CN106047925B - 糖蛋白质的制造方法及糖蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明提供糖蛋白质的制造方法，其包括向鳞翅目昆虫活体导入编码半乳糖转移酶的基因和编码期望的蛋白质的基因的工序，及对上述工序中得到的昆虫活体施用选自脱氧半乳糖野尻霉素、甲基β‑吡喃半乳糖苷及乳糖的1种以上的物质，取得具有在非还原末端有半乳糖的糖链的期望的蛋白质的工序。

Description

糖蛋白质的制造方法及糖蛋白质

【技术领域】

本发明涉及糖蛋白质的制造方法及由该制造方法得到的糖蛋白质。更具体而言，本发明涉及具有在非还原末端有半乳糖的糖链的蛋白质的制造方法及由该制造方法得到的蛋白质。

【背景技术】

在活体内表达的蛋白质，在多数情况，作为附加有数条～数十条的比较短的糖链的糖蛋白质存在。已知多数这些糖蛋白质通过附加糖链，发挥特异性的性质。近年得知、糖蛋白质的糖链成分在癌的转移或免疫等中担负重要的作用，由此关心集中到对于关注其潜在的有用性的研究。例如，认为如果能使用有癌特有的糖链的糖蛋白质筛选单独显示强的抗体依赖性细胞毒性(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity)活性的抗体医药，就能提供对化学疗法的依赖性就变低，副作用少的新的癌治疗法。

为了糖链研究的发展，附加期望的糖链的糖蛋白质的量产是必须的。近年、为了有哺乳动物型糖链的糖蛋白质量产，进行对使用昆虫系统的研究。但是，在昆虫中，表达的蛋白质所附加的糖链，在多数情况，是甘露糖核心型的N联糖链。此甘露糖核心型的N联糖链有在β1,4键合于存在于还原末端的二乙酰壳二糖部位的甘露糖的各3位及6位上各自β1,3键合及β1,6键合别的2个甘露糖的结构。在昆虫中，在糖链的形成过程中，也可形成N-乙酰葡萄糖胺键合于甘露糖核心型糖链的非还原末端的糖链，但这最终由N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的作用而失去N-乙酰葡萄糖胺，成为甘露糖核心型的糖链。

另一方面，在人等的哺乳动物的血清蛋白质中所见的糖链主要是复合型的N联糖链。这是在甘露糖核心型糖链的非还原末端上键合N-乙酰葡萄糖胺的糖链、在其上键合半乳糖的糖链、再者在其上键合唾液酸的糖链等。从而，在昆虫系统中制造有哺乳动物型糖链的糖蛋白质时，有向昆虫导入半乳糖转移酶、唾液酸转移酶等的必要。

在Tomiya N.Trends in Glycoscience and Glycotechnology Vol.21 No.118(2009)pp.71-86及Tomiya N.等人Glycobiology，vol.13,no.1 pp.23-34,2003中记载了通过向昆虫培养细胞导入半乳糖转移酶，在昆虫中产生有哺乳动物型的糖链的糖蛋白质。在这些文献中记载，通过在粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)来源的昆虫培养细胞Tn5中使GnT II及GalT表达，得到具有非还原末端有半乳糖的N联糖链的蛋白质。

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

但是，为了在以往使用的昆虫培养细胞中量产蛋白质，需要特殊的设备。在蛋白质制造中使用昆虫活体时，没必要这样的特殊的设备，另外，可期望比昆虫培养细胞优良的蛋白质表达量。

从而，本发明旨在提供使用昆虫活体制造有哺乳动物型糖链的糖蛋白质的新的方法。

【解决课题的技术方案】

本发明人为解决上述的课题而重复锐意探讨的结果意外发现，通过向导入编码半乳糖转移酶的基因的昆虫活体施用特定的物质使得糖蛋白质的产生量增大，从而完成本发明。

由本发明提供糖蛋白质的制造方法，其包括向鳞翅目昆虫活体导入编码半乳糖转移酶的基因和编码期望的蛋白质的基因的工序，及向在上述工序中得到的昆虫活体施用选自脱氧半乳糖野尻霉素、甲基β-吡喃半乳糖苷及乳糖的1种以上的物质，取得具有非还原末端有半乳糖的糖链的期望的蛋白质的工序。

【附图说明】

【图1】是实施例2中得到的膜的照片。

【图2】是实施例3中得到的膜的照片。

【图3】是实施例4中得到的膜的照片。

【实施方式】

在由本发明的糖蛋白质的制造方法(以下，也简称为“制造方法”)中，向鳞翅目昆虫活体导入编码半乳糖转移酶的基因和编码期望的蛋白质的基因。

鳞翅目昆虫只要是对于重组蛋白质的表达适宜的公知的鳞翅目(Lepidoptera)昆虫，就不特别限定。例如，可举出选自蚕蛾科(Bombycidae)、夜蛾科(Noctuidae)、灯蛾科(Arctiidae)及大蚕蛾科(Saturniidae)的鳞翅目昆虫等。作为更具体性的生物种，可举出蚕(Bombyx mori)、黄领麻纹灯蛾(Spilosoma imparilis)、柞蚕(Antheraea pernyi)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等。它们之中也特别优选为蚕。

昆虫活体可为成虫、蛹及幼虫之任何的形态。优选为蛹或幼虫。

半乳糖转移酶只要是可从糖供体向糖链转移半乳糖的酶，就不特别限定。优选为β-1,4-半乳糖转移酶、更优选为β-1,4-半乳糖转移酶I(GalT I)、β-1,4-半乳糖转移酶II(GalT II)、β-1,4-半乳糖转移酶III(GalT III)、β-1,4-半乳糖转移酶IV(GalT IV)等。半乳糖转移酶的来源不特别限定，但优选为哺乳动物来源。在本实施方式中，可使用小家鼠(Mus musculus)来源的GalT III(mGalT3)。

半乳糖转移酶也可与其他糖链修饰酶同时表达。作为这样的糖链修饰酶，只要是可从糖供体向糖链转移期望的糖的酶，就不特别限定。例如，可举出能转移N-乙酰葡萄糖胺的N-乙酰基葡萄糖胺转移酶I或N-乙酰基葡萄糖胺转移酶II、能转移岩藻糖的α1,6岩藻糖转移酶等。

在本实施方式中，通过选自N-乙酰基葡萄糖胺转移酶III、IV、V及VI的至少1种转移酶的功能也能制造具有截开型糖链、在3～5链分歧的非还原末端有半乳糖的糖链的蛋白质。

旨在附加半乳糖的期望的蛋白质只要是可附加糖链的蛋白质，就不特别限定。在本实施方式中，可使用碱性磷酸酶(ALP)或白细胞介素18结合蛋白质(IL18BP)等。

向鳞翅目昆虫活体导入编码半乳糖转移酶的基因及编码期望的蛋白质的基因可使用本领域技术人员公知的方法进行。作为这样的方法，可举出例如使用病毒、质粒、粘粒、F粘粒等的载体的方法。在其中也是，优选使用病毒载体，特别优选使用杆状病毒载体。作为具体性的杆状病毒，可举出BmNPV、AcNPV、HycuNPV、AnpeNPV等。在本实施方式中，可使用杆状病毒载体将上述的基因导入鳞翅目昆虫活体。载体可以使导入的基因瞬时表达的方式导入，也可由转基因技术等以使持续表达的方式导入。

在本发明的制造方法中，通过向如上述一样得到的昆虫活体施用特定的物质，从上述的昆虫活体取得具有在非还原末端有半乳糖的糖链的期望的蛋白质。

向昆虫活体施用的上述特定的物质是选自脱氧半乳糖野尻霉素、甲基β-吡喃半乳糖苷及乳糖的1种以上的物质、它们的异构体、或者它们的盐。可优选施用脱氧半乳糖野尻霉素。

脱氧半乳糖野尻霉素是CAS编号75172-81-5的公知的化合物。此化合物也称为1-脱氧半乳糖野尻霉素等。脱氧半乳糖野尻霉素可由本领域技术人员公知的方法制造。脱氧半乳糖野尻霉素也可为商业购买的。例如，可自Toronto Research Chemicals公司购入。

甲基β-吡喃半乳糖苷是CAS编号1824-94-8的公知的化合物。此化合物也可称为甲基-β-D-吡喃半乳糖苷、1-O-甲基-β-D-吡喃半乳糖苷等。甲基β-吡喃半乳糖苷可由本领域技术人员公知的方法制造。甲基β-吡喃半乳糖苷也可为商业购买的。例如，可自东京化成工业购入。

乳糖可由本领域技术人员公知的方法制造。乳糖也可为商业购买的。例如，可自和光纯药工业购入。

上述的特定的物质可作为溶液施用，也可作为固体施用。优选为，可作为溶液施用。将上述的特定的物质作为溶液施用时，作为溶剂，可举出水及碳原子数1～4的低级醇等。

上述特定的物质的每1次的施用量只要能产生期望的糖蛋白质，就不特别限定。优选为，可每1次施用0.10mg以上。

上述特定的物质的施用途径只要能产生期望的糖蛋白质，就不特别限定。例如，可由注入、经口、涂布等施用。

上述特定的物质的施用期间及施用间隔只要能产生期望的糖蛋白质，就不特别限定。在本实施方式中，在6天之间、可在第2、5及/或6天等施用。

作为上述特定的物质选择2种以上的物质时，它们可混合，可不混合而同时或分别施用，或者也可以任意的顺序依次施用。

在昆虫活体中表达的期望的蛋白质中，可形成糖链。此糖链可由昆虫活体中原本备有的翻译后修饰等的机制形成。或者，也可通过如下方式形成：对于由昆虫活体中原本备有的翻译后修饰等的机制来形成的糖链，通过由导入昆虫活体的基因表达的酶的作用而进一步附加糖的糖链，或者通过自这样的糖链除去任何糖的糖链等。如此形成的糖链可相当于在半乳糖附加前的期望的蛋白质上形成的糖链的状态。

一般而言，糖链大致分为O联糖链和N联糖链。O联糖链是指O-糖苷键合于蛋白质或多肽的丝氨酸或苏氨酸残基的羟基的糖链。具体而言，可举出含以下的式(12)～(16)：

【化1】

Galβ1—3GalNAc…(12)

GlcNAcβ1—3GalNAc…(13)

GalNAcβ1—3GalNAc…(14)

GlcNAcβ1—6GalNAc…(15)

GalNAcα1—6GalNAc…(16)

之任一个所表示的糖链结构的糖链等，不限于这些。也可在还原末端侧的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)上键合GlcNAc。再有，还原末端侧是指与蛋白质或多肽的丝氨酸或苏氨酸残基键合的GalNAc的侧。在上述的式(12)～(16)中，右侧相当于还原末端侧。另一方面，将与上述的与丝氨酸或苏氨酸残基键合的GalNAc的侧相反侧(在上述的式(12)～(16)中是左侧)称为非还原末端。以下，以同样的式表示糖链结构时，将右侧作为还原末端侧、将左侧作为非还原末端侧表示。另外，在上述的式中也显示糖的键合方式。例如，当2个糖之间记为“β1-3”时，表示这些糖各自在左侧的糖的1位及右侧的糖的3位有β1,3键合。上述的式中，Gal表示半乳糖、GlcNAc表示N-乙酰葡萄糖胺。

N联糖链是指N-糖苷键合于蛋白质或多肽的天冬酰胺残基的氨基的糖链。N联糖链，一般而言，大致分为少甘露糖型、高甘露糖型、混成型及复合型。

在本实施方式中，少甘露糖型糖链是指(i)在存在于N联糖链的还原末端的二乙酰壳二糖部分的非还原末端侧的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)上β1,4键合甘露糖的糖链，及(ii)在上述的(i)的糖链的非还原末端侧的甘露糖上β1,3键合及/或β1,6键合1个或2个甘露糖的糖链。具体而言，可为由以下的式(4)～(7)：

【化2】

Manβ1——4GlcNAcβ1——4GlcNAcβ...(7)

之任一个所表示的糖链结构构成的糖链。在这些式中，右侧被表示为还原末端侧、左侧被表示为非还原末端侧。上述的式中，Man表示甘露糖。在本说明书中，由式(4)所表示的糖链结构构成的糖链也称为甘露糖核心型糖链。

在本实施方式中，高甘露糖型糖链是指在式(4)的糖链结构的非还原末端侧的甘露糖上不键合甘露糖以外的糖而进一步键合1个以上的甘露糖的糖链。例如，可举出在以下的式(8)：

【化3】

所表示的糖链结构的非还原末端侧的甘露糖上不键合甘露糖以外的糖而进一步键合1个以上的甘露糖的糖链等。作为更具体的例，可举出含以下的式(9)：

【化4】

所表示的糖链结构的糖链等。

在本实施方式中，混成型糖链是指，在以下的式(4)：

【化5】

的糖链结构的非还原末端侧的一方的甘露糖上键合甘露糖以外的糖，在另一方的甘露糖上不键合甘露糖以外的糖而进一步键合1个以上的甘露糖的糖链。例如，可举出有以下的式(10)：

【化6】

所表示的糖链结构(式中，X表示甘露糖以外的1以上的糖，也可存在多个)的糖链等。作为更具体的例，可举出含以下的式(11)：

【化7】

所表示的糖链结构的糖链等。

混成型糖链也可为在其二乙酰壳二糖部分的还原末端侧的N-乙酰葡萄糖胺上键合、特别是α1,6键合岩藻糖的糖链。另外，混成型糖链也可为在β1,4键合于二乙酰壳二糖部分的甘露糖上进一步键合、特别是β1,4键合1个以上的N-乙酰葡萄糖胺的糖链(所谓的截开型糖链)。

在本实施方式中，复合型糖链是指

(i)含以下的式(1)或(2)：

【化8】

所表示的糖链结构，但是，含在未键合N-乙酰葡萄糖胺的非还原末端侧的甘露糖上不键合甘露糖的糖链结构的糖链、及

(ii)含式(3)：

【化9】

的糖链结构的糖链。在式(3)的糖链结构中也可包含，例如含以下的式(17)～(20)：

【化10】

所表示的糖链结构的糖链等。式(17)～(19)的糖链结构各自是所谓的3链分支型(Triantennary)、4链分支型(Tetraantennary)及5链分支型(Pentaantennary)。另外，式(20)的糖链结构是所谓的截开型糖链。

复合型糖链也可为在其二乙酰壳二糖部分的还原末端侧的N-乙酰葡萄糖胺上键合、特别是α1,6键合岩藻糖的糖链。另外，复合型糖链也可为在β1,4键合于二乙酰壳二糖部分的甘露糖上进一步键合、特别是β1,4键合1个以上的N-乙酰葡萄糖胺的糖链(所谓的截开型糖链)。

附加半乳糖前的糖链不特别限定，也可为O联糖链及N联糖链之任一者。优选为，附加半乳糖前的糖链可为在非还原末端有可附加半乳糖的糖的糖链、例如为在非还原末端具有选自N-乙酰葡萄糖胺及N-乙酰半乳糖胺的至少1个的糖的糖链。更优选为，附加半乳糖前的糖链可为在非还原末端有N-乙酰葡萄糖胺的N联糖链。更优选为，附加半乳糖前的糖链可为含下述的式(1)～(3)：

【化11】

的糖链结构的糖链、特别优选为由式(1)～(3)的糖链结构构成的复合型糖链，或可为在它们的还原末端的GlcNAc上键合、优选为α1,6键合岩藻糖的复合型糖链。

具有在非还原末端有半乳糖的糖链的蛋白质通过由导入昆虫活体的半乳糖转移酶的作用，在上述的附加半乳糖前的蛋白质的糖链的非还原末端附加半乳糖而得到。

半乳糖对在非还原末端的糖的键合方式不特别限定。例如，可举出在非还原末端的N-乙酰半乳糖胺或N-乙酰葡萄糖胺等上键合有半乳糖的方式、在得到的糖链是混成型糖链时、在非还原末端的甘露糖上键合有半乳糖的方式等。特别优选为半乳糖β1,4键合于在非还原末端的N-乙酰葡萄糖胺的方式。

再有，也可有在附加半乳糖前的糖链的非还原末端的半乳糖上进一步键合半乳糖的实施方式。作为这样的键合方式的例，可举出糖链的非还原末端β1,4键合于任意的糖的半乳糖上α1,3-键合别的半乳糖的方式等。

如上述一样得到的具有在非还原末端有半乳糖的糖链的蛋白质可为上述所举的在附加半乳糖前的糖链的非还原末端的糖、优选为N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺上键合半乳糖的糖链。更优选为，具有在非还原末端有半乳糖的糖链的蛋白质可为在附加半乳糖前的糖链的非还原末端的N-乙酰葡萄糖胺上β1,4键合半乳糖的N联糖链。再优选为，附加半乳糖前的糖链可为在含下述的式(1)～(3)：

【化12】

的糖链结构的糖链的非还原末端的N-乙酰葡萄糖胺上β1,4键合半乳糖的N联糖链、特别优选为，由式(1)～(3)的糖链结构构成的复合型糖链，或可为在它们的还原末端的GlcNAc上键合(优选α1,6键合)岩藻糖的复合型糖链。

在本实施方式中，作为具有在非还原末端有半乳糖的糖链的蛋白质，例如，可取得具有含以下的式(21)～(25)：

【化13】

所表示的糖链结构的糖链的蛋白质。

具有在非还原末端有半乳糖的糖链的蛋白质也可为在其二乙酰壳二糖部分的还原末端侧的N-乙酰葡萄糖胺上键合、特别是α1,6键合岩藻糖的糖链。另外，具有在非还原末端有半乳糖的糖链的蛋白质也可为在β1,4键合于二乙酰壳二糖部分的甘露糖上进一步键合、特别是β1,4键合1个以上的N-乙酰葡萄糖胺的糖链(所谓的截开型糖链)。

从昆虫活体取得期望的糖蛋白质可使用本领域技术人员公知的方法进行。例如，可通过使用本领域技术人员公知的方法，将昆虫活体磨碎，进行超离心分离等而回收目的蛋白质。如此得到的糖蛋白质也可使用本领域技术人员公知的方法、例如层析法等进一步纯化。

在本发明的范围内，也可包含如上述一样得到的期望的糖蛋白质本身。

在本发明的范围内，也包括选自脱氧半乳糖野尻霉素、甲基β-吡喃半乳糖苷及乳糖的1种以上的物质的用于制造糖蛋白质的用途。对于脱氧半乳糖野尻霉素、甲基β-吡喃半乳糖苷、乳糖及糖蛋白质，则如上所述。

以下，由实施例详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。

【实施例】

【参考例1：重组病毒的制作(1)基因的取得及向转移载体的导入】

mGalT3(小家鼠(Mus musculus)UDP-Gal:βGlcNAcβ1,4-半乳糖基转移酶,多肽3)(登录编号NM_020579)的克隆通过将由使用作为模板的基因组DNA和表1所示的引物组的PCR得到的扩增产物导入转移载体(Sysmex公司制pV01)中的表2中记载的限制性内切酶位点来进行。

【表1】

【表2】

作为旨在在N联糖链的非还原末端附加半乳糖的蛋白质，使用hIL18BP。

编码hIL18BP(智人(Homo sapiens)白细胞介素18结合蛋白；登录编号NM_001039659)的基因的克隆通过将由使用作为模板的基因组DNA和表1所示的引物组的PCR得到的扩增产物导入转移载体(Sysmex公司制pM01/cStrep)中的表2中记载的限制性内切酶位点来进行。

对于ALP基因，合成由SEQ ID NO:7表示的核酸(GenScript公司)、通过将由使用表1所示的引物组的PCR得到的扩增产物导入转移载体(Sysmex公司制pM31)中的表2中记载的限制性内切酶位点来进行。

【(2)重组病毒的制作】

使用脂转染试剂(X-tremeGENE HP DNA转染试剂：Roche制)，将上述得到的3个质粒之任一种(0.5μg)及线状杆状病毒ABvNPV的DNA(0.2μg)共转染于BmN细胞(Maeda et al，Inverterbrate Cell system and Applications，Vol.1，p.167-181,CRC Press，BocaRaton(1989))。由使用96孔板的有限稀释法挑选重组病毒，回收培养上清。将如此得到的表达mGalT3、hIL18BP及ALP的重组病毒各自命名为mGalT3_NPV、cStrep-hIL18BP_NPV及cDock-ALP_NPV。

【参考例2：施用化合物的调制】

，溶解于各种灭菌超纯水，用0.45μm滤器灭菌，使各化合物的浓度是对于乳糖(和光纯药公司制(124-00092))是50mg/mL、对于半乳糖(和光纯药公司制(071-00032))是50mg/mL、对于脱氧半乳糖野尻霉素(Toronto Research Chemicals公司制(D240000))是15mg/mL、对于N-乙酰葡萄糖胺(东京化成工业公司制(A0092))是50mg/mL、对于脱氧半乳糖(东京化成工业公司制(D0050))是100mg/mL、对于甲基-D-吡喃半乳糖苷(东京化成工业公司制(M1035))是100mg/mL。

另外，使用DMSO(和光纯药公司制(046-21981))将25mg/mL苄基-2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(MerckMillipore公司制(200100))调整为50mg/mL，其后用等量的灭菌超纯水稀释。

利用注射向蚕施用以每1只50μL进行。用灭菌超纯水稀释至脱氧半乳糖野尻霉素成示于以下的表3的施用量。

【实施例1：具有在非还原末端有半乳糖的糖链的ALP的制造】

将5龄第1天的蚕(品种：锦秋钟和)用mGalT3_NPV及/或cDock-ALP_NPV感染。在5龄第6天，通过向病毒感染的蚕注入脱氧半乳糖野尻霉素0.50mg而施用。在5龄第7天，对蚕体液采样。由该体液纯化cDock-ALP，对于得到的残渣取得由糖链MALDI-TOFMS测定服务(住友Bakelite)获得的结果而进行解析(表3)。

【表3】病毒感染·化合物施用一览表及复合型糖链比率

试验区1,2：比较例、

试验区3：实施例(着色的行表示在该试验区中见到显著的半乳糖附加)

结果，在不进行半乳糖转移酶的导入及脱氧半乳糖野尻霉素的施用时(试验区1)，检测不到具有在非还原末端有半乳糖的糖链的蛋白质。另外，即使使半乳糖转移酶表达，在不施用脱氧半乳糖野尻霉素时(试验区2)，相对于全糖链的在非还原末端有半乳糖的糖链的比例仍低至8.3％。与此相对，在导入半乳糖转移酶、并且施用脱氧半乳糖野尻霉素时(试验区3)，相对于全糖链的在非还原末端有半乳糖的糖链的比例大幅地增大至52.1％。

【实施例2：具有在非还原末端有半乳糖的糖链的hIL18BP的制造】

在5龄第1天，将蚕(品种：锦秋钟和)用mGalT3_NPV及cStrep-hIL18BP_NPV感染。化合物的施用通过以表4中记载的施用量及施用间隔，利用注射针的注入来进行。在5龄第7天，对蚕体液采样。使用Strep-Tactin载体(GE HEALTHCARE公司制)，依顺序纯化hIL18BP。对于纯化的样品分别使用波长280nm的吸光度测定来测定蛋白质浓度，备0.5μg电泳蛋白量之后，根据常规方法进行SDS-PAGE，用半干法转印到PVDF膜。封闭、清洗后，将半乳糖特异性凝集素RCA-120(VECTOR Laboratories公司制)用过氧化物酶标记试剂盒(同仁化学)HRP标记后，在1％BSA/TTBS中稀释(RCA-120的终浓度4μg/ml)，暴露于膜。膜的检测使用ECL试剂(GE HEALTHCARE公司制)进行。在一系列的工序中的膜的清洗中使用TTBS。图1显示膜的照片。另外，对于得到的膜，将使用ImageJ(http://rsb.info.nih.gov/ij/docs/intro.html)进行的密度计测定结果示于表4。

【表4】病毒感染·化合物施用一览表

试验区1,3,6：比较例、

试验区2,4,5：实施例(着色的行表示在该试验区中见到显著的半乳糖附加)

从表4确认，在施用脱氧半乳糖野尻霉素及乳糖时，具有在非还原末端有半乳糖的糖链的hIL18BP的量显著地增大(图1、表4的试验区2、4、5)。另一方面，在施用半乳糖或N-乙酰葡萄糖胺时，见不到具有在非还原末端有半乳糖的糖链的hIL18BP量的显著的增大(图1、表4的试验区3、6)。

【实施例3：非还原末端是半乳糖的hIL18BP的制造2】

除如表5中记载那样变更施用化合物、施用量及施用日以外、与实施例1同样进行试验。结果示于表5。

【表5】病毒感染·化合物施用一览表

泳道1,3,5：比较例、

泳道2,4：实施例(着色的行表示见到显著的半乳糖附加)

从表5确认，除施用脱氧半乳糖野尻霉素之外、在施用甲基-D-吡喃半乳糖苷时，具有在非还原末端有半乳糖的糖链的hIL18BP的量也显著地增大(图2、表5的泳道2、4)。

【实施例4：在非还原末端有半乳糖的hIL18BP的制造3】

除使施用的化合物仅为仅脱氧半乳糖野尻霉素，如表6中记载那样变更施用量及施用日以外，与实施例2同样地进行试验。

【表6】病毒感染·化合物施用一览表

从表6得知，当脱氧半乳糖野尻霉素的施用量是0.10mg以上时，具有在非还原末端有半乳糖的糖链的hIL18BP的量增大。另外，随着化合物的施用量变多，具有在非还原末端有半乳糖的糖链的hIL18BP的量也变多。

Claims (4)

1.糖蛋白质的制造方法，其包括：

向蚕导入编码mGalT3的基因和编码期望的蛋白质的基因的工序，及

对在上述工序得到的蚕施用选自脱氧半乳糖野尻霉素、甲基β-吡喃半乳糖苷及乳糖的1种以上的物质，取得具有在非还原末端有半乳糖的糖链的期望的蛋白质的工序。

2.权利要求1所述的制造方法，其中施用的物质是脱氧半乳糖野尻霉素。

3.权利要求1或2所述的制造方法，其中上述在非还原末端有半乳糖的糖链是含在存在于以下(1)、(2)或(3)之任一个糖链结构的非还原末端的至少1个N-乙酰葡萄糖胺上β1,4键合半乳糖的糖链结构的糖链：

所表示的糖链结构、

所表示的糖链结构、

所表示的糖链结构。

4.选自脱氧半乳糖野尻霉素、甲基β-吡喃半乳糖苷及乳糖的1种以上的物质用于制造糖蛋白质的用途，

其中上述糖蛋白质是具有在非还原末端有半乳糖的糖链的蛋白质，

其中上述糖蛋白质的制造经以下的工序进行：

向蚕导入编码mGalT3的基因和编码期望的蛋白质的基因的工序；及

对在上述工序得到的蚕施用选自脱氧半乳糖野尻霉素、甲基β-吡喃半乳糖苷及乳糖的1种以上的物质，取得具有在非还原末端有半乳糖的糖链的期望的蛋白质的工序。