CN101700267B - 一种检测柿叶中山柰素和槲皮素含量的方法 - Google Patents

一种检测柿叶中山柰素和槲皮素含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种柿叶质量的检测方法,其特征在于,步骤包括:样品溶液制备步骤:取柿叶待测品粉末,与甲醇混合,所得的第一混合液用超声波处理,将所述第一混合液进行过滤,得到的滤液进行浓缩,浓缩后的第一混合液作为供试品溶液;取山柰素和槲皮素与甲醇混合,得到的第二混合液作为对照品溶液;检测步骤:按照薄层色谱法对所述样品溶液进行测定,观察在供试品色谱中,在与对照品色谱相同的位置上,是否显示与对照品相同颜色的斑点,如果是,则确定所述柿叶待测粉末中含有山柰素和槲皮素。与现有技术中的只从性状上来确定柿叶质量的方法相比,本发明提供的检测方法可以准确的确定柿叶待测品中的药物有效成分。

Description

一种检测柿叶中山柰素和槲皮素含量的方法
技术领域
本发明涉及药物质量控制领域,特别是一种柿叶质量的检测方法。 
背景技术
柿叶用做药物早在600多年前的《滇南本草》中就有记载,其良好的止咳喘、肺账、内出血、以及降血压的功效使得其在中药大家庭中拥有重要的位置。在现有技术中,柿叶经过水提醇沉后,得到水提液再由乙酸乙酯萃取,得到柿叶提取物,再由柿叶提取物加辅料制成的中药制剂,是广州白云山和记黄埔中药有限公司独家中药保护品种,收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第二十册第294页。 
与本发明最近似的实现方案,是1990版的《广西中药材标准》(1990版,第70-71页,广西壮族自治区卫生厅编,广西科学技术出版社出版)中收载的柿叶质量标准,该标准主要内容包括:柿叶性状、炮制、功能与主治、用法与用量等。其中,在柿叶性状有如下定义:本品多皱缩或破碎,完整者展平后呈卵状椭圆形至宽卵形或近圆形,长10cn~15cm,宽6cm~10cm,先端渐尖或钝,基部楔形至圆形,全缘,边缘微反卷,上面灰绿色或黄棕色,较光滑,下表面颜色稍浅,中脉及侧脉上面凹下或平坦,下面隆起,侧脉每边5~7条,向上斜生,将近叶缘网结,脉上有微柔毛。叶柄长8mm~20mm,质脆。气微、味微苦涩。其中,炮制方法为:除去杂质,略洗,切碎,干燥。其中性味为:苦、酸、涩、凉。其中,功能与主治为:清肺止咳,凉血止血,活血化瘀,降血压。用于咳喘,肺气胀,各种内出血,高血压,脑动脉硬化症,冠心病。其中用法与用量为:5g~15g,重症加倍。其中贮藏方法为:置干燥处。 
现有技术中主要体现了柿叶在药物用途时的主要性状、用法用 量、贮藏方式等主要性能特点,但是只是靠外观和性味等无法有效地检测及控制柿叶的质量,而且在现有技术中对柿叶的质量控制没有一个实用而有效的方法,导致了目前柿叶质量的不稳定性以及柿叶在药用时的规范性的缺失。 
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供一种柿叶质量的检测方法,通过该检测方法准确的确定柿叶待测品中是否含有有效药物成分山柰素和槲皮素。 
为了解决以上技术问题,本发明提供一种柿叶质量的检测方法,步骤包括: 
样品溶液制备步骤:取柿叶待测品粉末,与甲醇混合,所得的第一混合液用超声波处理,将所述第一混合液进行过滤,得到的滤液进行浓缩,浓缩后的第一混合液作为供试品溶液;取山柰素和槲皮素与甲醇混合,得到的第二混合液作为对照品溶液; 
检测步骤:按照薄层色谱法对所述样品溶液进行测定,观察在供试品色谱中,在与对照品色谱相同的位置上,是否显示与对照品相同颜色的斑点,如果是,则确定所述柿叶待测粉末中含有山柰素和槲皮素。 
优选的,所述检测步骤具体为:分别吸取所述待测样品溶液,分别点于同一硅胶G薄层板上,加入展开剂展开,晾干,喷以2.5wt%~3.5wt%的三氯化铝乙醇溶液,然后加热至100℃~110℃,观察在硅胶G薄层板上的供试品色谱中,在与对照品色谱相同的位置上,是否显示相同颜色的斑点,如果是,则确定所述柿叶待测粉末中含有山柰素和槲皮素。 
优选的,所述样品溶液制备步骤还包括: 
取柿叶对照药材粉末,与甲醇混合,所得的第三混合液用超声波处理,将第三混合液进行过滤,得到的滤液进行浓缩,浓缩后的第三混合液作为对照药材溶液; 
所述检测步骤为:按照薄层色谱法对所述供试品溶液、对照品溶 液、对照药材溶液进行测定,观察在供试品色谱中,在与对照品色谱、对照药材色谱相同的位置上,是否显示相同颜色的斑点,如果是则确定所述柿叶待测粉末中含有柿叶,并且所述柿叶含有山柰素和槲皮素。 
优选的,所述检测步骤具体为: 
分别吸取所述待测样品溶液,分别点于同一硅胶G薄层板上,加入展开剂展开,晾干,喷以2.5wt%~3.5wt%的三氯化铝乙醇溶液,然后加热至100℃~110℃,观察在硅胶G薄层板上的供试品色谱中,在与对照品色谱、对照药材色谱相同的位置上,是否显示相同颜色的斑点,如果是,则确定所述柿叶待测粉末中含有柿叶,并且所述柿叶含有山柰素和槲皮素。 
优选的,所述展开剂为甲苯、乙酸乙酯、甲酸的混合液。 
优选的,所述展开剂中的甲苯、乙酸乙酯、甲酸按体积比为4.95~5.05∶4.45~4.55∶0.45~0.55。 
优选的,所述进一步包括使用高效液相色谱法测定所述柿叶待测品中柿叶含量的步骤: 
取山柰素和槲皮素与甲醇混合,得到的第四混合液作为高效液相色谱用对照品溶液; 
提供柿叶待测品的高效液相色谱用供试品溶液; 
使用高效液相色谱法测定所述柿叶待测品中山柰素和槲皮素的含量。 
优选的,所述柿叶待测品的高效液相色谱用供试品溶液的步骤具体为: 
将所述柿叶待测品粉末用甲醇定容,得到第五混合液,过滤; 
取过滤后得到的过滤液加入甲醇、盐酸溶液得到第六混合液,摇匀并加热回流,放冷,所述第六混合液转移至量瓶中,过滤取滤液,得到供试品溶液。 
优选的,所述将所述柿叶待测品粉末用甲醇定容具体为: 
将所述柿叶待测品粉末与甲醇混合并置于具塞容器中,密封瓶塞,将所述具塞容器中的混合液称定重量并经过超声处理,放冷,再 次称定重量,用甲醇补足所述具塞容器中混合液缺失的重量,摇匀后过滤得到所述第五混合液。 
优选的,在所述使用高效液相色谱法测定所述柿叶待测品中柿叶的含量中,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇-0.2wt%磷酸溶液为流动相。 
优选的,所述高效液相色谱法的检测波长为360nm。 
优选的,所述的高效液相色谱法的理论板数按槲皮素峰计算不低于2500。 
本发明提供柿叶质量的检测方法,在该检测方法中,将柿叶待测品用甲醇和超声波进行处理作为供试品溶液,并将山柰素和槲皮素与甲醇混合作为对照品溶液,通过提供所述的供试品溶液和对照品溶液,用薄层色谱法进行检测时,可以准确的确定所述柿叶中是否含有有效药物成分如山柰素和槲皮素。与现有技术中的只从性状上来确定柿叶质量的方法相比,本发明提供的检测方法可以准确的确定柿叶待测品中的药物有效成分。 
在一种优选的方式中,本发明进一步提供将对照药材与甲醇混合作为对照药材溶液,然后将供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液同时进行薄层色谱鉴定,这样,可以确定柿叶待测品是否与标准对照药材溶液一致,并且准确的确定柿叶待测品中的药物有效成分。 
在一种优选的实施方式中,本发明提供的检测方法进一步包括使用高效色谱测定柿叶待测品的步骤,这样可以进一步确定所述柿叶待测品中的药品有效含量,即对山柰素和槲皮素的含量进行定量测定。 
附图说明
图1为本发明实施例公开的柿叶薄层色谱图;。 
图2为本发明实施例公开的对照品溶液的HPLC图; 
图3为本发明实施例公开的供试品溶液的HPLC图; 
图4为本发明实施例公开的柿叶粉末非腺毛特征图; 
图5为本发明实施例公开的柿叶粉末气孔特征图; 
图6为本发明实施例公开的柿叶粉末导管特征图; 
图7为本发明实施例公开的柿叶粉末腺毛特征图; 
图8为本发明实施例公开的柿叶粉末方晶特征图; 
图9为本发明实施例公开的柿叶粉末栅栏组织特征图。 
具体实施方式
为了进一步了解本发明,下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述,但是应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点,而不是对本发明权利要求的限制。 
首先对专用名词进行一下解释 
对照药材:指通过权威机构鉴定后,能用以鉴别其他药材真伪的药材。 
附录:指2005版中国药典的附录。 
总灰分:指药材在一定条件下经灼烧后,剩下的残渣重量占药材总重的百分数。 
含叶量:在叶类的药材中,叶子的重量占整个药材重量的百分数。 
水分:药材中水的重量占药材总重量的百分数。 
高效液相色谱法(HPLC,High Performance Liquid Chromatography)采用高效液相色谱仪对样品的化学成分进行定性、定量分析的一种技术方法。
薄层色谱:天然药物化学及其他相关专业常用的一种定性鉴别、分析手段。 
实施例1 
由于柿叶中主要含黄酮类化合物,也是柿叶中的主要有效成分,而柿叶黄酮又以槲皮素和山柰素的苷元及其苷类为主。因此,槲皮素和山柰素可以采用黄酮常规的鉴别方法。 
具体步骤为: 
取柿叶待侧品粉末1g与甲醇25ml充分混合,混合液经超声处理30分钟后滤过,滤液浓缩至1ml,作为供试品溶液。 
另取柿叶对照药材1g,同法制成对照药材溶液。 
再取山柰素、槲皮素对照品,与甲醇混合制成每1ml各含0.1mg的混合溶液,所述混合液作为对照品溶液。 
照薄层色谱法试验: 
吸取实施例1得到的供试品溶液三个编号为①、②、③;对照药材溶液各2ul编号为④,对照品溶液1ul编号为⑤,分别点于同一硅胶G薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸按重量比为5∶4.5∶0.5混合作为展开剂,在所述硅胶G薄层板上展开,取出后晾干,在晾干后的硅胶G薄层板上喷以3%三氯化铝乙醇溶液,在105℃加热,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材、对照品色谱相应的位置上,均显相同紫色的荧光斑点,如图1所示,其中的①、②、③是供试品色谱,其中的④为对照药材色谱,其中的⑤为对照品色谱,结果表明,在与④和⑤相同的位置上,供试品色谱均显示了相同颜色的斑点,可以确定,该供试品为柿叶,并且该柿叶中的有效药物为山柰素和槲皮素。 
实施例2 
黄酮类化合物是柿叶中的主要有效成分,而柿叶黄酮又以槲皮素和山柰素的苷元及其苷类为主。柿叶水解后的槲皮素和山柰素的苷元总量能基本反映柿叶中的总黄酮含量,而总黄酮含量就可以反映柿叶待测品中有效成分——柿叶的含量,所以在本发明中还包括了使用高效液相色谱法测定柿叶待测品中柿叶含量的测定方法。具体步骤如下: 
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇-0.2%磷酸混合溶液(50∶50)为流动相,检测波长为360nm,理论板数按槲皮素峰计算应均不低于2500。 
分别取山柰素和槲皮素,精密称定,与甲醇混合,配置成每1ml含山柰素和槲皮素各50μg的混合溶液,得到的混合液作为高效液相色谱用对照品溶液。 
提供柿叶待测品的高效液相色谱用供试品溶液。 
取柿叶待测品粉末0.5g,精密称定后之具塞锥形瓶中,精密加入甲醇20ml,密封后称定重量,经功率250W、频率40kHz的超声处理30分钟,然后室温放置冷却,再次称定重量,如有不足使用甲醇补足缺失的重量。 
将定量的混合液摇匀,过滤后,精密量取续滤液10ml至锥形瓶,加入甲醇10ml、体积百分数为25%的盐酸溶液5ml后,摇匀加热回流30分钟,室温冷却放置,转移至50ml的容量瓶中,用甲醇将所有配置溶质洗涤后洗液转移至所述容量瓶,加入甲醇至刻度,密封摇匀过滤,取续滤液,记得到柿叶待测品的高效液相色谱用供试品溶液。 
高效液相色谱测定方法为:分别精密吸取实施例5中得到的供试品溶液和对照品溶液各10μl,侏儒液相色谱仪,测定。所说得到的数据按干燥品计算,含黄酮以以槲皮素(C15H10O7)计不得少于0.11%,以山柰素(C15H10O6)计不得少于0.12%。测试结果见图2、图3。 
实施例3 
本发明除了对柿叶待测品进行薄层色谱鉴别和高效液相色谱测定柿叶待测品中柿叶的含量两种测试方法以外,还可以包括柿叶粉末的鉴别。 
柿叶粉末的特征为:粉末棕黄色。表皮细胞为多边形或不规则形。具有许多非腺毛,为单细胞,弯曲呈钩状或S型。气孔为不定式气孔。导管为螺纹或梯纹导管,有的导管内含棕色块状物。腺毛为多细胞,头部呈棕黄色。叶肉中草酸钙方晶大而多,有时含晶细胞连接,方晶排列成行。有许多栅栏组织。 
将柿叶待测品研磨,加入甲醇充分混合,混合液中加入展开剂展开,然后点在玻片上制成试片,通过生物显微镜观测得到的结果如图4~图9所示。 
实施例4 
本发明除了对柿叶待测品进行薄层色谱鉴别和高效液相色谱测定柿叶待测品中柿叶的含量两种测试方法以外,还可以包括柿叶水分的测定。 
具体步骤:取柿叶粉末2~5g,平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中,厚度不超过5mm,精密称定(干燥前柿叶重量),打开瓶盖在100~105℃干燥5小时,将瓶盖盖好,移置干燥器中,冷却30分钟,精密称定,再在上述温度干燥1小时,冷却,称重(干燥后柿叶重量),至连续两次称重的差异不超过5mg为止。按公式:(干燥前柿叶重量-干燥后柿叶重量)/干燥前柿叶重量×100%计算水分的含量。 
取实测样品10批,结果为7.1wt%~9.2wt%,平均值为7.9wt%。 
按照水分测定法(附录IX H第一法)测定,不得超过11.0wt%。 
实施例5 
本发明除了对柿叶待测品进行薄层色谱鉴别和高效液相色谱测定柿叶待测品中柿叶的含量两种测试方法以外,还可以包括柿叶含叶量的测定。 
步骤具体为: 
随机称取总重为2g的柿叶,去除杂质,弃去叶柄,称定剩下的柿叶重量(叶重),按公式:含叶量=(叶重/总重)×100%计算含叶量。 
实测样品10批,结果为94.73wt%~97.28wt%,平均值96.19wt%。结果表明,各批柿叶的含叶量相对稳定,以含叶量最低的08批含叶量的95wt%(94.73wt%×95wt%=90.0)为保证含量,确定本品含叶量应该大于90.0wt%。 
实施例6 
发明除了对柿叶待测品进行薄层色谱鉴别和高效液相色谱测定柿叶待测品中柿叶的含量两种测试方法以外,还可以包括柿叶总灰分的测定: 
按照总灰分测定法(附录IX K)测定。具体步骤:测定用的柿叶粉碎,使能过二号筛,混合均匀,取柿叶粉末2~3g,置灼烧至恒重的坩埚中,称定重量(准确至0.01g),缓缓加热,注意避免燃烧,至完全炭化时,逐渐升高温度至500~600℃,使完全灰化并至恒重。根据残渣重量,按公式:总灰分(%)=(残渣重量/粉末重量)×100%计算柿叶粉末中总灰分的含量(%)。 
实测样品10批,结果为4.8wt%~7.9wt%,平均值为7.0wt%。根据实测结果确定样品总灰分应少于10.0wt%。 
实施例7 
发明除了对柿叶待测品进行薄层色谱鉴别和高效液相色谱测定柿叶待测品中柿叶的含量两种测试方法以外,还可以包括柿叶药材的浸出物的检测。 
按照醇溶性浸出物曾顶法中的热浸法(附录X A)测定,用70wt%的乙醇做溶剂。具体步骤:取柿叶粉末约2~4g,精密称定,置100~250ml的锥形瓶中,精密加70wt%的乙醇50~100ml,密塞,称定重量(柿叶重量),静置1小时候,连接回流冷凝管,加热至沸腾,并保持微沸1小时。放冷后,取下锥形瓶,密塞,再称定重量,用70wt%的乙醇补足减失的重量,摇匀,用干燥滤器滤过,精密量取滤液25ml,置已干燥至恒重的蒸发皿中,再水浴上蒸干后,于105℃干燥3小时,置干燥器中冷却30分钟,迅速精密称定重量(浸出物重量)。按公式:(浸出物重量/柿叶重量)×100%计算柿叶中70wt%的乙醇浸出物的含量。 
实测样品10批,结果为21.7wt%~32.4wt%,平均值为28.8wt%。本品醇溶性浸出物应超过20.0wt%。 
实施例8 
将实施例7中的70wt%乙醇换为90wt%的乙醇按照醇溶性浸出物 测定法中的热浸法(附录X A)测定,实测样品10批,结果表明,90wt%乙醇为溶剂的浸出物较低。 
以上对本发明提供柿叶质量的检测方法的进行了详细的介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。 

Claims (1)

1.一种检测柿叶中山柰素和槲皮素含量的方法,其特征在于,步骤包括:
样品溶液制备步骤:取柿叶待测品粉末,与甲醇混合,所得的第一混合液用超声波处理,将所述第一混合液进行过滤,得到的滤液进行浓缩,浓缩后的第一混合液作为供试品溶液;取山柰素和槲皮素与甲醇混合,得到的第二混合液作为对照品溶液;取柿叶对照药材粉末,与甲醇混合,所得的第三混合液用超声波处理,将第三混合液进行过滤,得到的滤液进行浓缩,浓缩后的第三混合液作为对照药材溶液;
检测步骤:分别吸取所述样品溶液,分别点于同一硅胶G薄层板上,加入展开剂展开,晾干,喷以2.5wt%~3.5wt%的三氯化铝乙醇溶液,然后加热至100℃~110℃,观察在硅胶G薄层板上的供试品色谱中,在与对照品色谱、对照药材色谱相同的位置上,是否显示相同颜色的斑点,如果是,则确定所述柿叶待测粉末中有山柰素和槲皮素;
所述展开剂为甲苯、乙酸乙酯、甲酸的混合液,所述展开剂中的甲苯、乙酸乙酯、甲酸按体积比为4.95~5.05∶4.45~4.55∶0.45~0.55;
进一步包括以下高效液相色谱法测定柿叶中山奈素和槲皮素含量的步骤:
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以甲醇:0.2%磷酸混合溶液50∶50为流动相,检测波长为360nm,理论板数按槲皮素峰计算应均不低于2500;
分别取山柰素和槲皮素,精密称定,与甲醇混合,配置成每1ml含山柰素和槲皮素各50μg的混合溶液,得到的混合液作为高效液相色谱用对照品溶液;
取柿叶待测品粉末0.5g,精密称定后之具塞锥形瓶中,精密加入甲醇20ml,密封后称定重量,经功率250W、频率40kHz的超声处理30分钟,然后室温放置冷却,再次称定重量,如有不足使用甲醇补足缺失的重量,得到柿叶待测品的高效液相色谱用供试品溶液;
高效液相色谱测定方法为:分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定;得到的数据按干燥品计算,含黄酮以槲皮素计不得少于0.11%,以山柰素计不得少于0.12%。
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