CN101588792A - 纳米乳剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种纳米乳剂，其包含至少一种含水组分和一种载体，其中所述载体包括至少一种亲脂性组分、至少一种表面活性剂和至少一种醇。本发明另外涉及包括所述纳米乳剂和一种活性剂的组合物。特别地，所述组合物作为凝胶存在，并且所述活性剂是5－氨基乙酰丙酸、其衍生物、前体和/或代谢物。本发明另外涉及所述纳米乳剂和/或组合物的制备方法，并且涉及它们用于治疗皮肤学疾病、与病毒有关的疾病以及与细胞增殖有关的疾病的用途，特别是用于治疗肿瘤疾病和/或银屑病的用途。本发明另外涉及所述纳米乳剂在化妆品中的用途。

Description

纳米乳剂
技术领域
本发明涉及一种纳米乳剂，其包含至少一种含水组分和一种载体，其中所述载体包括至少一种亲脂性组分、至少一种表面活性剂和至少一种醇。本发明另外涉及包括所述纳米乳剂和一种活性剂的组合物。特别地，所述组合物作为凝胶存在，并且所述活性剂是5-氨基乙酰丙酸(ALA)、其衍生物、其前体和/或其代谢物。本发明另外涉及所述纳米乳剂和/或组合物的制备方法，并且涉及它们用于治疗皮肤学疾病、与病毒有关的疾病以及与细胞增殖有关的疾病的用途，特别是用于治疗肿瘤疾病和/或银屑病的用途。本发明另外涉及所述纳米乳剂在化妆品中的用途。
背景技术
纳米乳剂构成胶体系统。胶体系统包括胶束、脂质体、病毒颗粒、纳米悬浮液、微乳状液和聚合物溶液。基于其物理和化学特性，纳米乳剂属于微乳状液的组类。微乳状液是由被表面活性剂和共表面活性剂单层包围的脂质核组成的均质的、微米级微粒的水分散体。纳米乳剂的特征在于平均粒径(平均直径)小于200nm、经常是小于100nm，以及窄的单分散性粒径分布。另外，纳米乳剂是透明的和略带乳白色的。它们通常是通过在表面活性剂的存在下使油相在水相中机械破裂而生产的。含油的小球的非常小的尺寸经常是借助于通过高压匀化器或超声破碎器至少一次来得到。本文中所述的纳米乳剂的制备不需要这种高剪切设备。小球的小尺寸以及它们的高均质性为它们赋予了美容上的有利性质，使得它们与常规的乳剂相区别：它们是透明的并且表现出新的质地。另外，它们可以更有效地携带活性剂，因此，在药物和药剂学领域变得愈加重要。
被称为纳米分散体的微乳状液是本领域中已知的，其包括a)一种成膜分子，例如大豆卵磷脂，b)一种共乳化剂，c)一种亲脂性组分，例如辛酸和/或癸酸的甘油三酯(Miglyol 812或Myritol 318)和可选的d)醇，特别是乙醇(EP 0956853)。这些纳米分散体在药物制剂中用作药学活性剂的转运介质。
然而，在纳米乳剂中使用乙醇具有几个缺点。
第一，使用乙醇作为共表面活性剂产生比使用更长碳链的醇时更大的纳米微粒。更大的微粒引起皮肤和纳米乳剂之间的接触面积减小并引起渗透速率降低。第二，乙醇具有1.10cp的相对低的粘度，这对于微乳状液的稳定性来说不是最佳的。另外，由于乙醇的相对低疏水性，可能损害纳米乳剂通过皮肤的亲脂性生理学膜层的渗透。因而，纳米乳剂的稳定性以及其生物利用度(即渗透到组织中)降低。另外，与其它种类的醇例如异丙醇相比，乙醇是非常昂贵的醇。另外，乙醇在一些国家中在一定条件下具有特别的酒税的问题。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种纳米乳剂，其克服了现有技术提及的那些纳米乳剂的缺点并且特别地表现出可以改善稳定性以及渗透到细胞和组织中的最佳的物理性能，同时比现有技术的纳米乳剂更廉价。
这个目的是根据本发明通过提供纳米乳剂实现的，所述纳米乳剂包括a)至少一种含水组分和b)载体，所述载体包括i)至少一种亲脂性组分、ii)至少一种表面活性剂和iii)至少一种醇，其中所述至少一种醇具有至少三个碳原子。
发明人现在发现，本发明的纳米乳剂具有最佳地更低的平均粒径，具有窄的粒径分布。粒径的减小有助于稳定性的改善以及有助于纳米乳剂更好地渗透到细胞和组织中。
载体的组分i)(即亲脂性组分)的量优选以基于纳米乳剂的总重量为0.1重量％到15重量％的量存在，更优选1重量％到8重量％的量，最优选3重量％到4重量％的量。载体的组分ii)(即，一种或多种表面活性剂)的量优选以基于纳米乳剂的总重量为1重量％到30重量％的量存在，更优选2重量％到15重量％，并且最优选4重量％到6重量％的量。载体的组分iii)(即，醇)的量优选以基于纳米乳剂的总重量为0.1重量％到10重量％的量存在，更优选0.5重量％到5重量％和最优选1重量％到2重量％的量。
含水组分优选以基于纳米乳剂的总重量为50重量％到98重量％的量存在，更优选70重量％到95重量％，和最优选88重量％到92重量％的量。有利地，纳米乳剂的这种特定的组成产生皮肤的高度可耐受的并且在应用于皮肤期间不会产生粘滞感的纳米乳剂，这种效果尤其是由于表面活性剂和亲脂性组分的相对低比例引起的。
在本发明的优选实施方案中，纳米乳剂包括作为表面活性剂的成膜表面活性剂和形成O/W-乳剂的共表面活性剂。所述成膜表面活性剂：形成O/W-乳剂的共表面活性剂的量的重量比为0.1∶1到10∶1，优选为0.2∶1到0.8∶1，更优选为0.4∶1到0.6∶1。
在本发明范围内的具有至少3个碳原子的优选的醇是具有3-10个碳原子，优选3-7个碳原子，更优选3-5个碳原子，和最优选3个碳原子的醇。特别适合的具有5个碳原子的醇是1-戊醇和/或4-甲基-2-戊醇。具有4个碳原子的适合的醇是1-丁醇、叔丁醇(2-甲基-2-丙醇)和/或仲丁醇(2-丁醇)。最优选的是具有3个碳原子的醇，即，1-丙醇和异丙醇，其中优选异丙醇。通过在本发明的纳米乳剂中使用C3-醇(特别是异丙醇)，本发明人发现，与使用乙醇作为醇的现有技术的纳米乳剂相比，所述纳米乳剂表现出减小的粒径和更窄的粒径分布以及改善稳定性，并且向组织中的渗透有所增加。这是令人意料之外的，因为异丙醇和乙醇在生理学和化学特征方面是非常类似的。
在将异丙醇用作本发明纳米乳剂中的醇时，与使用乙醇相比，乳化的微粒的尺寸更小。由于产生的纳米乳剂与皮肤的接触面积增加，渗透性质得到增加。粒径的减小对于纳米乳剂的稳定性改善也是决定性的，因为众所周知，最终引起相分离的微粒聚结的速率随粒径而增加。异丙醇的有利作用可能是因为其略更高的疏水性，这可以引起渗透通过亲脂性生理学膜层的能力增加。另外，异丙醇具有与乙醇(粘度/cp，25℃，1.10)相比为更高的粘度(在25℃的cp为2.32)。异丙醇的所述更高的粘度可以在纳米乳剂中产生更好的稳定化机制，因为粘度减少分子的可动性。异丙醇与乙醇相比的另一个优点在于，其可以以相对低成本得到(为乙醇费用的大约1/3)，并且没有另外的酒税的负担。
优选地，本发明的纳米乳剂的载体的至少一种亲脂性组分是脂质、植物油和/或动物油。根据本发明适合的脂质是生理学上可接受的脂质，例如神经酰胺、单酰甘油酯、二酰甘油酯和三酰甘油酯(甘油三酯)，特别地是甘油三辛酸酯和/或甘油三癸酸酯和/或其混合物，特别优选Miglyol(例如，可得自Henkel的Miglyol 812或Myritol 318)。适合的植物油和动物油例如是向日葵油、豆油、花生油、菜籽油、鱼油和/或鲸脑。
适合的成膜表面活性剂是磷脂、溶血磷脂、神经酰胺和/或其混合物。优选地，磷脂是得自大豆或鸡蛋的卵磷脂或脑磷脂，更优选，卵磷脂是大豆卵磷脂。
优选地，卵磷脂具有至少80重量％，更优选至少90重量％，最优选至少94重量％的磷脂酰胆碱含量。本发明人发现，卵磷脂的质量(即，其磷脂酰胆碱含量)对于纳米乳剂的微粒尺寸起到关键作用。卵磷脂的磷脂酰胆碱含量越高，则纳米乳剂的微粒尺寸越小。
作为形成O/W乳剂的共表面活性剂，适合的是阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂和/或两性表面活性剂以及嵌段共聚物。适合的离子表面活性剂是皂类、烷基苯磺酸盐、烷烃磺酸盐、烷基硫酸盐和/或烷基醚硫酸盐。适合的阳离子型表面活性剂是季铵化合物(优选具有一个或两个疏水性基团的季铵化合物，例如溴化十六烷基三甲基铵和氯化十六烷基三甲基铵)和/或长链伯胺的盐。适合的两性表面活性剂是N-(酰基酰胺基烷基)甜菜碱、N-烷基-β-氨基丙酸盐和/或胺-N-氧化物。适合的嵌段共聚物例如是环氧丙烷。在本发明的范围内，特别优选非离子型表面活性剂作为形成O/W乳剂的共表面活性剂。适合的非离子型表面活性剂选自脂肪醇聚甘油醚、烷基苯酚聚甘油醚、烷基聚葡萄糖苷、脂肪酸葡糖酰胺、脂肪酸聚甘油醚、环氧乙烷-环氧丙烷-嵌段共聚物、聚甘油脂肪酸酯、脂肪酸链烷醇酰胺(alcanolamide)和(乙氧基化)山梨坦脂肪酸酯(山梨坦(sorbitane))。特别优选的乙氧基山梨聚醇脂肪酸酯是聚氧化乙烯山梨聚醇单油酸酯，最优选聚山梨酯80。
本发明的纳米乳剂的含水组分优选包括低含盐量的弱缓冲系统，更优选5mM到30mM的磷酸盐缓冲液，最优选10mM的磷酸盐缓冲液。优选磷酸盐缓冲液的pH值为pH4到pH8，更优选pH5到pH7，最优选pH5.5到pH6.5。用于制备磷酸盐缓冲液所用的水优选是无菌无离子水和/或注射用水，更优选注射用水。
纳米乳剂(纳米体，nanosome)的乳化微粒的平均直径为5nm到500nm，优选10nm到200nm，更优选小于100nm，特别是最大为90nm，优选最大为70nm，更优选最大为10nm到50nm，最优选15nm到35nm。纳米微粒的粒径分布优选是单分散性的并且遵循高斯分布。本发明的乳化微粒的直径是借助粒径分布来测定的，所述粒径分布是通过动态光散射(DLS)(也称为光子相关光谱术(PCS))的方法来测量的。微粒分布的统计分析是通过本发明的被称为微粒数-加权分布的方法来进行的。
本发明的另一个目的是制备本发明的纳米乳剂的方法，该方法包括以下步骤：a)提供含水组分，b)提供包括至少一种亲脂性组分、至少一种表面活性剂和至少一种醇的载体，其中所述至少一种醇具有至少3个碳原子，和c)将步骤a)的含水组分与步骤b)的载体混合。通过制备纳米乳剂，载体的各组分被提供在含水组分中，并且通过集中的或温和的均质化将混合物转化为纳米乳剂。均质化可以通过例如市售的匀化器来进行。在制备纳米乳剂之后，可以加入另外的添加剂和赋形剂，所述另外的添加剂和赋形剂的存在在均质化过程中是不适合的。
制备纳米乳剂的方法优选在无菌条件下进行，例如使用层流防护罩。
本发明人发现，除了组成之外，制备方法的一些步骤对于纳米乳剂中乳化微粒的最终尺寸和粒径分布是决定性的。特别地，在步骤c中的温度和均质化条件起到举足轻重的主要作用。步骤c在50-60℃的温度进行。所有的成分都是事先加热到这个温度。还应该优化容器和混合器，以便非常快地(在几秒内)得到各组分的均质混合物，避免形成泡沫。关于这种操作的说明参见实施例1。或者，均质化不需要高剪切设备例如超声破碎器或高压匀化器。
本发明的另一个方面是包括本发明的纳米乳剂的药物组合物和/或美容组合物。本发明的纳米乳剂在化妆品领域是适合的，例如作为抗老化试剂，因为它提供了可以用于多种不同产品类型的一种精致的、半透明的和透明的介质。所述纳米乳剂提供了一种处于微妙的平衡状态的系统，具有相对低的乳化剂的水平，所述乳化剂被认为是刺激性的。本发明的纳米乳剂保持合乎需要的透明度或半透明度，其能够容纳合理量的添加剂例如香料或增湿剂，同时由于低的乳化剂水平而在使用者的皮肤上保持稳定、温和及柔和。对于化妆品的情况中的最终产品的预定用途，有可能要加入非治疗性的或非活性的试剂，例如润肤剂、调味剂、着色剂、香料、胶凝剂、增稠剂、遮光剂等，所述非治疗性的或非活性的试剂增强产品的最终用途，特别是对于局部美容的目的而言，条件是要注意避免选择妨碍产品透明度(澄清度)的组分。最终产品可以采用乳剂、霜剂、洗液、凝胶剂、血清剂或液体喷雾剂的形式。在遮光剂的情况中，本发明的纳米乳剂可以包含一种或多种遮光剂，例如二苯甲酮、阿伏苯宗、肉桂酸盐、水杨酸盐等。
所述纳米乳剂还可以用于药物组合物中，特别地，它们可以用于生产局部用药物，用以治疗皮肤学疾病，例如神经性皮炎、银屑病、角化病(特别是光化性角化病)和与细胞增殖有关的疾病(例如肿瘤疾病)。优选地，所述肿瘤疾病选自基底细胞癌、鳞状细胞癌、Morbus Bowen、外阴上皮内瘤形成(VIN)或结节或皮下的癌症疾病。另外，所述纳米乳剂适合用于治疗由人乳头瘤病毒引起的病毒相关的疾病，例如尖锐湿疣(Condylomata acuminata)。通过并入纳米乳剂的亲脂性组分，可以有利影响水分的经表皮损失，即，可以增强皮肤的屏障功能并且由此可以有利地影响皮肤学疾病例如神经性皮炎。
本发明的另一个方面涉及包括本发明的纳米乳剂和一种活性剂的组合物。在这方面，所述组合物特别地可用作药物组合物和/或美容组合物，例如用于对皮肤或毛发施用。在所述组合物中包含的本发明的纳米乳剂提供对于各种活性剂的非常有效的递送系统。可以使用的活性剂的实例包括用于根除老年斑、角质化物和皱纹的药物，镇痛药，麻醉药，抗痤疮药，抗菌药，抗酵母菌药，抗真菌药，抗病毒药，抗头皮屑药，抗皮炎药，止痒药，止吐药，抗晕动病药，消炎药，抗过度角化药，抗干皮肤药，止汗药，抗牛皮癣药，抗皮脂溢药，护发素和毛发治疗药，抗衰老剂，抗皱纹药，止喘药和支气管扩张药，遮光剂，抗组胺药，皮肤增白药，脱色素药，维生素，皮质类固醇，激素，维A酸类(例如视黄酸和视黄醇)，局部心血管用药，克霉唑，酮康唑，咪康唑，灰黄霉素，羟嗪，苯海拉明，普莫卡因，利多卡因，普鲁卡因，甲哌卡因，莫诺苯宗，红霉素，四环素，克林霉素，卡拉霉素，meclocyline，氢醌，米诺环素，萘普生，布洛芬，theophylin，cromolyn，沙丁胺醇，局部用甾体类(例如，氢化可的松、氢化可的松21-乙酸酯、氢化可的松17-戊酸酯和氢化可的松17-丁酸酯)，戊酸倍他米松，二丙酸倍他米松，曲安奈德，醋酸氟轻松，丙酸氯倍他索，过氧苯甲酰，克罗米通，普萘洛尔，异丙嗪，维生素A棕榈酸酯，维生素E乙酸酯及其混合物。
在本发明的优选实施方案中，所述活性剂选自5-氨基乙酰丙酸、其衍生物、前体和/或代谢物。“衍生物”应该理解为特别是5-氨基乙酰丙酸的氨基被一个或两个烷基基团取代，特别优选被一个甲基基团取代的酯化。最优选的衍生物是甲基氨基乙酰丙酸。所述衍生化还可以理解为盐复合物和加成化合物以及烷基化的化合物。“前体”和“代谢物”应该理解为在细胞中被转化为原卟啉IX的物质。尤其优选的活性剂是5-氨基乙酰丙酸或其衍生物。
5-氨基乙酰丙酸在光动力学治疗领域中用作前体药物。光动力学治疗是用于治疗与细胞增殖有关的不同的前恶性和恶性疾病的一种有前途的方法(Taylor EL和Brown SB，2002，Journal ofDermatological treatment，13，Suppl.1，S3-11 and Peng Q.等人，1997，Cancer，79，S2282-2308)。光动力学治疗的原则是基于将所谓的光敏化剂引入到受损组织中并且随后用适当波长的光辐射，以便使所述光敏化剂转化为细胞毒性的活性剂，由所述细胞毒性活性剂引起细胞的破坏。这种方法的选择性是由于敏化剂在快速增殖或受损细胞中的浓度与正常组织中相比得到增强。此外，光敏剂的照射产生特征性荧光辐射，其可以用于诊断目的，例如用于检测增殖性细胞。
5-氨基乙酰丙酸是在细胞内从甘氨酸和琥珀酰-CoA合成得到的内源性物质。在血红素生物合成的范围内，由5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)形成高度光敏性的原卟啉IX，然后原卟啉IX转化为血红素。通过外源给予合成制备的5-氨基乙酰丙酸得以绕过这种控制机理，从而引起原卟啉IX的产生增加。因为原卟啉IX的降解另外受到自然控制机制的抑制，这种化合物变得在细胞中浓集起来。在用光辐射时，原卟啉IX能够经历光化学氧化反应并且从而作为光动力学治疗的光敏剂起作用。
系统给予5-氨基乙酰丙酸涉及多种副作用，所述副作用可以通过药物的局部施用而得以绕过。在现有技术中已知使用可局部施用的5-氨基乙酰丙酸组合物的许多研究。尽管这些研究在所用的5-氨基乙酰丙酸是水包油型乳剂的方面具有一致的特征，但是差别在于其它参数，例如渗透的时间段、疗程、所用的光的类型和所用的光的剂量。
B.Thiele等人(H+G，Vol.69，No.3，pp 161-164(1994))描述如下的研究：使用水包油型乳剂形式的20％δ-氨基乙酰丙酸、渗透时间段为5-6小时、并且随后用氩离子泵浦染料激光辐射(发射峰630nm)，累积的总剂量为50-100J/cm2。
Wolf等人(Journal of the American Academy of Dermatology，Vol.28，pp.17-21，1993)描述了如下的研究：使用水包油型乳剂形式的20％5-氨基乙酰丙酸；使用4、6或8小时的渗透时间；以及用未过滤的光或红色光辐射，给予30J/cm2到100J/cm2的光剂量。
尽管现有技术中公开的研究清楚地证明了使用5-氨基乙酰丙酸的光动力学治疗的有前途的潜力，但是目前已知的水包油型乳剂具有许多缺点。
例如，M.Novo Rodriguez等人(SPIE，Vol.2371，pp.204-209)表明，在临床应用所需的高浓度，氨基乙酰丙酸在水溶液中在中性到碱性pH的范围是不稳定的。在25小时的研究期间，只在3％的浓度和pH5的条件下获得令人满意的结果，所述条件被确定为5-氨基乙酰丙酸水溶液的最佳条件。然而，对于临床应用而言，通常需要提供更高浓度范围的组合物；此外，为了在商业上使用，5-ALA溶液必须在数周或数月规格的时间内是稳定的。
V.von Arx等人(J.Pharm.Pharmacol.49：652-656，1997)描述了涉及在各种凝胶中局部施用5-氨基乙酰丙酸的研究。这个出版物声明，对于保持5-氨基乙酰丙酸的稳定性来说，最好的制剂是与Novion AA-1(一种聚丙烯酸)的在pH＜6的组合物。
H ürlimann等人(Dermatology，Vol.197，No.3，1998，pp.248-254)公开了包含5-氨基乙酰丙酸的纳米胶体洗液以及其在光动力学治疗中的用途，但是没有具体说明所述乳剂。
WO 00/28971描述了包含纳米乳剂和5-氨基乙酰丙酸的组合物，其中所述纳米乳剂由含卵磷酯(83％磷脂酰胆碱)、Miglyol 812(甘油三酯)和聚山梨酯80的20mM磷酸盐缓冲液组成(参见WO 00/28971的实施例1)，但是没有使用醇作为溶剂。然而，包含卵磷酯作为乳化剂的纳米胶体制剂的具有缺点，即它们具有比包含大豆卵磷脂作为乳化剂的5-氨基乙酰丙酸纳米乳剂显著更浓的颜色。制剂的颜色变化与活性剂5-氨基乙酰丙酸降解产物的形成相关。由此可以推断，包含卵磷酯的纳米乳剂制剂与包含大豆卵磷脂作为乳化剂的制剂相比涉及显著降低的5-氨基乙酰丙酸稳定化。
与5-氨基乙酰丙酸组合的已知的水包油型乳剂的另一个缺点是光敏剂渗透到受损组织中的深度不是最佳的。结果，患病的组织只有其上面数层能得到光动力学治疗，尽管用于活化光敏剂所使用的光的渗透深度也允许治疗处于下面更深处的层。
因此，本发明的另一个目的是提供包含5-氨基乙酰丙酸的组合物，其至少部分地克服了现有技术的已知缺点。
根据本发明，通过提供一种包含本发明的纳米乳剂和作为活性剂的5-氨基乙酰丙酸、其衍生物、前体和/或代谢物的组合物，实现了这个目。在这些组合物中，可以利用上述本发明的纳米乳剂在稳定性、在组织中的渗透、以及更低成本方面的有利性质，将5-氨基乙酰丙酸转运到组织的目标位置。
已经发现在氨基乙酰丙酸和乳剂的纳米微粒之间有特异的相互作用。特别是，5-氨基乙酰丙酸、其衍生物、前体和/或代谢物连接在纳米乳剂的纳米微粒的单层的外侧。因此，尽管氨基乙酰丙酸不是被包含在所述微粒的芯内，但是它还是被所述微粒转运。相反地，由于氨基乙酰丙酸和外侧单层之间的相互作用，氨基乙酰丙酸处于所述微粒的芯的外侧。与其相比，在常规的纳米乳剂中，药物被包含在纳米乳剂的微粒的脂质芯内。
令人意料之外的是，已经发现在将5-氨基乙酰丙酸与本发明的包含至少一种具有至少3个碳原子的醇的纳米乳剂一起配制时，可以显著地提高5-氨基乙酰丙酸的稳定性。尽管尚不知其原因，但是似乎是由纳米体产生的微环境对5-氨基乙酰丙酸的稳定性具有特别有利的影响。
还令人意料之外地发现，使用本发明的纳米乳剂可以实现改善的细胞和组织渗透，使得处于下面更深处的疾病和/或具有更高层厚度的疾病也能得到治疗。更大的渗透深度是令人意料之外的，尤其是因为以前认为5-氨基乙酰丙酸由于其小尺寸，其在任何情况中都能够容易地渗透通过存在于例如与炎症、癌变前阶段和肿瘤有关的组织中的受损表皮。
第三个令人意料之外的优点是，当用本发明的纳米体配制时，5-氨基乙酰丙酸明显地非常有效地由细胞吸收。首先，这改善了靶向；其次，这意味着可以缩短渗透周期(即，在施用组合物与用光照射患病组织之间的时间)，这对患者而言意味着明显的缓解。从实施例4、图5结合可以看出，通过增加具有恒定浓度的氨基乙酰丙酸的本发明纳米乳剂的浓度，增强了5-氨基乙酰丙酸摄取进入培养细胞以及氨基乙酰丙酸在细胞内转化为PpIX。
而且，还可以通过包含具有至少3个碳原子的醇作为载体中的溶剂的本发明的纳米乳剂，改善储存稳定性。
根据本发明，所述组合物优选包括选自5-氨基乙酰丙酸或其衍生物、前体和/或代谢物的活性剂。“衍生物”应该理解为(特别是)被一个或两个烷基基团取代的(特别优选被一个甲基基团取代)的5-氨基乙酰丙酸的氨基的酯化。最优选的是5-氨基乙酰丙酸或5-甲基氨基乙酰丙酸。所述衍生化还可以理解为盐复合物和另外的化合物以及烷基化的化合物。“前体”和“代谢物”应该理解为在细胞中转化为原卟啉IX的物质。尤其优选的活性剂是5-氨基乙酰丙酸或其衍生物。
纳米乳剂(纳米体)中的乳化微粒的尺寸如上所给出。在各种情况中为最佳的粒径取决于另外的参数，例如组合物的粘度。例如，使用平均微粒直径小于100nm时粘度为1～10mPas的纳米乳剂获得了良好的结果。
组合物中的活性剂(优选为5-氨基乙酰丙酸)的量基本上取决于预定的应用。在优选的实施方案中，存在约1～30重量％的活性剂(基于组合物的总重量)。然而，更高或更低的剂量也是适合的。已经证明优选3～15重量％的量适合于与光动力学治疗有关的应用。
本发明的组合物优选可以进一步包含至少一种防腐剂和至少一种溶剂。
在特别优选的实施方案中，将所述组合物配制为凝胶剂。所包含的形成凝胶的试剂是形成基质的试剂，优选为黄原胶(xanthan)。尽管凝胶剂形式的纳米乳剂的粒径也优选小于100nm，但是其粘度显著更高，例如为500～2000mPas。
本发明的另一个方面是包括本发明的组合物的药物组合物、美容用组合物和/或诊断用组合物。在这种情况中，所述组合物可以另外包括美容学和/或药学上可接受的添加剂和/或赋形剂，特别是通常用于化妆品或药剂学的物质。这类物质的实例是缓冲剂、稳定剂、另外的乳化剂、增稠剂等。另外，所述组合物不含药学或诊断学上不可接受的的组分，并且优选不含例如引起刺激和/或歪曲诊断结果的组分。除了已经提及的载体物质之外，所述药物和/或诊断用制备物还可以包含可接受的并且优选充分耐受的另外的助剂或/和添加剂。
优选地，所述组合物作为液体或半固体存在。本发明范围内的适合的液体选自溶液(优选滴剂)、喷雾剂、气雾剂、乳剂或洗液。本发明范围内的适合的半固体选自软膏、霜剂、(O/W乳剂)、脂肪霜剂(W/O乳剂)、凝胶剂、洗液、泡沫、糊剂和/或悬浮液。
对于皮肤学和妇科学的应用，所述制备物优选为适合于局部给药的形式，特别是凝胶形式。所述制备物具有一些性质例如粘度和流变学，该性质有利于为确保在给予所述制备物之后荷载有5-氨基乙酰丙酸的纳米体在充分程度上渗透到目标组织中而期望的各自的应用形式。可以通过加入例如增稠剂例如聚乙二醇十八烷基醚、聚乙二醇硬脂酸酯和/或多糖例如多糖B-1459，调节所述粘度和流变学性质。
在特别优选的实施方案中，本发明的组合物为凝胶剂。凝胶剂与上述制剂相比表现出改善的盖仑制剂(galenic)性质。本发明的凝胶制剂表现出更好的粘着性、更好的稳定性、更好的活性剂释放以及在皮肤和粘膜上更好的耐受性。本发明的凝胶剂优选包含(基于组合物的总重量)0.01重量％到50重量％，更优选0.5重量％到30重量％和最优选1重量％到20重量％的活性剂，1重量％到60重量％，更优选15重量％到50重量％，最优选10重量％到30重量％的纳米乳剂，0.01重量％到4重量％，更优选1重量％到3重量％的至少一种填充剂，1重量％到3重量％的至少一种防腐剂，并且余量为至少一种溶剂。
本发明的另一个方面是制备本发明组合物的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供含水组分，
b)提供包含至少一种亲脂性组分、至少一种表面活性剂和至少一种醇的载体，其中所述至少一种醇具有至少三个碳原子，
c)将步骤a)的含水组分与步骤b)的载体混合，以形成纳米乳剂，
d)在形成步骤c)的所述纳米乳剂之前和/或之后加入活性剂，以及
e)任选地向步骤d)中加入另外的添加剂和/或赋形剂。
特别优选的是，步骤d)的活性剂是在形成步骤c)的所述纳米乳剂之后加入的。
所述方法优选在无菌条件下进行，例如使用层流防护罩。在上述方法中使用的含水组分、载体和活性剂具有与如上所述相同的优选和适合的含义。含水组分与载体的混合优选通过充分的均质化来进行。可以在均质化之前和/或之后加入5-氨基乙酰丙酸和可选存在的添加剂和/或赋形剂，优选在均质化之后加入。
优选地，在实施所述方法时将空气排除，例如借助施加真空和/或保护性气体气氛来排除空气。另外，优选在避光的情况下实施所述方法。
所述方法在一定的温度下进行，在该温度下可以如上所述形成所需纳米乳剂，并且对于后面的步骤来说，所述组分(尤其是活性物质)是充分稳定的。一般来说，发现约5～30℃的温度范围是适合的。然而，例如在适合的情况下首先被混合并且均质化为单独的混合物并且只在其之后加到组合物中的添加剂和/或赋形剂的加工也可以在较高的温度进行，例如直到约70℃。尤其对于药物应用，要小心以确保例如通过使用无菌的原料并且保持无菌的工艺条件或/和借助制备后的灭菌步骤，所得到的产品是无菌的。
在化妆品领域，优选将本发明组合物用作抗衰老剂，例如用于消除老年斑、皱纹和/或对抗干燥皮肤。
本发明的组合物的一个重要的应用领域是光动力学治疗的领域，特别优选将所述纳米乳剂局部施用。本发明的纳米乳剂可以应用于所有如下的疾病的情况中，对所述疾病的控制包括通过使由5-氨基乙酰丙酸形成的敏化剂光敏化来抑制细胞或组织的增殖或破坏该细胞或组织。特别地，所述疾病包括病毒相关的疾病，所述病毒优选选自人乳头瘤病毒(HPV)。最优选地，所述病毒相关的疾病是尖锐湿疣。尖锐湿疣定义为病毒起源的良性上皮瘤，其几乎是只局位于生殖器肛门，其病原体是6、11和42型人乳头瘤病毒(HPV)。在该疾病的过程中，针头大小的丘疹发展为菜花样和鸡冠样乳头状增殖。
本发明的组合物还适用于治疗皮肤学疾病，例如与角化病有关的疾病，特别优选适用于治疗光化性角化病。光化性角化病是表皮原位的鳞状细胞癌。光化性角化病是局限于表皮的转化角化细胞的增殖。光化性角化病主要是由长期暴露于紫外辐射诱导的，特别是长期暴露于日光(也称为日光性角化病)。光化性角化病本身表现出直径为约1毫米至约2厘米的粗糙的起鳞斑点、丘疹或斑块。
另外，本发明的组合物优选设计用于治疗与细胞增殖增加有关的疾病，因为在那种情况下，由于患病细胞中的细胞代谢增加，光敏剂被浓缩至特别高的浓度。
因此，本发明的组合物适合用于治疗肿瘤疾病，例如基底细胞腺瘤、鳞状细胞癌、Morbus Bowen、外阴上皮内瘤形成(VIN)和/或结节和/或皮下癌症疾病。银屑病是与细胞增殖增加有关的非肿瘤性疾病的一个实例。
本发明的组合物对于治疗基底细胞腺瘤是特别优选的。基底细胞腺瘤的特征是一种上皮瘤，其局部侵染性和破坏性地生长，但是很少转移，因此被认为是半恶性的。其主要发生在头部和颈部区域(80％)，特别是前额、眼角和鼻子的区域。在不利的进展的情况中，发生组织破坏甚至死亡，例如通过与其相关的骨和血管侵蚀和出血、以及通过CNS侵入。基底细胞腺瘤起源于表皮和/或毛囊的外侧根鞘的胚层(基底细胞层)的变性细胞。与通常在穿过表皮时丧失其分裂能力、衰变和重新形成角质层的健康基底细胞相反，基底细胞癌细胞保持其分裂能力，并且不再能够形成角质层。
本发明另外涉及本发明的纳米乳剂用于制备用于光动力学治疗的药物中的用途。
因此，例如通过如下方法实现以上疾病的治疗：局部施用包含活性剂(例如，5-氨基乙酰丙酸)的纳米乳剂，并且随后进行保温，以便允许充分量的5-氨基乙酰丙酸渗透到接受治疗的组织中。在保温过程中，优选避免用光照射经过处理的区域，例如将其覆盖，以便防止任何不期望的过早活化。在通常为约1～8小时、通常为约4小时的保温期间结束之后，使用光源以充分剂量的辐射来照射组织。适合的光源包括发射白光的灯以及单色光光源。辐射剂量通常是每次施用为约20J/cm2至几个100J/cm2。
根据本发明施用5-氨基乙酰丙酸凝胶剂的另一个领域涉及检测增殖性细胞在样品(例如组织样品)中的存在。检测的基础为：与正常细胞相比，由活性剂代谢产生的光敏剂选择性地浓集在增殖细胞中。优选地，所述活性剂是5-氨基乙酰丙酸并且光敏剂是原卟啉IX。可以借助光诊断(photodiagnostic)性方法测定光敏剂浓集的程度，例如通过用波长405nm的光照射并且测量由光敏剂生成的荧光辐射。本发明的纳米乳剂特别适合用于肿瘤诊断。
另外，本发明涉及一种试剂盒，其包含本发明的组合物和一种或多种辅助物质，所述组合物包含本发明的纳米乳剂和适合于局部施用的5-氨基乙酰丙酸、其衍生物、前体和/或代谢物。这些辅助物质的实例是必要的阻光覆盖材料例如塑料薄膜(在对被处理的位置施用纳米乳剂之后将其应用到所述位置，以免纳米乳剂过早地被光活化)，以及用于附着覆盖材料的工具或者用于对被治疗的位置施用纳米乳剂的其它工具。
另外，本发明涉及治疗与病毒相关的疾病、皮肤学疾病和/或与细胞增殖有关的疾病的方法，该方法包括对有此需要的受试者给予药学上有效的量的本发明的组合物。优选地，所述受试者是哺乳动物，更优选是人。
本发明的另一个方面涉及包含活性剂和纳米乳剂的组合物，所述活性剂选自5-氨基乙酰丙酸、其衍生物、前体和/或代谢物，其中所述纳米乳剂包含醇。
优选地，所述组合物和特别是所述纳米乳剂进一步包含至少一种含水组分(优选为水)和至少一种亲脂性组分和/或至少一种表面活性剂。
使用适合于局部施用的5-氨基乙酰丙酸、其衍生物、前体和/或代谢物。“衍生物”应该理解为特别是被一个或两个烷基基团取代的，特别优选被一个甲基基团取代的5-氨基乙酰丙酸的氨基的酯化。最优选的是5-氨基乙酰丙酸或5-甲基氨基乙酰丙酸。所述衍生化还可以理解为盐复合物和加成化合物以及烷基化的化合物。“前体”和“代谢物”应该理解为在细胞中被转化为原卟啉IX的物质。尤其优选的活性剂是5-氨基乙酰丙酸或其衍生物。
作为醇，优选C2-C8醇，特别是C3-C8醇，由于上述的原因，还更优选异丙醇和/或1-丙醇。
优选地，所述氨基乙酰丙酸、其衍生物、前体和/或代谢物连接在纳米乳剂的微粒的外侧单层。因此，由于氨基乙酰丙酸与外侧单层之间的相互作用，氨基乙酰丙酸处于所述微粒的芯的外面。
优选地，所述至少一种亲脂性组分是Miglyol，所述至少一种表面活性剂是卵磷脂，优选大豆卵磷脂和/或聚氧乙烯型表面活性剂，优选聚山梨酯80。
本发明的另一个方面涉及包括上述组合物的药物组合物和/或诊断用组合物。
本发明的另一个方面涉及所述纳米乳剂在药物组合物中的用途，特别是用于生产用于治疗皮肤学疾病例如银屑病、角化病和特别是光化性角化病的药物。另外，所述组合物适用于与细胞增殖有关的疾病，例如肿瘤疾病，例如基底细胞癌、鳞状细胞癌、MorbusBowen、外阴上皮内瘤形成(VIN)或结节和/或皮下的癌症疾病。另外，所述组合物适合用于治疗与病毒相关的疾病，例如尖锐湿疣。
本发明的另一个方面涉及包含纳米乳剂和活性剂的组合物，其中所述活性剂连接于纳米乳剂的微粒的外侧单层。这对于增强活性剂的化学性质(例如稳定性)和药学性质(例如渗透到皮肤中的深度以及生物利用度)特别有用。
优选地，所述纳米乳剂和/或所述活性剂为对于上述组合物所定义(参见说明书的第9ff页)。
另一个方面涉及包含组合物的药物组合物和/或美容组合物，其中所述活性剂连接于纳米乳剂的微粒的外侧单层。
本发明还包括所述组合物用于生产药物的用途，所述组合物包含纳米乳剂和活性剂，其中该活性剂连接于纳米乳剂的微粒的外侧单层，所述药物用于治疗与病毒相关的疾病、皮肤学疾病、与细胞增殖相关的疾病和/或用于光动力学治疗。所述疾病和所述光动力学治疗的优选实施方案如上所述。
附图和以下实施例意在用于进一步说明本发明。
附图简要说明
图1显示通过光子相关光谱术测量的代表性批次纳米乳剂BF-200的粒径分布。
图2显示纳米乳剂BF-200的冷冻破碎电子显微照片：(A)放大1,200,000倍，(B)放大250,000倍。
图3显示纳米乳剂BF-200的阴性染色电子显微照片：(A)放大1,200,000倍，(B)放大250,000倍。
图4显示在与ALA和不同浓度的BF-200保温三小时的希拉(Hela)细胞中测量的UV诱导的PpIX荧光。在洗去培养基之后二小时测量荧光。
图5显示氨基乙酰丙酸凝胶剂的冷冻破碎电子显微照片，放大50,000倍。
图6显示氨基乙酰丙酸凝胶剂的冷冻破碎电子显微照片
(A)放大250,000倍
(B)放大1,200,000倍
具体实施方式
实施例1：纳米乳剂BF200的制备
下表给出了纳米乳剂BF200的定性和定量组成。
表1.纳米乳剂BF200的组成
  成分   ％(w/w)   功能   质量
大豆卵磷脂 1.73 表面活性剂   ＞94％磷脂酰胆碱，用于药用，USP
  聚山梨酯80(聚氧乙烯山梨醇单油酸酯) 3.40 共表面活性剂 Ph.Eur.
  辛酸/癸酸甘油三酯   3.45   脂质芯   Ph.Eur.
  异丙醇   1.42   溶剂   Ph.Eur.
10mM磷酸盐缓冲液，pH 6 补足到100.00 溶剂   注射用水：Ph.Eur磷酸氢二钠和磷酸二氢钠：Ph.Eur.
乳剂BF200的生产方法由以下步骤组成：
步骤1：制备10mM的磷酸盐缓冲液，pH 6(含水组分)。
步骤2：制备包含亲脂性组分、表面活性剂和醇的载体。
步骤3：通过将得自步骤1的含水组分和得自步骤2的载体混合生产纳米乳剂。
步骤4：无菌过滤并在层流防护罩下将纳米乳剂BF200填充到无菌的玻璃瓶中。
用于典型的批量大小的生产方法的描述：
步骤1：制备10mM磷酸盐缓冲液(1000g)，pH 6，并且通过0.2μm无菌过滤器过滤将该磷酸盐缓冲液灭菌。
步骤2：制备包含亲脂性组分、表面活性剂和醇的载体。
表2.载体
Figure A20078004746900281
将大豆卵磷脂(17.30g)称重到适合的容器中。加入异丙醇(14.20g)并将容器覆盖，以避免醇蒸发。在室温下在用适合的搅拌器进行持续搅拌下使大豆卵磷脂溶解。称量辛酸/癸酸甘油三酯(34.50g)和聚山梨酯80(34.00g)并且加到大豆卵磷脂的溶液中。在室温下用适合的搅拌器搅拌混合物，直到得到均质的透明溶液。这个溶液为包含纳米乳剂BF200的所有乳化剂和脂质组分的浓缩物。
步骤3：通过将900g磷酸盐缓冲液(得自步骤1)和100g载体(得自步骤2)混合生产乳剂。
首先，将包括磷酸盐缓冲液的含水组分在适合的容器中加热到大约55℃。然后，将步骤2的载体(浓缩物)加热到大约55℃。随后，在用螺旋桨式混合器进行持续搅拌(700rpm)下将载体倾倒在磷酸盐缓冲液中。将得到的纳米乳剂搅拌15分钟。在整个操作过程中将温度保持在大约55℃。最后，将纳米乳剂在水浴中冷却到室温。
步骤4：通过0.2μm无菌过滤器过滤将所述纳米乳剂灭菌并且在层流防护罩下填充到100ml的无菌玻璃瓶中。
实施例2：氨基乙酰丙酸1％、3％和10％凝胶剂以及安慰剂凝胶剂的制备
下表中给出安慰剂凝胶剂和1％、3％、10％氨基乙酰丙酸凝胶剂的定性和定量组成。
表3.安慰剂凝胶剂的组成
Figure A20078004746900291
表4.氨基乙酰丙酸1％凝胶剂的组成
Figure A20078004746900292
表5：氨基乙酰丙酸3％凝胶剂的组成
  成分   每克凝胶剂中的量   功能   质量
  盐酸氨基乙酰丙酸   30.0mg   药物物质   内部
  黄原胶   19.625mg   填充剂   Ph.Eur.
  纳米乳剂BF200   175.0mg   载体   内部
  丙二醇   9.0mg   防腐剂   Ph.Eur.
  对羟基苯甲酸甲酯   0.7mg   防腐剂   Ph.Eur.
  对羟基苯甲酸丙酯   0.3mg   防腐剂   Ph.Eur.
  注射用水   765.375mg   溶剂   Ph.Eur.
表6：氨基乙酰丙酸10％凝胶剂的组成
  成分   每克凝胶剂中的量   功能   质量
  盐酸氨基乙酰丙酸   100.0mg   药物物质   内部
  黄原胶   17.875mg   填充剂   Ph.Eur.
  纳米乳剂BF200   175.0mg   载体   内部
  丙二醇   9.0mg   防腐剂   Ph.Eur.
  对羟基苯甲酸甲酯   0.7mg   防腐剂   Ph.Eur.
  对羟基苯甲酸丙酯   0.3mg   防腐剂   Ph.Eur.
  注射用水   697.125mg   溶剂   Ph.Eur.
安慰剂凝胶剂或氨基乙酰丙酸凝胶剂的生产方法由以下步骤组成：
-步骤1：通过将黄原胶加到注射用水中、混合并且蒸汽杀菌来生产凝胶基质；
-步骤2：制备对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯在丙二醇中的浓溶液；
-步骤3(对于安慰剂)：通过将防腐剂的浓溶液加到凝胶基质中、将纳米乳剂BF200加到凝胶基质中并将凝胶均质化，制备最终的凝胶制剂。
-步骤3(对于氨基乙酰丙酸凝胶剂)：最终的凝胶制剂制备如下，将防腐剂的浓溶液加到凝胶基质中。制备盐酸氨基乙酰丙酸在纳米乳剂BF200中的溶液。将盐酸氨基乙酰丙酸在纳米乳剂BF200中的溶液加到凝胶基质中并将凝胶均质化。
生产方法的描述：
步骤1：用黄原胶制备凝胶基质
将Stephan碗用异丙醇70％消毒。将注射用水(97.50单位量)置于碗中，然后将黄原胶(2.5单位量)铺展在其上面。在大约100mbar的压力以每分钟600转在真空中将混合物分散90分钟。将得到的基质凝胶填充到事先用注射用水(至多填充1/3)漂洗的200ml Schott烧瓶中。然后将烧瓶中的基质凝胶在高压灭菌器中在121℃蒸汽灭菌20分钟。
步骤2：对羟基苯甲酸酯浓缩物(Parabeni conc.)的制备
将对羟基苯甲酸甲酯(7.0份)和对羟基苯甲酸丙酯(3.0份)称重到适合的容器中。向其中混入丙二醇(90份)并使该对羟基苯甲酸酯溶解于丙二醇中。在用磁力搅拌器搅拌的情况下将混合物在加热板上加热，直到混合物溶解(70℃)，得到透明溶液。
步骤3第1部分：制备安慰剂凝胶剂
表7.从基质凝胶和对羟基苯甲酸酯浓缩物制备安慰剂凝胶剂
  组分   单位量
  A   凝胶基质   81.50
  B   纳米乳剂BF200   17.50
  D   对羟基苯甲酸酯浓缩物FH   1.0
  合计   100.0
所有下列步骤在无菌条件下在层流的气流中进行。将1单位量的对羟基苯甲酸酯浓缩物(D)和81.5单位量的基质凝胶(A)加到适合的容器中。将17.5单位量的纳米乳剂(B)通过0.2μm的无菌过滤器过滤并且加到基质凝胶中。将混合物搅拌10分钟。随后，将2单位量的凝胶剂各自填充到层压铝管中。
步骤3第2部分：制备氨基乙酰丙酸1％凝胶剂
表8.氨基乙酰丙酸1％凝胶剂的制备
  组分   单位量
  A   基质凝胶   80.50
  B   纳米乳剂BF200   17.50
  C   5ALA(盐酸氨基乙酰丙酸)   1.00
  D   对羟基苯甲酸酯浓缩物FH   1.0
  合计   100.0
所有下列操作在无菌条件下在层流的气流中进行。将1单位量的对羟基苯甲酸酯浓缩物(D)和80.5单位量的基质凝胶(A)加到适合的容器中。通过温和的搅拌将1单位量的ALA(C)溶解于17.5单位量的纳米乳剂(B)中，直到得到溶液。将所述溶液通过0.2μm的无菌过滤器过滤并且加到基质凝胶中。将混合物搅拌10分钟，以便得到均质的凝胶剂。随后，将2g的凝胶剂各自填充到层压铝管中。
步骤3第3部分：制备氨基乙酰丙酸3％和10％凝胶剂
以与对于1％凝胶所述的同样的方法制备3％和10％凝胶剂，但是分别使用了78.50单位量的基质凝胶和3单位量的ALA或71.50单位量的基质凝胶和10单位量的ALA。
实施例3：纳米乳剂BF-200的粒径
通过光子相关光谱术、PCS(也称为动态激光光散射，DLS)评价，所生产的纳米乳剂的平均粒径小于100nm。此外，所述纳米乳剂的特征是具有非常窄的粒径分布(参见以下图1)。
所述纳米乳剂在宽的温度范围内是稳定的，但是可以被冷冻和高压灭菌破坏。纳米乳剂对pH和离子强度的变化相对不敏感，并且由于它们的小尺寸，它们可以通过0.2μm过滤器过滤来灭菌。纳米乳剂具有改善活性物质到皮肤中的递送的潜力，因此增强局部施用的药物的功效。
使用低能量技术生产纳米乳剂BF-200；即，纳米乳剂的制备不需要高剪切力设备，例如超声破碎器或高压匀化器。
通过光子相关光谱术以及通过两种电子显微镜术(冷冻破碎EM和阴性染色)来研究纳米乳剂BF-200中的纳米微粒。
光子相关光谱术证实，BF-200产生具有非常一致和可靠的粒径和窄的微粒分布的纳米乳剂。这些特征在长时间和在不同温度下是稳定的(参见下表9)。
表9：纳米乳剂BF-200的稳定性研究的结果
Figure A20078004746900341
总之，在不同的储存条件下储存直到12个月之后，所有的结果都在指定的界限内。
放大1,200,000倍和250,000倍的纳米乳剂BF-200的冷冻破碎电子显微镜照片显示在下图2中。该显微镜照片中最显著的特征是直径为15至50nm的非常多的很小的球状囊泡。这些值与通过光子相关光谱术测量的那些值充分相关(参见上文表9)。所述囊泡最有能是单层的(unilammelar)，因为该囊泡膜的厚度为3-4nm。这相当于磷脂酰胆碱(它是所述纳米乳剂中的表面活性剂卵磷脂的主要成分)分子的长度。脂质体和其它双层囊泡的膜厚度在7nm以上。
还可以在通过阴性染色产生的电子显微照片中观察囊泡的结构。纳米乳剂BF-200中的纳米微粒是球形的，直径大约为20nm，具有大约3-4nm厚的碗状物并且填充有无定形物质(参见以下图3)。没有发现空心的微粒。
通过使用冷冻破碎和阴性染色技术的电子显微镜术研究氨基乙酰丙酸凝胶剂中的纳米微粒。
氨基乙酰丙酸凝胶剂的冷冻破碎电子显微照片证实，存在于凝胶剂中的纳米微粒具有与在纯的纳米乳剂BF-200中的那些相似的尺寸。显微照片阐明了单个的微粒以及集聚体(图5)。凝胶剂中的纳米微粒的形态学和尺寸不受储存条件的影响。通过冷冻破碎电子显微镜术检验BF-200ALA(在25℃(60％相对湿度)储存4个月之后的10％凝胶剂)显示，微粒具有与在新生产的凝胶剂中所观察到的那些相似的大小与形状。计划使用BF-200ALA凝胶剂(10％氨基乙酰丙酸)和安慰剂到要用于与临床研究平行进行的III期临床研究的BF-200ALA凝胶剂的批料进行的稳定性研究包括在更迟的时间点通过电子显微镜术进行粒径的检验。
图6显示以更高的放大倍数产生的凝胶剂的冷冻破碎电子显微照片。破裂面主要地显示被覆盖的微粒的外壳。通过微粒本身发生的破碎非常少。所述囊泡似乎被一层材料所包围，认为所述材料表示氨基乙酰丙酸。这产生了煎蛋样照片(在图6的B部分中用箭头标注的)。
通过阴性染色10％氨基乙酰丙酸凝胶剂产生的电子显微照片显示具有混浊的扩散的表面结构的纳米微粒，这可以证实在冷冻破碎电子显微照片中观察到的材料在纳米微粒上的分层。
实施例4：在哺乳动物细胞中的吸收：关于ALA摄取的体外细胞培养研究：细胞培养研究
可以通过测量UV-诱导的PpIX荧光来监测培养细胞中的ALA摄取和向原卟啉IX(PpIX)的转化。使用几种肿瘤细胞系进行细胞培养实验：HELA、HepG2和CCD 106KERTr(一种人上皮角化细胞细胞系)。将细胞在含有甲基(Methyl)-ALA(MAL)、ALA或BF-200的含水培养基中与ALA培养最长3小时。在选择的药物浓度下，所有的三种培养基都具有相似的pH值。在培养之后，温和地洗涤细胞并且加入新鲜的培养基。通过量化荧光在不同的时间点测量PpIX产生。图5显示了用HELA细胞获得的结果。
在图5中显示增加浓度的纳米乳剂BF-200(在恒定的ALA浓度下)对PpIX合成的影响。细胞中的PpIX荧光随BF200浓度的增加而升高，并且在3％BF200时达到最大值。
实施例5
在2006年秋天开始并且由Biofrontera Bioscience GmbH资助的II期剂量-确定临床研究中显示5-ALA的纳米乳剂制剂对于光化性角化病的光动力学治疗的功效。在University Clinics ofRegensburg的Rolf-Markus Szeimies博士教授的医疗指导下在德国的13个临床中心进行了安慰剂对照的、随机化的和双盲的研究。使用了三个活性剂剂量(1、3和10％ALA)和安慰剂。为了验证化合物的功效，通过使用三个不同ALA浓度的中一种或安慰剂进行光动力学治疗，对105患者进行处理一次。
包括了在脸上和头皮上具有3-10处光化性角化病病变的患者。每名患者的所有病变都接受一种治疗(1％、3％或10％的5-氨基乙酰丙酸(ALA)或安慰剂)。在3小时的保温之后施加红光。在治疗期间之后，受试者在3周、8周和12周回到诊所，以便监测临床结果和愈合进程。每次都由研究人员根据具有AK迹象和临床症状的剩余面积的证据，评价经过处理的光化性角化病(AK)病变区域。主要的功效变量为在第12周就诊时所有AK病变的总清除率，其被定义为表现出完全缓解的病变(所述病变完全清除并且不再看见AK的粘性起鳞斑块)的数目。还监测了在应用BF-200ALA之后的照射过程中出现的疼痛。
结果：发现在PDT之前用10％ALA预治疗在清除AK病变方面是三个试验浓度中最有效的(统计上显著优于安慰剂)。在用BF-200ALA单次治疗之后12周评价患者时，经过治疗的病变有至少60-70％完全地治愈(取决于临床中心的衡量和头部的面积)。安慰剂组中的清除率是经过治疗的病变的大约5-15％(取决于临床中心的衡量)。所述清除率与得自类似研究设计但是使用更高浓度的活性物质5-ALA或甲基ALA的ALA-PDT研究的公开结果非常符合。美容学结果是优异的。只有6％的患者抱怨有剧烈的疼痛。在研究过程中没有发生相关的副作用，美容学结果是优异的。在PDT过程中和在PDT之后的12周期间，四个组中的任一组都没有安全问题。
作为另外的安全措施，这个剂量确定部分包括药物动力学评价。测量了ALA及其代谢物原卟啉IX的系统血浆水平和尿水平。在用ALA治疗的患者中，与相同个体的天然存在的生理学数值相比，这些化合物的血浆浓度和尿浓度没有增加。

Claims (63)

1.一种纳米乳剂，其包含a)至少一种含水组分和b)载体，该载体包含i)至少一种亲脂性组分，ii)至少一种表面活性剂和iii)至少一种醇，
其中所述至少一种醇具有至少三个碳原子。
2.权利要求1的纳米乳剂，其中所述载体存在于所述含水组分中。
3.权利要求1或2的纳米乳剂，其中基于所述纳米乳剂的总重量，所述亲脂性组分的含量为0.1重量％到15重量％，所述表面活性剂的含量为1重量％到30重量％，并且所述醇的含量为0.1重量％到10重量％。
4.前述权利要求中任一项的纳米乳剂，其中基于所述纳米乳剂的总重量，所述含水组分的含量为50重量％到98重量％。
5.前述权利要求中任一项的纳米乳剂，其中所述至少一种醇是异丙醇和/或1-丙醇。
6.前述权利要求中任一项的纳米乳剂，其中所述至少一种亲脂性组分是甘油三酯和/或其混合物。
7.前述权利要求中任一项的纳米乳剂，其中所述至少一种表面活性剂是卵磷脂和/或聚氧乙烯型表面活性剂。
8.权利要求7的纳米乳剂，其中所述卵磷脂是大豆卵磷脂，并且所述聚氧乙烯型表面活性剂是聚山梨酯80。
9.权利要求8的纳米乳剂，其中所述大豆卵磷脂具有至少80重量％的磷脂酰胆碱含量。
10.前述权利要求中任一项的纳米乳剂，其中乳化的微粒的平均直径为约5nm～500nm，优选小于100nm。
11.前述权利要求中任一项的纳米乳剂，其中乳化的微粒的平均直径为10～50nm。
12.制备前述权利要求中任一项的纳米乳剂的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供含水组分，
b)提供载体，该载体包括至少一种亲脂性组分、至少一种表面活性剂和至少一种醇，
其中所述至少一种醇具有至少三个碳原子，以及
c)将步骤a)的含水组分与步骤b)的载体混合。
13.药物组合物和/或美容组合物，其包含权利要求1～11中任一项的纳米乳剂。
14.一种组合物，其包含前述权利要求中任一项中限定的纳米乳剂和活性剂。
15.权利要求14的组合物，其中所述活性剂选自5-氨基乙酰丙酸、其衍生物、前体和/或代谢物。
16.权利要求15的组合物，其中5-氨基乙酰丙酸、其衍生物、前体和/或代谢物连接于所述纳米乳剂的微粒的外侧单层。
17.药物组合物、美容组合物和/或诊断用组合物，其包含权利要求14到16中任一项的组合物。
18.权利要求14到17中任一项的组合物，其中所述组合物以凝胶剂的形式存在并且包含，基于组合物的总重量，0.01重量％到50重量％的活性剂、1重量％到60重量％的纳米乳剂、0.01重量％到4重量％的至少一种填充剂、1重量％到3重量％的至少一种防腐剂，并且余量为至少一种溶剂。
19.制备权利要求14到18中任一项中限定的组合物的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供含水组分，
b)提供载体，该载体包含至少一种亲脂性组分、至少一种表面活性剂和至少一种醇，
其中所述至少一种醇具有至少三个碳原子，
c)将步骤a)的含水组分与步骤b)的载体混合，以形成纳米乳剂，
d)在形成步骤c)的所述纳米乳剂之前和/或之后加入活性剂，以及
e)可选地向步骤d)加入另外的添加剂和/或赋形剂。
20.权利要求19的方法，其中步骤d)中的所述活性剂是在步骤c)形成所述纳米乳剂之后加入的。
21.权利要求1到11中任一项的纳米乳剂或权利要求13到18中任一项的组合物作为抗衰老剂的美容用途。
22.权利要求1到11中任一项的纳米乳剂或权利要求13到18中任一项的组合物用于生产药物的用途，所述药物用于治疗与病毒相关的疾病。
23.权利要求22的用途，其中所述与病毒相关的疾病是由人乳头瘤病毒(HPV)引起的。
24.权利要求23的用途，其中所述与病毒相关的疾病是尖锐湿疣。
25.权利要求1到11中任一项的纳米乳剂或权利要求13到18中任一项的组合物用于生产药物的用途，所述药物用于治疗皮肤学疾病。
26.权利要求25的用途，其中所述病症选自神经性皮炎。
27.权利要求26的用途，其中所述皮肤学疾病是痤疮和/或与角化病有关的疾病。
28.权利要求27的用途，其中所述角化病是光化性角化病。
29.权利要求1到11中任一项的纳米乳剂和/或权利要求13到18中任一项的组合物用于生产药物的用途，所述药物用于治疗与细胞增殖有关的疾病。
30.权利要求29的用途，其中所述与细胞增殖有关的疾病是肿瘤疾病。
31.权利要求30的用途，其中所述肿瘤疾病选自基底细胞腺瘤、鳞状细胞癌、Morbus Bowen、外阴上皮内瘤形成(VIN)和/或结节和/或皮下的癌症疾病。
32.权利要求25或29的用途，其中所述疾病是银屑病。
33.权利要求15到18中任一项的组合物用于生产用于光动力学治疗的药物的用途。
34.权利要求33的用途，其中所述组合物以有效量对患者给药并且保温适合于为被治疗的组织中提供充分量的活性剂的一段时间，并且其中所述组织经受光辐射。
35.权利要求15到18中任一项的组合物用于检测增殖性细胞的用途。
36.权利要求15到18中任一项的组合物用于诊断皮肤学疾病和/或肿瘤疾病的用途。
37.试剂盒，其包含权利要求15到18中任一项的组合物和至少一种组分，该组分选自
a)阻光的覆盖物
b)用于使所述覆盖物附着于应用部位的工具，以及
c)用于将所述组合物应用到应用部位的工具。
38.治疗与病毒相关的疾病、皮肤学疾病和/或与细胞增殖有关的疾病的方法，该方法包括对有此需要的受试者给予药学上有效的量的权利要求1到11中任一项的纳米乳剂和/或权利要求13到18中任一项中限定的组合物。
39.包含活性剂和纳米乳剂的组合物，所述活性剂选自5-氨基乙酰丙酸、其衍生物、前体和/或代谢物，其中所述纳米乳剂包含醇。
40.权利要求39的组合物，其进一步包含至少一种含水组分，优选包含水，至少一种亲脂性组分和/或至少一种表面活性剂。
41.权利要求39到40中任一项的组合物，其中所述醇是C2-C8醇，特别是C3-C8醇。
42.权利要求41的组合物，其中所述醇是异丙醇和/或1-丙醇。
43.权利要求38到42中任一项的组合物，其中5-氨基乙酰丙酸、其衍生物、前体和/或代谢物连接于所述纳米乳剂的外侧单层。
44.权利要求38到42中任一项的组合物，其中所述至少一种亲脂性组分是Miglyol，所述至少一种表面活性剂是卵磷脂，优选是大豆卵磷脂，和/或聚氧乙烯型表面活性剂，优选聚山梨酯80。
45.药物组合物和/或诊断用组合物，其包含权利要求38到44中任一项的组合物。
46.权利要求38到44中任一项的组合物用于生产药物的用途，所述药物用于治疗与病毒相关的疾病。
47.权利要求46的用途，其中所述与病毒相关的疾病是由人乳头瘤病毒(HPV)引起的。
48.权利要求47的用途，其中所述与病毒相关的疾病是尖锐湿疣。
49.权利要求39到44中任一项的组合物用于生产药物的用途，所述药物用于治疗皮肤学疾病。
50.权利要求49的用途，其中所述皮肤学疾病是痤疮和/或与角化病有关的疾病。
51.权利要求44的用途，其中所述角化病是光化性角化病。
52.权利要求39到44中任一项的组合物用于生产药物的用途，所述药物用于治疗与细胞增殖相关的疾病。
53.权利要求52的用途，其中所述与细胞增殖有关的疾病是肿瘤疾病。
54.权利要求53的用途，其中所述肿瘤疾病选自基底细胞腺瘤、鳞状细胞癌、Morbus Bowen、外阴上皮内瘤形成(VIN)和/或结节和/或皮下的癌症疾病。
55.权利要求49或52的用途，其中所述疾病是银屑病。
56.权利要求39到44中任一项的组合物用于生产用于光动力学治疗的药物的用途。
57.权利要求56的用途，其中所述组合物以有效量对患者给药并且保温适合于为被治疗的组织中提供充分量的活性剂的一段时间，并且其中所述组织经受光辐射。
58.权利要求39到44中任一项的组合物用于检测增殖性细胞的用途。
59.权利要求39到44中任一项的组合物用于诊断皮肤学疾病和/或肿瘤疾病的用途。
60.包含纳米乳剂和活性剂的组合物，其中所述活性剂连接于所述纳米乳剂的微粒的外侧单层。
61.权利要求60的组合物，其中所述纳米乳剂和/或活性剂是权利要求39到44中任一项所限定的。
62.药物组合物和/或美容组合物，其包含权利要求60或61的组合物。
63.权利要求60或61的组合物用于生产药物的用途，所述药物用于治疗与病毒相关的疾病、皮肤学疾病、与细胞增殖相关的疾病和/或用于光动力学治疗。
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