る。上記の特定の物質を溶液として投与する場合、溶媒としては、水および炭素数１〜４の低級アルコール等が挙げられる。
上記特定の物質の１回あたりの投与量は、所望の糖タンパク質産生が可能である限り特に限定されない。好ましくは、１回あたり0.10 mg以上が投与され得る。
上記特定の物質の投与経路は、所望の糖タンパク質産生が可能である限り特に限定されない。例えば、注入、経口、塗布等によって投与することができる。
上記特定の物質の投与期間および投与間隔は、所望の糖タンパク質産生が可能である限り特に限定されない。本実施形態では、６日間の間、２、５および／または６日目等に投与され得る。
上記特定の物質として２以上の物質が選択される場合、それらは混合されてもよいし、混合されずに同時もしくは別々に投与されてもよいし、または任意の順序で逐次的に投与されてもよい。
上記特定の物質の投与経路は、所望の糖タンパク質産生が可能である限り特に限定されない。例えば、注入、経口、塗布等によって投与することができる。
上記特定の物質の投与期間および投与間隔は、所望の糖タンパク質産生が可能である限り特に限定されない。本実施形態では、６日間の間、２、５および／または６日目等に投与され得る。
上記特定の物質として２以上の物質が選択される場合、それらは混合されてもよいし、混合されずに同時もしくは別々に投与されてもよいし、または任意の順序で逐次的に投与されてもよい。
昆虫生体において発現された所望のタンパク質には、糖鎖が形成され得る。この糖鎖は、昆虫生体に本来的に備わる翻訳後修飾などの機構によって形成され得る。あるいは、昆虫生体に本来的に備わる翻訳後修飾などの機構によって形成された糖鎖に対して、昆虫生体に導入された遺伝子によって発現された酵素の作用によって更なる糖が付加されること、または、このような糖鎖から何らかの糖が除去されること等によっても形成され得る。このようにして形成された糖鎖は、ガラクトースが付加される前の所望のタンパク質に形成された糖鎖の状態に相当し得る。
一般に、糖鎖は、O-結合型糖鎖とN-結合型糖鎖とに大別される。O-結合型糖鎖とは、タンパク質またはポリペプチドのセリンまたはスレオニン残基のヒドロキシ基にO-グリコシド結合する糖鎖をいう。具体的には、以下の式（１２）〜（１６）：
のいずれか１つで表される糖鎖構造を含む糖鎖等が挙げられるが、これらに限定されない。還元末端側のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)には、GlcNAcが結合していてもよい。なお、還元末端側とは、タンパク質またはポリペプチドのセリンまたはスレオニン残基に結合するGalNAcの側をいう。上記の式（１２）〜（１６）においては、右側が還元末端側に相当する。一方、上記のセリンまたはスレオニン残基に結合するGalNAcの側とは反対側(上記の式（１２）〜（１６）においては左側)を非還元末端という。以下、同様の式で糖鎖構造を表す場合、右側を還元末端側、左側を非還元末端側として表記する。また、上記の式には、糖の結合態様も示されている。例えば、２つの糖の間に「β1-3」と記されている場合、それらの糖は、それぞれ左側の糖の1位および右側の糖の3位において、β1,3結合していることを示す。上記の式中、Galはガラクトース、GlcNAcはN-アセチルグルコサミンを表す。
N-結合型糖鎖とは、タンパク質またはポリペプチドのアスパラギン残基のアミノ基にN-グリコシド結合する糖鎖をいう。N-結合型糖鎖は、一般に、少マンノース型、ハイマンノース型、混成型および複合型に大別される。
本実施形態において、少マンノース型糖鎖とは、(i) N-結合型糖鎖の還元末端に存在するジアセチルキトビオース部分の非還元末端側のN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)にマンノースがβ1,4結合している糖鎖および(ii)上記の(i)の糖鎖の非還元末端側のマンノースに１つまたは２つのマンノースがβ1,3結合および/またはβ1,6結合している糖鎖をいう。具体的には、以下の式（４）〜（７）：
のいずれか１つで表される糖鎖構造からなる糖鎖であり得る。これらの式においても、右側が還元末端側、左側が非還元末端側として表される。上記の式中、Manはマンノースを表す。本明細書においては、式（４）で表される糖鎖構造からなる糖鎖を、マンノースコア型糖鎖ともいう。
本実施形態において、ハイマンノース型糖鎖とは、式（４）の糖鎖構造の非還元末端側のマンノースに、マンノース以外の糖が結合することなく、１以上のマンノースが更に結合している糖鎖をいう。例えば、以下の式（８）：
で表される糖鎖構造の非還元末端側のマンノースに、マンノース以外の糖が結合することなく、１以上のマンノースが更に結合している糖鎖等が挙げられる。より具体的な例としては、以下の式（９）：
で表される糖鎖構造を含む糖鎖等が挙げられる。
本実施形態において、混成型糖鎖とは、以下の式（４）：
の糖鎖構造の非還元末端側の一方のマンノースに、マンノース以外の糖が結合し、もう一方のマンノースには、マンノース以外の糖が結合することなく、１以上のマンノースが更に結合している糖鎖をいう。例えば、以下の式（１０）：
で表される糖鎖構造（式中、Xは、マンノース以外の１以上の糖を表し、複数存在してもよい）を有する糖鎖等が挙げられる。より具体的な例としては、以下の式（１１）：
で表される糖鎖構造を含む糖鎖等が挙げられる。
混成型糖鎖は、そのジアセチルキトビオース部分の還元末端側のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合、特にα1,6結合した糖鎖であってもよい。また、混成型糖鎖は、ジアセチルキトビオース部分にβ1,4結合しているマンノースに更に１以上のN-アセチルグルコサミンが結合、特にβ1,4結合した糖鎖(いわゆるバイセクティング糖鎖)であってもよい。
本実施形態において、複合型糖鎖とは、
(i) 以下の式（１）または（２）：
で表される糖鎖構造を含むが、但し、N-アセチルグルコサミンが結合していない非還元末端側のマンノースには、マンノースが結合することはない糖鎖構造を含む糖鎖、および
(ii)式（３）：
の糖鎖構造を含む糖鎖をいう。式（３）の糖鎖構造には、例えば以下の式（１７）〜（２０）：
で表される糖鎖構造を含む糖鎖等も包含され得る。式（１７）〜（１９）の糖鎖構造は、それぞれ、いわゆる３本鎖分岐型(Triantennary)、４本鎖分岐型(Tetraantennary)および５本鎖分岐型(Pentaantennary)である。また、式（２０）の糖鎖構造は、いわゆるバイセクティング糖鎖である。
(i) 以下の式（１）または（２）：
(ii)式（３）：
複合型糖鎖は、そのジアセチルキトビオース部分の還元末端側のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合、特にα1,6結合した糖鎖であってもよい。また、複合型糖鎖は、ジアセチルキトビオース部分にβ1,4結合しているマンノースに更に１以上のN-アセチルグルコサミンが結合、特にβ1,4結合した糖鎖(いわゆるバイセクティング糖鎖)であってもよい。
ガラクトースが付加される前の糖鎖は、特に限定されず、O-結合型糖鎖およびN-結合型糖鎖のいずれであってもよい。好ましくは、ガラクトースが付加される前の糖鎖は、非還元末端にガラクトースが付加され得る糖、例えば非還元末端にN-アセチルグルコサミンおよびN-アセチルガラクトサミンから選択される少なくとも１つの糖を有する糖鎖であり得る。より好ましくは、ガラクトースが付加される前の糖鎖は、非還元末端にN-アセチルグルコサミンを有するN-結合型糖鎖であり得る。更に好ましくは、ガラクトースが付加される前の糖鎖は、下記の式（１）〜（３）：
の糖鎖構造を含む糖鎖であり得、特に好ましくは式（１）〜（３）の糖鎖構造からなる複合型糖鎖またはそれらの還元末端にあるGlcNAcにフコースが結合、好ましくはα1,6結合した複合型糖鎖であり得る。
非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つタンパク質は、昆虫生体に導入されたガラクトース転移酵素の作用によって、上記のガラクトースが付加される前のタンパク質の糖鎖の非還元末端にガラクトースが付加されることによって得られる。
非還元末端にある糖へのガラクトースの結合態様は特に限定されない。例えば、非還元末端にあるN-アセチルガラクトサミンまたはN-アセチルグルコサミン等にガラクトースが結合する態様、得られる糖鎖が混成型糖鎖である場合には非還元末端にあるマンノースにガラクトースが結合する態様等が挙げられる。非還元末端にあるN-アセチルグルコサミンに、ガラクトースがβ1,4結合する態様が特に好ましい。
なお、ガラクトースが付加される前の糖鎖の非還元末端にあるガラクトースに、ガラクトースが更に結合する態様もあり得る。このような結合態様の例としては、糖鎖の非還元末端において任意の糖にβ1,4結合しているガラクトースに、別のガラクトースがα1,3-結合する態様等が挙げられる。
なお、ガラクトースが付加される前の糖鎖の非還元末端にあるガラクトースに、ガラクトースが更に結合する態様もあり得る。このような結合態様の例としては、糖鎖の非還元末端において任意の糖にβ1,4結合しているガラクトースに、別のガラクトースがα1,3-結合する態様等が挙げられる。
上記のようにして得られる非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つタンパク質は、上記で挙げられたガラクトースが付加される前の糖鎖の非還元末端にある糖、好ましくはN-アセチルグルコサミンまたはN-アセチルガラクトサミンに、ガラクトースが結合した糖鎖であり得る。より好ましくは、非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つタンパク質は、ガラクトースが付加される前の糖鎖の非還元末端にあるN-アセチルグルコサミンに、ガラクトースがβ1,4結合したN-結合型糖鎖であり得る。更に好ましくは、ガラクトースが付加される前の糖鎖は、下記の式（１）〜（３）：
の糖鎖構造を含む糖鎖の非還元末端にあるN-アセチルグルコサミンに、ガラクトースがβ1,4結合したN-結合型糖鎖であり得、特に好ましくは、式（１）〜（３）の糖鎖構造からなる複合型糖鎖またはそれらの還元末端にあるGlcNAcにフコースが結合、好ましくはα1,6結合した複合型糖鎖であり得る。
本実施形態においては、非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つタンパク質として、例えば、以下の式（２１）〜（２５）：
で表される糖鎖構造を含む糖鎖を持つタンパク質を取得することができる。
非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つタンパク質は、そのジアセチルキトビオース部分の還元末端側のN-アセチルグルコサミンにフコースが結合、特にα1,6結合した糖鎖であってもよい。また、非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つタンパク質は、ジアセチルキトビオース部分にβ1,4結合しているマンノースに更に１以上のN-アセチルグルコサミンが結合、特にβ1,4結合した糖鎖(いわゆるバイセクティング糖鎖)であってもよい。
昆虫生体からの所望の糖タンパク質の取得は、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。例えば、当業者に公知の方法を用いて、昆虫生体を磨砕し、超遠心分離を行うこと等によって目的タンパク質を回収することができる。このようにして得られた糖タンパク質は、当業者に公知の方法、例えばクロマトグラフィ等を用いて、更に精製してもよい。
本発明の範囲内には、上記のようにして得られた所望の糖タンパク質自体も包含され得る。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
参考例１：組換えウイルスの作製
（１）遺伝子の取得及びトランスファーベクターへの導入
mGalT3(Mus musculus UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4-galactosyltransferase,polypeptide 3) (アクセッション番号NM_020579)のクローニングは、鋳型としてのゲノムDNAと、表１に示されるプライマーセットとを用いるPCRによって得られた増幅産物を、トランスファーベクター（シスメックス社製pV01）中の表２に記載される制限酵素サイトに導入することによって行った。
（１）遺伝子の取得及びトランスファーベクターへの導入
mGalT3(Mus musculus UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4-galactosyltransferase,polypeptide 3) (アクセッション番号NM_020579)のクローニングは、鋳型としてのゲノムDNAと、表１に示されるプライマーセットとを用いるPCRによって得られた増幅産物を、トランスファーベクター（シスメックス社製pV01）中の表２に記載される制限酵素サイトに導入することによって行った。
N-結合型糖鎖の非還元末端にガラクトースを付加することが意図されるタンパク質として、hIL18BPを用いた。
hIL18BP (Homo sapiens interleukin 18 binding protein；アクセッション番号NM_001039659)をコードする遺伝子のクローニングは、鋳型としてのゲノムDNAと、表１に示されるプライマーセットを用いるPCRによって得られた増幅産物を、トランスファーベクター（シスメックス社製pM01/cStrep）中の表２に記載される制限酵素サイトに導入することによって行った。
ALP遺伝子については、配列番号７によって表される核酸を合成し(GenScript社)、表１に示されるプライマーセットを用いるPCRによって得られた増幅産物を、トランスファーベクター（シスメックス社製pM31）中の表２に記載される制限酵素サイトに導入することによって行った。
hIL18BP (Homo sapiens interleukin 18 binding protein；アクセッション番号NM_001039659)をコードする遺伝子のクローニングは、鋳型としてのゲノムDNAと、表１に示されるプライマーセットを用いるPCRによって得られた増幅産物を、トランスファーベクター（シスメックス社製pM01/cStrep）中の表２に記載される制限酵素サイトに導入することによって行った。
ALP遺伝子については、配列番号７によって表される核酸を合成し(GenScript社)、表１に示されるプライマーセットを用いるPCRによって得られた増幅産物を、トランスファーベクター（シスメックス社製pM31）中の表２に記載される制限酵素サイトに導入することによって行った。
（２）組換えウイルスの作製
リポフェクション試薬(X-tremeGENE HP DNA トランスフェクション試薬：ロシュ製)を用いて、上記で得られた３つのプラスミドのいずれか１つ(0.5 μg)および線状バキュロウイルスABvNPVのDNA (0.2 μg)をBmN細胞(Maeda et al, InverterbrateCell system and Applications, Vol.1, p.167-181,CRC Press, Boca Raton(1989))にコ・トランスフェクションした。96穴プレートを用いる限界希釈法によって組換えウイルスを選抜し、培養上清を回収した。このようにして得られたmGalT3、hIL18BPおよびALPを発現する組換えウイルスは、それぞれmGalT3_NPV、cStrep-hIL18BP_NPVおよびcDock-ALP_NPVと名付けた。
リポフェクション試薬(X-tremeGENE HP DNA トランスフェクション試薬：ロシュ製)を用いて、上記で得られた３つのプラスミドのいずれか１つ(0.5 μg)および線状バキュロウイルスABvNPVのDNA (0.2 μg)をBmN細胞(Maeda et al, InverterbrateCell system and Applications, Vol.1, p.167-181,CRC Press, Boca Raton(1989))にコ・トランスフェクションした。96穴プレートを用いる限界希釈法によって組換えウイルスを選抜し、培養上清を回収した。このようにして得られたmGalT3、hIL18BPおよびALPを発現する組換えウイルスは、それぞれmGalT3_NPV、cStrep-hIL18BP_NPVおよびcDock-ALP_NPVと名付けた。
参考例２：投与化合物の調製
各化合物の濃度が、ラクトース（和光純薬社製(124-00092)）については50 mg/mL、ガラクトース（和光純薬社製(071-00032)）については50 mg/mL、デオキシガラクトノジリマイシン（Toronto Research Chemicals社製(D240000)）については15 mg/mL、N-アセチルグルコサミン（東京化成工業社製(A0092)）については50 mg/mL、デオキシガラクトース（東京化成工業社製(D0050)）については100 mg/mL、メチル-D-ガラクトピラノシド（東京化成工業社製(M1035)）については100 mg/mLとなるように、各種滅菌超純水に溶解し、0.45 μmフィルターで滅菌した。
また、DMSO(和光純薬社製（046-21981）)を用いて25 mg/mLベンジル-2-アセトアミノ-2-デオキシ-α-D-ガラクトピラノシド（メルクミリポア社製（200100））を50 mg/mLに調整し、その後等量の滅菌超純水で希釈した。
カイコへの注射による投与は、１頭当たり50 μLで行った。デオキシガラクトノジリマイシンは以下の表３に示される投与量となるように、滅菌超純水で希釈した。
各化合物の濃度が、ラクトース（和光純薬社製(124-00092)）については50 mg/mL、ガラクトース（和光純薬社製(071-00032)）については50 mg/mL、デオキシガラクトノジリマイシン（Toronto Research Chemicals社製(D240000)）については15 mg/mL、N-アセチルグルコサミン（東京化成工業社製(A0092)）については50 mg/mL、デオキシガラクトース（東京化成工業社製(D0050)）については100 mg/mL、メチル-D-ガラクトピラノシド（東京化成工業社製(M1035)）については100 mg/mLとなるように、各種滅菌超純水に溶解し、0.45 μmフィルターで滅菌した。
また、DMSO(和光純薬社製（046-21981）)を用いて25 mg/mLベンジル-2-アセトアミノ-2-デオキシ-α-D-ガラクトピラノシド（メルクミリポア社製（200100））を50 mg/mLに調整し、その後等量の滅菌超純水で希釈した。
カイコへの注射による投与は、１頭当たり50 μLで行った。デオキシガラクトノジリマイシンは以下の表３に示される投与量となるように、滅菌超純水で希釈した。
実施例１：非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つALPの製造
5齢1日目のカイコ（錦秋鐘和）を、mGalT3_NPVおよび/またはcDock-ALP_NPVに感染させた。5齢6日目に、ウイルス感染したカイコにデオキシガラクトノジリマイシン0.50 mgを注入することによって投与した。5齢7日目に、カイコ体液をサンプリングした。この体液からcDock-ALPを精製し、得られた残渣について、糖鎖MALDI-TOF MS 測定サービス（住友ベークライト）による結果を取得し、解析した（表３）。
5齢1日目のカイコ（錦秋鐘和）を、mGalT3_NPVおよび/またはcDock-ALP_NPVに感染させた。5齢6日目に、ウイルス感染したカイコにデオキシガラクトノジリマイシン0.50 mgを注入することによって投与した。5齢7日目に、カイコ体液をサンプリングした。この体液からcDock-ALPを精製し、得られた残渣について、糖鎖MALDI-TOF MS 測定サービス（住友ベークライト）による結果を取得し、解析した（表３）。
その結果、ガラクトース転移酵素の導入およびデオキシガラクトノジリマイシンの投与がされない場合には(試験区１)、非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つタンパク質は検出されなかった。また、ガラクトース転移酵素を発現させても、デオキシガラクトノジリマイシンの投与がされない場合には(試験区２)、全糖鎖に対する非還元末端にガラクトースを有する糖鎖の割合は8.3％と低かった。これに対し、ガラクトース転移酵素を導入し、かつ、デオキシガラクトノジリマイシンを投与した場合には(試験区３)、全糖鎖に対する非還元末端にガラクトースを有する糖鎖の割合は、52.1％と大幅に増大された。
実施例２：非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つhIL18BPの製造
5齢1日目に、カイコ(錦秋鐘和)をmGalT3_NPVおよびcStrep-hIL18BP_NPVに感染させた。化合物の投与は、表４に記載される投与量および投与間隔で、注射針による注入によって行った。5齢7日目に、カイコ体液をサンプリングした。Strep−Tactin担体（GEヘルスケア社製）を用いて、手順通りにhIL18BPを精製した。精製されたサンプルの各々について、波長280nmの吸光度測定を用いてタンパク質濃度を測定し、泳動タンパク量を0.5 μgに揃えた後、常法に従ってSDS-PAGEし、セミドライ法でPVDF膜に転写した。ブロッキング、洗浄後、ガラクトース特異的レクチンRCA-120 (ベクターラボラトリーズ社製)をペルオキシダーゼ標識キット（同仁化学）でHRP標識した後、1％ BSA/TTBSに希釈(RCA-120の終濃度4 μg/ml)し、メンブレンに曝露した。メンブレンの検出は、ECL試薬(GEヘルスケア社製)を用いて行った。一連の工程におけるメンブレンの洗浄にはTTBSを用いた。図１にメンブレンの写真を示す。また、得られたメンブレンについて、ImageJ（http://rsb.info.nih.gov/ij/docs/intro.html）を用いて行ったデンシトメータ測定結果を表４に示す。
5齢1日目に、カイコ(錦秋鐘和)をmGalT3_NPVおよびcStrep-hIL18BP_NPVに感染させた。化合物の投与は、表４に記載される投与量および投与間隔で、注射針による注入によって行った。5齢7日目に、カイコ体液をサンプリングした。Strep−Tactin担体（GEヘルスケア社製）を用いて、手順通りにhIL18BPを精製した。精製されたサンプルの各々について、波長280nmの吸光度測定を用いてタンパク質濃度を測定し、泳動タンパク量を0.5 μgに揃えた後、常法に従ってSDS-PAGEし、セミドライ法でPVDF膜に転写した。ブロッキング、洗浄後、ガラクトース特異的レクチンRCA-120 (ベクターラボラトリーズ社製)をペルオキシダーゼ標識キット（同仁化学）でHRP標識した後、1％ BSA/TTBSに希釈(RCA-120の終濃度4 μg/ml)し、メンブレンに曝露した。メンブレンの検出は、ECL試薬(GEヘルスケア社製)を用いて行った。一連の工程におけるメンブレンの洗浄にはTTBSを用いた。図１にメンブレンの写真を示す。また、得られたメンブレンについて、ImageJ（http://rsb.info.nih.gov/ij/docs/intro.html）を用いて行ったデンシトメータ測定結果を表４に示す。
表４から、デオキシガラクトノジリマイシンおよびラクトースを投与したときに非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つhIL18BPの量が有意に増大することが確認された（図１、表４の試験区２、４、５）。一方、ガラクトースまたはN-アセチルグルコサミンを投与した場合には、非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つhIL18BP量の有意な増大は見られなかった（図１、表４の試験区３、６）。
実施例３：非還元末端がガラクトースであるhIL18BPの製造２
投与化合物、投与量および投与日を表５に記載のとおり変更したこと以外は実施例１と同様にして、試験を行った。結果を表５に示す。
投与化合物、投与量および投与日を表５に記載のとおり変更したこと以外は実施例１と同様にして、試験を行った。結果を表５に示す。
表５から、デオキシガラクトノジリマイシンの他、メチル-D-ガラクトピラノシドを投与した場合にも、非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つhIL18BPの量が有意に増大することが確認された(図２、表５のレーン２、４)。
実施例４：非還元末端にガラクトースを有するhIL18BPの製造３
投与する化合物をデオキシガラクトノジリマイシンのみとし、投与量および投与日を表６に記載のとおり変更したこと以外は実施例２と同様にして、試験を行った。
投与する化合物をデオキシガラクトノジリマイシンのみとし、投与量および投与日を表６に記載のとおり変更したこと以外は実施例２と同様にして、試験を行った。
表６から、デオキシガラクトノジリマイシンの投与量が0.10 mg以上の場合に、非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つhIL18BPの量が増大された。また、化合物の投与量が多くなるに従い、非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つhIL18BPの量も多くなった。
Claims (3)
- カイコに、mGalT3をコードする遺伝子と所望のタンパク質をコードする遺伝子とを、バキュロウイルスベクターを用いて導入する工程と、
前記導入工程で得られたカイコに、デオキシガラクトノジリマイシン、メチルβ-ガラクトピラノシドおよびラクトースからなる群より選択される１種類以上の物質を投与して、非還元末端にガラクトースを有する糖鎖を持つ所望のタンパク質を取得する工程と
を含む糖タンパク質の製造方法。 - 投与される物質が、デオキシガラクトノジリマイシンである請求項１に記載の製造方法。
- 前記非還元末端にガラクトースを有する糖鎖が、
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