发明内容
(一)要解决的技术问题
针对罗莫肽极微溶于水,且在水溶液中又极为不稳定的特点,发明人通过试验,采用环糊精包合技术对罗莫肽进行包合,成功的制备出水溶性好、稳定性高的罗莫肽-环糊包合物及其水溶液注射剂,且可制成口服剂型。本发明的罗莫肽-环糊精包合物同时也提高了药物罗莫肽在体内的稳定性,降低了罗莫肽致炎性及中枢致热性等毒副作用,从而使得罗莫肽具有更好的药用价值。
(二)技术方案
本发明可通过以下技术方案实现:
罗莫肽-环糊精包合物的具体制备方法:饱和水溶液法和冷冻干燥法。
罗莫肽-环糊精包合物制剂(溶液剂型和口服剂型)的制备方法。
所述罗莫肽可以是罗莫肽单体成分,也可以是以罗莫肽为主要成分的混合物,即罗莫肽含量超过85%。
所述环糊精可为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟丙基-磺丁基-β-环糊精、葡萄糖-β-环糊精、甲基-β-环糊精。环糊精优选羟丙基-β-环糊精和β-环糊精。
所述罗莫肽-环糊精包合物可以通过将罗莫肽与环糊精采用饱和水溶液法、研磨法,冷冻干燥法,喷雾干燥法和超声法等制备方法获得。
罗莫肽与环糊精的摩尔比是1∶1-100。
罗莫肽与环糊精的优选尔比是1∶1-50。
罗莫肽与环糊精的更优选的摩尔比是1∶1-25。
罗莫肽与环糊精的更优选的摩尔比是1∶1-10。
罗莫肽与环糊精的最优选的摩尔比是1∶1-4。
实验显示如果环糊精与罗莫肽的比率低于1∶1的下限,则形成的包合物的水溶性增加不明显,收率明显降低,而如果大于100∶1则过量的环糊精可能会引起毒副作用。
饱和水溶液法是将罗莫肽用适量的DMF或甲醇加热溶解,按照与罗莫肽摩尔比1∶1-100倍的量称取环糊精配成40℃-80℃的溶液,将两种溶液混合搅拌60min以上,搅拌冷却降温使得形成的包合物沉淀,将沉淀的包合物过滤,用适量的DMF或甲醇洗去单体的罗莫肽,干燥即得罗莫肽-环糊精包合物。
研磨法是将罗莫肽用适量的DMF或甲醇加热溶解,再加入与罗莫肽摩尔比1∶1-100倍的量称取环糊精,再加入适量的水混合,充分研磨成糊状物,低温干燥,再用DMF或甲醇洗涤洗去单体罗莫肽,干燥即得罗莫肽-环糊精包合物。
冷冻干燥法是将罗莫肽与环糊精按照摩尔比1∶1-100,溶于10%(v/v)冰醋酸溶剂的水溶液中,搅拌溶解并通过微孔滤膜,低温冷冻成冰,再冷冻干燥约24小时,即得罗莫肽-环糊精包合物。
超声法是将罗莫肽与环糊精按摩尔比1∶1-100称量,置锥形瓶中,加入适量的DMF或甲醇溶解,置超声波中超声5~20min,减压蒸干,即得罗莫肽-环糊精包合物。
上述方法制备的罗莫肽-环糊精包合物的载药量用HPLC方法测得:
色谱条件:色谱柱:C18反相色谱柱;流动相:甲醇∶0.02M乙酸铵缓冲液(用冰醋酸调pH值4.7)∶乙腈=18∶22∶60;检测波长:220nm。
对照品溶液的配制:精密称取罗莫肽对照品适量,用流动相溶解并稀释制备200μg/ml的溶液作为对照品溶液。
样品预处理:精密称取包合物适量的罗莫肽-环糊精包合物适量,用流动相溶解并稀释制备200μg/ml的溶液作为供试品溶液。
准确称取一定量罗莫肽包合物,产生的包合物用高效液相测定罗莫肽-环糊精包合物的含量,代入下式进行计算载药量:
载药量=药物量/包合物量×100%
用上述方法制得的罗莫肽-环糊精包合物的载药量通常在1%-45%之间,优选10%-44%。
本发明中的包合物主要通过如下方法证明。
(1)薄层色谱法
采用硅胶薄层色谱法测定包合物是否形成。方法是取罗莫肽甲醇溶液;环糊精水溶液;罗莫肽-环糊精水溶液;罗莫肽甲醇溶液和环糊精水溶液的混合液(v/v=1∶1)按照薄层色谱法分别点样1-5μl,在硅胶G-CMC板上展开,展开剂为乙醇-氯仿-水-冰醋酸(12∶10∶3∶1),碘蒸汽显色,结果薄层色谱显示罗莫肽甲醇溶液和环糊精水溶液的混合液展开,显色后出现两个斑点,两个斑点分别与罗莫肽甲醇溶液和环糊精水溶液展开并显色后的斑点处于同一水平线上,罗莫肽-环糊精包合物水溶液展开后不再有罗莫肽斑点。说明罗莫肽-环糊精包合物形成。
(2)红外光谱法
对罗莫肽-环糊精包合物、罗莫肽与环糊精混合物、环糊精、罗莫肽做了红外光谱(IR谱),发现罗莫肽-环糊精包合物的IR谱既不同于罗莫肽和环糊精单独的IR谱,也不同于二者混合物的IR谱,说明形成了罗莫肽-环糊精包合物。
(3)溶解度法
将罗莫肽、罗莫肽-环糊精包合物分别用DMF、甲醇、水溶解,比较在每种溶剂中的溶解度。发现包合物在DMF、甲醇中的溶解度下降,在水中的溶解度显著升高,说明形成了罗莫肽-环糊精包合物。
本发明的罗莫肽-环糊精包合物可与可药用的稀释剂、载体或赋形剂(包括它们的混合物),形成药物组合物。所述组合物根据不同的给药途径可制备的剂型有口服制剂、注射剂、滴鼻剂、喷鼻剂等。
本组合物可用于人体或动物,通常含有任何一种或多种可药用的稀释剂、载体或赋形剂。用于治疗或保健用途的可药用的稀释剂、载体或赋形剂为制药领域中普通技术人员公知的,可通过商业途径得到。
所述口服制剂为片剂、胶囊、口服液、颗粒剂等制剂,优选胶囊和片剂;胶囊和片剂辅料可以为淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、微晶纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、PVP k25、PVP k30、PEG400-6000、氯化钠等无机盐、硬脂酸、硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶等一种或几种的混合物作为辅料。
所述注射剂可为冻干粉针、小水针和大容量注射液形式;注射剂溶剂可选用注射用水、注射用油、以及乙醇、甘油、丙二醇等其中的一种或几种混合物;pH调节剂可为盐酸、氢氧化钠、磷酸盐缓液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液中的一种或几种混合物;填充剂可选乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇等的一种或几种混合物;等渗调节可选用氯化钠、葡萄糖和木糖醇中的一种或几种。
所述滴鼻剂或喷鼻剂惰性载体为选自水、丙二醇、苯扎氯铵、苯扎溴铵、苯甲醇、苯甲酸、三氯叔丁醇、对羟基苯甲酸酯类、山梨酸、苯酚和麝香草酚中的一种或几种的混合。
本发明同时提供所述药物组合物各种制剂的应用,可以将其用作免疫调节剂,具有促进造血作用,可以升白细胞和血小板,用于治疗白细胞减少和血小板减少症,以及微生物感染性疾病和恶性肿瘤的辅助治疗。还可以用作疫苗佐剂。
下面通过试验例来进一步说明本发明的效果:
试验例1红外光谱(IR谱)法鉴定包合物
本方法参照专利号为200410060918.1《傅利叶红外光谱法分析β-环糊精包合物的方法》对本发明合成的罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物、罗莫肽、羟丙基-β-环糊精、罗莫肽与羟丙基-β-环糊精混合物进行红外吸收光谱的测定。
从图谱中可以看出,包合物中比羟丙基-β-环糊精多出了1737处的羰基C=O伸缩振动(归属于罗莫肽的特征吸收),但由于包合作用,强度较罗莫肽的该吸收峰下降了约40%-60%。同样,1642处的CONH基团C=O伸缩振动,包合物的吸收峰也较罗莫肽的该吸收峰下降了约40%-60%。
罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物红外光谱数据表
试验例2溶解度
取适量的罗莫肽、罗莫肽-β-环糊精包合物、罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物置于10ml的蒸馏水的容量瓶中,25℃水浴,每隔5分钟强烈振摇,30分钟后用高效液相测定罗莫肽含量,计算出溶解度。结果如下:
样品 |
罗莫肽 |
罗莫肽-β-环糊精包合物 |
罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物 |
溶解度(mg/ml) |
1.05 |
15.74 |
48.63 |
罗莫肽极微溶于水,环糊精包合后溶解度显著提高。罗莫肽-β-环糊精包合物可提高15倍以上,而罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物溶解度提高40倍以上。
试验例3稳定性
取罗莫肽磷酸盐溶液、罗莫肽-β-环糊精包合物溶液、罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物溶液,60℃条件下放置10天,于第5天和第10天用高效液相色谱法测定含量。
罗莫肽水溶液不稳定,经环糊精包合后,稳定性显著提高,能满足药用要求。
试验例4罗莫肽与罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物急性毒性试验对比
将罗莫肽和罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物一次给予动物后所产生的急性毒性反应和死亡情况进行对比。
1.动物:瑞士种昆明远交系小鼠,体重18-22g,雌雄各半,温度25±3℃。12小时明,12小时暗分笼饲养,每笼6只,自由饮食饮水。
2.动物来源:由军事医学科学院动物中心提供。
3.药物与配制:
罗莫肽:自制
批号:20060919
含量:93%
配制:临用前将样品溶解或悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)中。
罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物(罗莫肽与羟丙基-β-环糊精摩尔比按1∶1计算):自行研制
批号:20071105
含量:92%
配制:临用前将样品溶解或悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)中。
4.剂量与给药途径:试验每个药各分5组,每组雌雄个3只,最大剂量组为1854mg/kg,最小剂量组为300mg/kg,组间比I为0.695。头颈皮下给药,每只0.5ml。
5.观察指标:给药后每天观察记录动物的中毒表现和死亡情况,连续观察14天,对死亡动物进行尸检。
6.结果
观察罗莫肽一次给予小鼠后所产生的急性毒性反应和死亡情况。
表1给予罗莫肽各组动物死亡情况
根据简化概率法进行计算,得出小鼠的LD50=755.19mg/kg。
表2给予罗莫肽-β-环糊精包合物各组动物死亡情况
根据简化概率法进行计算,得出小鼠的LD50=1089.2mg/kg。
7.结论
罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物给药后,小鼠活动亢进程度弱于罗莫肽组。包合物的LD50大于罗莫肽。尸检显示,包合物894mg/kg剂量组注射部位未发现硬痂和溃烂现象,1854mg/kg、1289mg/kg剂量组出现的硬痂和溃烂的现象较罗莫肽的减轻。说明包合物的毒副作用较罗莫肽下降。
试验例5免疫实验
1.动物:5~7周Hartley系雌性豚鼠30只,体重400~450g,分为3组,温度23±1℃,自由饮食饮水。
2.动物来源:由军事医学科学院动物中心提供。
3.药物与配制:
罗莫肽:自制
批号:20060919
含量:93%
配制:临用前将样品溶解于磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)中,于50℃水浴中恒温,制成500μg/ml的溶液备用。
罗莫肽-β-环糊精包合物(罗莫肽与β-环糊精摩尔比按1∶1计算):自行研制
批号:20071112
含量:91%
配制:临用前将样品溶解或悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)中,制成500μg/ml的溶液备用。
4.剂量与给药途径:每日上午9:00皮下给药,每只0.2ml。对照组皮下给0.2ml pH7.4的PBS。
5.动物模型制备:用X-射线单次全身照射豚鼠,剂量1Gy。
6.血样收集:每日上午9:00~10:00收集豚鼠耳静脉血。
7.观察指标:于第0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、21天收集血样,观察白细胞数量变化。
8.结果
X射线照射后各组白细胞变化情况见下表:
9.结论
豚鼠在接受X-射线照射后第一天白细胞达到最低值,而罗莫肽或包合物组可显著提高白细胞达的最低值。治疗组于第13天后白细胞数量全部恢复正常范围,而包合物组疗效显著高于罗莫肽组。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明,而不用来限制本发明的范围。
实施例1罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物的制备
准确称取60mg罗莫肽加入到20ml甲醇中,45℃水浴放置搅拌,使罗莫肽溶解。称取360mg羟丙基-β-环糊精溶解于20ml蒸馏水中,将羟丙基-β-环糊精水溶液置于45℃水浴环境,将罗莫肽甲醇溶液加入到羟丙基-β-环糊精水溶液中,超声10分钟。加入丙酮,搅拌析出沉淀,静置20min,过滤后沉淀用丙酮洗涤,干燥后即得罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物。用高效液相法测定收率为95.7%,载药量为13.4%。
实施例2罗莫肽-β-环糊精包合物的制备
准确称取60mg罗莫肽加入到10ml冰醋酸中,45℃水浴放置搅拌,使罗莫肽溶解。称取80mg β-环糊精溶解于10ml蒸馏水中,β-环糊精水溶液置于45℃水浴环境,搅拌下将罗莫肽冰醋酸溶液缓慢加入到β-环糊精水溶液中,用微孔滤膜滤过后,置液氮罐中冷藏,再冷冻干燥约24小时,即得罗莫肽-环糊精包合物。用高效液相法测定收率为94.2%,载药量为41.3%。
罗莫肽的其它环糊精包合物和制备方法亦在本专利保护范围内。
实施例3口服制剂的制备
胶囊制剂、口服液、片剂的制备
1、胶囊的制备
胶囊组成由下列要素组成(罗莫肽与羟丙基-β-环糊精摩尔比按1∶1计算,载药量为38.3%)
罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物 |
13.0g |
淀粉 |
70.0g |
微晶纤维素 |
70.0g |
滑石粉 |
1.5g |
取罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物与其它辅料按等量递加法混合均匀,填充到2号空胶囊中制备1000粒胶囊即可。
胶囊中罗莫肽药物含量为5mg/粒。
2、口服液的制备
口服液组成由下列要素组成(罗莫肽与羟丙基-β-环糊精摩尔比按1∶2计算,载药量为23.6%)
罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物 |
17.0g |
乳酸 |
30.0g |
蔗糖 |
100.0g |
对羟基苯甲酸酯 |
0.4g |
香精 |
适量 |
纯化水 |
4000ml |
取罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物及各辅料加入到4L水中,搅拌使之溶解,过滤,精滤,分装入瓶中,灭菌,制得规格为10mg/瓶的罗莫肽-β-环糊精包合物口服液,制备400瓶即可。
口服液中罗莫肽药物含量为10mg/瓶。
3、片剂的制备
片剂组成由下列要素组成(罗莫肽与羟丙基-β-环糊精摩尔比按1∶4计算,载药量为13.4%)
罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物 |
38.0g |
乳糖 |
35.0g |
微晶纤维素 |
70.0g |
羧甲基淀粉钠 |
7.0g |
硬脂酸镁 |
1.0g |
50%乙醇 |
适量 |
取罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物与淀粉按等量递加法混合均匀,过筛混合均匀,再与糊精混合均匀,加入50%乙醇适量制成软材,通过16目筛制粒,在55℃下干燥,干粒再过16目筛整粒,加入硬脂酸镁,混匀后压片,制备1000片即可。
片剂中罗莫肽药物含量为5mg/片。
实施例4注射剂的制备
1、冻干粉针的制备
冻干粉剂组成由下列要素组成(罗莫肽与羟丙基-β-环糊精摩尔比按1∶4计算,载药量为13.4%)
羟丙基-β-环糊精包合物 |
748.0mg |
D-甘露醇 |
45g |
0.1N盐酸 |
适量 |
加注射用水至 |
1000ml |
在无菌操作室内称取罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物748.0g,置于适当无菌容器中,加入45g D-甘露醇,加入无菌注射用水至约950ml,搅拌使包合物和D-甘露醇溶解,用0.1N盐酸调pH至7.8,加活性炭0.1%(g/v)搅拌15分钟,粗滤脱炭,补加灭菌注射用水至足量,搅拌5~10min,用无菌抽滤漏斗铺两层灭菌滤纸过滤,再用经灭菌的G6垂溶漏斗精滤,滤液检查合格后,分装于500瓶5ml西林瓶中,低温冷冻干燥约26小时后即得。
每安瓿注射冻干粉中罗莫肽药物含量为0.2mg/瓶。
2、大容量注射液的制备
大容量注射液组成由下列要素组成(罗莫肽与羟丙基-β-环糊精摩尔比按1∶4计算,载药量为13.4%)
羟丙基-β-环糊精包合物 |
150.0mg |
氯化钠 |
9.0g |
构橼酸 |
适量 |
加注射用水至 |
5000ml |
取注射用水适量,加入氯化钠,搅拌溶解,再加入罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物使之溶解,加枸橼酸调pH至6.5,加活性炭0.1%(g/v)搅拌15分钟,粗滤脱炭,补加注射用水至足量,过滤分装成100瓶,用流通蒸汽115℃30分钟灭菌。
每瓶注射液中含罗莫肽药0.2mg。
3、注射液的制备
注射液组成由下列要素组成(罗莫肽与羟丙基-β-环糊精摩尔比按1∶2计算,载药量为23.6%)
羟丙基-β-环糊精包合物 |
425.0mg |
枸橼酸 |
适量 |
加注射用水至 |
1000ml |
取注射用水约800ml,加入氯化钠,搅拌溶解,再加入羟丙基-β-环糊精包合物使之溶解,加枸橼酸调pH至6.5,加活性炭0.1%(g/v)搅拌15分钟,粗滤脱炭,补加注射用水至足量,过滤分装成500瓶,用流通蒸汽115℃30分钟灭菌。
每瓶注射液中含罗莫肽药0.2mg。
实施例5喷鼻剂的制备
1、喷鼻剂的制备
喷鼻剂组成由下列要素组成(罗莫肽与羟丙基-β-环糊精摩尔比按1∶4计算,载药量为13.4%)
罗莫肽-羟丙基-β-环糊精包合物 |
4.7g |
苯扎氯铵 |
0.5g |
1N HCl |
适量 |
纯化水 |
1000.0ml |
将上述组分溶于纯化水中,将所配药液用0.22μm除菌过滤器过滤,然后分装入100瓶喷鼻装置中,该泵每喷为70-90μl。每1-2喷/鼻孔,约40-60μg/鼻孔剂量。