CN101474227A - 治疗肿瘤的白首乌提取物以及含有其的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白首乌提取物以及含有其的药物组合物。所述白首乌提取物通过包括以下步骤的方法制得：将白首乌经有机溶剂提取，然后将所得提取液除去有机溶剂得到提取物粗品，再将粗品水溶液经大孔树脂后用水洗脱除去杂质，再用有机溶剂洗脱并将所得洗脱液除去有机溶剂。该提取物以及含有其的药物组合物具有良好的抗肿瘤功效。

Description

治疗肿瘤的白首乌提取物以及含有其的药物组合物

技术领域

本发明涉及中药领域，尤其涉及从白首乌制得的提取物以及含有该提取物的药物组合物，尤其是胶囊制剂，该提取物具有治疗肿瘤的功效。

背景技术

中药白首乌(Bunge Auriculate Root)为双子叶植物药萝藦科植物大根牛皮消(Cynanchum bungei Decne)的块根，有时，其同属织物耳叶牛皮消(Cynanchumauriculatum Royle ex Wight)以及隔山牛皮消(C.wilfordi(Maxim.)Hemsl.)的块根也用作白首乌。白首乌具有养血益肝、固肾益精、强筋健骨等功效，在药品、保健食品和化妆品等行业具有广泛的应用。

现代药理研究表明白首乌含有的C21甾体苷具有抗肿瘤和增强免疫力的功效，这为白首乌更好用于药品行业提供了更为良好的理论基础。

目前，致力于研究白首乌在调节机体免疫功能、抑制肿瘤方面的课题已经有所报道。例如，专利号00136364.6的中国专利公开了一类新颖的抗肿瘤化合物，特别是用于抑制人癌细胞生长的4种碳-21甾体苷以及包含有这4种碳-21甾体苷的混合物。从白首乌中分离的这4种碳-21甾体苷，被分别命名为：耳叶牛皮消苷A、耳叶牛皮消苷B、白首乌新苷A、白首乌新苷B。包含有这4种碳-21甾体苷的混合物被定名为白首乌总苷B。它们都具有一定的抗肿瘤作用。还例如，专利号为03131868.1的中国专利进一步公开了对白首乌中含有的皂甙类进行提取生产的方法，包括将白首乌的水或含水醇浸析液通过甲基丙烯系合成吸附剂或芳香族系合成吸附剂吸附，再用含水40％～100％的含水醇或醇或者丙酮加以解吸洗提处理，将洗提液中的溶媒除去，便能提取白首乌中的皂甙类。所述白首乌的水是指制作白首乌的精制粉末时产生大量含有白首乌的皂甙类水浸析液，或者将新鲜的白首乌放在水中悬浊、搅拌、充分浸泡后进行离心分离产生的含有首乌的皂甙类离心分离液。所述含水醇的浸析液是指采用含水醇对新鲜的白首乌或干燥的白首乌片、粉末进行浸析处理，提取出含有白首乌的皂甙类含水醇浸析液。含水醇或醇包括甲醇、乙醇、丙醇。

上述现有技术都公开了对白首乌中的有效活性成分进行提取精制的方法，但是提取时所用溶剂基本都限定于是水和/或醇溶剂，对白首乌中抗肿瘤活性成分的提取并不是很完全。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从白首乌制得的提取物，其对肿瘤具有治疗效果。

本发明的另一目的在于提供从白首乌制备治疗肿瘤的提取物的方法。

本发明的再一目的在于一种治疗肿瘤的药物组合物，其含有上述从白首乌制得的提取物作为活性成分。

本发明的再一目的在于提供上述治疗肿瘤的药物组合物的胶囊制剂。

以下对本发明进行详细说明。

本发明提供了一种白首乌提取物，其通过包括以下步骤的方法制得：将白首乌经有机溶剂提取，然后将所得提取液除去有机溶剂得到提取物粗品，再将粗品水溶液经大孔树脂后用水洗脱除去杂质，再用有机溶剂洗脱并将所得洗脱液除去有机溶剂。

本发明中，提取白首乌所用的有机溶剂可以选自酯、醇溶液和酮中的一种或多种。其中，所述酯优选是乙酸乙酯；所述醇溶液优选是乙醇溶液，更优选是40-95％的乙醇溶液，还更优选是50-90％的乙醇溶液，还更优选是60-85％的乙醇溶液，最优选是70-85％的乙醇溶液；所述酮优选是丙酮溶液。

作为本发明的一个优选实施方式，提取白首乌所用的有机溶剂至少由选自乙酸乙酯、乙醇溶液和丙酮中的两者的混合物组成。更优选地，提取白首乌所用的有机溶剂由乙酸乙酯、乙醇溶液和丙酮三者的混合物组成，更进一步优选，乙酸乙酯、乙醇溶液和丙酮三者的混合比例是1-5:50-60:35-49(v:v:v)，优选为2-4:53-58:40-45。

本发明中，使用有机溶剂提取白首乌的提取方式并没有特别限定，可以在常温常压下提取，可以加热提取，可以加热回流提取，可以减压提取，可以减压回流提取等。从提取效率角度考虑，优选加热回流提取。

发明人经过实验发现，使用有机溶剂提取白首乌的提取次数优选不低于2次，更优选在2-6次，还更优选在2-4次。

为了除去经有机溶剂提取白首乌所得提取液中的有机溶剂以得到白首乌提取物粗品，可以使用常规方法进行。例如，通过蒸发、蒸馏、减压蒸馏等方法除去有机溶剂。这些方法对于本领域技术人员来说都是已知的。

除去提取液中的有机溶剂，即得到白首乌提取物粗品。为了除去其中的杂质成分，将该粗品的水溶液通过大孔树脂，然后再用水洗脱。所用大孔树脂优选使用非极性大孔树脂，例如但不限于D101大孔树脂、AB-8大孔树脂、H-20大孔树脂或H-60大孔树脂等。

用有机溶剂洗脱时，优选使用选自酯、醇溶液和酮的有机溶剂进行洗脱。所述酯优选是乙酸乙酯；所述醇溶液优选是乙醇溶液，所述酮优选是丙酮。优选使用选自酯、醇溶液和酮的有机溶剂中的至少两种分别洗脱，更优选使用乙酸乙酯、乙醇溶液和丙酮中的任意两种或三种有机溶剂分别洗脱。最优选地，使用乙酸乙酯、乙醇溶液和丙酮分别依次进行洗脱。

使用有机溶剂进行洗脱时，所用是乙醇溶液的浓度优选为40-95％，还更优选是50-90％，还更优选是60-85％，最优选是70-85％。

收集有机溶剂洗脱而得的洗脱液，除去其中的溶剂，即可得到本发明的白首乌提取物。

作为制备本发明白首乌提取物方法的优选实施方式，包括以下步骤：

白首乌加5-10倍量(以质量计)由乙酸乙酯、50-90％乙醇和丙酮组成的混合溶剂回流提取2-6次，每次不低于1小时，滤过，滤液回收溶剂至干，得到白首乌粗提物；

将白首乌粗提物加水溶解，通过非极性大孔吸附树脂柱，用水洗脱；

再依次用柱体积2-10倍量的乙酸乙酯、柱体积2-10倍量的50-90％乙醇和柱体积1-10倍量的丙酮依次进行洗脱，分别收集洗脱液；

分别回收上述洗脱液中的溶剂至干，合并，得到本发明的白首乌提取物。

本发明人经过研究和实验发现，本发明的白首乌提取物具有良好的抗肿瘤效果，对多种肿瘤都具有很好的治疗效果。

本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物组合物，其含有本发明的白首乌提取物作为活性成分，还含有药学可接受的辅料。所述药学可接受的辅料例如是载体、赋形剂和稀释剂中的一种或多种。

特别地，本发明还提供了上述治疗肿瘤的药物组合物的胶囊制剂，其中所述辅料是乳糖和淀粉。本发明人经过研究发现，本发明的白首乌提取物作为活性成分的胶囊剂，当使用乳糖和淀粉作为辅料时，再通过使用乙醇制软材，可以得到稳定的颗粒以填塞胶囊。优选地，作为活性成分的白首乌提取物与作为辅料的乳糖和淀粉的重量配比为1-7:1-9:1-10，更优选为1-6:1-8:1-9。

作为生产本发明治疗肿瘤的药物组合物的胶囊制剂的工艺，一个优选的实施方式包括：将白首乌提取物粉碎，过40-100目筛，白首乌提取物加辅料乳糖和淀粉混合均匀，白首乌提取物、乳糖和淀粉的比例为1-6:1-8:1-9，用70-100％的乙醇制软材，再制成颗粒，50-90℃烘干，整粒，装入胶囊。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步描述本发明，本发明的特点和优点会随着这些描述变得更为清晰。但这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，本发明有多种不同的实施方式，对本发明技术方案的细节可以有多种替换方式，这些均应落入本发明的范围内。

实施例1  白首乌提取物的制备

取白首乌饮片50g，用由乙酸乙酯12mL、90％乙醇220mL和丙酮180mL组成的混合溶剂回流提取4次，每次2小时。滤过，合并滤液，减压回收溶剂至干，得到白首乌提取物粗品。

将上述白首乌提取物粗品加水200mL溶解，通过D101大孔吸附树脂柱，用水400mL洗脱；

再依次用200mL乙酸乙酯、200mL90％乙醇、150mL丙酮洗脱，分别收集洗脱液；

将所有的洗脱液分别减压回收溶剂至干，合并，得到白首乌提取物4.6g，为淡黄色粉末。

实施例2  白首乌提取物的制备

取白首乌饮片50g，用由乙酸乙酯20mL、80％乙醇240mL和丙酮195mL组成的混合溶剂回流提取2次，每次2小时。滤过，合并滤液，减压回收溶剂至干，得到白首乌提取物粗品。

将上述白首乌提取物粗品加水200mL溶解，通过D101大孔吸附树脂柱，用水400mL洗脱；

再依次用300mL乙酸乙酯、300mL 90％乙醇、100mL丙酮洗脱，分别收集洗脱液；

将所有的洗脱液分别减压回收溶剂至干，合并，得到白首乌提取物4.65g，为淡黄色粉末。

实施例3  白首乌提取物的制备

取白首乌饮片50g，用由乙酸乙酯20mL、60％乙醇200mL和丙酮180mL组成的混合溶剂回流提取6次，每次2小时。滤过，合并滤液，减压回收溶剂至干，得到白首乌提取物粗品。

将上述白首乌提取物粗品加水200mL溶解，通过AB-8大孔吸附树脂柱，用水400mL洗脱；

再依次用400mL乙酸乙酯、200mL 90％乙醇、300mL丙酮洗脱，分别收集洗脱液；

将所有的洗脱液分别减压回收溶剂至干，合并，得到白首乌提取物4.72g，为淡黄色粉末。

实施例4  白首乌提取物的制备

取白首乌饮片50g，用由乙酸乙酯8mL、50％乙醇230mL和丙酮140mL组成的混合溶剂回流提取3次，每次2小时。滤过，合并滤液，减压回收溶剂至干，得到白首乌提取物粗品。

将上述白首乌提取物粗品加水200mL溶解，通过D101大孔吸附树脂柱，用水400mL洗脱；

再依次用500mL乙酸乙酯、200mL 90％乙醇、400mL丙酮洗脱，分别收集洗脱液；

将所有的洗脱液分别减压回收溶剂至干，合并，得到白首乌提取物4.58g，为淡黄色粉末。

实施例5  胶囊剂的制备

将实施例1中所得白首乌提取物粉碎，过80目筛，将白首乌提取物加辅料乳糖和淀粉混合均匀，其中白首乌提取物、乳糖和淀粉的比例为6:1:1，用70％的乙醇制软材，再制成颗粒，80℃烘干，整粒，装入胶囊。

实施例6  胶囊剂的制备

将实施例2中所得白首乌提取物粉碎，过60目筛，将白首乌提取物加辅料乳糖和淀粉混合均匀，其中白首乌提取物、乳糖和淀粉的比例为1:1:1，用75％的乙醇制软材，再制成颗粒，80℃烘干，整粒，装入胶囊。

实施例7  胶囊剂的制备

将实施例3中所得白首乌提取物粉碎，过40目筛，将白首乌提取物加辅料乳糖和淀粉混合均匀，其中白首乌提取物、乳糖和淀粉的比例为1:8:1，用90％的乙醇制软材，再制成颗粒，60℃烘干，整粒，装入胶囊。

实施例8  胶囊剂的制备

将实施例4中所得白首乌提取物粉碎，过100目筛，将白首乌提取物加辅料乳糖和淀粉混合均匀，其中白首乌提取物、乳糖和淀粉的比例为1:8:9，用乙醇制软材，再制成颗粒，50℃烘干，整粒，装入胶囊。

试验例  本发明白首乌提取物体外对肿瘤细胞的抑制作用

一、实验方法

1.体外传代人肿瘤细胞株的培养

KB细胞在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液内，置37℃、饱和湿度、5％ CO₂条件下培养，在适当时间以0.2％胰蛋白酶消化传代。

2.本发明白首乌提取物对KB 细胞株生长增殖的影响

将培养的KB 细胞用0.2％胰酶消化，用完全1640培养液洗细胞1次后，以完全1640培养液调细胞悬液浓度至1×10⁵/ml，0.1ml/孔加至进口96孔板，置于37℃、5％ CO₂培养箱中培养24h。然后将本发明实施例1中所得白首乌提取物分别以50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL的浓度按0.1ml/孔加入96孔板，将顺铂以20μg/mL的浓度按0.1ml/孔加入作为阳性对照组。每个实验组和阳性对照组设3个复孔，另设无药物的阴性对照组。培养板置于37℃、5％ CO₂培养箱中培养20h、44h、68h后，分别加MTT 0.01ml/孔，继续培养4h后移去药液，每孔加DMSO0.1ml，置于微量液体振荡器上充分混匀，10min后用酶标仪于530nm下测定吸光度值A。每组3个复孔数据取均数，并计算细胞生长抑制率。

细胞生长抑制率＝(1-实验组×A/阴性对照组×A)×100％。

3.白首乌提取物作用于癌细胞后对细胞形态学的影响

在培养有对数生长期的KB 细胞的培养瓶中分别加入终浓度为50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml的本发明白首乌提取物，置于37℃、5％ CO₂培养箱中培养4h、24h、48h、72h后用0.2％胰酶消化，以完全1640培养液洗细胞1次后，以完全1640培养液调细胞悬液浓度至1×10⁶/ml，取0.1ml加于离心涂片机的杯中，1000rpm下离心5min甩片，每组3张复片。甩片毕用记号笔标出染色区，充分干燥，纯甲醇固定3min，使干；以稀释的Giemsa染液染色15min，用蒸馏水略冲洗，晾干，用加拿大树胶封片，光镜下观察细胞形态，寻找凋亡小体。设无药物的阴性对照组和用顺铂20g/ml作用4h为阳性对照组。

4.统计学处理t检验。药物作用时间和浓度同癌细胞生长抑制率的关系用相关系数r表示，并作t检验。

二、实验结果

1.本发明白首乌提取物对KB 细胞生长增殖的影响

白首乌提取物 对KB细胞在不同用药浓度、不同用药时间作用下的生长抑制率显示：白首乌提取物对KB细胞生长增殖有抑制作用，其抑制作用在一定范围内有剂量-时间依赖效应。

药物剂量与生长抑制率成正相关，48h，r＝0.9766，P<0.001；药物作用时间与生长抑制率成正相关，50g/ml，r＝0.9911，P<0.001。

2.经本发明白首乌提取物作用后的细胞形态学观察

正常细胞倒置显微镜下贴壁良好，仅极少数细胞悬浮于培养液中。台盼蓝拒染良好，Giemsa染色，细胞着色均匀，胞浆及核染色均一，有时可见双核或多核，核内可见浅染的核仁。

本发明白首乌提取物150g/ml作用于KB细胞4h及100g/ml作用于KB细胞24h后，将培养瓶于倒置显微镜下观察即可见大部分细胞缩小、变圆，飘浮于培养液中；台盼蓝拒染计数时光镜下可见部分细胞蓝染，表明有胞膜破坏；Giemsa染色后高倍镜下可见部分细胞胞膜破裂，胞浆外溢如喷雾状，细胞核浅染，染色质不规则碎裂。

本发明白首乌提取物50g/ml作用于KB细胞24h、48h、72h后，倒置显微镜下观察同上述类似，而台盼蓝拒染计数时光镜下未见细胞蓝染，表明胞膜未被破坏；Giemsa染色后高倍镜下可见24h、48h细胞形态同正常细胞类似，胞膜完整，胞核及胞浆染色均匀；72h后部分细胞核内发生形态学改变，可见染色质浓缩，或凝聚在核膜内侧，或呈斑块状分布在细胞核内。

Claims (10)

1、一种白首乌提取物，其通过包括以下步骤的方法制得：将白首乌经有机溶剂提取，然后将所得提取液除去有机溶剂得到提取物粗品，再将粗品水溶液经大孔树脂后用水洗脱除去杂质，再用有机溶剂洗脱并将所得洗脱液除去有机溶剂。

2、如权利要求1的白首乌提取物，提取白首乌所用的有机溶剂选自酯、醇溶液和酮中的一种或多种；所述酯优选是乙酸乙酯；所述醇溶液优选是乙醇溶液，优选40-95％的乙醇溶液，更优选是50-90％的乙醇溶液，还更优选是60-85％的乙醇溶液，最优选是70-85％的乙醇溶液：所述酮优选是丙酮溶液。

3、如权利要求1的白首乌提取物，提取白首乌所用的有机溶剂至少由选自乙酸乙酯、乙醇溶液和丙酮中的两者的混合物组成；更优选地，提取白首乌所用的有机溶剂由乙酸乙酯、乙醇溶液和丙酮三者的混合物组成；更进一步优选，乙酸乙酯、乙醇溶液和丙酮三者的混合比例是1-5:50-60:35-49，优选为2-4:53-58:40-45。

4、如权利要求1-3任一项的白首乌提取物，其中用有机溶剂洗脱时，所用选集选自酯、醇溶液和酮；所述酯优选是乙酸乙酯；所述醇溶液优选是乙醇溶液，所述酮优选是丙酮；优选使用选自酯、醇溶液和酮的有机溶剂中的至少两种分别洗脱，更优选使用乙酸乙酯、乙醇溶液和丙酮中的任意两种或三种有机溶剂分别洗脱，最优选使用乙酸乙酯、乙醇溶液和丙酮分别依次进行洗脱。

5、制备白首乌提取物的方法，该方法如权利要求1-4中任一项所述。

6、如权利要求5的方法，包括：

白首乌加5-10倍量由乙酸乙酯、50-90％乙醇和丙酮组成的混合溶剂回流提取2-6次，每次不低于1小时，滤过，滤液回收溶剂至干，得到白首乌粗提物；

将白首乌粗提物加水溶解，通过非极性大孔吸附树脂柱，用水洗脱；

再依次用柱体积2-10倍量的乙酸乙酯、柱体积2-10倍量的50-90％乙醇和柱体积1-10倍量的丙酮依次进行洗脱，分别收集洗脱液；

分别回收上述洗脱液中的溶剂至干，合并，得到白首乌提取物。

7、权利要求1-4任一项的白首乌提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

8、一种治疗肿瘤的药物组合物，其含有本发明的白首乌提取物作为活性成分，还含有药学可接受的辅料。

9、如权利要求8的药物组合物，其是胶囊制剂，其中所述辅料是乳糖和淀粉；优选地，作为活性成分的白首乌提取物与作为辅料的乳糖和淀粉的重量配比为1-7:1-9:1-10，更优选为1-6:1-8:1-9。

10、制备权利要求9所述胶囊制剂的工艺，包括：将白首乌提取物粉碎，过40-100目筛，白首乌提取物加辅料乳糖和淀粉混合均匀，白首乌提取物、乳糖和淀粉的比例为1-6:1-8:1-9，用70-100％的乙醇制软材，再制成颗粒，50-90℃烘干，整粒，装入胶囊