CN101548989A - 四角蛤蜊提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种四角蛤蜊提取物，由以下方法制得：取四角蛤蜊软体部位为原材料，洗净、绞碎，加水煎煮，滤过，得水煎煮提取液，将水煎煮提取液离心，收集上清液，浓缩，冷却后加乙醇沉淀，滤过，得乙醇沉淀物，干燥，得四角蛤蜊提取物；对该提取物进行脱蛋白，可得纯化后的四角蛤蜊提取物，该四角蛤蜊提取物具有降血糖、免疫调节和保护肝脏的功能，本发明同时公开该四角蛤蜊提取物在制备药物或保健品中的应用。
Description
一、技术领域
本发明属于天然药物领域，具体涉及一种四角蛤蜊提取物，及其制备方法和在制药上的应用。
二、背景技术
四角蛤蜊(Mactra quadrangularis)，又叫方形马珂蛤、白蛤或四角蛤，俗称白蚬子、泥蚬子、布鸽头，是一种常见的海生软体动物，广泛分布于我国南北沿海海域。属于软体动物门，瓣鳃纲，真瓣鳃目，蛤蜊科。贝壳略呈四角形，两壳相等，侧膨胀，壳面光滑呈白色。斧足发达，无足丝，生活于浅海泥沙中。江苏沿海多滩涂，四角蛤蜊为优势贝类，已实现了大规模人工养殖，产量高达每年80000吨。四角蛤蜊是一种重要的食用经济贝类，其软体肉嫩鲜美，营养丰富，内含蛋白质，脂肪，碳水化合物，钙、铁、磷及多种维生素。四角蛤蜊不仅可以食用，还具有药用、保健价值。传统中医理论认为蛤蜊味咸、性寒、无毒，归胃、肝、膀胱经，有多种的主治功能。关于四角蛤蜊的研究主要集中于食品加工、增养殖、种属界定等方面。国内外针对四角蛤蜊的开发应用多见以软体为原料加工罐头、调味品、饲料添加剂等，而以药效功能为目标的四角蛤蜊的医药、保健品研究开发较少。四角蛤蜊活性物质研究多集中在小分子化学成分(如牛磺酸和EPA)，对其生物活性大分子提取物，诸如蛋白质和多糖的研究报道较少。目前市场上未见关于四角蛤蜊提取物的药物和保健品。
三、发明内容
技术问题：
本发明公开了一种四角蛤蜊提取物，同时公开了该提取物的制备方法、以及该提取物在制备降血糖、调节免疫和保护肝脏药物或保健食品中的应用。
技术方案：
一种四角蛤蜊提取物，由以下方法制得：取四角蛤蜊软体部位为原材料，洗净、绞碎，加水煎煮，滤过，得水煎煮提取液，将水煎煮提取液离心，收集上清液，浓缩，浓缩液冷却后加乙醇沉淀，滤过，得乙醇沉淀物，干燥，得四角蛤蜊提取物。
上述的四角蛤蜊提取物的制备方法，可进一步包括纯化步骤：取所述乙醇沉淀物溶于水中，脱蛋白，收集脱蛋白的水溶液部位，加乙醇沉淀，干燥，得脱蛋白的四角蛤蜊提取物。
上述的四角蛤蜊提取物的制备方法，加水煎煮步骤循环进行1-3次，每次加水与四角蛤蜊软体原材料的质量比为2∶1-5∶1，每次提取时间为30-120分钟。
上述四角蛤蜊提取物的制备方法，加乙醇沉淀步骤为：在搅拌情况下加入乙醇，至乙醇在沉淀体系中的质量百分含量为60-90％。
上述的四角蛤蜊提取物的制备方法，脱蛋白步骤使用蛋白酶法，或离子交换柱层析法。
如上所述的四角蛤蜊提取物在制备降血糖药物或保健品中的应用。
如上所述的四角蛤蜊提取物在制备调节免疫药物或保健品中的应用。
如上所述的四角蛤蜊提取物在制备护肝药物或保健品中的应用。
上述的四角蛤蜊提取物的应用，所述药物和保健品中添加制剂学和食品学中上允许添加的其他辅料和添加剂，制成常规的制剂形式。
有益效果：
本发明公开了一种四角蛤蜊提取物，该提取物由以下方法制备：取四角蛤蜊软体部位为原材料，洗净、绞碎，加水煎煮，滤过，得水煎煮提取液，将水煎煮提取液离心，收集上清液，浓缩，浓缩液冷却，加乙醇沉淀，滤过，得乙醇沉淀物，干燥，得四角蛤蜊提取物。该方法以中药理论指导的提取分离为技术手段，得到了具有功能活性的四角蛤蜊提取物，该提取物主要是四角蛤蜊多糖。
上述制备方法还进一步包括纯化步骤：取所述乙醇沉淀物溶于水中，脱蛋白，收集脱蛋白的水溶液部位，加乙醇沉淀，干燥，得脱蛋白的四角蛤蜊提取物。通过纯化步骤，能够明显的提高提取物中有效物质——四角蛤蜊多糖的含量。
作为本发明的一个优选：上述加水煎煮步骤循环进行1-3次，每次加水与四角蛤蜊软体原材料的质量比2∶1-5∶1，每次提取时间为30-120分钟。该优选操作步骤的实施，在保证四角蛤蜊多糖提取得率较高的同时，既简化了操作，又降低了能耗，节约了成本。
作为本发明的另一个优选，上述加乙醇沉淀步骤的方法为在搅拌情况下加入乙醇，至乙醇在沉淀体系中的质量百分含量为60-90％。该优选操作能明显的提高四角蛤蜊提取物的得率。
作为本发明的还一个优选，上述脱蛋白步骤使用蛋白酶法、离子交换柱层析法。该优选操作方法不对四角蛤蜊提取物引入其它对人体有毒的成分，生产操作简单，环保卫生。
上述方法制得的该四角蛤蜊提取物主要由多糖和蛋白质组成，其中多糖总含量为70-100％，蛋白质和其他成分低于30％。
本发明还涉及上述四角蛤蜊提取物在制备药物或保健品中的应用，具体来说公开了该种四角蛤蜊提取物具有降血糖、调节免疫力和保护肝脏的活性。本发明通过药效学实验对上述四角蛤蜊提取物的降血糖、调节免疫和保护肝脏活性进行了验证，结果证实：该种四角蛤蜊提取物能够改善正常小鼠和糖尿病小鼠的口服糖耐量(OGTT)，降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平而对正常小鼠的空腹血糖水平无影响，明显改善化学性糖尿病小鼠的肝肾肿胀而对正常小鼠脏器指数无影响，明显抑制正常小鼠糖异生引起的血糖升高；四角蛤蜊粗提取物能够显著增强正常小鼠单核巨噬细胞吞噬功能，能够提高免疫力低下小鼠的血清溶血素水平，显著降低二硝基氯苯引起的低疫力小鼠的耳肿胀率；四角蛤蜊提取物明显降低四氯化碳所致肝损伤引起的ALT和ALT水平升高，表现出较强的护肝活性。
四、具体实施方式
以下实施例为本发明的一些举例，不应视为是对本发明的限定。
一、四角蛤蜊提取物的制备
2007年7月至2008年6月期间，每月在江苏启东吕四港镇水产养殖场采收三贝龄的四角蛤蜊，通过测量所采收的四角蛤蜊的选出肉率、蛋白质和多糖含量，得出6和7月份采收的四角蛤蜊品质最优。据此确定以6-7月份江苏沿海采收的三贝龄四角蛤蜊为产品原料，制备降血糖四角蛤蜊提取物。以下为具体的实施方式。
实施例1：
取新采收的活体四角蛤蜊，除去外壳，得软体部位原材料5kg，洗净泥砂，沥干后绞碎。沸水煎煮重复提取3次，每次加水10kg，每次煎煮提取30分钟，用200目滤布滤过，收集滤液。煎煮液于离心机在4000rmp转速下离心，得上清液，浓缩至约5L，冷却后中加入质量浓度95％的乙醇，使体系乙醇含量达到50％，搅匀，-10℃下静置12小时进行沉淀，抽滤，得白色絮状沉淀物。沉淀物用于60℃真空箱中干燥64小时，得浅棕色四角蛤蜊提取物。
实施例2：
取新采收的活体四角蛤蜊，除去外壳，得软体部位原材料5kg，洗净泥砂，沥干后绞碎。沸水煎煮重复提取2次，每次加水15kg，每次煎煮提取60分钟，用200目滤布滤过，收集滤液。煎煮液于离心机在4000rmp转速下离心，得上清液，浓缩至约5L，浓缩液冷却加入质量浓度95％的乙醇，使体系乙醇含量达到90％，搅匀，-10℃下静置12小时进行沉淀，抽滤，得白色絮状沉淀物。沉淀物用于80℃烘箱中干燥48小时，得棕黄色四角蛤蜊提取物。
实施例3：
取新采收的活体四角蛤蜊，除去外壳，得软体部位原材料5kg，洗净泥砂，沥干后绞碎。沸水煎煮循环提取2次，第一次加水15kg，第二次加水10kg，每次煎煮60分钟，用200目滤布滤过，收集滤液。滤液于离心机在4000rmp转速下离心，得上清液，浓缩至约5L，浓缩液冷去后加入质量浓度为95％的乙醇，使体系乙醇含量达到80％，搅匀，-10℃下静置6小时进行沉淀，抽滤，得白色絮状沉淀物。沉淀物转入冷冻干燥机中，-25℃冻干48h，得乳白色块状四角蛤蜊提取物。
实施例4：
取新采收的活体四角蛤蜊，除去外壳，得软体部位原材料5kg，洗净泥砂，沥干后绞碎。沸水煎煮提取1次，加水25kg，煎煮120分钟，用200目滤布滤过，收集滤液，于离心机在4000rmp转速下离心，得上清液。提取液浓缩至约5L，冷却后加入质量浓度为95％的乙醇，使体系乙醇含量达到90％，搅匀，-10℃下静置24小时进行沉淀，抽滤，得白色絮状沉淀物。将该沉淀物于少量纯净水中，配成浓度适当的提取物溶液，进行喷雾干燥，得浅白色粉末状四角蛤蜊提取物。
实施例5：
取新采收的活体四角蛤蜊若干，除去外壳，得软体部位原材料50kg，洗净泥砂，沥干后绞碎，加水150kg，沸水煎煮60分钟，120目滤布过滤，收集滤液，滤渣再加100kg水煎煮60分钟，120目滤布过滤得滤液，合并2次提取滤液。将滤液浓缩至50L，于管式离心机在14000rmp转速下离心，得上清液。离心液中加入质量浓度为95％的乙醇，使醇含量达到80％，搅匀，常温下静置24h，抽滤，得白色沉淀物。将该沉淀用少许质量浓度为95％的乙醇再次洗涤，于60℃真空箱中干燥60小时，得浅棕色四角蛤蜊提取物。
实施例6
酶法脱蛋白
取实施例5所制备的四角蛤蜊提取物，溶于水，配成一定浓度的溶液。量取所配制的溶液1000ml，调pH值至6.5，60℃下放置1h后，用1％(V/V)的木瓜蛋白酶55℃恒温5h后，离心(4000rmp，5min)，得到脱蛋白液。脱蛋白溶液加入95％乙醇，至乙醇含量达80％，-10℃下静置24小时进行沉淀，醇沉液抽滤，得白色絮状沉淀物，冷冻干燥得白色块状四角蛤蜊提取物。
实施例7：
阳离子交换柱层析法脱蛋白
称取阳离子交换树脂(732型，中国医药集团上海化学试剂公司)，浸泡于水中，漂去异物，反复冲洗数次，待浸泡充分后装柱，以4-5倍体积1M的HCl水溶液流洗，蒸馏水冲洗至中性，然后以4-5倍体积1M的NaOH水溶液流洗，蒸馏水冲洗至中性，后再以4-5倍体积的1M的HCl水溶液流洗，蒸馏水冲洗至中性。称取一定量实施例5所制得的四角蛤蜊提取物，用蒸馏水溶解，缓缓沿树脂柱壁均匀上样。用蒸馏水洗脱样品，收集洗脱液，直至洗脱液未检出多糖时为止。洗脱液在70℃下减压浓缩，用0.5M的NaOH调洗脱液的pH至7.0。浓缩液中加入95％乙醇至醇的质量百分含量达80％，-10℃条件下醇沉12h。过滤醇沉液，收集沉淀，冷冻干燥后即得除蛋白的四角蛤蜊提取物。
实施例8：
四角蛤蜊提取物的表征
取上述各实施例制备的四角蛤蜊提取物进行样品表征分析：四角蛤蜊提取物易溶于水，室温溶解度可高达20％，α-萘酚反应检验呈阳性，费林试剂反应呈阳性，水溶液加热沉淀反应呈阳性，茚三酮反应呈阳性，说明提取物中主要由多糖和蛋白质组成。蒽酮硫酸法测量提取物中总糖含量为70-100％，蛋白质和其他成分含量低于30％，其中经阳离子交换柱层析得到的脱蛋白四角蛤蜊提取物中多糖含量高于99.7％。元素分析结果显示提取物中含C元素35-42％，H元素5.5-7.2％，N元素2.0-4.0％；另外，等离子体原子发射光谱分析显示样品中还含有S、P、K、Na、Mg、Ca、Fe、Mn、Zn、Cu等元素微量。红外光谱(KBr)显示四角蛤蜊提取物在3400cm-1、2930cm-1、1650cm-1、1420cm-1、1153cm-1、1080cm-1、847cm-1、760cm-1、583cm-1左右处有明显的吸收。硫酸咔唑法、硫酸钡比浊法和乙酰丙酮比色法显示四角蛤蜊提取物中含有一定量的糖醛酸、磺酸基团和氨基糖。
二、四角蛤蜊提取物的降血糖药效学实验
降血糖药效学实验选用正常和化学性糖尿病小鼠模型，口服灌胃，从定时检测小鼠血糖入手，在整体水平上评价了四角蛤蜊提取物的降血糖药效活性。同时，为了说明四角蛤蜊提取物的降血糖物质基础是其中的多糖成分，对经阳离子柱层析得到的脱蛋白四角蛤蜊提取物进行了降血糖活性的验证。
实施例9：
1.四角蛤蜊提取物的降血糖活性实验
实验材料：取实施例5所制得的四角蛤蜊提取物；美国癌研所选育种(ICR)小鼠，体重20-22g，全雄，由南京中医药大学动物房提供；四氧嘧啶(Sigma公司产品，上海贝基生物科技有限公司进口分装，批号：A7413)；盐酸二甲双胍片(深圳市中联制药有限公司，批号：0708212)；盐酸肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司，批号：080106)；L-α-丙氨酸(上海惠兴生化试剂有限公司，批号：20080418)；格列齐特片(北京京丰制药有限公司，批号：080101)；GT1810型血糖仪附加血糖试纸条，日本ARKRAY公司。
实验数据用均数加减标准差(X±S)表示，统计学处理采用SPSS11.5统计软件做单因素方差分析。
1.1.四角蛤蜊提取物对正常小鼠口服糖耐量(OGTT)的影响
实验方法：取正常小鼠30只，禁食12h(可自由饮水)后，取尾静脉血测定空腹血糖值(FBG)，按血糖水平分为5组，每组6只。分别为：空白对照组，二甲双胍组(175mg/kg)；四角蛤蜊提取物低剂量组(200mg/kg)，四角蛤蜊提取物中剂量组(400mg/kg)，四角蛤蜊提取物高剂量组(600mg/kg)。再按上述剂量灌胃给药，空白组给予等体积的蒸馏水。1h后，各组以2g/kg葡萄糖溶液灌胃，分别于0、30、60、120min后尾静脉取血，用血糖仪测定血糖值，绘制血糖曲线并计算曲线下面积(AUC)。
实验结果见下表：
表1四角蛤蜊提取物对正常小鼠口服葡萄糖耐量的影响
注：实验组同空白组比较，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
实验结果：显示四角蛤蜊提取物的中、高剂量组在给予葡萄糖后30min时，能明显地抑制葡萄糖引起的血糖升高，低剂量组也呈现一定抑制趋势。在给予葡萄糖后120min时，高剂量组仍对血糖的升高有显著抑制作用，与空白组比较有显著性差异。从各组OGTT试验曲线下面积(AUC)可以看出，四角蛤蜊提取物高剂量能明显减少血糖升高的曲线下面积，与空白组比较有显著性差异。
1.2.四角蛤蜊提取物对糖尿病小鼠口服糖耐量(OGTT)的影响
实验方法：正常小鼠禁食12h(不禁水)后，由尾静脉快速注射新鲜配制的四氧嘧啶生理盐水溶液(剂量为60mg/kg)，72h后(禁食4h)尾静脉取血测定小鼠空腹血糖值，血糖值≥11.1mmol/L并出现多饮、多尿症状的小鼠被选为糖尿病模型小鼠。取成功糖尿病模型小鼠30只，禁食12h(不禁水)后，取尾静脉血测定空腹血糖值(FBG)，按血糖和体重水平分为5组，每组6只，分别为：空白对照组；二甲双胍组(175mg/kg)；四角蛤蜊提取物低剂量组(200mg/kg)；提取物中剂量组(400mg/kg)；提取物高剂量组(600mg/kg)。再按上述剂量灌胃给药，空白组给予等体积的蒸馏水。1h后，各组以2g/kg葡萄糖溶液灌胃，分别于0、30、60、120、180min后取尾静脉血测定血糖值，绘制血糖曲线并计算曲线下面积(AUC)。
实验结果见下表：
表2四角蛤蜊提取物对糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量的影响
注：实验组同空白组比较，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
实验结果：在给予葡萄糖后60min时，四角蛤蜊提取物的低、中、高剂量组对血糖的升高显示出一定的抑制作用，在给予葡萄糖后120min时，四角蛤蜊提取物的中、高剂量组能明显地抑制葡萄糖引起的血糖升高(与空白组比较，p＜0.05)，低剂量组也呈现一定抑制趋势，在给予葡萄糖后180min时，四角蛤蜊提取物各实验组动物的血糖仍低于模型组。从各组OGTT试验曲线下面积(AUC)可以看出，四角蛤蜊提取物能减小葡萄糖引起的血糖升高的曲线下面积，并呈现出一定的剂量依赖性关系。
1.3.四角蛤蜊提取物对正常小鼠的空腹血糖及脏器指数的影响
实验方法：取正常小鼠50只，禁食12h后取尾静脉血测定空腹血糖值(FBG)，按空腹血糖和体重水平随机分为5组。每组10只，分别为：空白对照组；格列齐特组(100mg/kg)；四角蛤蜊提取物低剂量组(200mg/kg)；提取物中剂量组(400mg/kg)；提取物高剂量组(600mg/kg)，各组药物临用前用蒸馏水配至所需浓度，按0.2mL/10g灌胃，空白组给予等体积的蒸馏水。每天给药1次，连续10天。末次给药后禁食12h尾静脉取血测定空腹血糖值。最后处死动物，取胸腺、肝、脾、肾称重，计算脏器指数。
实验结果见下表：
表3四角蛤蜊提取物对正常小鼠空腹血糖的影响
注：**表示同初始空腹血糖值相比p＜0.01。
表4四角蛤蜊提取物对正常小鼠脏器指数的影响
注：实验组同空白组比较，*表示p＜0.05。
实验结果：给药10d后，格列齐特(100mg/kg)能显著降低正常小鼠的空腹血糖水平(与空白对照组比较，P＜0.01)，使正常小鼠的脾指数降低(与空白对照组比较，P＜0.05)；四角蛤蜊粗提取物三个剂量组对正常小鼠的空腹血糖水平和脏器系数均无明显影响。说明四角蛤蜊提取物药效活性比较缓和，对人更加安全，这与化学降血糖药品有很大的区别，说明四角蛤蜊提取物适合作为保健药品，符合药食同源的观念。
1.4.四角蛤蜊提取物对糖尿病小鼠的空腹血糖及脏器指数的影响
实验方法：取正常小鼠80只，随机取10只作为空白对照组，其余禁食12h(不禁水)，由尾静脉快速注射新鲜配制的四氧嘧啶生理盐水溶液(剂量为60mg/kg)，造成糖尿病动物模型。正常对照组注射等量的生理盐水。72h后(禁食4h)尾静脉取血测定小鼠空腹血糖值，血糖值≥11.1mmol/L并出现多饮、多尿症状的小鼠被选为糖尿病模型小鼠。造模成功的小鼠取50只按血糖水平随机分为5组(各组小鼠血糖均值相差不大于0.55mmol/L)，分别为：模型对照组，二甲双胍组(250mg/kg)，四角蛤蜊提取物低剂量组(200mg/kg)，提取物中剂量组(400mg/kg)，提取物高剂量组(600mg/kg)。各组药物临用前用蒸馏水配制成所需浓度，每天1次，共30天。给药10天、20天和30天后测定小鼠空腹血糖值(禁食4h)；给药30天后处死各组小鼠，取肝、肾、脾、胸腺称重，计算脏器指数。
实验结果见下表：
表5四角蛤蜊提取物对糖尿病小鼠空腹血糖的影响
注：*表示同初始空腹血糖值相比p＜0.05，**表示p＜0.01。
表6四角蛤蜊提取物对糖尿病小鼠脏器指数的影响
注：△表示同空白对照组相比p＜0.05，△△表示p＜0.01；*表示同模型对照组相比p＜0.01。
实验结果：给药10d后，四角蛤蜊提取物的高剂量组，能显著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的空腹血糖值，给药20d后，四角蛤蜊提取物的中、高剂量组均显示出明显的降血糖作用，给药30d后，四角蛤蜊提取物的中、高剂量组仍显示出明显降血糖作用，这说明四角蛤蜊提取物的降血糖活性比较缓和，需长期的坚持服用。化学物质四氧嘧啶能引起小鼠肝、肾脏和胸腺显著性肿大，通常情况下，重型糖尿病患者也伴有肝、肾肿大等并发症，患者免疫力低下。四角蛤蜊提取物的低、中、高剂量组能显著抑制四氧嘧啶糖尿病小鼠的肝肿大，同时，四角蛤蜊提取物的低、中、高剂量组均能适度减轻四氧嘧啶糖尿病小鼠的肾水肿，使肾指数略低于模型组，但是对脾脏和胸腺几乎没有影响。说明四角蛤蜊提取物在作为调节血糖药物或保健品的长期服用的过程中，具有标本兼治的功效。
1.5.四角蛤蜊提取物对正常小鼠糖异生的影响
实验方法：取正常小鼠30只禁食12h(不禁水)后，取尾静脉血测定空腹血糖值(记为0min)，按血糖水平分为5组，每组6只，分别为空白对照组，二甲双胍组(175mg/kg)，四角蛤蜊提取物低剂量组(200mg/kg)，提取物中剂量组(400mg/kg)，提取物高剂量组(600mg/kg)。再按上述剂量灌胃给药，空白组给予等体积的蒸馏水。30min后各组腹腔注射L-α-丙氨酸2g/kg，给药60min后用血糖仪取尾静脉血测定血糖水平，计算糖异生效率。
实验结果见下表：
表7四角蛤蜊提取物对正常小鼠糖异生的影响
注：实验组同空白组比较，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。
实验结果：表7显示蛤蜊粗多糖中、高剂量组在腹腔注射L-α-丙氨酸后60min时均能明显地抑制正常小鼠糖异生引起的血糖升高，低剂量组也显示抑制趋势。
实施例10：
2.脱蛋白四角蛤蜊提取物的降血糖药效学实验
实验材料：取实施7制得的脱蛋白四角蛤蜊提取物；美国癌研所选育种(ICR)小鼠，体重20-22g，全雄，由本校动物房提供；其他实验材料与上述降血糖药效学实验相同。
实验统计方法与上述实验相同
2.1.脱蛋白四角蛤蜊提取物对正常小鼠口服糖耐量的影响
实验方法：取正常小鼠30只，全雄，体重24-26g，禁食12h(自由饮水)后，取尾静脉血测定空腹血糖值(FBG)，按血糖水平分为5组，每组6只，分别为：空白对照组；二甲双胍组(175mg/kg)；脱蛋白四角蛤蜊提取物低剂量组(150mg/kg)；脱蛋白四角蛤蜊提取物中剂量组(300mg/kg)；脱蛋白四角蛤蜊提取物高剂量组(450mg/kg)。再按上述剂量灌胃给药，空白组给予溶剂。1h后，各组以2g/kg葡萄糖溶液灌胃，分别于0、30、60、90、120min后取尾静脉血用血糖仪测定血糖值，绘制血糖曲线并计算曲线下面积(AUC)。
实验结果见下表：
表8.脱蛋白四角蛤蜊提取物对正常小鼠口服糖耐量的影响
注：实验组同空白组比较、，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
实验结果：表8显示四角蛤蜊提取物的低、中剂量组在给予葡萄糖后30min时，能明显地抑制葡萄糖引起的血糖升高，而高剂量组对降血糖无明显活性。从各组OGTT试验曲线下面积(AUC)可以看出，脱蛋白四角蛤蜊提取物中剂量能明显减少血糖升高的曲线下面积。
2.2.脱蛋白四角蛤蜊提取物对糖尿病小鼠口服糖耐量的影响
实验方法：取成功糖尿病模型小鼠30只，禁食12h(不禁水)后，取尾静脉血测定空腹血糖值(FBG)，按血糖和体重水平分为5组，每组6只，分别为：模型组；二甲双胍组(175mg/kg)；脱蛋白四角蛤蜊提取物低剂量组(150mg/kg)；脱蛋白四角蛤蜊提取物中剂量组(300mg/kg)；脱蛋白四角蛤蜊提取物高剂量组(450mg/kg)。再按上述剂量灌胃给药，模型组给予溶剂。1h后，各组以2g/kg葡萄糖溶液灌胃，分别于0、30、60、90、120、180min后取尾静脉血用血糖仪测定血糖值，绘制血糖曲线并计算曲线下面积(AUC)。
实验结果见下表：
表9.脱蛋白四角蛤蜊提取物对糖尿病小鼠口服糖耐量的影响
注：实验组同空白组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
实验结果：表9显示在给予葡萄糖后60min时，脱蛋白四角蛤蜊提取物低、中、高剂量组对血糖的升高显示出一定的抑制作用；在给予葡萄糖后120min时，提取物的中、高剂量组能明显地抑制葡萄糖引起的血糖升高，中剂量组抑制效果略优于高剂量组，低剂量组也呈现一定抑制作用；在给予葡萄糖后180min时，脱蛋白提取物低、中、高剂量组的血糖值仍低于模型组。从各组OGTT试验曲线下面积(AUC)可以看出，脱蛋白四角蛤蜊提取物低、中、高剂量组能减小葡萄糖引起的血糖升高的曲线下面积，中剂量效果略优于低、高剂量。
2.3.脱蛋白四角蛤蜊提取物对糖尿病小鼠空腹血糖及脏器指数的影响
实验方法：取正常小鼠80只，随机取10只作为空白对照组，其余禁食12h(不禁水)，由尾静脉快速注射新鲜配制的四氧嘧啶生理盐水溶液(剂量为60mg/kg)，造成糖尿病动物模型。正常对照组注射等量的生理盐水。72h后(禁食4h)尾静脉取血测定小鼠空腹血糖值，血糖值≥11.1mmol/L并出现多饮、多尿症状的小鼠被选为糖尿病模型小鼠。造模成功的小鼠取50只按血糖水平随机分为5组(各组小鼠血糖均值相差不大于0.55mmol/L)，分别为：模型对照组，二甲双胍组(250mg/kg)，脱蛋白四角蛤蜊提取物低剂量组(150mg/kg)、中剂量组(300mg/kg)、高剂量组(450mg/kg)。各组药物临用前用蒸馏水配制成所需浓度，每天1次，共30天。给药10天、20天和30天后测定小鼠空腹血糖值(禁食4h)；给药30天后处死各组小鼠，取肝、肾、脾、胸腺称重，计算脏器指数。
实验结果见下表：
表10脱蛋白四角蛤蜊提取物对糖尿病小鼠空腹血糖的影响
注：*表示同初始空腹血糖值相比p＜0.05，**表示p＜0.01。
表11脱蛋白四角蛤蜊提取物对糖尿病小鼠脏器指数的影响
注：△△表示同空白对照组相比p＜0.01；*表示同模型对照组相比p＜0.05，**表示p＜0.01。
实验结果：表10显示在给药10d时，脱蛋白四角蛤蜊提取物的高剂量组，能显著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的空腹血糖值；在给药20d时，高剂量显示出明显的降血糖作用；在给药30d时，脱蛋白四角蛤蜊提取物中、高剂量组均显示出明显降血糖。这和四角蛤蜊提取物的降血糖效果相似，说明多糖成分就是提取物的降血糖活性的物质基础。表11说明了脱蛋白提取物同样能减轻四氧嘧啶糖尿病小鼠的肝肿大，适度减轻肾水肿。
三、四角蛤蜊提取物的免疫调节活性药效实验
免疫调节药效学实验选用碳粒廓清实验、鸡红细胞吞噬实验、和迟发性变态反应实验，对正常和免疫缺陷的模型小鼠口服灌胃，评价四角蛤蜊提取物的免疫调节药效活性。
实施例11：
3.四角蛤蜊提取物的免疫调节活性药效实验
实验材料：取实施例5所制得的四角蛤蜊提取物；美国癌研所选育种(ICR)小鼠，体重20-22g，全雄，由本校动物房提供；市售公鸡，适应性饲养，取血保藏备用；环磷酰胺(Sigma公司，批号：A7413)；印度墨汁(青岛海博生物技术有限公司，批号：921044)；香菇多糖(深圳市中联制药有限公司，批号：0708212)；左旋咪唑(西南制药一厂，批号：000806019)；二硝基氟苯(DNCP，中国医药集团，批号：070412)。
数据统计同实验例1。
3.1.碳粒廓清实验
实验方法：取正常小鼠40只，随机分为4组，每组10只；设空白对照组(生理盐水)，阳性对照组(香菇多糖)，提取物高剂量组和低剂量组(四角蛤蜊提取物)；连续给药15天，每只小鼠沿尾静脉按0.05ml每10g体重注射印度墨汁，分别于3和10min眼眶取血20μl，加入到2ml的Na2CO3溶液(0.1％w/v)中，680nm下分光光度计测光密度，计算廓清指数。
实验结果如下表：
表12四角蛤蜊提取物对正常小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响
注：*表示同空白组相比p＜0.05，**表示p＜0.01。
实验结果：见表12，结果表明，四角蛤蜊提取物高低剂量组均能够显著增强正常小鼠单核巨噬细胞吞噬功能，其中高剂量与空白组比较具有极显著统计学差异。
3.2.鸡红细胞吞噬实验
实验方法：取正常小鼠60只，随机分为6组，每组10只，设为空白组对照组(生理盐水)，免疫力低下模型对照组(环磷酰胺)，阳性药组(香菇多糖)，四角蛤蜊提取物低、中、高剂量组。除空白对照外，其余各组于第1、2、3天腹腔注射环磷酰胺(按200mg每公斤体重注射)，造成免疫力低下小鼠模型。同时，上述各实验组按设定剂量口服灌胃给药，连续给药10次，每次间隔24h。于第1次口服给药后的30min，按0.2mL/只剂量腹腔注射5％的鸡红细胞生理盐水混悬液进行小鼠免疫；于第10次给药后的30min，对小鼠进行眼眶取血。所取血样离心，分离血清，生理盐水稀释至100倍，取稀释样品1ml，加入0.5ml的5％鸡红细胞混悬液和0.5ml的10％补体，混匀，37℃下孵育30min，放入冰浴中终止反应，分光光度法测量540nm处的吸光度值。
实验结果见下表：
表13四角蛤蜊提取物对免疫力低下小鼠的血清溶血素生成的影响
注：△△表示同空白对照组相比p＜0.01；*表示同模型对照组相比p＜0.05，**表示p＜0.01。
实验结果：鸡红细胞吞噬实验结果见表13，腹腔注射环磷酰胺导致小鼠免疫力低下，血清溶血素水平明显降低，表明免疫力低下小鼠造模成功；口服灌胃蛤蜊粗提取物能够提高免疫力低下小鼠的血清溶血素水平，高剂量组与模型对照组比较有极显著的差异。
3.3.迟发性变态反应实验：
实验方法：取ICR小鼠60只，随机分为6组，每组10只，设为空白对照组(生理盐水)，模型对照组(环磷酰胺)，阳性药组(左旋咪唑)，四角蛤蜊提取物低、中、高剂量组。除空白对照外，其余各组于第1、2、3天腹腔注射环磷酰胺(按200mg每公斤体重注射)，造成免疫力低下小鼠模型。同时，上述各实验组按设定剂量口服灌胃给药，连续给药7次，每次间隔24h。在口服灌胃给药第7天，除空白对照组外，其余各组小鼠腹部剔除毛发，范围约3×3cm2，并将20μl的2％DNCB丙酮-麻油(丙酮∶麻油＝1∶1)溶液均匀涂抹于裸露皮肤上进行致敏反应。致敏后第5d，再将30μl的DNCP溶液均匀涂抹于小鼠右耳(背侧耳廓)进行致敏攻击。攻击后24h，颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径8mm的耳片，称重，以(右耳重-左耳重)/左耳重为肿胀率。
实验结果如下表所示：
表14四角蛤蜊提取物对免疫力低下小鼠迟发性变态反应的影响
注：△△表示同空白对照组相比p＜0.01；*表示同模型对照组相比p＜0.05，**表示p＜0.01。
实验结果：迟发性变态反应试验结果见表14。结果表明，四角蛤蜊提取物各剂量组与模型对照组比较均能显著降低二硝基氯苯引起的低疫力小鼠的耳肿胀率，其中，高剂量组效果极显著。
四、四角蛤蜊提取物的护肝活性药效学实验
护肝活性实验选用四氯化碳肝损伤小鼠模型，评价口服四角蛤蜊提取物的护肝效果。
实施例12：
4.四角蛤蜊提取物的护肝活性药效学实验
实验材料：实施例5所制的四角蛤蜊提取物；美国癌研所选育种(ICR)小鼠，体重20-22g，全雄，由本校动物房提供；四氯化碳(广东光华化工厂，批号：200804015)；联苯双脂滴丸(浙江医药股份有限公司，批号200807012)；谷草转氨酶(ASL)、谷丙转氨酶(AST)测定试剂盒(南京大光明公司)。
数据统计同实验例1。
实验方法：ICR小鼠正常饲养2天，随即分成8组，为空白对照组(生理盐水)，模型对照组(四氯化碳)，阳性药组(联苯双酯)，四角蛤蜊提取物低、中、高剂量组。每组动物取10只，按指定剂量口服灌胃连续给药6次，每次间隔24h(模型对照组给予生理盐水)。末次给药1h后，空白对照组按10mL每公斤体重的剂量腹腔注射花生油，其余7组均按10mL·kg-1腹腔注射0.1％CCL4花生油溶液，制成四氯化碳肝损伤模型。禁食，不禁水，24h后，再次按剂量给药，1h后小鼠眼眶取血，3000rpm离心10min，取血清，测ALT，AST。
结果如下表：
表15四角蛤蜊提取物对CCL4肝损伤模型小鼠血清中ALT、AST的影响
注：△表示同空白对照组相比p＜0.05；*表示同模型对照组相比p＜0.05。
实验结果：四角蛤蜊提取物对由四氯化碳造成的化学肝损伤小鼠的护肝活性效果见表15。结果显示，对正常小鼠腹腔注射四氯化碳后，小鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平明显提升，这是肝功能异常的表现，说明四氯化碳肝损伤模型成功。给予小鼠口腔灌服四角蛤蜊各提取部位后，小鼠ALT，AST水平变化出现差异，四角蛤蜊提取物三个给药水平的ALT和ALT水平均下降明显，说明提取物具有护肝活性，且活性比较强烈。
六、四角蛤蜊提取物的保健品或药品配方
实施例13：
保健品片剂：
四角蛤蜊提取物180g，
硬脂酸镁1g，
滑石粉0.5g，
干淀粉18g，
上述组分在混合机中混匀后压制成片。
实施例14：
保健品胶囊剂：
四角蛤蜊提取物100g，
微晶纤维素0.5g，
上述组分混合匀后灌制成胶囊。
实施例15：
药品片剂：
二甲双胍10g，
四角蛤蜊提取物150g，
干淀粉40g，
硬脂酸镁1g，
滑石粉0.5g，
上述组分在混合机中混匀后压制成片。
实施例16：
药品胶囊剂：
二甲双胍10g，
四角蛤蜊提取物100g，
微晶纤维素1g，
上述组分混合匀后灌制成胶囊。
Claims (10)
1.一种四角蛤蜊提取物，由以下方法制得：取四角蛤蜊软体部位为原材料，洗净、绞碎，加水煎煮，滤过，得水煎煮提取液，将水煎煮提取液离心，收集上清液，浓缩，浓缩液冷却后加乙醇沉淀，滤过，得乙醇沉淀物，干燥，得四角蛤蜊提取物。
2.权利要求1所述的四角蛤蜊提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：取四角蛤蜊软体部位为原材料，洗净、绞碎，加水煎煮，滤过，得水煎煮提取液，将水煎煮提取液离心，收集上清液，浓缩，浓缩液冷却，加乙醇沉淀，滤过，得乙醇沉淀物，干燥，得四角蛤蜊提取物。
3.根据权利要求2所述的四角蛤蜊提取物的制备方法，其特征在于进一步包括纯化步骤：取所述乙醇沉淀物溶于水中，脱蛋白，收集脱蛋白的水溶液部位，加乙醇沉淀，干燥，得脱蛋白的四角蛤蜊提取物。
4.根据权利要求2所述的四角蛤蜊提取物的制备方法，其特征在于所述加水煎煮步骤循环进行1-3次，每次加水与四角蛤蜊软体原材料的质量比为2∶1-5∶1，每次提取时间为30-120分钟。
5.根据权利要求2或3所述的四角蛤蜊提取物的制备方法，其特征在于所述加乙醇沉淀步骤为：在搅拌情况下加入乙醇，至乙醇在沉淀体系中的质量百分含量为60-90％。
6.根据权利要求3所述的四角蛤蜊提取物的制备方法，其特征在于所述脱蛋白步骤使用蛋白酶法，或离子交换柱层析法。
7.权利要求1所述的四角蛤蜊提取物在制备降血糖药物或保健品中的应用。
8.权利要求1所述的四角蛤蜊提取物在制备调节免疫药物或保健品中的应用。
9.权利要求1所述的四角蛤蜊提取物在制备护肝药物或保健品中的应用。
10.根据权利要求7-9之一所述的四角蛤蜊提取物的应用，其特征在于相应药物和保健品中添加制剂学和食品学中上允许添加的其他辅料和添加剂，制成常规的制剂形式。
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