CN114144434A - 调节抗体效应子功能 - Google Patents
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Abstract
本文提供了调节抗体组合物的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法。在示例性实施例中,该方法包括(1)增加或降低帕尼单抗的N‑297糖基化位点处的末端β‑半乳糖的量,或者增加或降低在N‑297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量;(2)增加或降低在N‑297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者增加或降低在N‑297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量;以及(3)增加或降低在N‑297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量。
Description
技术领域
本发明总体上涉及调节治疗性抗体的效应子功能。
背景技术
单克隆抗体已经广泛用作治疗多种多样的代谢、炎性和肿瘤疾病状态的治疗剂。用作生物治疗剂的最常见的人抗体亚类IgG1和IgG2具有非常不同的免疫特性,并且通常基于所需的作用机制针对候选药物进行选择。如对于癌症适应症而言可能是可取的,靶细胞杀伤将寻求利用IgG1介导的效应子功能,诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。虽然这些效应子功能可以容易地由IgG1抗体介导,但IgG2传统上被认为无法引起此类效应(Ravetch,J.V.和S.Bolland.2001,Annu.Rev.Immunol.[免疫学年鉴]19:275-290)。然而,最近发现帕尼单抗(一种用于治疗转移性结直肠癌的人IgG2 EGFR拮抗剂)可以介导细胞毒性(Schneider-Merck,J Immunol[免疫学杂志]2010;184:512-520)。这被证明主要通过髓系细胞(单核细胞和嗜中性粒细胞)介导并由FcγRIIa介导,这与传统ADCC相反,传统ADCC由IgG1通过淋巴源性自然杀伤(NK)细胞介导并与FcγRIIIa相关。
在制造治疗性单克隆抗体时,确保必要的产品质量需要定义和监测影响产品安全性和功效的关键质量属性。已经十分确定,IgG1的与Fc CH2结构域中的保守聚糖相关的特定聚糖结构可以强烈影响与介导ADCC、ADCP的FcγR的相互作用以及影响引发CDC的C1q结合(Reusch D,Tejada ML.,Glycobiology[糖生物学]2015;25:1325-34)。然而,没有探讨IgG2分子的影响免疫介导的细胞毒活性的产品质量属性的影响的研究。Fc受体是将抗体介导的(体液)免疫反应与细胞效应子功能联系起来的关键免疫调节受体。效应细胞(像自然杀伤细胞、巨噬细胞或单核细胞)表面上的Fcγ受体与IgG(其本身与靶细胞结合)的Fc区结合。在Fc结合后,信号传导途径被触发,这导致各种介导靶细胞的破坏的物质的分泌。细胞毒性效应子功能的水平因人IgG亚型而异。与IgG2或IgG4相比,人IgG1和IgG3与FcγR的结合更好,从而介导更高的效应子功能(Jefferis,R.2007,Expert Opin.Biol.Ther.[生物疗法专家意见]7:1401-1413;Daeron M,Fc receptor biology[Fc受体生物学];Annu RevImmunol.[免疫学年鉴]1997;15:203-234)。
既没有十分理解IgG2介导的细胞毒性在治疗功效中的贡献,也没有十分理解影响IgG2介导的细胞毒性的质量属性。尚未建立对IgG2介导的细胞毒性有影响和预测性的、因此适合于在IgG2抗体制造期间进行监测的质量属性。因此,需要理解某些质量属性如何影响IgG2介导的细胞毒性,并且相应地调节此类质量属性。
发明内容
基于本文提供的披露内容,本领域技术人员将认知到或者仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的特定实施例的许多等同物。此类等同物旨在由以下实施例(E)所涵盖。
E1.一种调节帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加或降低帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加或降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。
E2.一种增加帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。
E3.如E1或E2所述的方法,其中β-半乳糖的约1%的增加将FcγR介导的细胞毒性增加约0.55%至约0.75%,诸如约0.55%、约0.6%、约0.65%、约0.7%或约0.75%。
E4.一种降低帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括降低帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。
E5.如E1或E4所述的方法,其中β-半乳糖的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性降低约0.55%至约0.75%,诸如约0.55%、约0.6%、约0.65%、约0.7%或约0.75%。
E6.如E1-E5中任一项所述的方法,其中所述FcγR是FcγRIIa。
E7.如E1-E6中任一项所述的方法,其中通过体外细胞毒性测定诸如KILRTM细胞毒性测定来测量所述FcγR介导的细胞毒性。
E8.如E1-E7中任一项所述的方法,其中所述FcγR介导的细胞毒性是FcγRIIa介导的细胞毒性。
E9.一种将帕尼单抗样品的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性与参考值匹配的方法,该方法包括:
(1)获得FcγR介导的细胞毒性的参考值;
(2)确定所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;以及
(3)通过增加或降低帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加或降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来改变所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;使得该帕尼单抗样品与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约35%或更低。
E10.如E9所述的方法,其中该帕尼单抗样品与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约30%或更低、约25%或更低、约20%或更低、约15%或更低、约10%或更低或者约5%或更低。
E11.如E9或E10所述的方法,其中通过增加帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来增加该帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。
E12.如E9-E11中任一项所述的方法,其中β-半乳糖的约1%的增加将FcγR介导的细胞毒性增加约0.55%至约0.75%,诸如约0.55%、约0.6%、约0.65%、约0.7%或约0.75%。
E13.如E9或E10所述的方法,其中通过降低帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来降低该帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。
E14.如E9、E10或E13中任一项所述的方法,其中β-半乳糖的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性降低约0.55%至约0.75%,诸如约0.55%、约0.6%、约0.65%、约0.7%或约0.75%。
E15.如E9-E14中任一项所述的方法,其中所述FcγR是FcγRIIa。
E16.如E9-E15中任一项所述的方法,其中通过体外细胞毒性测定诸如KILRTM细胞毒性测定来测量所述FcγR介导的细胞毒性。
E17.如E9-E16中任一项所述的方法,其中所述FcγR介导的细胞毒性是FcγRIIa介导的细胞毒性。
E18.一种调节帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加或降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。
E19.一种调节帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加或降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。
E20.一种增加帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。
E21.一种增加帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。
E22.如E18-E21中任一项所述的方法,其中岩藻糖基化帕尼单抗分子的约1%的增加将FcγR介导的细胞毒性增加约2.70%至约3%,诸如约3.0%、约2.95%、约2.90%、约2.85%或约2.70%。
E23.如E18-E21中任一项所述的方法,其中去岩藻糖基化帕尼单抗分子的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性增加约2.70%至约3%,诸如约3.0%、约2.95%、约2.90%、约2.85%或约2.70%。
E24.一种降低帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。
E25.一种降低帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。
E26.如E18-E19和E24-E25中任一项所述的方法,其中岩藻糖基化帕尼单抗分子的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性降低约2.70%至约3%,诸如约3.0%、约2.95%、约2.90%、约2.85%或约2.70%。
E27.如E18-E19和E24-E25中任一项所述的方法,其中去岩藻糖基化帕尼单抗分子的约1%的增加将FcγR介导的细胞毒性增加约2.70%至约3%,诸如约3.0%、约2.95%、约2.90%、约2.85%或约2.70%。
E28.如E18-E27中任一项所述的方法,其中所述FcγR是FcγRIIa。
E29.如E18-E28中任一项所述的方法,其中通过体外细胞毒性测定诸如KILRTM细胞毒性测定来测量所述FcγR介导的细胞毒性。
E30.如E18-E29中任一项所述的方法,其中所述FcγR介导的细胞毒性是FcγRIIa介导的细胞毒性。
E31.一种将帕尼单抗样品的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性与参考值匹配的方法,该方法包括:
(1)获得FcγR介导的细胞毒性的参考值;
(2)确定所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;以及
(3)通过增加或降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来改变所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;使得该帕尼单抗样品与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约35%或更低。
E32.一种将帕尼单抗样品的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性与参考值匹配的方法,该方法包括:
(1)获得FcγR介导的细胞毒性的参考值;
(2)确定所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;以及
(3)通过增加或降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来改变所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;使得该帕尼单抗样品与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约35%或更低。
E33.如E31或E32所述的方法,其中该帕尼单抗样品与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约30%或更低、约25%或更低、约20%或更低、约15%或更低、约10%或更低或者约5%或更低。
E34.如E31-E33中任一项所述的方法,其中通过增加在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来增加该帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。
E35.如E31-E34中任一项所述的方法,其中岩藻糖基化帕尼单抗分子的约1%的增加将FcγR介导的细胞毒性增加约2.70%至约3%,诸如约3.0%、约2.95%、约2.90%、约2.85%或约2.70%。
E36.如E31-E33中任一项所述的方法,其中通过降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来增加该帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。
E37.如E31-E34和E36中任一项所述的方法,其中去岩藻糖基化帕尼单抗分子的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性增加约2.70%至约3%,诸如约3.0%、约2.95%、约2.90%、约2.85%或约2.70%。
E38.如E31-E33中任一项所述的方法,其中通过降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来降低该帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。
E39.如E31-E33和E38中任一项所述的方法,其中岩藻糖基化帕尼单抗分子的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性降低约2.70%至约3%,诸如约3.0%、约2.95%、约2.90%、约2.85%或约2.70%。
E40.如E31-E33中任一项所述的方法,其中通过增加在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来降低该帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。
E41.如E31-E33和E40中任一项所述的方法,其中去岩藻糖基化帕尼单抗分子的约1%的增加将FcγR介导的细胞毒性降低约2.70%至约3%,诸如约3.0%、约2.95%、约2.90%、约2.85%或约2.70%。
E42.如E31-E41中任一项所述的方法,其中所述FcγR是FcγRIIa。
E43.如E31-E42中任一项所述的方法,其中通过体外细胞毒性测定诸如KILRTM细胞毒性测定来测量所述FcγR介导的细胞毒性。
E44.如E31-E43中任一项所述的方法,其中所述FcγR介导的细胞毒性是FcγRIIa介导的细胞毒性。
E45.一种调节帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加或降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量。
E46.一种增加帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量。
E47.如E45或E46所述的方法,其中高甘露糖聚糖的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性增加约1.20%至约1.40%,诸如约1.2%、约1.25%、约1.3%、约1.35%或约1.40%。
E48.一种降低帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量。
E49.如E45或E48所述的方法,其中高甘露糖聚糖的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性降低约1.20%至约1.40%,诸如约1.2%、约1.25%、约1.3%、约1.35%或约1.40%。
E50.如E45-E49中任一项所述的方法,其中所述高甘露糖是甘露糖-5(Man-5)。
E51.如E45-E50中任一项所述的方法,其中所述FcγR是FcγRIIa。
E52.如E45-E51中任一项所述的方法,其中通过体外细胞毒性测定诸如KILRTM细胞毒性测定来测量所述FcγR介导的细胞毒性。
E53.如E45-E52中任一项所述的方法,其中所述FcγR介导的细胞毒性是FcγRIIa介导的细胞毒性。
E54.一种将帕尼单抗样品的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性与参考值匹配的方法,该方法包括:
(1)获得FcγR介导的细胞毒性的参考值;
(2)确定所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;以及
(3)通过增加或降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量来改变所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;使得该帕尼单抗样品与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约35%或更低。
E55.如E54所述的方法,其中该帕尼单抗样品与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约30%或更低、约25%或更低、约20%或更低、约15%或更低、约10%或更低或者约5%或更低。
E56.如E54或E55所述的方法,其中通过降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量来增加该帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。
E57.如E54-E56中任一项所述的方法,其中高甘露糖聚糖的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性增加约1.2%至约1.40%,诸如约1.2%、约1.25%、约1.3%、约1.35%或约1.40%。
E58.如E54或E55所述的方法,其中通过增加在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量来降低该帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。
E59.如E54、E55或E58中任一项所述的方法,其中高甘露糖聚糖的约1%的增加将FcγR介导的细胞毒性降低约1.2%至约1.40%,诸如约1.2%、约1.25%、约1.3%、约1.35%或约1.40%。
E60.如E54-E59中任一项所述的方法,其中所述高甘露糖是甘露糖-5(Man-5)。
E61.如E54-E60中任一项所述的方法,其中所述FcγR是FcγRIIa。
E62.如E54-E61中任一项所述的方法,其中通过体外细胞毒性测定诸如KILRTM细胞毒性测定来测量所述FcγR介导的细胞毒性。
E63.如E54-E62中任一项所述的方法,其中所述FcγR介导的细胞毒性是FcγRIIa介导的细胞毒性。
E64.一种调节帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括:
(i)增加或降低帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加或降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量;
(ii)增加或降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者增加或降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量;和/或
(iii)增加或降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量。
E65.一种增加帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括:
(i)增加帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量;
(ii)增加在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量;和/或
(iii)降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量。
E66.一种降低帕尼单抗的Fc受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括:
(i)降低帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量;
(ii)降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者增加在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量;和/或
(iii)增加在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量。
E67.一种抗体组合物,该抗体组合物通过如E1-E66中任一项所述的方法产生。
E68.一种药物组合物,该药物组合物包含如E67所述的抗体组合物以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
附图说明
图1A是三种类型的N-聚糖(寡甘露糖、复合物和杂合体)和此类糖的常用符号的说明。图1B是在人IgG中发现的主要N-连接聚糖的说明,在N-糖基化位点天冬酰胺(Asn)297处具有寡糖结构的代表性附接。这些聚糖通常包含核心庚糖以及通过可变添加岩藻糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、唾液酸(SA)和平分的N-GlcNAc构建的外臂。图1C是在细胞毒性报告基因测定中评估的三种主要聚糖种类的结构的总结,这三种主要聚糖种类包括去岩藻糖基化种类(即缺乏核心岩藻糖的种类,包括G0或G1)、高甘露糖种类(包括M5种类)或末端β-半乳糖种类(即末端β-半乳糖,包括G1F或G2F)种类。图1D提供了总结聚糖富集和工程化样品制备的基本示意性流程图。图1E是岩藻糖代谢的补救途径和从头途径的图。在补救途径中,游离L-岩藻糖转化为GDP-岩藻糖,而在从头路径中,经由GMD和FX催化的三个反应合成GDP-岩藻糖。然后,GDP-岩藻糖通过GDP-Fuc转移酶从胞质溶胶转运到高尔基体腔,并且转移到受体寡糖和蛋白质。另一种反应产物GDP通过腔核苷酸二磷酸酶转化为鸟苷5-单磷酸(GMP)和无机磷酸盐(Pi)。前者被输出到胞质溶胶中(经由与GDP-岩藻糖的转运偶联的反向运输系统),而后者被假定经由高尔基体阴离子通道GOLAC离开高尔基体腔。参见例如,Nordeen等人2000;Hirschberg等人2001。
图2A示出了作为β-半乳糖基化水平的函数的FcγRIIa信号传导活性。图2B示出了代表性剂量-反应曲线重叠。线性回归线(与所示的等式)适用于所测量活性的图(图2A),并且在相关线形图内提供了各种活性水平的代表性剂量-反应曲线(图2B)。此数据展现了ADCC报告基因测定的定量性质和范围、及其对于评估影响ADCC活性的质量属性的适合性。较高水平的β-半乳糖通常导致较高的细胞毒性。
图3A示出了作为去岩藻糖基化水平的函数的FcγRIIa信号传导活性。图3B示出了代表性剂量-反应曲线重叠。线性回归线(与所示的等式)适用于所测量活性的图(图3A),并且在相关线形图内提供了各种活性水平的代表性剂量-反应曲线(图3B)。较高水平的去岩藻糖基化通常导致较低的细胞毒性。
图4A示出了作为高甘露糖水平的函数的FcγRIIa信号传导活性。图4B示出了代表性剂量-反应曲线重叠。线性回归线(与所示的等式)适用于所测量活性的图(图4A),并且在相关线形图内提供了各种活性水平的代表性剂量-反应曲线(图4B)。较高水平的高甘露糖通常导致较低的细胞毒性。
图5示出了使用KILR测定测得的富集的聚糖样品的PBMC介导的细胞毒性的代表性剂量曲线。
图6A-6D是示出了来自对于FcγRIIa和FcγRIIIa受体分别具有(A)HHVV、(B)HHFF、(C)RRFV和(D)HHFV多态性的供体的作为帕尼单抗去岩藻糖基化水平的函数的PBMC介导的细胞毒性的图。
图7A-7D是示出了来自对于FcγRIIa和FcγRIIIa受体分别具有(A)HHVV、(B)HHFF、(C)RRFV和(D)HHFV多态性的供体的作为帕尼单抗高甘露糖水平的函数的PBMC介导的细胞毒性的图。
图8A-8D是示出了来自对于FcγRIIa和FcγRIIIa受体分别具有(A)HHVF、(B)RRVF、(C)HHVV和(D)RRFF多态性的供体的作为帕尼单抗β-半乳糖水平的函数的PBMC介导的细胞毒性的图。
图9A是PBMC细胞毒性活性的代表性帕尼单抗剂量曲线。图9B是示出了使用针对所指示受体的抗体或对照阻断FcγR的图。
图10A-10C是示出了帕尼单抗或对照与以下的结合的SPR传感图:(A)在高达10uM抗体下的FcγRI;(B)在高达10uM抗体下的FcγRIIIa-158F;以及(C)在高达10uM抗体下的FcγRIIa-131H。
图11A-11B是(A)岩藻糖富集的和(B)非岩藻糖富集的样品中的帕尼单抗与huFcgRIIa-131H的结合的SPR平衡结合曲线,表观KD分别为约7.9μM和8μM。
具体实施方式
1.概述
用作生物治疗剂的最常见的人抗体亚类IgG1和IgG2具有非常不同的免疫特性。常见的效应子功能(诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))可以是IgG1抗体的重要作用机制。以前,并不知道IgG2抗体表现出效应子功能。然而,最近,已经证明帕尼单抗可以通过接合FcγRIIa介导与ADCC类似的细胞毒性效应。这与通过IgG1与FcγRIIIa接合介导的常规ADCC相反。
帕尼单抗是一种与人表皮生长因子受体(也称为EGF受体、EGFR、ErbB-1和HER1)结合的人IgG2单克隆抗体。帕尼单抗的近似分子量为147kD。重链和轻链序列在表1中分别显示为SEQ ID No.1和2。帕尼单抗具有位于每条重链的第2恒定结构域中的两个N-糖基化位点。根据Kabat EU编号,N-糖基化位点通常称为残基N-297。实际残基编号是SEQ ID NO:1的残基295。
如本文所述和例示,诸位发明人对介导帕尼单抗的细胞毒性的机制以及影响帕尼单抗的FcγR介导的细胞毒性水平的产品质量属性进行了广泛的研究。诸位发明人发现细胞毒性主要由髓系细胞(单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞)介导。然后诸位发明人研究了此IgG2分子中的不同聚糖对效应子功能的影响。使用敏感的细胞毒性测定与帕尼单抗的糖工程化形式的组合,诸位发明人发现,根据糖型,不同聚糖对FcγRIIa介导的细胞杀伤的影响可以是实质性的且可变的。
例如,N-297位点处的半乳糖基化在报告基因中显示出正相关,而N-297位点处的去岩藻糖基化水平和高甘露糖水平显示出与细胞杀伤逆相关。因此,可以通过以下方式增加帕尼单抗的FcγR介导的细胞毒性:(1)增加N-297位点处的半乳糖基化水平;(2)降低N-297位点处的去岩藻糖基化水平;和/或(3)降低N-297位点处的高甘露糖水平。相反,可以通过以下方式降低帕尼单抗的FcγR介导的细胞毒性:(1)降低N-297位点处的半乳糖基化水平;(2)增加N-297位点处的去岩藻糖基化水平;和/或(3)增加N-297位点处的高甘露糖水平。
帕尼单抗目前在基因工程化哺乳动物(中国仓鼠卵巢)细胞中生产。在重组生产过程期间,通过翻译后修饰将聚糖部分附接到抗体上。诸位发明人在本文中的发现提供了帕尼单抗的糖型谱与其细胞毒性之间的可量化关系。该发现可以用于在CHO细胞生产过程期间调节糖基化模式,使得细胞毒性水平符合所需的参考水平。
2.定义
“帕尼单抗”(商品名)是指包含含有SEQ ID NO:1的重链和含有SEQ IDNO:2的轻链的人单克隆抗体。地舒单抗(denosumab)的重链和轻链的氨基酸序列示于表1中。编码SEQ ID No:1和2的核酸序列分别显示为SEQ ID No.3和4。如实例中所说明,帕尼单抗的聚糖谱可以变化。
表1帕尼单抗的序列
术语“聚糖(glycan)”、“聚糖(glycans)”、“糖型(glycoform)”或“糖型(glycoforms)”是指通过各种糖苷键连接的单糖种类的寡聚物。在哺乳动物N-连接聚糖中常见的单糖的实例包括己糖(Hex)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)和N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。在重组IgG2抗体上发现的主要N-聚糖种类包括岩藻糖、半乳糖、甘露糖、唾液酸和GlcNAc,如图1B、1C和表2所描绘的。在帕尼单抗的情况下,聚糖寡糖结构连接到Asn-297(Kabat EU编号)处的N-糖基化位点,并且通常由核心庚糖与通过可变添加岩藻糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、唾液酸(SA)和平分的N-GlcNAc构建的外臂构成。每个潜在的寡糖结构可以缩写如下:G0、G1或G2分别是指具有零个、一个或两个末端半乳糖分子的核心GlcNAc和甘露糖寡糖结构。在G1内,可以存在两个额外的结构(缩写为G1a和G1b),其中G1a或G1b是指末端半乳糖基团是附接到核心结构的6臂还是3臂。参见图1B和1C。当被岩藻糖基化(即岩藻糖基团附接到核心聚糖结构)时,G0、G1(G1a/G1b)或G2形式可以缩写为G0F、G1F(G1aF/G1bF)或G2F。当存在唾液酸时,这些缩写含有“S”,使得例如,G2FS2是指具有两个半乳糖、一个岩藻糖和两个唾液酸基团的聚糖。还可以存在连接到抗体的额外的聚糖,包括高甘露糖(HM)结构,其通过掺入额外的甘露糖基团而形成,包括高甘露糖种类(例如,“Man5”或“M5”,如图1C和表2所示)。如本文所用,术语“聚糖(glycan)”或“聚糖(glycans)”是指本文所述的单糖种类的任何寡聚物或连接到抗体的单糖种类的任何其他寡聚物。
基于EU编号系统,IgG2的N-糖基化位点(位于重链的第2恒定结构域)通常称为N-297。比较不同编号系统的完整图表由国际免疫遗传学信息系统(InternationalImmunogenetics Information System)提供(“IMGT科学图表(IMGT Scientificchart)”)。IMGT科学图表适用于IgG1,通过比对相应的序列可以容易地获得IgG2中的对应编号。
术语“末端β-半乳糖”、“半乳糖基化聚糖”或“G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖”是指包含通过附接到核心甘露糖结构的N-乙酰葡糖胺部分在N-糖基化位点(Asn-297)处连接到IgG抗体的一个或两个半乳糖分子的聚糖。包含“末端β-半乳糖”、“半乳糖基化聚糖”或“G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖”的示例性聚糖描绘于图1B和1C中。在一些实施例中,G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖可以含有或可以不含核心岩藻糖。
术语“核心岩藻糖”或“岩藻糖基化种类”是指包含通过附接到核心甘露糖结构的N-乙酰葡糖胺部分在N-糖基化位点(Asn-297)处连接到IgG抗体的岩藻糖分子(α1-6)的聚糖。包含“核心岩藻糖”或“岩藻糖基化聚糖”的示例性聚糖描绘于图1B和1C中。在一些实施例中,含有核心岩藻糖和/或岩藻糖基化聚糖的抗体可以含有或可以不含其他聚糖(包括末端β-半乳糖和/或高甘露糖聚糖)。
术语“去岩藻糖基化(afucosylated)”、“去岩藻糖基化聚糖”或“去岩藻糖基化(afucosylation)”是指在抗体上除去或缺乏核心岩藻糖。示例性去岩藻糖基化聚糖描绘于图1B和1C中。在一些实施例中,缺乏核心岩藻糖的抗体可以含有或可以不含其他聚糖(包括末端β-半乳糖和/或高甘露糖聚糖)。去岩藻糖基化糖型包括但不限于A1G0、A1G1a、A2G0、A2G1a、A2G1b、A2G2和A1G1M5。参见例如,Reusch和Tejada,Glycobiology[糖生物学]25(12):1325-1334(2015)。
术语“高甘露糖”、“高甘露糖聚糖”或“HM”是指包含在N-糖基化位点(Asn-297)处连接到IgG抗体的多于3个甘露糖分子的聚糖。示例性高甘露糖抗体描绘于图1C和表2中,包括含有两个额外的甘露糖分子的“Man-5高甘露糖聚糖”。高甘露糖聚糖涵盖包含5、6、7、8或9个甘露糖残基的聚糖,分别缩写为Man 5或M5、Man 6或M6、Man 7或M7、Man 8或M8和Man 9或M9。下面示出了Man 6、Man 7和Man 8的示例性结构。
表2.示例性高甘露糖结构
“FcγR”或“Fcγ受体”是属于参与诱导受调理细胞或微生物的吞噬的IgG超家族的蛋白质。参见例如,Fridman WH.Fc receptors and immunoglobulin binding factors[Fc受体和免疫球蛋白结合因子].FASEB Journal.[美国实验生物学会联合会杂志]5(12):2684-90(1991)。Fcγ受体家族的成员包括:FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和FcγRIIIB的序列可以在许多序列数据库中找到,例如在Uniprot数据库(www.uniprot.org)分别于登录号P12314(FCGR1_人)、P12318(FCG2A_人)、P31994(FCG2B_人)、P08637(FCG3A_人)和P08637(FCG3A_人)下找到。
除非本文另外指示或上下文明显矛盾,否则如本文所用,在描述本披露的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中),术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该(the)”以及类似指示物应被视为涵盖单数与复数两者。除非另外说明,否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应被解释为开放性术语(即,意指“包括但不限于”,并且允许存在一个或多个特征或组分)。术语“一个/一种(a)”(或“一个/一种(an)”)以及术语“一个或多个/一种或多种(one or more)”和“至少一个/至少一种(at least one)”可以在本文中互换使用。此外,“和/或”在本文中使用的情况下应被视为具有或不具有另一个指定特征或组分的两个指定特征或组分中的每一个的具体披露。因此,如在本文中在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样,如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个:A、B和C;A、B或C;A或C;A或B;B或C;A和C;A和B;B和C;A(单独);B(单独);以及C(单独)。
如在整个说明书和权利要求书中与数值相连使用的术语“约”表示本领域技术人员熟悉且可接受的精度区间。通常,这种精度区间为±10%。
3.翻译后糖基化和FcγR介导的细胞毒性
3.1翻译后糖基化
许多分泌的蛋白质经历翻译后糖基化,一种糖部分(例如,聚糖、糖)共价附接到蛋白质的特定氨基酸的过程。在真核细胞中,发生两种类型的糖基化反应:(1)N-连接糖基化,其中聚糖附接到识别序列Asn-X-Thr/Ser的天冬酰胺,其中“X”是除脯氨酸外的任何氨基酸;以及(2)O-连接糖基化,其中聚糖附接到丝氨酸或苏氨酸。不管糖基化类型如何(N-连接还是O-连接),由于与每个位点(O或N)相关的大范围的聚糖结构,存在蛋白质糖型的微不均一性。对于IgG2抗体,在天冬酰胺-297(N-297)位点(Eu编号系统)处发生N-连接糖基化。对于帕尼单抗,此天冬酰胺的实际位置出现在残基编号295处,但是通常,N-糖基化位点仍称为N-297以与EU编号系统一致。
所有N-聚糖均具有共同的核心糖序列:Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn-X-Ser/Thr(Man3GlcNAc2Asn),并且被归类为以下三种类型之一:(A)高甘露糖(HM)或寡甘露糖(OM)类型,其由两个N-乙酰葡糖胺(GalNAc)部分和大量的(例如,5、6、7、8或9个)甘露糖(Man)残基组成;(B)复合物类型,其包含多于两个GlcNAc部分和任何数目的其他糖类型;或(C)杂合体类型,其包含分支的一侧的Man残基和复合物分支的基部的GlcNAc。图1A(基于Stanley等人,Chapter 8:N-Glycans,Essentials of Glycobiology[第8章:N-聚糖,糖生物学基础],第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社];2009)示出了三种类型的N-聚糖。
N-连接聚糖通常包含半乳糖(Gal)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、甘露糖(Man)、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、岩藻糖(Fuc)中的一种或多种单糖。此类糖的常用符号示于图1A中。
聚糖结构的糖组成和结构构型根据ER和高尔基体中的糖基化机器、机械酶对聚糖结构的可及性、每种酶的作用顺序和蛋白质从糖基化机器中释放所处的阶段以及其他因素而变化。控制聚糖结构在治疗性单克隆抗体的重组生产中是重要的,因为附接到Fc结构域的聚糖结构影响与介导细胞毒性的FcγR的相互作用。
3.2影响FcγR介导的细胞毒性的聚糖
本披露鉴定了各种聚糖(包括例如β-半乳糖、核心岩藻糖和/或高甘露糖)对IgG2抗体(诸如帕尼单抗)的FcγR介导的细胞毒性的影响。因此,本披露提供了调节IgG2抗体(诸如帕尼单抗)或包含该抗体的组合物(抗体组合物)的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法。在示例性实施例中,该方法包括调节以下的量:(a)该抗体的半乳糖基化聚糖;(b)该抗体的去岩藻糖基化聚糖;(c)该抗体的高甘露糖聚糖;或(d)其组合。不受特定理论的束缚,据信本文披露的方法提供了用于定制组合物的手段,这些组合物包含给定抗体的特定量的特定糖型,这些糖型表现出目标水平的FcγR介导的细胞毒性。特别相关的聚糖结构说明于图1C中。
在示例性方面,本披露提供的方法涉及IgG2抗体(诸如帕尼单抗)或包含该抗体的组合物(抗体组合物)的调节,其中采取步骤以达到该IgG2抗体的糖型的所需或预定水平,使得该抗体或抗体组合物表现出所需或预定参考水平的FcγR介导的细胞毒性。在示例性实施例中,该方法包括调节(增加或降低)该IgG2抗体(诸如帕尼单抗)的以下的量:(a)半乳糖基化聚糖;(b)去岩藻糖基化聚糖;(c)高甘露糖聚糖;或(d)其组合,以调节(增加或降低)由该抗体诱导或刺激的FcγR介导的细胞毒性。在示例性实施例中,该方法包括调节(增加或降低)糖型的量,这些糖型是例如(a)半乳糖基化糖型;(b)去岩藻糖基化糖型;(c)高甘露糖糖型;或(d)其组合,以调节(增加或降低)由该抗体诱导或刺激的FcγR介导的细胞毒性。
当提及特定聚糖的量(包括例如(1)末端β-半乳糖的量、(2)G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的量、(3)核心岩藻糖的量、(4)岩藻糖基化聚糖的量、(5)去岩藻糖基化聚糖的量、(6)高甘露糖聚糖的量和/或(7)Man-5聚糖的量)时,术语“量”是指N-297位点处的特定聚糖与N-297位点处的聚糖总量相比的相对百分比。因为在单个分子水平上对聚糖种类进行计数是不切实际的/不可能的,所以通常根据常用的分析方法基于相对百分比来计算本文所述的聚糖含量的量。例如,如实例2.2中所例示,用酶从蛋白质中释放所有N-聚糖;然后通过亲水相互作用液相色谱(HILIC)分离聚糖。HILIC产生各种峰,每个峰代表聚糖种类。特定聚糖的量基于其峰的面积计算为占所有峰的总面积的相对百分比。因此,除非另外说明,否则聚糖的量是指使用任何常用的分析方法(诸如HPAEC、CE-SDS、HILIC或LC-MS)得到的该特定聚糖种类占N-297位点处的总N-聚糖的相对百分比。
用于测量和确定聚糖(包括例如末端β-半乳糖,G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖,核心岩藻糖,岩藻糖基化聚糖,去岩藻糖基化聚糖,高甘露糖聚糖,和/或Man-5聚糖)的量或相对百分比的方法是本领域公知的,并且包括例如如实例中所述的亲水相互作用液相色谱(HILIC)。还参见,Pace等人,Characterizing the Effect of Multiple Fc GlycanAttributes on the Effector Functions and FcγRIIIa Receptor Binding Activityof an IgG1 Antibody[表征多种Fc聚糖属性对IgG1抗体的效应子功能和FcγRIIIa受体结合活性的影响],Biotechnol.Prog.[生物技术进展],2016,第32卷,第5期第1181-1192页;以及Shah,B.等人LC-MS/MS Peptide Mapping with Automated Data Processing forRoutine Profiling of N-Glycans in Immunoglobulins[用于免疫球蛋白中N-聚糖的常规分析的LC-MS/MS肽谱分析与自动化数据处理]J.Am.Soc.Mass Spectrom.[美国质谱学会杂志](2014)25:999,各自出于所有目的通过援引并入本文。在一些实施例中,可以将量确定或计算为摩尔%掺入。
在一些方面,本文披露的方法包括调节附接到特定IgG2分子(诸如帕尼单抗)的末端β-半乳糖、核心岩藻糖或高甘露糖或其组合的量。
例如,该方法可以包括通过例如有效地将聚糖从G0改变为G1或G2或者从G1改变为G2来增加IgG2(诸如帕尼单抗)上的末端β-半乳糖的量,以增加FcγR介导的细胞毒性。替代性地,可以通过增加在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的抗体分子的量来增加FcγR介导的细胞毒性。此外,例如,该方法可以包括通过例如有效地将聚糖从G2改变为G1或G0或者从G1改变为G0来降低IgG2(诸如帕尼单抗)上的末端β-半乳糖的量,以降低FcγR介导的细胞毒性。替代性地,可以通过降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的抗体分子的量来降低FcγR介导的细胞毒性。
在其他示例性方面,该方法可以包括增加IgG2(诸如帕尼单抗)上的核心岩藻糖的量,以增加FcγR介导的细胞毒性。可以通过增加在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的抗体分子的量,或者通过降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的抗体分子的量来增加FcγR介导的细胞毒性。此外,该方法可以包括降低IgG2(诸如帕尼单抗)上的核心岩藻糖的量,以降低FcγR介导的细胞毒性。可以通过降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的抗体分子的量,或者通过增加在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的抗体分子的量来降低FcγR介导的细胞毒性。
在其他示例性方面,该方法可以包括降低IgG2(诸如帕尼单抗)上的高甘露糖(例如,Man-5)的量,以增加FcγR介导的细胞毒性。可以通过降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的抗体分子的量来增加FcγR介导的细胞毒性。此外,该方法可以包括增加IgG2(诸如帕尼单抗)上的甘露糖(例如,Man-5)的量,以降低FcγR介导的细胞毒性。可以通过增加在N-297位点处包含甘露糖(例如,Man-5)的抗体分子的量来降低FcγR介导的细胞毒性。
3.3调节FcγR介导的细胞毒性
存在两种不同类别的Fcγ受体-在其交联后激活细胞的那些(“激活FcR”)和在共接合后抑制激活的那些(“抑制性FcR”)。在人中,IgG有两种低亲和力激活FcR-FcγRIIa和FcγRIIIa。FcγRIIa(或FcγRIIA)是IgG的单链低亲和力受体,具有位于其胞质尾中的ITAM序列。它在巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和一些B细胞上表达。它在其胞外结构域中与人抑制性FcRIIb分子90%同源,该FcRIIb分子在其胞质结构域中具有ITIM序列,在B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞上表达,但是不在NK细胞或T细胞上表达。FcγRIIIa(或FcγRIIIA)是由配体结合α亚基和含有ITAM的γ或ζ亚基组成的寡聚激活受体。它在NK细胞、巨噬细胞和肥大细胞上表达。它不在嗜中性粒细胞、B细胞或T细胞上表达。另外,在其胞外结构域中具有大于95%序列同一性的受体(称为FcRIIIb)在人嗜中性粒细胞上作为GPI锚定蛋白被发现。它能够在不与含有ITAM的受体(像FcRIIa)缔合的情况下结合免疫复合物,但是不能激活细胞。FcRII和FcRIII在其配体结合胞外结构域中具有约70%同一性。
因此,在人中,IgG细胞毒性抗体与四种不同的低亲和力受体相互作用-其中的两种能够激活细胞反应,FcRIIa和FcRIIIa;其中的一种是抑制性的,FcRIIb;并且其中的一种将结合IgG复合物,但是不触发细胞反应,FcRIIIb。巨噬细胞表达FcRIIa、FcRIIb和FcRIIIa,嗜中性粒细胞表达FcRIIa、FcRIIb和FcRIIIb,而NK细胞仅表达FcRIIIa。因此,治疗性抗肿瘤抗体的功效将取决于与在不同细胞类型上差异表达的激活、抑制和惰性低亲和力FcR的特异性相互作用。
研究治疗性抗肿瘤抗体的细胞毒性的明确的肿瘤模型是已知的。例如,Matui等人描述了使用A431细胞的体外系统以及在无胸腺小鼠中使用A431细胞异种移植物的体内系统,以研究与EGFR结合的IgG1和IgG2抗体的细胞毒性。
在某些方面,本文所述的FcγR介导的细胞毒性由FcγRIIa介导。
在某些方面,该FcγR介导的细胞毒性是FcγRIIa介导的细胞毒性。
在某些方面,使用FcγR报告基因测定来测量或确定本文所述的FcγR介导的细胞毒性。在某些方面,该报告基因测定包含Jurkat细胞。在某些方面,该报告基因测定包含表达FcγR受体、NFAT响应元件和/或报告基因的Jurkat细胞。报告基因可以是其表达提供可测量信号的任何基因。示例性报告基因包括编码以下的基因:绿色荧光蛋白(GFP)、抗生素抗性蛋白(例如,氯霉素转移酶)、毒蛋白(例如,GATA-1DNA结合结构域、大肠菌素裂解蛋白)、β-半乳糖苷酶、大肠杆菌(E.coli)β-半乳糖苷酶(LacZ)、盐杆菌属(Halobacterium)β-半乳糖苷酶、脉孢菌属(Neuropsora)酪氨酸酶、人胎盘碱性磷酸酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、水母发光蛋白(水母生物发光)、来自美国萤火虫(American firefly/Photinuspyralis)的萤火虫萤光素酶(EC 1.13.12.7)、来自海肾(sea pansy/Renilla reniformis)的海肾萤光素酶(EC 1.13.12.5)和来自费氏发光杆菌(Photobacterium fischeri)的细菌萤光素酶(EC 1.14.14.3)。各种其他报告基因是本领域普通技术人员熟知的。在一个示例性实施例中,该报告基因编码萤光素酶。
在某些方面,使用ADCC测定试剂盒测量本文所述的FcγR介导的细胞毒性。ADCC测定试剂盒是可商购获得的,诸如普洛麦格公司(Promega)的“ADCC报告生物测定(ADCCReporter Bioassays)”(目录号G7010或G7018)。
在某些方面,本披露提供了与对照或参考值相比增加IgG2抗体(诸如帕尼单抗)或包含该抗体的组合物的FcγR介导的细胞毒性的方法。在示例性实施例中,该增加是与对照或参考值相比至少或约0.1%至约100%的增加(例如,至少或约0.1%的增加、至少或约0.2%的增加、至少或约0.3%的增加、至少或约0.4%的增加、至少或约0.5%的增加、至少或约0.55%的增加、至少或约0.6%的增加、至少或约0.65%的增加、至少或约0.7%的增加、至少或约0.75%的增加、至少或约0.8%的增加、至少或约0.9%的增加、至少或约1%的增加、至少或约1.2%的增加、至少或约1.25%的增加、至少或约1.3%的增加、至少或约1.35%的增加、至少或约1.4%的增加、至少或约1.5%的增加、至少或约2%的增加、至少或约2.5%的增加、至少或约2.7%的增加、至少或约2.75%的增加、至少或约2.8%的增加、至少或约2.85%的增加、至少或约2.9%的增加、至少或约2.95%的增加、至少或约3%的增加、至少或约4%的增加、至少或约5%的增加、至少或约6%的增加、至少或约7%的增加、至少或约8%的增加、至少或约9%的增加、至少或约9.5%的增加、至少或约10%的增加、至少或约15%的增加、至少或约20%的增加、至少或约25%的增加、至少或约30%的增加、至少或约35%的增加、至少或约40%的增加、至少或约45%的增加、至少或约50%的增加、至少或约55%的增加、至少或约60%的增加、至少或约65%的增加、至少或约70%的增加、至少或约75%的增加、至少或约80%的增加、至少或约85%的增加、至少或约90%的增加、至少或约95%的增加或者至少或约100%的增加)。在示例性实施例中,该增加与对照或参考值相比超过100%,例如至少或约125%、至少或约150%、至少或约175%、至少或约200%、至少或约300%、至少或约400%、至少或约500%、至少或约600%、至少或约700%、至少或约800%、至少或约900%或者至少或约1000%。在示例性实施例中,该抗体或包含该抗体的组合物的FcγR介导的细胞毒性与对照或参考值相比增加至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍或至少约1.9倍。在示例性实施例中,该抗体或包含该抗体的组合物的FcγR介导的细胞毒性相对于对照或参考值增加至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍或至少约10倍。在示例性实施例中,该抗体或包含该抗体的组合物的FcγR介导的细胞毒性与对照或参考值相比增加从约1.1倍至约10倍、从约1.2倍至约10倍、从约1.3倍至约10倍、从约1.4倍至约10倍、从约1.5倍至约10倍、从约1.1倍至约5倍、从约1.2倍至约5倍、从约1.3倍至约5倍、从约1.4倍至约5倍或从约1.5倍至约5倍。
在某些方面,本披露提供了与对照或参考值相比降低IgG2抗体(诸如帕尼单抗)或包含该抗体的组合物的FcγR介导的细胞毒性的方法。在示例性实施例中,该降低是与对照或参考值相比至少或约0.1%至约100%的降低(例如,至少或约0.1%的降低、至少或约0.2%的降低、至少或约0.3%的降低、至少或约0.4%的降低、至少或约0.5%的降低、至少或约0.55%的降低、至少或约0.6%的降低、至少或约0.65%的降低、至少或约0.7%的降低、至少或约0.75%的降低、至少或约0.8%的降低、至少或约0.9%的降低、至少或约1%的降低、至少或约1.2%的降低、至少或约1.25%的降低、至少或约1.3%的降低、至少或约1.35%的降低、至少或约1.4%的降低、至少或约1.5%的降低、至少或约2%的降低、至少或约2.5%的降低、至少或约2.7%的降低、至少或约2.75%的降低、至少或约2.8%的降低、至少或约2.85%的降低、至少或约2.9%的降低、至少或约2.95%的降低、至少或约3%的降低、至少或约4%的降低、至少或约5%的降低、至少或约6%的降低、至少或约7%的降低、至少或约8%的降低、至少或约9%的降低、至少或约9.5%的降低、至少或约10%的降低、至少或约15%的降低、至少或约20%的降低、至少或约25%的降低、至少或约30%的降低、至少或约35%的降低、至少或约40%的降低、至少或约45%的降低、至少或约50%的降低、至少或约55%的降低、至少或约60%的降低、至少或约65%的降低、至少或约70%的降低、至少或约75%的降低、至少或约80%的降低、至少或约85%的降低、至少或约90%的降低、至少或约95%的降低或者至少或约100%的降低)。在示例性实施例中,该降低与对照或参考值相比超过100%,例如至少或约125%、至少或约150%、至少或约175%、至少或约200%、至少或约300%、至少或约400%、至少或约500%、至少或约600%、至少或约700%、至少或约800%、至少或约900%或者至少或约1000%。在示例性实施例中,该抗体或包含该抗体的组合物的FcγR介导的细胞毒性与对照或参考值相比降低至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍或至少约1.9倍。在示例性实施例中,该抗体或包含该抗体的组合物的FcγR介导的细胞毒性与对照或参考值相比降低至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍或至少约10倍。在示例性实施例中,该抗体或包含该抗体的组合物的FcγR介导的细胞毒性与对照或参考值相比降低从约1.1倍至约10倍、从约1.2倍至约10倍、从约1.3倍至约10倍、从约1.4倍至约10倍、从约1.5倍至约10倍、从约1.1倍至约5倍、从约1.2倍至约5倍、从约1.3倍至约5倍、从约1.4倍至约5倍或从约1.5倍至约5倍。
如本文所用,这里的“对照”或“参考值”是在旨在调节聚糖谱的实验干预之前该抗体或包含该抗体的组合物的FcγR介导的细胞毒性水平(诸如第一次测量时的细胞毒性水平)。如果抗体或包含该抗体的组合物已经经历了旨在调节聚糖谱的实验干预,但是需要进行额外的调节,则“对照”或“参考值”可以是在旨在进一步调节聚糖谱的任何额外的实验干预之前的FcγR介导的细胞毒性水平。
在某些方面,该参考值是由可商购获得的帕尼单抗样品在相同剂量下(例如,相同量的抗体分子)表现出的FcγR介导的细胞毒性水平。在某些方面,该参考值是提供治疗益处的预定水平。
在某些方面,本披露提供了一种方法,该方法包括将该抗体的特定聚糖种类(例如,半乳糖基化聚糖,G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖,岩藻糖基化聚糖,去岩藻糖基化聚糖,核心岩藻糖,高甘露糖聚糖,Man-5聚糖或其组合)的量调节(即增加或降低)到至少或约0.5%、至少或约1%、至少或约2%、至少或约3%、至少或约5%、至少或约7%、至少或约10%、至少或约15%、至少或约20%、至少或约25%、至少或约30%、至少或约35%、至少或约40%、至少或约45%、至少或约50%、至少或约55%、至少或约60%、至少或约65%、至少或约70%、至少或约75%、至少或约80%、至少或约85%、至少或约90%、至少或约95%、至少或约96%、至少或约97%、至少或约98%、从约0.5%至约98%、从约0.5%至约98%、从约0.5%至约98%、从约0.1%至约99%、从约0.5%至约98%、从约0.5%至约95%、从约1%至约90%、从约1%至约85%、从约5%至约85%、从约10%至约85%或从约10%至约80%的总量。如上所述,当描述特定聚糖种类时,百分比通常是指根据任何本领域公认的分析方法(诸如HILIC、LC-MS)计算的特定聚糖种类占N-297位点处的总聚糖含量的相对百分比。在一个示例性实施例中,根据色谱峰的面积计算相对百分比。
在某些方面,本披露提供了调节帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加或降低帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加或降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。
在某些实施例中,本披露提供了增加帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。在某些实施例中,β-半乳糖的约1%的增加将FcγR介导的细胞毒性增加从约0.55%至约0.75%,诸如约0.55%、约0.6%、约0.65%、约0.7%或约0.75%。如上所述,β-半乳糖或者G1、G1a、G1b、G2半乳糖基化聚糖的百分比是指相应的聚糖种类占N-297位点处的总聚糖含量的相对百分比。
当量化FcγR介导的细胞毒性与各种聚糖(例如,特定聚糖的百分比水平变化与细胞毒性水平的对应变化)之间的关系时,FcγR介导的细胞毒性通常表示为相对于标准量化的相对值。例如,“%相对活性”(相对于标准)可以用于表示FcγR介导的细胞毒性水平。“%相对活性”可以计算为:(i)样品的细胞毒活性/标准的细胞毒活性(“/”意指除以);或(ii)标准的细胞毒活性/样品的细胞毒活性(“/”意指除以)。例如,如果样品A与标准相比表现出50%的细胞毒性水平,并且样品B与同一标准相比表现出51%的细胞毒性水平,则可以说FcγR介导的细胞毒性从样品A至样品B增加1%。
在某些实施例中,该标准是由可商购获得的帕尼单抗样品在相同剂量下(例如,相同量的抗体分子)表现出的FcγR介导的细胞毒性水平。因此,在某些实施例中,使用相对细胞毒性水平确立定量关系。例如,参考图2A,当末端β-半乳糖为约0%时,相对细胞毒性水平(相对于相同剂量下的可商购获得的帕尼单抗样品计算)为约88%。当末端β-半乳糖增加至约10%时,相对细胞毒性水平(相对于相同剂量下的可商购获得的帕尼单抗样品计算)为约95%。因此,末端β-半乳糖的约1%的增加与FcγR介导的细胞毒性的约0.67%的增加相关。这意味着对于末端β-半乳糖的每1%增加,帕尼单抗样品的相对细胞毒性水平增加0.67%。
在某些实施例中,可以基于在生物测定中测量的EC50值来计算相对细胞毒性水平。例如,如果使用报告基因确定样品抗体表现出的细胞毒性的EC50,则相对细胞毒性水平可以计算为EC50样品/EC50标准或EC50标准/EC50样品(“/”意指除以)。
如果愿意,可以多次(例如,两次、三次、四次)测量样品的相对细胞毒性值,并且结果可以报告为这多个值的平均值。
在某些实施例中,本披露提供了降低帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括降低帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。在某些实施例中,β-半乳糖的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性降低从约0.55%至约0.75%,诸如约0.55%、约0.6%、约0.65%、约0.7%或约0.75%。同样,通常如上所述基于相对细胞毒性值来计算细胞毒性水平的变化。
在某些方面,本披露提供了调节帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加或降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者增加或降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。
在某些实施例中,本披露提供了增加帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。在某些实施例中,岩藻糖基化帕尼单抗分子的约1%的增加将FcγR介导的细胞毒性增加从约2.70%至约3.0%,诸如约3.0%、约2.95%、约2.90%、约2.85%或约2.70%。在某些实施例中,本披露提供了增加帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。在某些实施例中,去岩藻糖基化帕尼单抗分子的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性增加从约2.70%至约3.0%,诸如约3.0%、约2.95%、约2.90%、约2.85%或约2.70%。同样,通常如上所述基于相对细胞毒性值来计算细胞毒性水平的变化。
在某些实施例中,本披露提供了降低帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。在某些实施例中,岩藻糖基化帕尼单抗分子的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性增加从约2.70%至约3.0%,诸如约3.0%、约2.95%、约2.90%、约2.85%或约2.70%。在某些实施例中,本披露提供了降低帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。在某些实施例中,去岩藻糖基化帕尼单抗分子的约1%的增加将FcγR介导的细胞毒性降低从约2.70%至约3.0%,诸如约3.0%、约2.95%、约2.90%、约2.85%或约2.70%。同样,通常如上所述基于相对细胞毒性值来计算细胞毒性水平的变化。
在示例性实施例中,在该抗体上调节(增加或降低)的岩藻糖基化聚糖包括选自由以下组成的组的一种或多种岩藻糖基化聚糖:A1G0、A1G1、A2G0、A2G1a、A2G1b、A2G2和A1G1M5。在示例性实施例中,在该抗体上调节(增加或降低)的去岩藻糖基化聚糖包括选自由以下组成的组的一种或多种去岩藻糖基化聚糖:A1G0、A1G1、A2G0、A2G1a、A2G1b、A2G2和A1G1M5。
在某些方面,本披露提供了调节帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加或降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量。在示例性实施例中,该高甘露糖聚糖可以是Man-5、Man-6、Man-7、Man-8或Man-9。在示例性实施例中,该高甘露糖聚糖是Man-5。
在某些方面,本披露提供了增加帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量。在某些实施例中,高甘露糖聚糖的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性增加从约1.2%至约1.4%,诸如约1.2%、约1.25%、约1.3%、约1.35%或约1.40%。同样,通常如上所述基于相对细胞毒性值来计算细胞毒性水平的变化。在某些实施例中,该高甘露糖是甘露糖-5(Man-5)。
在某些方面,本披露提供了降低帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量。在某些实施例中,高甘露糖聚糖的约1%的增加将FcγR介导的细胞毒性降低从约1.2%至约1.4%,诸如约1.2%、约1.25%、约1.3%、约1.35%或约1.40%。同样,通常如上所述基于相对细胞毒性值来计算细胞毒性水平的变化。在某些实施例中,该高甘露糖是甘露糖-5(Man-5)。
本文提供的方法还包括将IgG2抗体样品(诸如帕尼单抗样品)的FcγR介导的细胞毒性与参考值匹配的方法,这是通过调节该样品抗体中的聚糖(例如,半乳糖基化聚糖,末端β-半乳糖,G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖,岩藻糖基化聚糖,去岩藻糖基化聚糖,核心岩藻糖,高甘露糖聚糖,Man-5聚糖,或其组合)的量进行的,以与该参考值匹配。在某些方面,该参考值是由可商购获得的帕尼单抗样品在相同剂量下(例如,相同量的抗体分子)表现出的FcγR介导的细胞毒性水平。在某些方面,该参考值是提供治疗益处的预定水平。在示例性实施例中,该方法包括使用本文所述的方法测量该样品抗体和/或参考样品的细胞毒活性。在示例性方面,确定或测量该抗体样品和/或参考样品的细胞毒活性发生在:(i)调节该抗体中的聚糖的量之前;(ii)调节该抗体中的聚糖的量之后;或(iii)调节该抗体中的聚糖的量之前和之后。
在某些方面,本披露提供了将IgG2抗体样品(诸如帕尼单抗样品)的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性与参考值匹配的方法,该方法包括:(1)获得FcγR介导的细胞毒性的参考值;(2)确定所述IgG2抗体样品(诸如帕尼单抗样品)的FcγR介导的细胞毒性;以及(3)通过增加或降低该抗体的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加或降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的IgG2分子的量来改变所述IgG2抗体样品(诸如帕尼单抗样品)的FcγR介导的细胞毒性;使得该抗体样品与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约35%或更低。在某些实施例中,该IgG2抗体样品(诸如帕尼单抗样品)与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约30%或更低、约25%或更低、约20%或更低、约15%或更低、约10%或更低或者约5%或更低。在一些情况下,步骤(1)(“获得FcγR介导的细胞毒性的参考值”)发生在步骤(2)(“确定所述IgG2样品或帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性”)和/或步骤(3)(“改变所述IgG2样品或帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性”)之前,之后或与其同时发生;而在其他情况下,步骤(2)发生在步骤(1)和/或步骤(3)之前,之后或与其同时发生。
在某些方面,通过增加该抗体的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来增加该IgG2样品或帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。在某些实施例中,β-半乳糖的约1%的增加将FcγR介导的细胞毒性增加从约0.55%至约0.75%,诸如约0.55%、约0.6%、约0.65%、约0.7%或约0.75%。上面描述了聚糖水平和细胞毒性水平的计算,并且通常如上所述基于相对细胞毒性值来计算细胞毒性水平的变化。
在某些方面,通过降低该抗体的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的抗体分子的量来降低该IgG2样品或帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。在某些实施例中,β-半乳糖的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性增加从约0.55%至约0.75%,诸如约0.55%、约0.6%、约0.65%、约0.7%或约0.75%。同样,通常如上所述基于相对细胞毒性值来计算细胞毒性水平的变化。
在某些方面,本披露提供了将IgG2抗体样品(诸如帕尼单抗样品)的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性与参考值匹配的方法,该方法包括:(1)获得FcγR介导的细胞毒性的参考值;(2)确定所述IgG2抗体样品(诸如帕尼单抗样品)的FcγR介导的细胞毒性;以及(3)通过增加或降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的IgG2分子的量,或者增加或降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的IgG2分子的量来改变所述IgG2抗体样品(诸如帕尼单抗样品)的FcγR介导的细胞毒性;使得该抗体样品与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约35%或更低。在某些实施例中,该IgG2抗体样品(诸如帕尼单抗样品)与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约30%或更低、约25%或更低、约20%或更低、约15%或更低、约10%或更低或者约5%或更低。在一些情况下,步骤(1)(“获得FcγR介导的细胞毒性的参考值”)发生在步骤(2)(“确定所述IgG2样品或帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性”)和/或步骤(3)(“改变所述IgG2样品或帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性”)之前,之后或与其同时发生;而在其他情况下,步骤(2)发生在步骤(1)和/或步骤(3)之前,之后或与其同时发生。
在某些方面,通过增加在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者通过降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来增加该IgG2样品或帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。在某些实施例中,岩藻糖基化帕尼单抗分子的约1%的增加将FcγR介导的细胞毒性增加从约2.7%至约3.0%,诸如约3.0%、约2.95%、约2.90%、约2.85%或约2.70%。在某些实施例中,去岩藻糖基化帕尼单抗分子的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性增加从约2.7%至约3.0%,诸如约3.0%、约2.95%、约2.90%、约2.85%或约2.70%。同样,通常如上所述基于相对细胞毒性值来计算细胞毒性水平的变化。
在某些方面,通过降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者通过增加在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来降低该IgG2样品或帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。在某些实施例中,岩藻糖基化帕尼单抗分子的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性降低从约2.7%至约3.0%,诸如约3.0%、约2.95%、约2.90%、约2.85%或约2.70%。在某些实施例中,去岩藻糖基化帕尼单抗分子的约1%的增加将FcγR介导的细胞毒性降低从约2.7%至约3.0%,诸如约3.0%、约2.95%、约2.90%、约2.85%或约2.70%。同样,通常如上所述基于相对细胞毒性值来计算细胞毒性水平的变化。
在某些方面,本披露提供了将IgG2抗体样品(诸如帕尼单抗样品)的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性与参考值匹配的方法,该方法包括:(1)获得FcγR介导的细胞毒性的参考值;(2)确定所述IgG2抗体样品(诸如帕尼单抗样品)的FcγR介导的细胞毒性;以及(3)通过增加或降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的IgG2分子的量来改变所述IgG2抗体样品(诸如帕尼单抗样品)的FcγR介导的细胞毒性;使得该抗体样品与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约35%或更低。在某些实施例中,该IgG2抗体样品(诸如帕尼单抗样品)与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约30%或更低、约25%或更低、约20%或更低、约15%或更低、约10%或更低或者约5%或更低。在一些情况下,步骤(1)(“获得FcγR介导的细胞毒性的参考值”)发生在步骤(2)(“确定所述IgG2样品或帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性”)和/或步骤(3)(“改变所述IgG2样品或帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性”)之前,之后或与其同时发生;而在其他情况下,步骤(2)发生在步骤(1)和/或步骤(3)之前,之后或与其同时发生。
在某些方面,通过降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量来增加该IgG2样品或帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。在某些实施例中,高甘露糖聚糖的约1%的降低将FcγR介导的细胞毒性增加从约1.2%至约2.4%,诸如约1.2%、约1.25%、约1.3%、约1.35%或约1.40%。同样,通常如上所述基于相对细胞毒性值来计算细胞毒性水平的变化。
在某些方面,通过增加在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量来降低该IgG2样品或帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。在某些实施例中,高甘露糖聚糖的约1%的增加将FcγR介导的细胞毒性降低从约1.2%至约2.4%,诸如约1.2%、约1.25%、约1.3%、约1.35%或约1.40%。同样,通常如上所述基于相对细胞毒性值来计算细胞毒性水平的变化。
3.4调节聚糖的方法
调节糖蛋白(包括抗体)上的聚糖诸如半乳糖基化聚糖(包括例如末端β-半乳糖,G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖)、去岩藻糖基化聚糖、岩藻糖基化聚糖或含有核心岩藻糖的聚糖、和/或高甘露糖聚糖(包括例如Man-5聚糖)的量的合适方法是本领域已知的。参见例如,Zhang等人,Drug Discovery Today[今日药物发现]21(5):2016。因此,在一些方面,在特定条件下培养有糖基化能力的细胞-其可以用于重组产生糖蛋白(包括抗体),以达到聚糖的所需水平。
例如,国际专利公开号WO 2013/114164;WO 2013/114245;WO 2013/114167;WO2015128793;和WO 2016/089919各自教导了可用于调节聚糖诸如半乳糖基化聚糖(包括例如末端β-半乳糖或者G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖)、去岩藻糖基化聚糖、岩藻糖基化聚糖或含有核心岩藻糖的聚糖、和/或高甘露糖聚糖(包括例如Man-5聚糖)的重组细胞培养技术,包括:获得总去岩藻糖基化聚糖百分比增加的糖蛋白的方法(WO 2013/114164);获得Man5聚糖和/或去岩藻糖基化聚糖百分比增加的糖蛋白的方法(WO 2013/114245);获得具有特定量的高甘露糖聚糖、去岩藻糖基化聚糖和G0F聚糖的糖蛋白的方法(WO 2013/114167);获得具有高甘露糖聚糖和降低的半乳糖基化和/或高半乳糖基化聚糖的糖蛋白的方法(WO 2015128793);以及操纵重组蛋白上的岩藻糖基化聚糖含量的方法(WO 2016/089919)。WO 2013/114164;WO 2013/114245;WO 2013/114167;WO 2015128793;和WO 2016/089919描述的细胞培养方法包括修改一种或多种细胞培养参数(诸如温度、pH)、用锰离子或其盐(例如,0.35μΜ至约20μΜ锰)培养细胞和/或用铜(例如,10至100nM)和锰(例如,50至1000nM)培养细胞,以调节特定聚糖。
另外,国际专利公开号WO 2015/140700描述了在甜菜碱的存在下培养细胞以增加去岩藻糖基化聚糖,或用锰、半乳糖和甜菜碱培养细胞以获得目标值的甘露糖基化、半乳糖基化和去岩藻糖基化聚糖。美国专利申请公开号2014/0356910教导了通过操纵细胞培养基配方中的甘露糖与总己糖的比率来增加高甘露糖糖型的方法。Pacis等人,Biotechnologyand Bioengineering[生物技术与生物工程]108(10):2348-2358(2011)教导了通过增加细胞培养基渗量水平并延长培养持续时间来获得高水平的Man5聚糖。类似地,Konno等人,Cytotechnology[细胞技术]64:249-3+6(2012)描述了通过培养基渗量控制抗体岩藻糖含量的方法。Wong等人,Biotechnology and Bioengineering[生物技术与生物工程]89(2):164-177(2004)教导了通过使用低谷氨酰胺补料分批培养降低重组蛋白唾液酸化并增加高甘露糖聚糖的方法。国际专利公开号WO 2017/079165描述了通过使用基因修饰为没有GMD或FX的宿主细胞并用岩藻糖培养宿主细胞来增加或降低重组蛋白的去岩藻糖基化或岩藻糖基化形式的方法。国际专利公开号WO 2017/134667描述了用烟酰胺和岩藻糖培养细胞,以产生去岩藻糖基化水平降低的抗体。Sha等人,TIBs 34(10):835-846(2016)还综述了几种调节聚糖的方法,包括例如用尿苷、锰和半乳糖进行培养以增加抗体上的半乳糖基化水平,和使用甘露糖作为碳源以增加高甘露糖糖型。
因此,在示例性方面,本披露的方法包括采用任何一个或多个上述参考文献或本文所述的其他参考文献中教导的一种或多种实践、细胞培养基和/或细胞培养条件,以调节半乳糖基化聚糖(包括例如末端β-半乳糖或者G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖)、去岩藻糖基化聚糖、岩藻糖基化聚糖或含有核心岩藻糖的聚糖、和/或高甘露糖聚糖(包括例如Man-5聚糖)的量。在示例性方面,该方法包括在调节半乳糖基化聚糖(包括例如末端β-半乳糖或者G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖)、去岩藻糖基化聚糖、岩藻糖基化聚糖或含有核心岩藻糖的聚糖、和/或高甘露糖聚糖(包括例如M5高甘露糖种类)的水平的条件下在细胞培养基中培养表达该抗体的有糖基化能力的细胞。例如,在一些方面,该方法包括在调节所述一种或多种聚糖的水平的条件下在细胞培养基中培养表达该抗体的有糖基化能力的细胞,其中该细胞培养基包含岩藻糖或岩藻糖和葡萄糖。
在包括在细胞培养中维持或培养细胞的方法中,可以根据适合于重组糖基化蛋白或抗体产生的任何一组条件来维持细胞培养物。例如,在一些方面,将细胞培养物维持在特定pH、温度、细胞密度、培养体积、溶解氧水平、压力、渗量等下。在示例性方面,将接种前的细胞培养物在CO2培养箱中在标准加湿条件下在5%CO2下振荡(例如,以70rpm)。在示例性方面,该方法包括在调节所述一种或多种聚糖的水平的条件下在细胞培养基中培养表达该抗体的有糖基化能力的细胞,其中增加该细胞培养基的渗量以降低该抗体的去岩藻糖基化聚糖水平,例如如由Konno等人,同上所教导的。在示例性方面,该方法包括在调节所述一种或多种聚糖的水平的条件下在细胞培养基中培养表达该抗体的有糖基化能力的细胞,其中调整细胞培养的pH和温度,例如如由WO 2013/114164、WO 2013/114245、WO 2013/114167或WO2015/128793所教导的,各自通过援引并入本文。
在示例性方面,本披露的方法包括将这些有糖基化能力的细胞在细胞培养基中维持在适合于重组糖基化蛋白或抗体产生的pH、温度、渗量和溶解氧水平下,如本领域所公知的。在示例性方面,将细胞培养物维持在适合于细胞生长的培养基中和/或根据任何合适的给料方案为细胞培养物提供一种或多种给料培养基,如本领域所公知的。
在示例性方面,这些有糖基化能力的细胞是真核细胞,包括但不限于酵母细胞、丝状真菌细胞、原生动物细胞、藻类细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。此类宿主细胞在本领域中有描述。参见例如,Frenzel等人,Front Immunol[免疫学前沿]4:217(2013)。在示例性方面,这些真核细胞是哺乳动物细胞。在示例性方面,这些哺乳动物细胞是非人哺乳动物细胞。在一些方面,这些细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞及其衍生物(例如,CHO-K1、CHO pro-3)、小鼠骨髓瘤细胞(例如,NS0、GS-NS0、Sp2/0)、被工程化为缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)活性的细胞(例如,DUKX-X11、DG44)、人胚肾293(HEK293)细胞或其衍生物(例如,HEK293T、HEK293-EBNA)、绿色非洲猴肾细胞(例如,COS细胞、VERO细胞)、人宫颈癌细胞(例如,HeLa)、人骨肉瘤骨上皮细胞U2-OS、腺癌人肺泡基底上皮细胞A549、人纤维肉瘤细胞HT1080、小鼠脑肿瘤细胞CAD、胚胎癌细胞P19、小鼠胚胎成纤维细胞NIH 3T3、小鼠成纤维细胞L929、小鼠神经母细胞瘤细胞N2a、人乳腺癌细胞MCF-7、视网膜母细胞瘤细胞Y79、人视网膜母细胞瘤细胞SO-Rb50、人肝癌细胞Hep G2、小鼠B骨髓瘤细胞J558L或幼仓鼠肾(BHK)细胞(Gaillet等人2007;Khan,Adv Pharm Bull[高级药物通报]3(2):257-263(2013))。
没有糖基化能力的细胞也可以例如通过用编码糖基化所必需的相关酶的基因转染它们而转化为有糖基化能力的细胞。示例性酶包括但不限于寡糖基转移酶、糖苷酶、葡糖苷酶I、葡糖苷酶II、钙联蛋白/钙网蛋白、糖基转移酶、甘露糖苷酶、GlcNAc转移酶、半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶。
在额外的或替代性的方面,以调节该抗体的聚糖(诸如半乳糖基化聚糖(包括例如末端β-半乳糖或者G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化种类)、去岩藻糖基化聚糖或含有核心岩藻糖的聚糖、和/或高甘露糖聚糖(包括例如M5高甘露糖种类))的方式对重组产生该抗体的有糖基化能力的细胞进行基因修饰。在示例性方面,对这些有糖基化能力的细胞进行基因修饰以改变从头途径或补救途径的酶的活性。任选地,对这些有糖基化能力的细胞进行基因修饰以敲除编码GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶,4-还原酶的基因。在示例性实施例中,对这些有糖基化能力的细胞进行基因修饰以改变从头途径或补救途径的酶的活性。这两种岩藻糖代谢途径是本领域公知的并且示于图1E中。在示例性实施例中,对这些有糖基化能力的细胞进行基因修饰以改变以下任何一种或多种的活性:岩藻糖基转移酶(FUT,例如FUT1、FUT2、FUT3、FUT4、FUT5、FUT6、FUT7、FUT8、FUT9)、岩藻糖激酶、GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶(GMD)和GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶,4-还原酶(FX)。在示例性实施例中,对这些有糖基化能力的细胞进行基因修饰以敲除编码FX的基因。在示例性实施例中,对这些有糖基化能力的细胞进行基因修饰以改变β(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GNTIII)和/或GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖还原酶(RMD)的活性。在示例性方面,对这些有糖基化能力的细胞进行基因修饰以过表达GNTIII和/或RMD。在示例性实施例中,对这些有糖基化能力的细胞进行基因修饰以具有改变的β-半乳糖基转移酶活性。在一些实施例中,对这些有糖基化能力的细胞进行基因修饰以调节编码GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶,4-还原酶、β1-4半乳糖基转移酶和/或β1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶的基因的表达水平。
本领域已知几种方式来降低或消除含有Fc的分子(例如,抗体)的岩藻糖基化。这些方式包括在某些哺乳动物细胞系中进行重组表达,这些细胞系包括FUT8敲除细胞系、变体CHO细胞系Lec13、大鼠杂交瘤细胞系YB2/0、包含特异性针对FUT8基因的小干扰RNA的细胞系以及共表达β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II的细胞系。替代性地,可以在非哺乳动物细胞(诸如植物细胞、酵母或原核细胞(例如,大肠杆菌))中表达含有Fc的分子。
在示例性方面,通过对该抗体进行生产后化学制品或酶处理来达到目标聚糖量。在示例性方面,本披露的方法包括在重组产生该抗体之后用化学制品或酶处理该抗体。在示例性方面,该化学制品或酶选自由以下组成的组:EndoS;Endo-S2;Endo-D;Endo-M;endoLL;α-岩藻糖苷酶;β-(1-4)-半乳糖苷酶;Endo-H;Endo F1;Endo F2;Endo F3;β-1,4-半乳糖基转移酶;几夫碱(kifunensine)和PNGase F。在示例性方面,将该化学制品或酶与该抗体一起孵育不同时间,以产生具有不同量的聚糖的抗体。在一些方面,将该抗体与β-1,4-半乳糖基转移酶一起孵育,如实例中所述。在一些额外的方面,可以通过将该抗体与β-1,4-半乳糖基转移酶一起孵育设定的时间段(包括但不限于约10分钟、约20分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约9小时)或落在约10分钟与约9小时之间的范围内的时间段来产生具有不同水平的半乳糖的抗体。
3.5测量聚糖的方法
本领域已知多种用于评估存在于含有糖蛋白的组合物(包括抗体)中的糖型或者用于确定、检测或测量包含糖蛋白的特定样品的糖型谱的方法。合适的方法包括但不限于亲水相互作用液相色谱(HILIC)、液相色谱-串联质谱(LC-MS)、阳离子MALDI-TOF分析、阴离子MALDI-TOF分析、HPLC、弱阴离子交换(WAX)色谱、正相色谱(NP-HPLC)、外切糖苷酶消化、Bio-Gel P-4色谱、阴离子交换色谱和一维核磁共振波谱法及其组合。参见例如,Pace等人,Biotechnol.Prog.[生物技术进展],2016,第32卷,第5期第1181-1192页;Shah,B.等人J.Am.Soc.Mass Spectrom.[美国质谱学会杂志](2014)25:999;Mattu等人,JBC 273:2260-2272(1998);Field等人,Biochem J[生物化学杂志]299(第1部分):261-275(1994);Yoo等人,MAbs 2(3):320-334(2010);Wuhrer M.等人,Journal of Chromatography B[色谱杂志B辑],2005,第825卷,第2期,第124-133页;Ruhaak L.R.,Anal Bioanal Chem[分析和生物分析化学],2010,第397卷:3457-3481;Kurogochi等人,PLOS One[公共科学图书馆·综合]10(7):e0132848;doi:10.1371/journal.pone.0132848;Thomann等人,PLOS One[公共科学图书馆·综合]10(8):e0134949.Doi:10.1371/journal.pone.0134949;Pace等人,Biotechnol.Prog.[生物技术进展]32(5):1181-1192(2016);以及Geoffrey,R.G.等人Analytical Biochemistry[分析生物化学]1996,第240卷,第210-226页。此外,本文所述的实例描述了用于评估存在于含有糖蛋白的组合物(诸如抗体)中的糖型的合适方法。
例如,可以通过高pH阴离子交换色谱(HPAEC)测量聚糖含量,如Wuhrer等人(Journal of Chromatography B[色谱杂志B辑]第825卷:124-133,2005)和Dell等人(Science[科学]第291卷:2351-2356)所述。简而言之,从重组糖蛋白(诸如重组单克隆抗体)酶促除去N-聚糖,并且在还原末端用荧光标签(例如,2-氨基苯甲酰胺或2-氨基苯甲酸)标记。通过HPAEC分离荧光N-聚糖,并且使用荧光检测进行检测。中性N-聚糖的分离通常基于N-聚糖结构的复杂性渐增。带电的N-聚糖的分离基于存在的可以从中获得电荷数的唾液酸、硫酸盐或其他修饰的数目和类型。将这些测试样品的聚糖谱与适当的标准进行目测比较。
实例2.2使用亲水相互作用液相色谱(HILIC)。简而言之,可以基于以下步骤分析聚糖种类:(i)释放N-聚糖(例如,通过诸如PNGase F的酶);(ii)标记(例如,用2-氨基苯甲酸或2-氨基苯甲酰胺);(iii)除去游离标记(例如,通过凝胶过滤或固相萃取);(iv)通过HILIC分离聚糖种类;以及(v)检测(例如,通过荧光光谱法)。Melmer等人,Analytical andBioanalytical Chemistry[分析和生物分析化学],2010年9月,第398卷,第2期,第905-914页提供了HILIC的额外的细节。
另一种常用的方法是液相色谱-串联质谱(LC-MS)。在释放N-聚糖、标记并除去游离标记之后,可以通过将液相色谱(或HPLC)的物理分离能力与质谱(MS)的质量分析能力组合的技术来分析样品。参见例如,Wang等人,Biotech Method[生物技术方法],2018年1月17日,doi.org/10.1002/biot.201700185。
3.6抗体组合物
本文还提供了包含通过本文所述方法产生的重组糖基化蛋白和抗体的组合物。在示例性实施例中,通过调节该抗体中的聚糖(例如,半乳糖基化聚糖,末端β-半乳糖,G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖,去岩藻糖基化聚糖,岩藻糖基化聚糖,核心岩藻糖,高甘露糖聚糖,Man-5聚糖,或其组合)的方法制备这些组合物。在示例性方面,该重组糖基化蛋白是IgG2抗体,诸如帕尼单抗。因此,本文提供了抗体组合物,包括具有增加或降低的FcγR介导的细胞毒性的IgG2抗体(例如,帕尼单抗),其中该IgG2抗体(例如,帕尼单抗)已经如上所述通过调节聚糖谱而被工程化为与对照或参考值相比具有增加或降低的FcγR介导的细胞毒性。
在示例性实施例中,将本文提供的抗体组合物与药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合。因此,本文提供了包含本文所述的重组糖基化蛋白组合物(例如,抗体组合物)和药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的药物组合物。如本文所用,术语“药学上可接受的载剂”包括任何标准药物载剂,诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂(诸如油/水或水/油乳剂)和各种类型的润湿剂。
给出以下实例仅为了说明本披露而不以任何方式限制其范围。
实例
1.引言
为了阐述对IgG2介导的细胞毒性的理解,我们使用特定响应细胞类型以帕尼单抗作为模型IgG2开发了高度敏感的细胞毒性测定。利用使用工程化细胞系和报告基因的FcγRIIa信号传导测定以及源自从基因分型供体的全血中分离的PBMC的原代细胞来研究细胞毒性活性。我们使用表达常见的FcγRIIa和FcγRIIIa受体同种异型的供体。为了理解可随生产过程的变化而变化的质量属性的影响,我们产生了含有宽范围的主要聚糖种类(即半乳糖基化、去岩藻糖基化和甘露糖基化)的帕尼单抗种类,并且在各种测定中评估了每种的活性对帕尼单抗的影响。
2.材料与方法
在美商安进公司(Amgen)(加利福尼亚州千橡市)通过标准制造过程在CHO细胞中生产帕尼单抗。
2.1聚糖种类的富集和酶促重构
使用ProSwift ConA-1S亲和柱(5x50mm,赛默飞世尔公司(ThermoFisher),PN074148)在Agilent 1100系列HPLC系统上从mAb中富集含有高甘露糖的种类,流速为0.5mL/min。将柱首先在初始条件下用100%缓冲液A(50mM乙酸钠、0.2M NaCl、1mM CaCl2、1mMMgCl2,pH 5.3)保持10.5min,然后用100%缓冲液B(50mM乙酸钠、0.2M NaCl、1mM CaCl2、1mMMgCl2、100mM a-甲基-吡喃甘露糖苷,pH 5.3)洗脱17.5min。收集流过物(flow-through)和洗脱的级分两者,并且将其用β-(1-4)-半乳糖苷酶(QA Bio公司,PN E-BG07)处理,以除去末端半乳糖。具体地,在含有50mM磷酸钠的反应缓冲液(pH 6.0)的存在下,将mAb级分与β-(1-4)-半乳糖苷酶以1/50(μg/μg)的比率在37℃下一起孵育1小时。通过闪冻终止反应。
通过用Endo-H(QA-Bio公司,PN E-EH02)酶促处理从mAb中制备去岩藻糖基化种类。具体地,将mAb与Endo-H在50mM磷酸钠的反应缓冲液(pH 5.5)中在37℃下一起孵育24h。最终的mAb浓度为4mg/mL。随后,在Agilent 1100系列HPLC上使用定制的glycap-3A柱(低密度FcγIIIa,3x150mm,泽普泰恩公司(Zepteon),PN R3AVD1P1ML)通过亲和色谱分离去岩藻糖基化mAb。流动相A含有20mM Tris、150mM NaCl(pH 7.5),并且流动相B为50mM柠檬酸钠(pH 4.2)。使用流速为0.5mL/min的梯度(在0%B下保持8min,0%至18%B持续22min)来分离非岩藻糖耗尽的mAb(流过物)和富集的mAb(洗脱物)两者。还用β-(1-4)-半乳糖苷酶进行了酶促处理(如上所述),以除去末端半乳糖的任何潜在的影响。
通过β-1,4-半乳糖基转移酶(西格玛公司(Sigma)/罗氏公司(Roche))的体外活性产生了半乳糖重构的样品。首先,通过从FcγIIIa柱收集流过级分来制备岩藻糖基化mAb(主要是G0F),并且将其用半乳糖苷酶处理以除去末端半乳糖。然后,将G0F富集的mAb与β-1,4-半乳糖基转移酶在含有10mM UDP-半乳糖、100mM MES(pH 6.5)、20mM MnCl2和0.02%叠氮化钠的反应缓冲液中在37℃下一起孵育。最终的酶与mAb的比率为6(μL/mg),其中mAb浓度为2mg/mL。通过在不同的时间点(10min、20min、30min、1h、2h、4h和9h)从反应混合物中取出样品来获得具有不同的半乳糖水平的mAb,然后进行闪冻以停止反应。
对所有富集和重构的样品进行蛋白A色谱纯化以除去酶和其他组分。在Agilent1100系列HPLC系统上用预先包装的蛋白A柱(Poros A/20,4.6X100mm,应用生物系统公司(Applied Biosystems),PN 1-5022-26)进行纯化,流速为3mL/min。在加载适当量的每种样品之后,将柱首先在初始条件下用100%缓冲液A(20mM Tris-HCl/150mM NaCl,pH 7.0)保持1.4min,然后用100%缓冲液B(0.1%乙酸)洗脱2.9min。使用具有3kDa截止膜的AmiconUltra离心过滤器,将所有洗脱的mAb渗滤到配制缓冲液中。对于所有富集/重构的mAb样品,蛋白质浓度通常为约1mg/mL。
2.2富集和重构的聚糖种类的表征
用亲水相互作用液相色谱(HILIC)和尺寸排阻色谱表征所有富集和重构的样品,以确保所需的聚糖特性和最低水平的高分子量种类。使用PNGase F(新英格兰生物实验室(New England BioLabs))以1/25(μL/μg)的E/S比释放来自mAb的聚糖,并且通过将反应混合物在80℃下孵育75min来用12mg/mL2-氨基苯甲酸(2-AA,西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))进行标记。在配备有荧光检测器的Waters Acuity或H级UPLC系统上用BEH聚糖柱(1.7μm,2.1x100mm,沃特斯公司(Waters))分离2-AA标记的聚糖。将柱温保持在55℃下。流动相A含有100mM甲酸铵(pH 3.0),并且流动相B为100%乙腈。使聚糖与柱在高有机溶剂中结合,然后将其用渐增梯度的水性甲酸铵缓冲液洗脱(76%B保持5min,然后经14min使梯度从76%至65.5%B)。在Agilent 1100HPLC系统上使用尺寸排除柱(SEC)TSK-GelG3000SWLXL(7.8x300mm,东曹生命科学公司(Tosoh Bioscience))(流速为0.5mL/min)评估确认,即所需的操纵没有导致高分子量种类的形成。20-40μg样品的样品载荷通常用含有100mM磷酸钠(pH 6.8)和250mM NaCl的流动相等度地分离。
2.3 FcγRIIa报告基因测定
FcγRIIa报告萤光素酶报告基因测定采用工程化Jurkat T细胞作为效应细胞。Jurkat报告细胞在细胞表面上表达IgG Fc受体FcγRIIa(H131变体)以及萤光素酶报告基因与活化T细胞核因子(NFAT)的响应元件。靶细胞上的抗体与抗体Fc结构域之间的与Jurkat效应细胞上的稳定表达的FcγRIIa的同时结合激活转录因子NFAT。激活的NFAT易位到Jurkat细胞的细胞核中,并且诱导萤光素酶报告基因表达。在添加含有萤光素和表面活性剂的萤光素酶底物之后,发光信号产生使得能够检测FcγRIIa报告物活性。对于帕尼单抗,将参考标准、测定对照和测试样品在具有低IgG FBS的RPMI 1640测定培养基中经8个浓度水平连续稀释至(0.004μg/mL-2μg/mL)的最终板孔浓度的范围,以用作剂量反应曲线。将效应Jurkat报告细胞和靶细胞(A431)以3:2的效应与靶标(E与T)细胞比制备为合并的细胞悬浮液。然后将板在加湿培养箱中在5%CO2和37℃下孵育约5.5小时。在孵育结束时,通过萤光素酶测定缓冲液中的表面活性剂裂解细胞。通过EnVision读板仪检测通过萤光素酶与萤光素酶测定缓冲液中的其底物萤光素反应产生的发光信号。使用SoftMaxPro使用4参数拟合将数据拟合为平均发射值,并且将其报告为如通过EC50标准/EC50样品计算的活性百分比。对每种样品在3次独立的测定中进行测试,并且将样品最终结果报告为3次测定的平均值。
2.4使用PBMC进行供体同种异型分型和细胞毒性测定
对PBMC供体进行同种异型分型。使用Becton Dickinson制备管(BD-CPT)从健康供体的血液中分离PBMC。使用静脉穿刺从每个供体收集8mL血液到BD CPT管中。然后将管在1500RPM下离心30min,以将血液分离成不同的层。吸出血浆层,并且将淋巴细胞收集到15mL离心管中。然后将淋巴细胞用PBS洗涤2次以除去任何血浆,并且在DNA分离之前对细胞进行计数。使用QIAGEN血液和细胞培养DNA试剂盒从细胞中提取DNA。然后在7900HT实时PCR系统中用对每种受体(FcγRIIa和FcγRIIIa)具有特异性的合格套件对DNA进行Taqman单核苷酸多态性(SNP)基因分型分析。用主混合物、DNA和测定寡核苷酸混合物(荧光标记的探针)建立qPCR测定,持续40个循环。每个探针特异性退火到互补序列,如果存在的话。DNA聚合酶的外切核酸酶活性切割已经与靶标杂交的探针,从而释放报告染料,导致荧光增加。如果特异性序列不存在,则探针在扩增期间不附接,从而不会释放染料,因此染料的存在指示特定的多态性。SDS软件给出了每个孔的读出,并且调用决定了基因型。该软件还提供了等位基因分型图,其中聚类指示单个基因型。5'-核酸酶测定化学法提供了获得单核苷酸多态性(SNP)基因分型结果的方式。每种预设计的SNP基因分型测定包括含有不同荧光染料的两个等位基因特异性MGB探针以及PCR引物对,以检测特定SNP靶标。这些探针和引物组(测定)与基因组唯一比对,以提供对目的等位基因的无与伦比的特异性。用于FcγRIIA 131组氨酸或精氨酸多态性(H/R)的SNP测定是C_9077561_20。用于FcγRIIIA 158苯丙氨酸或缬氨酸多态性(F/V)的SNP测定是C_25815666_10。
KILRTM细胞毒性测定。此测定利用过表达EGFR的U2OS靶细胞以及与作为EurofinsDiscoverX KILRTM细胞毒性测定的组成部分的β-半乳糖苷酶(β-gal)报告物的无活性片段融合的专有持家蛋白。在变化浓度的帕尼单抗或糖工程化样品的存在下,分别将修饰的靶细胞与PBMC以1:200的比率混合。当靶细胞被裂解时,带标签的持家蛋白被释放到培养基中。通过添加含有β-gal报告物的另一个片段的试剂(这导致活性β-gal酶的形成)在培养基中检测带标签的持家蛋白。在化学发光试剂的β-gal依赖性水解后,发生发光的剂量依赖性增加。发光反应数据与细胞毒性的量成正比。在此测定中使用来自健康供体的新鲜PBMC作为效应细胞。用读板仪检测发光信号。相对于测试浓度和所生成的剂量反应曲线绘制发光反应。
美商安进公司(加利福尼亚州千橡市)采购了从具有已知的FcγRIIa和FcγRIIIa基因型的健康志愿者中分离的PBMC。通过使用BD-CPT管分离PBMC进行KILRTMADCC测定。收获PBMC,将其在D-PBS中洗涤,并且为96孔板的每个孔分配1.2x106个细胞。将KILRTM U2OS靶细胞(6,000个/孔)添加到含有PBMC的孔中,并且与渐增浓度的帕尼单抗或糖工程化样品(0.148-200ng/mL)一起孵育12小时。通过在Perkin Elmer Envision读板仪上读取测定板来检测发光信号的剂量依赖性增加。使用SoftMax Pro v5.4.1进行数据分析,并且报告剂量反应曲线。
2.5 FcγR阻断测定以显示特异性
通过单独阻断CD16(FcγRIIIa)、CD32(FcγRIIa)和CD64(FcγRI)与特异性结合和阻断这些受体的抗体进行受体抗体阻断研究,并且测量所得的细胞毒活性。将帕尼单抗以200mg/mL的恒定浓度使用,并且将不同的阻断mAb(抗FcγRI[小鼠单克隆抗体,百进生物科技公司(BioLegend)目录号360701]、抗FcγRIIa[山羊多克隆抗体,安迪生物科技公司(R&D Systems)目录号AF1330]和抗FcγRIIIa[山羊多克隆抗体,安迪生物科技公司目录号AF1257])以变化的浓度(2000ng/mL-1ng/mL)使用。山羊同种型对照:山羊多克隆抗体,安迪生物科技公司目录号AB-108-C;小鼠IgG1/k同种型对照:小鼠IgG1/k,BD生物科学公司(BDBiosciences)目录号550979。
收获用来自Eurofins DiscoverX的持家基因工程化的U2OS靶细胞,并且将其以6000个细胞/孔的密度在96孔板中铺板。将恒定浓度(200ng/mL)的帕尼单抗与从2000ng/mL至1ng/mL的浓度范围内的阻断试剂混合,并且将其添加到靶细胞中。通过取全血并用BD-CPT管分离PBMC而将健康供体PBMC用作效应细胞。然后将这些PBMC以1.2e6个细胞/孔的密度添加到靶细胞和抗体混合物的混合物中,效应物与靶标的比率为200:1。在添加检测试剂并在Envision读板仪上读取发光信号之前,将测定板在37℃下共培养大约18小时。
2.6通过SPR测量FcγR结合
使用SPR T-200仪器进行表面等离子体共振实验。在CHO细胞中表达带His标签的人FcγR,并且对其进行内部纯化使用仪器缓冲液(在PBS中的0.005%P20)将小鼠抗his捕获抗体以大约5000RU固定在系列S传感器芯片CM5(通用电气医疗集团(GE Healthcare))上。将FcγR在运行缓冲液(在PBS中的0.005%P20、0.1mg/mL BSA)中稀释至3.3~10nM,并且以10μL/min注射1.5min以进行捕获步骤。将帕尼单抗样品在运行缓冲液(PBS+0.005%P20+0.1mg/mL BSA)中在从0.4nM-20000nM的浓度范围内稀释,并且以50μL/min注射在捕获的FcγR上,缔合和解离时间为3分钟。通过以30μL/min持续30s注射10mM甘氨酸(pH 1.7)使芯片表面再生。
3.结果
3.1聚糖种类对帕尼单抗介导的细胞毒性的影响
如先前已经描述的,帕尼单抗可以介导细胞介导的细胞毒性活性,这尚未针对人IgG2治疗性抗体进行描述。为了确定哪些产品质量属性可以影响该活性,使用一系列富集和酶促处理(参见材料与方法)来改变帕尼单抗的聚糖谱,以产生宽范围的以下主要聚糖种类中的每一种:末端半乳糖、核心岩藻糖和高甘露糖。由于此活性先前已经归因于FcγRIIa,我们还设计了敏感的FcγRIIa报告基因测定,以读出质量属性对该活性的影响。
评估影响的第一种聚糖种类是末端β-半乳糖。如方法部分中所述,对帕尼单抗样品进行酶促处理,以展示从0.4%至88.3%的宽范围的末端半乳糖。如图2A-2B所示,在该半乳糖水平范围内,如通过报告基因测定测量的活性变化近60%,其中活性水平对半乳糖水平显示出非常具线性的反应。我们通过用活性/属性相关图的斜率(其可以用于代表反应系数)表示β-半乳糖对FcγRIIa信号传导活性的相对影响对其进行了量化。使用这种针对帕尼单抗的方法,可以将β-半乳糖的FcγRIIa信号传导影响计算为0.6681,R2值为0.98。
接下来,我们检查了核心岩藻糖种类水平对FcγRIIa报告基因测定的影响。帕尼单抗还展现了对变化的岩藻糖(去岩藻糖基化)水平的线性反应。FcγRIIa信号传导活性对去岩藻糖基化的剂量反应曲线示于图3A-3B中。所计算的活性对去岩藻糖基化量产生了非常具线性的负反应。数据表明,帕尼单抗在较低的去岩藻糖基化水平下介导较高的细胞毒性,并且在较高的去岩藻糖基化水平下介导较低的细胞毒性,从而与mAb上的去岩藻糖基化百分比逆相关。我们注意到这是IgG1对非岩藻糖水平对FcγRIIIa介导的ADCC活性的影响的有趣逆转。
此聚糖研究的最后组成部分涉及检查高甘露糖对帕尼单抗影响FcγRIIa报告基因测定的能力的影响。作为高甘露糖水平的函数的FcγRIIa信号传导活性反应示于图4A-4B中。在这里,帕尼单抗同样对高甘露糖具有线性但逆的反应。
不同聚糖种类的影响的总结可见于表3。
表3.各种聚糖属性对帕尼单抗活性的影响的总结
*仅来自两个剂量点的数据
NV:由于R2值非常低,没有值
NA:不明显
ND:没有进行
3.2 PBMC同种异型分型
为了将这些观察结果扩展到更能反映生理背景的额外的测定形式,我们开发了原代PBMC测定,以评估帕尼单抗介导的细胞毒性的影响,参见材料与方法。此外,为了评估FcγR同种异型在此方法中的影响,我们对几种供体的DNA进行了基因分型,以确定FcγRIIA受体的氨基酸位置131(H/R)处的等位基因和FcγRIIIA受体的氨基酸位置158(V/F)处的等位基因。在氨基酸位置158处,FcγRIIIa受体多态性的等位基因簇的52%为FF基因型纯合型,36%为FV基因型杂合型,并且12%为VV基因型纯合型;并且在氨基酸位置131处,FcγRIIa的等位基因分型图发现26%为RR基因型纯合型,58%为HR基因型杂合型,并且16%为HH基因型纯合型。在随后的细胞毒性活性测定中使用来自这些供体的原代PBMC。
3.3 PBMC细胞毒性数据
使用来自对于FcγRIIa和FcγRIIIa分别具有HHVV、HHFF、RRFV和HHFV同种异型的供体的PBMC在细胞毒性测定中测试宽范围的去岩藻糖基化、甘露糖基化和半乳糖基化帕尼单抗样品,如材料与方法中所述。用变化水平的特定聚糖进行的方法的代表性剂量-反应曲线重叠示于图5中。帕尼单抗同样对从0.4%-27.4%的岩藻糖(去岩藻糖基化)范围显示出线性逆关系反应。当用具有不同的同种异型(分别为HHVV、HHFF、RRFV和HHFV)的供体进行测试时,所计算的活性对去岩藻糖基化量产生了非常具线性的负反应(图6A-6D)。除HHVV外,所有供体均显示出细胞杀伤与去岩藻糖基化百分比的线性负相关。
帕尼单抗再次同样对从2.9%-75.6%的高甘露糖范围显示出线性反应。当用具有不同的同种异型(分别为HHVV、HHFF、RRFV和HHFV)的供体进行测试时,所计算的活性对高甘露糖量产生了非常具线性的负反应(图7A-7D)。在此测定中,所有4个供体均显示出细胞杀伤与高甘露糖水平的强烈负相关。
还在PBMC介导的细胞毒性测定中对具有从0.4%至88.3%的宽范围的末端半乳糖的帕尼单抗样品进行了测试。在这种情况下,结果表明,在细胞毒性活性与变化水平的半乳糖基化之间缺乏显著相关性,与在FcγRIIa报告基因测定的情况下看到的结果不同。使用这种针对帕尼单抗的方法,我们无法量化β-半乳糖对细胞毒性的相对影响。用来自具有不同的同种异型(如图8A-8D所示,分别为HHFV、RRFV、HHVV和RRFF)的4个供体的PBMC进行了这些测定。
3.4 FcγRIIa是参与IgG2介导的细胞杀伤的唯一受体
通过单独阻断CD16(FcγRIIIa)、CD32(FcγRIIa)和CD64(FcγRI)与特异性结合和阻断这些受体的抗体进行受体抗体阻断研究,并且测量所得的细胞毒活性。使用用PBMC和帕尼单抗的KILR测定建立阻断实验。将帕尼单抗以200mg/mL的恒定浓度使用,并且变化浓度(2000ng/mL-1ng/mL)的不同阻断mAb显示,仅与抗FcγRIIa一起孵育的细胞随着阻断mAb的浓度增加而显示出细胞死亡的降低。正如所预期的,用帕尼单抗(0.1-200ng/mL)而非用任何阻断抗体处理的细胞以剂量依赖性方式介导细胞毒性(图9A)。与抗FcγRI或抗FcγRIIIa一起孵育的细胞在任何浓度的阻断mAb下均没有显示出细胞死亡百分比的差异,类似于同种型对照mAb(图9B)。这证明IgG2(帕尼单抗)介导的细胞毒性主要是通过FcγRIIa受体而非FcγRI或FcγRIIIa的参与。
3.5帕尼单抗与FcγR的结合
为了尝试评估帕尼单抗和各种富集的聚糖种类对FcγR的亲和力,我们通过表面等离子体共振(SPR)测量了帕尼单抗样品与所有三种人Fcγ受体的结合。10μM的帕尼单抗未显示任何可检测的与人FcγRI或FcγRIIIa-158F的结合,但是确实与huFcγRIIa-131H结合(图10A-10C)。帕尼单抗和huIgG2对照与huFcγRIIa-131H结合,表观KD分别为约20μM和25μM(图10C)。通过平衡结合进一步评估了岩藻糖富集的和非岩藻糖富集的帕尼单抗样品的结合(图11A-11B)。通过SPR测得的在两种聚糖富集的样品之间的结合差异(岩藻糖富集的样品和非岩藻糖富集的样品的KD值分别为约7.9μM和8μM)远不如在FcγRIIa信号传导活性或PBMC细胞毒性测定中发现的差异那样明显。这可能可归因于通过基于细胞的测定经由结合反应的受体聚类、信号转导和基因表达方面提供的信号放大(参见例如,Unkeless等人,Semin Immunol.[免疫学研讨会]1995;7(1):37-44;Amigorena等人,Science.[科学]1992;256(5065):1808-1812;Amigorena等人,Nature.[自然]1992;358(6384):337-341;Regnault等人,J Exp Med.[实验医学杂志]1999;189(2):371-380)。
为了总结各种聚糖对帕尼单抗细胞毒活性的影响,表3示出了当用去岩藻糖基化样品、高甘露糖样品或β-半乳糖样品对其介导细胞毒性的能力进行测试时每个供体的斜率值和R2。
4.讨论
此研究的目的是理解影响治疗性人IgG2单克隆抗体介导的细胞毒性的机制和产品质量属性。为了评估质量属性的影响,有必要具有高度敏感的可重复的定量功能测定。为了理解可随生产过程的变化而变化的质量属性的影响,我们产生了含有宽范围的主要聚糖种类(即半乳糖基化、去岩藻糖基化和甘露糖基化)的帕尼单抗种类,并且在各种测定中评估了每种的活性对帕尼单抗的影响。通过工程化过程,我们能够通过过程修改来达到比可能的情况显著更宽的范围,以更准确地辨别属性与活性之间的关系。Gal水平的范围为从0.4%至88.3%,非岩藻糖水平的范围为从0.4%至27.4%,并且高甘露糖水平的范围为从2.9%至75.6%。
使用原代细胞确定吞噬活性的许多测定易于在测定时在存在于源自供体的群体中的效应物类型以及可能影响测定活性的受体同种异型和其他背景遗传变异性方面不一致。此外,由于所表达的受体的多样性,通常更难以辨别吞噬细胞上的相关受体,正如他人也已经注意到的(Parren等人,J.Clin.Invest.[临床研究杂志]90:1537-1546,1992;Salmon等人,1992,J.Clin.Invest.[临床研究杂志]89(4):1274-81;Ackerman等人,JImmunol Methods.[免疫学方法杂志]2011;366:8-19)。从操作角度来看,测定通量也受到可以收获的细胞数目的限制。因此,这些类型的测定对于质量控制环境中的药物开发和表征是不合适的。在认识到这些挑战时,Tada等人(PLOS ONE[公共科学图书馆·综合],2014年4月2日,第9卷,第4期,e95787)开发了用于FcγRIIa信号传导活性的报告基因测定,其克服了许多上述限制。
效应子功能也依赖于受体多态性(对于FcγRIIIa为158V或F,或者对于FcγRIIa为131H或R)。为了进一步研究质量属性在更生理相关环境中的影响,我们使用表达常见的FcγRIIa和FcγRIIIa受体同种异型的PBMC供体来评估受体同种异型是否对帕尼单抗介导的细胞毒性有任何影响以及关于聚糖影响的结论。我们能够使用能够容忍长读出测定的PBMC开发可靠的功能测定,因为IgG2的动力学比IgG1慢得多,从而增加了这些测定的孵育持续时间。迪斯卡沃雷克斯公司(DisCoverX)的KILR(杀伤免疫裂解反应(killing immunolysis reaction))是用于动力学地显示细胞毒性的非放射性测定。使用帕尼单抗包被的过表达EGFR的用KILR持家基因转导的U2OS靶细胞以及作为效应细胞的PBMC来建立KILR测定。
这些研究首次证明IgG2帕尼单抗中的聚糖对细胞毒性活性有实质且差异的影响。我们观察到去岩藻糖基化和甘露糖基化在FcγRIIa信号传导活性和PBMC介导的细胞杀伤测定中对细胞毒性均具有负面影响,一种与IgG1完全相反的现象。去岩藻糖基化的增加显著降低了该抗体的细胞杀伤能力,并且类似地,该抗体中高甘露糖含量的增加降低了由帕尼单抗介导的细胞毒性。对于这两种聚糖,在原代细胞和报告基因测定中均观察到非常具线性的负反应。另一方面,半乳糖基化在β-半乳糖含量与细胞杀伤之间似乎具有更适度但正的相关性。这在FcγRIIa信号传导活性测定中比在PBMC介导的细胞杀伤测定中更明显。应当提到的是,对于观察到的FcγRIIa与IgG2的缔合,尚没有权威性的机械解释,因为岩藻糖基化帕尼单抗对FcγRIIa-H131的亲和力(KD约7.9μM)好像仅略高于去岩藻糖基化帕尼单抗对FcγRIIa-H131的亲和力(KD约8μM)),如通过表面等离子体共振所测量的。
应承认,PMBC是一个复杂的且可变的群体。为了确认FcγRIIa介导该活性,进行了受体阻断研究以确认特异性以显示帕尼单抗通过FcγRIIa而非FcγRIIIa介导细胞毒性。这是通过使用针对FcγRI、FcγRIIa和FcγRIIIa的阻断抗体完成的。细胞毒性仅在渐增浓度的抗FcγRIIa的情况下被抑制,并且当用针对FcγRI或FcγRIIIa的其他抗体阻断时,对细胞毒性没有影响。在具有相同FcγRIIa等位基因的不同供体之间的细胞毒性水平差异可能是由于各种原因,诸如受体密度、膜流动性或与可能影响细胞内信号传导并且因此影响细胞毒性的其他分子的相互作用/合作。仍有待辨别抑制性受体的作用是否影响以及如何影响PBMC中的整体细胞毒性。
通过SPR结合测定进一步检查了FcγR的参与,其中对高达10μM的帕尼单抗样品与FcγRI、FcγRIIa 131H和FcγRIIIa 158V的结合进行了测试。仅检测到与FcγRIIa 131H的结合,表观KD为20μM。在此研究中使用的IgG2对照mAb也展现了仅对FcγRIIa的类似结合活性(在25uM KD下)。另外,产生了岩藻糖富集的和非岩藻糖富集的样品以检测结合活性的差异。在SPR结合测定的背景下,在两种聚糖富集的样品以及岩藻糖富集的与非岩藻糖富集的样品之间的结合的显著差异并不如在功能测定中看到的那样夸张,样品分别以7.9μM和8μM KD结合。IgG复合物对携带有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的FcγR类型的接合启动了导致细胞激活和随后的效应子功能诱导的许多信号传导级联。对Fc-FcγR相互作用的细胞反应在骨髓细胞类型之间有所不同;然而,FcγR的聚集通常导致FcγR的快速内化以及影响细胞激活的不同信号传导途径的激活(Unkekess等人,Semin Immunol.[免疫学研讨会]1995;7(1):37-44.PubMed PMID:7612894;Amigorena等人,Science.[科学]1992;256(5065):1808-1812;Amigorena等人,Nature.[自然]1992;358(6384):337-341;Regnault等人,J Exp Med.[实验医学杂志]1999;189(2):371-380)。在非岩藻糖与岩藻糖基化帕尼单抗之间的差异在Biacore结合测定中可能不太明显,这是由于像聚类和信号放大的基于细胞的测定可能带来的这些组成部分的缺失。
在此研究中,宽范围的属性与高度响应的功能测定结合揭示了保守Fc聚糖对新颖的IgG2介导的细胞毒性活性的显著影响。这种理解应当在治疗性IgG2候选药物的设计和表征期间加以考虑。
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本发明特别涉及以下实施例:
1.一种调节帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加或降低帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加或降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。
2.如权利要求1所述的方法,其中通过增加帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来增加帕尼单抗的FcγR介导的细胞毒性。
3.如权利要求1所述的方法,其中通过降低帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来降低帕尼单抗的FcγR介导的细胞毒性。
4.如权利要求1所述的方法,其中所述FcγR是FcγRIIa。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述FcγR介导的细胞毒性是FcγRIIa介导的细胞毒性。
6.一种将帕尼单抗样品的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性与参考值匹配的方法,该方法包括:
(1)获得FcγR介导的细胞毒性的参考值;
(2)确定所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;以及
(3)通过增加或降低帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加或降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来改变所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;使得该帕尼单抗样品与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约35%或更低。
7.如权利要求6所述的方法,其中通过增加帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来增加该帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。
8.如权利要求6所述的方法,其中通过降低帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来降低该帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。
9.如权利要求6所述的方法,其中所述FcγR是FcγRIIa。
10.如权利要求6所述的方法,其中所述FcγR介导的细胞毒性是FcγRIIa介导的细胞毒性。
11.一种调节帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加或降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者增加或降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。
12.如权利要求11所述的方法,其中通过增加在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来增加帕尼单抗的FcγR介导的细胞毒性。
13.如权利要求11所述的方法,其中通过降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者增加在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来降低帕尼单抗的FcγR介导的细胞毒性。
14.如权利要求11所述的方法,其中所述FcγR是FcγRIIa。
15.如权利要求11所述的方法,其中所述FcγR介导的细胞毒性是FcγRIIa介导的细胞毒性。
16.一种将帕尼单抗样品的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性与参考值匹配的方法,该方法包括:
(1)获得FcγR介导的细胞毒性的参考值;
(2)确定所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;以及
(3)通过增加或降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者增加或降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来改变所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;使得该帕尼单抗样品与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约35%或更低。
17.如权利要求16所述的方法,其中通过增加在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来增加该帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。
18.如权利要求16所述的方法,其中通过降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者增加在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来降低该帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。
19.如权利要求16所述的方法,其中所述FcγR是FcγRIIa。
20.如权利要求16所述的方法,其中所述FcγR介导的细胞毒性是FcγRIIa介导的细胞毒性。
21.一种调节帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加或降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量。
22.如权利要求21所述的方法,其中通过降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量来增加帕尼单抗的FcγR介导的细胞毒性。
23.如权利要求21所述的方法,其中通过增加在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量来降低帕尼单抗的FcγR介导的细胞毒性。
24.如权利要求21所述的方法,其中所述FcγR是FcγRIIa。
25.如权利要求21所述的方法,其中所述FcγR介导的细胞毒性是FcγRIIa介导的细胞毒性。
26.一种将帕尼单抗样品的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性与参考值匹配的方法,该方法包括:
(1)获得FcγR介导的细胞毒性的参考值;
(2)确定所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;以及
(3)通过增加或降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量来改变所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;使得该帕尼单抗样品与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约35%或更低。
27.如权利要求26所述的方法,其中通过降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量来增加该帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。
28.如权利要求26所述的方法,其中通过增加在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量来降低该帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性。
29.如权利要求26所述的方法,其中所述FcγR是FcγRIIa。
30.如权利要求26所述的方法,其中所述FcγR介导的细胞毒性是FcγRIIa介导的细胞毒性。
31.一种增加帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括:
(i)增加帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量;
(ii)增加在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量;和/或
(iii)降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量。
32.一种降低帕尼单抗的Fc受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括:
(i)降低帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量;
(ii)降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者增加在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量;和/或
(iii)增加在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量。
Claims (10)
1.一种调节帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加或降低帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加或降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。
2.一种调节帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加或降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者增加或降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量。
3.一种调节帕尼单抗的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性的方法,该方法包括增加或降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量。
4.一种将帕尼单抗样品的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性与参考值匹配的方法,该方法包括:
(1)获得FcγR介导的细胞毒性的参考值;
(2)确定所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;以及
(3)通过增加或降低帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加或降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来改变所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;使得该帕尼单抗样品与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约35%或更低。
5.一种将帕尼单抗样品的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性与参考值匹配的方法,该方法包括:
(1)获得FcγR介导的细胞毒性的参考值;
(2)确定所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;以及
(3)通过增加或降低在N-297位点处包含岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量,或者增加或降低在N-297位点处包含去岩藻糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来改变所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;使得该帕尼单抗样品与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约35%或更低。
6.一种将帕尼单抗样品的Fcγ受体(FcγR)介导的细胞毒性与参考值匹配的方法,该方法包括:
(1)获得FcγR介导的细胞毒性的参考值;
(2)确定所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;以及
(3)通过增加或降低在N-297位点处包含高甘露糖聚糖的帕尼单抗分子的量来改变所述帕尼单抗样品的FcγR介导的细胞毒性;使得该帕尼单抗样品与该参考值之间的FcγR介导的细胞毒性的差异为约35%或更低。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法,其中通过增加帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者增加在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来增加帕尼单抗的FcγR介导的细胞毒性。
8.如权利要求1至6中任一项所述的方法,其中通过降低帕尼单抗的N-297糖基化位点处的末端β-半乳糖的量,或者降低在N-297位点处包含G1、G1a、G1b和/或G2半乳糖基化聚糖的帕尼单抗分子的量来降低帕尼单抗的FcγR介导的细胞毒性。
9.如权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述FcγR是FcγRIIa。
10.如权利要求1所述的方法,其中所述FcγR介导的细胞毒性是FcγRIIa介导的细胞毒性。
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