CN101480220A - 一种从酵母细胞制备混合型核苷酸饲料添加剂的方法及应用 - Google Patents

Abstract

一种从酵母细胞制备混合型核苷酸饲料添加剂的方法及应用，属于酵母制备核苷酸及饲料添加剂技术领域。本发明以酵母细胞为原料，采用均质和盐法相结合的方法对细胞进行高效破壁处理；通过离心、分步等电结晶分离出细胞壁、蛋白质和其他不溶性物质；专门收集特定等电点时的核酸RNA沉淀，获得70％纯度的核酸湿粗品；将该核酸湿粗品溶于水后，用来自麦芽根的高活力磷酸二酯酶进行高效定向酶解反应，酶解结束后直接喷雾干燥、粉碎，获得含量超过60％的四种单体核苷酸(AMP、GMP、CMP、UMP)、蛋白含量低于10％的混合型核苷酸饲料添加剂产品。将这种饲料添加剂用于动物饲料，能显著改善动物肠道吸收功能，促进动物生长，提高免疫功能、抗病能力和抗应激能力。

Description

一种从酵母细胞制备混合型核苷酸饲料添加剂的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种以酵母细胞为原料制备出高含量单体核苷酸的饲料添加剂并应用于动物饲料的方法，属于酵母制备核苷酸及饲料添加剂技术领域。

背景技术

酵母菌是一群以圆形或椭圆形的以出芽或分裂为主要繁殖方式的单细胞真菌，具有典型的细胞结构，包括细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核。酵母细胞是一个丰富的天然营养宝库，蛋白质含量高达50％，核酸含量接近8％，此外还含有大量的葡聚糖、甘露聚糖等免疫多糖和类脂、无机盐、维生素等，极具开发价值。

酵母菌作为单细胞微生物，具有繁殖快，易培养，产量大的特性。例如目前我国的啤酒年产量已超过2300万吨，现在仍以每年10％左右的速度递增，啤酒废酵母是啤酒生产的副产物，其量约占啤酒产量的0.15％(干重)，据此计算，我国每年有3.45万吨(干重)啤酒废酵母产生，急待开发和综合利用。

核糖核酸RNA是重要的生物遗传物质，是指导蛋白质合成的模板物质。核酸RNA经来自麦芽根的5’-磷酸二酯酶定向酶解，可水解为腺苷酸(AMP)、鸟苷酸(GMP)、尿苷酸(UMP)和胞苷酸(CMP)四种单体核苷酸。

迄今为止公开的以酵母菌体制取核苷酸的方法有许多种，如CN1370837公开了用啤酒酵母为原料制取核苷酸的方法；CN1049521公开了利用酒厂废酵母生产5’-核苷酸的方法；CN13970779公开了一种从味精废水中提取核苷酸的方法，但是这些方法均是从酵母菌体中提取核苷酸精制产品(纯度达99％以上)，生产过程使用了柱吸附、分离等方法，工艺复杂，产品损失大，收率低，生产成本很高。CN1864516公布了一种简单且低成本地从酵母中制备核苷酸的方法，但该专利制备得到的核苷酸制剂四种单体核苷酸的含量很低，仅为8％～24％，含量很不稳定，且蛋白质含量高达50％～60％，该专利也未对这种制剂在饲料中的添加方法和添加比例进行说明。

九十年代初，人们开始研究核苷酸在饲料上的应用。虽然大多数的生物体都能自身从嘌呤和嘧啶合成核苷酸。但由于这种从头合成和分段合成核苷酸在代谢上是一个耗费代价的过程，尤其当机体处于特殊生理条件下，例如快速生长期、肝功能障碍、或处于免疫应激时，内源核苷酸相对合成不足，不能满足代谢旺盛的器官和组织的需要，此时就需要来源于日粮的外源核苷酸加以补充。研究结果表明日粮中额外地添加外源核苷酸，可以优化组织快速分化的功能。目前营养专家已将核苷酸称作半必须营养物质，或条件营养物质。

核苷酸对于动物的生理和营养具有多种生理功效。饲料中添加核苷酸可促进动物肠道的生长，增加肠道吸收面积，改善肠道功能，促进消化，控制下痢，使动物能吸收更多的营养物质，提高饲料利用率。饲料中添加核苷酸能刺激动物的特异性和非特异性免疫反应，通过增强动物的免疫系统而明显地提高动物的抗病能力和抗应激能力。由于核苷酸具有促进动物免疫功能的作用，因此目前专家认为核苷酸是动物的有效免疫增强剂。肝脏是从头合成核苷酸的主要器官，添加核苷酸可促进肝脏蛋白质和脂肪的合成，促进肝的再生和受损肝的恢复，肝损伤时补充核苷酸尤为必要。

到目前为止，国内对核苷酸用于动物饲料的研究论文很多，但将核苷酸用作动物饲料添加剂，并明确提出使用方法和使用剂量的国内专利还没有出现。国外则早在2006年的美国专利US6987095中就报道，在鱼饲料中添加一定浓度的核苷酸，例如尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸、胸苷酸、腺苷酸或它们的混合物，能促进肠道的发育，使得小肠绒毛的面积增加，从而有效地提高肠道对饲料和饲料添加剂的吸收。

发明内容

本发明的目的是提出一种机械破壁与盐法破壁相结合的方法，对酵母细胞实现高效破壁，节省了盐用量，提高了破壁率，提高了核酸提取收率(达到4％)。

本发明的另一目的是提供一种采用分步等电结晶技术从酵母细胞中提取出相对纯度较高的核酸RNA产品(含RNA≥70％)的方法。

本发明的进一步目的是提出一种核酸RNA高效酶解方法，即在5’-磷酸二酯酶液的制备过程中以及核酸RNA的水解过程中，加入酶激活剂、稳定剂、恢复剂与增强剂，从而提高酶活力(达550U/mL)和酶解效率(≥87％)。

本发明的更进一步目的是提供一种混合型核苷酸饲料添加剂在动物饲料中的添加方法，包括添加方式、添加剂量、饲喂周期等。

本发明的技术方案：一种从酵母细胞制备混合型核苷酸饲料添加剂的方法，制备工艺过程如下：

(1)破壁：采用均质破壁与盐法破壁相结合的方法，将酵母混入水中，用高压均质机在30～40Mpa压力下均质破壁2～3次；然后加入固体食盐，溶解，配制成含10％干重计酵母细胞、3％～6％NaCl的酵母乳液；

将酵母乳液置于反应釜中，通过蒸汽加热迅速升温至95℃～100℃；

在95℃～100℃条件下搅拌保温2～5小时后，冷却至室温；

(2)分离：将上述反应液离心分离(7000转/分)，固体物为脱核酸酵母，富含酵母葡聚糖及甘露聚糖的细胞壁和不溶性的蛋白质；

(3)等电结晶：母液用盐酸调节pH 5.0～6.0，室温结晶后，离心分离(7000转/分)，固型物为变性后的蛋白质和其他不溶性物质；剩下的母液继续用盐酸调节pH3.0～4.0，室温结晶，离心分离(7000转/分)，固型物为变性后的蛋白质和其他不溶性物质；

最后的母液进一步用盐酸调节pH 1.0～2.5，室温结晶，离心分离(7000转/分)，固型物为核糖核酸RNA湿粗品；将湿粗品90℃烘干，粉碎，烘干物含70％核酸RNA；相当于国家规定的合格品核酸。

(4)制酶：麦芽根经粉碎、过筛、浸泡、离心，获得5’-磷酸二酯酶酶液；

(5)酶解：将制备得到的核酸RNA溶于水中，按照每克核酸加入3000～6000U5’-磷酸二酯酶，进行定向酶解，70℃搅拌1～3小时后，迅速升温至90℃灭酶；

(6)干燥：将上述酶水解液直接喷雾干燥，粉碎，筛分，获得含量超过60％的四种单体核苷酸AMP、GMP、CMP、UMP的混合型核苷酸饲料添加剂。

用所述方法制备的混合型核苷酸饲料添加剂用于动物饲料的添加方法，以含量超过60％的单体核苷酸的混合型核苷酸为饲料添加剂原料，其添加方法如下：

将所述添加剂与水产饲料相混合，添加比例为占总质量的0.01％～0.05％，然后经熟化、调质、制粒、干燥，制备成专门的颗粒型水产饲料。在水产动物早期生长阶段使用，或者在水产动物处于应激状态时使用，也可以作为免疫增强剂在水产动物的整个生长阶段中使用。

或将所述添加剂与畜禽饲料相混合，添加比例为占总质量的0.02％～0.09％，混合均匀后，制备成专门的畜禽饲料。在畜禽动物早期生长阶段使用，或者在畜禽动物处于应激状态时使用，也可以作为免疫增强剂在畜禽动物的整个生长阶段中使用。

所使用的酵母原料选用啤酒废酵母、面包酵母、产朊假丝酵母、热带假丝酵母、园拟酵母、球拟酵母或酿酒酵母。

所述的制酶步骤麦芽根浸泡液中加入了MgSO₄、NaCL和ZnSO₄三种无机盐，加入浓度分别为0.1M～0.3M、0.1M～0.3M、和10^-2M～10^-4M，从而获得酶活达到550U/mL的高活性5’-磷酸二酯酶液。

在酶解步骤中5’-磷酸二酯酶液酶解核酸RNA时，在反应液中加入了5’-磷酸二酯酶的激活剂MgSO₄，添加浓度为0.1M～0.3M，同时加入能提高5’-磷酸二酯酶热稳定性和酶活力的ZnSO₄，添加浓度为10^-2M～10^-4M，从而使核酸RNA的酶解率达到87％以上。

加了添加剂后所制备的水产饲料适用于鱼饲料、虾饲料、蟹饲料及所有类型的水产饲料。

加了添加剂后所制备的畜禽饲料中的添加比例为0.02％～0.08％，该比例适用于鸡饲料、猪饲料等类型的畜禽动物饲料；对于牛、羊等反臼类动物饲料，该比例提高为0.05％～0.09％。

本发明使用的NaCl为普通的食用盐，使用的盐酸为食用级盐酸。

本发明使用的麦芽根可以是啤酒企业的废弃麦芽根，也可以是麦芽生产企业生产麦芽过程中的废弃麦芽根。

本发明使用的MgSO₄、NaCL和ZnSO₄均为分析纯级别。

本发明使用的喷雾干燥法，操作工艺参数如下：进料物质的干物质含量在25％～30％左右，进风温度140℃～150℃，塔体出风温度控制在95℃以上，干燥后成品含水量5％～6％，必须用刮板式真空蒸气机浓缩。

本发明通过分步等电结晶法，尽可能高效率地去除了蛋白质、肽类和其他杂质，获得了相对纯度较高的核酸产品(含RNA超过70％)。

在5‘-磷酸二酯酶液制备工艺和核酸RNA酶解工艺中，本发明使用了MgSO₄、NaCl和ZnSO₄等无机盐，MgSO₄是5’-磷酸二酯酶的激活剂；而NaCl和ZnSO₄是5‘-磷酸二酯酶的热稳定剂，同时也是酶活力的恢复剂与增强剂。通过使用这些无机盐使本发明制备得到的5‘-磷酸二酯酶活力高达550U/mL单位，对RNA的水解效率达到87％以上，最后获得的混合型核苷酸产品四种单体核苷酸含量超过60％。

本发明的混合型核苷酸添加剂因含有较高的四种单体核苷酸(AMP、GMP、UMP、CMP)，总含量达到60％以上，可以作为幼畜、幼禽、奶牛、鱼、虾、蟹和其他水产养殖动物的饲料添加剂。起到促进动物肠道发育、促进动物生长、提高饲料利用率、增强动物免疫功能，提高动物抗病能力、抗应激能力等多种生理功效。同时本发明产品中含有的单体鸟苷酸(GMP)还具有增强饲料鲜味的功能，对动物能起到一定的诱食效果。

本发明的创新点：

①本发明以酵母细胞为原料生产核苷酸饲料添加剂，酵母是2003年国家明文规定的可用作饲料原料的微生物，本发明使用的原料来源广泛，生产工艺无毒无污染，所生产的核苷酸产品是一种高效绿色安全的饲料添加剂。

②本发明采用机械破壁(均质法)和盐法破壁相结合的方法，与单一的盐法破壁相比，减少了盐用量，提高了破壁率，提高了核酸RNA提取收率(达到4％左右)。

③本发明采用分步等电结晶技术，尽可能分离出变性后不溶于水的蛋白质、多肽和其他杂质，从而获得纯度较高的核酸产品，产品核酸RNA的纯度达70％以上。

④本发明在5‘-磷酸二酯酶制备工艺和RNA酶解工艺中，加入酶激活剂、热稳定剂、恢复剂与增强剂等无机盐，酶活力高达550U/mL单位，酶解效率高达87％以上，最后获得的添加剂产品四种单体核苷酸含量超过60％。

⑤由于采用了创新技术②、③和④，使本发明产品的生产成本大幅度降低，从而显著降低了在饲料中的添加成本。

⑥由于采用了创新技术②、③和④，使本发明产品四种单体核苷酸含量较高(60％以上)，杂质含量较低，从而便于饲料组方的设计，降低综合成本。

⑦本发明在国内首次对核苷酸用作动物饲料添加剂，明确提出使用方法和使用剂量。

我国是一个农业大国，也是一个养殖业大国。我国的养殖技术经历了由粗放型养殖到高密度集约化工厂化养殖的过程。近年来，集约化高密度养殖规模日益扩大，使得养殖动物产量大幅度提高。但这种养殖方式带来的弊端是养殖环境日益恶化，动物免疫力下降、抗病能力下降、抗应激反应能力下降、环境耐受性降低，为了解决这些问题，人们就大量使用滥用各种抗生素和化学药物。为了加速动物的生长，提高饲料报酬，人们在饲料中大量使用各种生长激素。这样做的后果是导致这些药物在动物体内大量残留和蓄积，不仅严重影响了动物产品的质量和食用安全，危害消费者健康，同时也会污染生态环境。

当前国内外高度重视食品的安全性，人们对环境保护的意识空前加强，因此研发以养殖生态环境保护、提供食用安全、有营养的绿色食品为前提的高效安全养殖技术，从养殖源头上消除动物产品食用安全问题十分必要。尤其是开发能替代抗菌素、生长激素等影响动物产品安全的物质，具有促进动物生长、提高动物免疫力、减少环境污染和无残留作用的新型安全高效和绿色环保的饲料添加剂，成为当前饲料领域的研究热点和研究方向。

采用本发明工艺生产出来的混合型核苷酸添加剂属天然物质，不受动物排斥，不引起任何毒副作用，是一种绿色安全的产品，具有安全高效的特点。将其用于动物养殖饲料中，能较好地解决上述国内养殖业面临的诸多问题。

本发明工艺简单，原料便宜，酶解效率高，生产成本低，产品纯度高，产品功效显著，具有实现产业化的条件，市场前景广阔。

具体实施方式

实施例1

1、将啤酒废酵母用水搅拌均匀，过80目筛，沉降并去除上层清液、沉淀用水洗涤两次，离心(7000转/分)，固型物为纯度较高的废酵母菌体。

2、经过预处理的啤酒废酵母混入水中，用高压均质机在35Mpa压力下机械破壁2次，然后加入固体食盐，溶解，配制成含10％酵母细胞(干重)、5％NaCl的酵母悬浮液。

3、反应釜中通蒸汽夹套加热，将酵母乳液迅速升温至95℃～100℃。

4、在95℃～100℃条件下搅拌保温4小时后，夹套通冷却水冷却至室温。

5、将上述反应液离心分离(7000转/分)，固体物为脱核酸酵母，主要为细胞壁(富含酵母葡聚糖、甘露聚糖等)和不溶性的蛋白质。

6、母液用盐酸调节pH5.0左右，室温结晶，离心分离(7000转/分)，固型物为变性后的蛋白质和其他不溶性物质。

7、剩下的母液继续用盐酸调节pH3.0左右，室温结晶，离心分离(7000转/分)，固型物为变性后的蛋白质和其他不溶性物质。

8、最后的母液进一步用盐酸调节pH2.2左右，室温结晶，离心分离(7000转/分)，固型物为核糖核酸RNA湿粗品。将湿粗品90℃烘干，粉碎，获得核酸RNA产品(含RNA 71％)，相当于国家规定的合格品核酸。

9、麦芽根粉碎、过80目筛、4℃水浸泡一整液(水中预先分别加入0.2MMgSO₄、0.2MNaCl、和10^-3M的ZnSO₄)，离心(4000转/分)，上清液70℃水浴5～10分钟灭杂酶，最后得到的溶液为5‘-磷酸二酯酶酶液，测定酶活力达550U/mL单位。

10、将制备得到的核酸RNA溶于水中，按照每克核酸RNA加入4000U的5‘-磷酸二酯酶，再分别补加入MgSO₄和ZnSO₄，使其终浓度分别为0.2M和10^-3M，然后70℃水浴搅拌反应2小时，测定酶解率达到87.2％。反应结束后迅速升温至90℃灭酶。

11、将上述酶水解液直接喷雾干燥，干燥工艺条件为进料固型物浓度25％～30％左右，进风温度140℃～150℃，塔体出风温度控制在95℃以上，干燥后成品含水量5％～6％，用刮板式真空蒸气机浓缩。

12、产品粉碎，过80目筛，获得含有四种单体核苷酸AMP、GMP、CMP、UMP(含量60.9％)的混合型核苷酸饲料添加剂。

实施例2

1、将含单体核苷酸60.9％的混合型核苷酸添加剂与水产饲料相混合，添加比例为0.03％(干重)，然后经熟化、调质、制粒、干燥，制备成专门的颗粒型水产饲料；在水产动物早期生长阶段使用，或者在水产动物处于应激状态时使用，也可以作为免疫增强剂在水产动物的整个生长阶段中使用。每天分3次投喂，早、中、晚各一次。对于虾类投喂时间2个月；对于鱼类投喂时间可以从3周～17周，一般选择5周～8周。

2、将含单体核苷酸60.9％的混合型核苷酸添加剂与畜禽饲料相混合，对于鸡饲料、猪饲料，添加比例为0.02％～0.08％(干重)；对于牛饲料、羊饲料等反臼类动物饲料，添加比例提高为0.05％～0.09％(干重)。混合均匀后，制备成专门的畜禽动物饲料。在动物早期生长阶段使用，或者在动物处于应激状态时使用，也可以作为免疫增强剂在动物的整个生长阶段中使用。每天分3次投喂，早、中、晚各一次。根据动物的生长情况和摄食情况，确定投喂的时间长度。

Claims (7)

1、一种从酵母细胞制备混合型核苷酸饲料添加剂的方法，其特征是制备工艺过程如下：

(1)破壁：采用均质破壁与盐法破壁相结合的方法，将酵母混入水中，用高压均质机在30～40Mpa压力下均质破壁2～3次；然后加入固体食盐，溶解，配制成含10％干重计酵母细胞、3％～6％NaCl的酵母乳液；

将酵母乳液置于反应釜中，通过蒸汽加热迅速升温至95℃～100℃；

在95℃～100℃条件下搅拌保温2～5小时后，冷却至室温；

(2)分离：将上述反应液离心分离，固体物为脱核酸酵母，富含酵母葡聚糖及甘露聚糖的细胞壁和不溶性的蛋白质；

(3)等电结晶：母液用盐酸调节pH5.0～6.0，室温结晶后，离心分离，固型物为变性后的蛋白质和其他不溶性物质；剩下的母液继续用盐酸调节pH3.0～4.0，室温结晶，离心分离，固型物为变性后的蛋白质和其他不溶性物质；

最后的母液进一步用盐酸调节pH1.0～2.5，室温结晶，离心分离，固型物为核糖核酸RNA湿粗品；将湿粗品烘干，粉碎，烘干物含70％核酸RNA；

(4)制酶：麦芽根经粉碎、过筛、浸泡、离心，获得5’-磷酸二酯酶酶液；

(5)酶解：将制备得到的核酸RNA溶于水中，按照每克核酸加入3000～6000U5’-磷酸二酯酶，进行定向酶解，70℃搅拌1～3小时后，迅速升温至90℃灭酶；

(6)干燥：将上述酶水解液直接喷雾干燥，粉碎，筛分，获得含量超过60％的四种单体核苷酸AMP、GMP、CMP、UMP的混合型核苷酸饲料添加剂。

2、根据权利要求1所述的从酵母细胞制备混合型核苷酸饲料添加剂的方法，其特征在于步骤(1)所使用的酵母原料选用啤酒废酵母、面包酵母、产朊假丝酵母、热带假丝酵母、园拟酵母、球拟酵母或酿酒酵母。

3、根据权利要求1所述的从酵母细胞制备混合型核苷酸饲料添加剂的方法，其特征在于制酶步骤麦芽根浸泡液中加入了MgSO₄、NaCl和ZnSO₄三种无机盐，加入浓度分别为0.1M～0.3M、0.1M～0.3M、和10^-2M～10^-4M，从而获得酶活达到550U/mL的高活性5’-磷酸二酯酶液。

4、根据权利要求1所述的从酵母细胞制备混合型核苷酸饲料添加剂的方法，其特征在于酶解步骤中5’-磷酸二酯酶液酶解核酸RNA时，在反应液中加入了5’-磷酸二酯酶的激活剂MgSO₄，添加浓度为0.1M～0.3M，同时加入能提高5’-磷酸二酯酶热稳定性和酶活力的ZnSO₄，添加浓度为10^-2M～10^-4M，从而使核酸RNA的酶解率达到了87％以上。

5、用权利要求1所述方法制备的混合型核苷酸饲料添加剂用于动物饲料的添加方法，其特征是以含量超过60％的单体核苷酸的混合型核苷酸为饲料添加剂原料，其添加方法如下：

将所述添加剂与水产饲料相混合，添加比例为占总质量的0.01％～0.05％，然后经熟化、调质、制粒、干燥，制备成专门的颗粒型水产饲料。

或将所述添加剂与畜禽饲料相混合，添加比例为占总质量的0.02％～0.09％，混合均匀后，制备成专门的畜禽饲料。

6、根据权利要求5所述的将混合型核苷酸饲料添加剂用于动物饲料的添加方法，其特征在于加了添加剂后所制备的水产饲料适用于鱼饲料、虾饲料、蟹饲料及所有类型的水产饲料。

7、根据权利要求5所述的将混合型核苷酸饲料添加剂用于动物饲料的方法，其特征在于加了添加剂后所制备的畜禽饲料中的添加比例为0.02％～0.08％，该比例适用于鸡饲料、猪饲料等类型的畜禽动物饲料；对于牛、羊等反臼类动物饲料，该比例提高为0.05％～0.09％。