CN101450047B - 一种从黑桑中提取的化合物作为酪氨酸酶抑制剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从黑桑中提取的天然化合物(I)的用途。该化合物对酪氨酸酶有强烈的抑制作用，应用于防治皮肤色斑、雀斑、老年斑等皮肤的色素沉着和美白以及食品添加剂。通过对其抑制活性的测定，证明化合物(I)的活性很强，并且具有较好的稳定性。化合物(I)对于黑色素瘤细胞具有显著的生长抑制作用，可显著降低黑色素瘤细胞内酪氨酸酶的活性，降低细胞内黑色素的生物合成水平。

Description

一种从黑桑中提取的化合物作为酪氨酸酶抑制剂的用途

技术领域

本发明涉及一种黑桑提取物，更具体地说涉及一种从黑桑中提取的天然化合物的用途。

背景技术

随着人民生活水平和审美标准的提高，人们对拥有健康美白的肌肤的要求日益增加。所以，近些年皮肤美白类化妆品市场的开发日趋重视，美白化妆品已成为护肤类化妆品的主流品种之一，其消费市场在不断扩大。

研究表明，皮肤色素沉着是由于黑色素细胞内黑色素产生过多导致的，而酪氨酸酶是黑色素生物合成过程中必不可少的关键酶。因此通过抑制酪氨酸酶的活性可以限制黑色素生成，改善皮肤的色素沉着。

目前已有多种酪氨酸酶抑制剂用于美白，但依然存在问题，不能满足消费市场的需要。曲酸作为一种酪氨酸酶抑制剂，由于其不稳定性，美白效果较弱；氢醌化合物具有强烈的酪氨酸酶抑制作用，但由于其可以诱导皮肤病以及细胞毒性，许多国家已经禁止使用；熊果苷较为安全，也具有酪氨酸酶抑制性，但作用微弱。因此，近几年许多天然植物提取物被开发成美白化妆品，由于其安全、温和、能有效清除氧自由基，受到了大众的欢迎。但是由于化妆品中添加的提取物颜色较深，化妆品的外观受到不良影响，并且有效性不理想。因此，从天然植物中寻找安全、有效的美白化合物已成为化妆品行业研究的趋向。

此外，果蔬鱼虾类保鲜是当前我国农、水产品面临的一个迫待解决的课题，有些农、水产品，例如水果、蔬菜、鱼、虾等，由于得不到及时有效的保鲜方法处理，每年给我国经济带来巨大的损失。而酪氨酸酶参与了许多果蔬鱼虾的褐变反应，是这些果蔬鱼虾变褐生斑而失鲜的主要原因。黑色素是苯酚类型的大分子，由黑色色素和蛋白质的复合物组成。这一多聚体色素会出现在动物的皮肤、眼睛、毛发，鸟的皮毛和天然含有酚类化合物而在加工时在内源性多酚氧化酶的影响下容易发生褐变反映的食品，这些现象可在当苹果，土豆和香蕉的切面与空气接触产生的棕色表面中看到。对于食物，如蔬菜，水果和鱼、虾等甲壳类产品，如果合成了较多的黑色素，它们的质量就下降了。因此，寻求一种食物添加剂，其中含有作为预防褐变的有效成分的化合物，使用在如水果，蔬菜和鱼、虾等甲壳类产品中，通过寻找酪氨酸酶的特效抑制剂用于果蔬鱼虾保鲜是一种可取的有效方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种结构如下式(I)的化合物的用途，该化合物是一种从黑桑中提取得到的天然化合物，其对酪氨酸酶有强烈的抑制作用，应用于防治色斑、雀斑、老年斑等皮肤的色素沉着和美白以及食品添加剂。

上述化合物(I)可以从黑桑中提取得到，其制备方法如下(参考文献：傅大煦，陈蕾，侯爱君^*，《黑桑的化学成分研究》，中草药，2005，36(9)，1296-1299.)：黑桑茎粗粉2kg，用95％EtOH室温浸提3次，合并提取液减压浓缩至干。将得到提取物(204g)加水悬浮，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取。将石油醚萃取物(47g)进行硅胶柱层析，分别用石油醚、石油醚-丙酮(30∶1，20∶1，10∶1，9∶1，6∶1，4∶1)梯度洗脱后得到组分1～17。组分17经硅胶柱层析，氯仿-异丙醇(20∶1～10∶1)洗脱，并经ODS柱层析，甲醇-水(1∶1)洗脱，得到化合物2-丙烯-1-酮，1-[2，4-二羟基-3-(3-甲基-2-丁烯基)苯基]-3-(2，4-二羟基苯基)，如式(I)所示。

化合物(I)的理化性质及光谱数据如下：分子式：C₂₀H₂₀O₅；分子量：340；其性状为桔红色无定形粉末；电子轰击质谱(质荷比)(％)：340[M]⁺(18)，324(100)，322(42)，307(25)，305(14)，279(81)，267(93)，205[RDA of 340]⁺(18)，176(19)，161(39)，149(73)，134(1 9)，123(20)；¹HNMR(500MHz)：(化学位移：ppm，偶合常数：Hz，溶剂：氘代丙酮)：δ14.15(1H，s，OH-2′)，8.21(1H，d，J＝15.4Hz，H-β)，7.88(1H，d，J＝8.9Hz，H-6′)，7.79(1H，d，J＝15.4Hz，H-α)，7.67(1H，d，J＝8.5Hz，H-6)，6.53(1H，d，J＝2.0Hz，H-3)，6.52(1H，d，J＝8.9Hz，H-5′)，6.45(1H，dd，J＝2.0，8.5Hz，H-5)，5.28(1H，br t，J＝7.2Hz，H-2″)，3.37(2H，br d，J＝7.2Hz，H2-1″)，1.78(3H，br s，H₃-4″)，1.64(3H，br s，H₃-5″)；¹³CNMR(125MHz)数据：(化学位移：ppm，溶剂：氘代丙酮)：δ193.8s(C＝O)，165.5s(C-2′)，162.9s(C-4′)，162.7s(C-4)，160.4s(C-2)，141.2d(C-β)，132.1d(C-6)，131.7s(C-3″)，130.3d(C-6′)，123.8d(C-2″)，118.0d(C-α)，116.5s(C-3′)，115.7s(C-1)，114.9s(C-1′)，109.6d(C-5)，108.3d(C-5′)，104.1d(C-3)，26.2q(C-5″)，22.7t(C-1″)，18.3q(C-4″)。

通过对化合物(I)酪氨酸酶抑制活性的测定并进行动力学分析和时间分析，发现该化合物表现出酪氨酸酶抑制活性，并成剂量依赖性；同时以曲酸作为对照品，发现化合物(I)对酪氨酸酶的抑制作用更强。动力学分析结果表明，化合物(I)是一个竞争性抑制剂；同时化合物(I)的抑制作用具有一定的稳定性。

在细胞实验中，发现化合物(I)对黑色素瘤细胞有显著的生长抑制作用，并且可降低细胞内酪氨酸酶的活性，同时又可降低细胞内黑素生物合成的水平。

化合物(I)作为酪氨酸酶抑制剂可以单独使用，也可以与其它化合物混合使用，并含有药学上所允许的药用辅料或常规的药用载体，用作抑制黑色素生成的美白化妆品。本发明的化合物还可以添加其它美白剂成分，这些美白剂成分可以采用但不限于下列成分：熊果苷、曲酸衍生物，L-抗坏血酸及其衍生物及它们的盐、氢醌及其衍生物及它们的盐；植物提取物如甘草提取物、芦荟提取物等。美白剂成分可任意选择1种或2种以上掺入。

化合物(I)具有强烈的酪氨酸酶抑制作用，进一步地可以在制备药品、化妆品或食品添加剂中应用，其中化合物(I)的使用量可视不同的用途而不同。

制备药物或化妆品时，用该化合物与常规的药用载体，如软膏基质、乳化剂、表面活性剂、稳定剂等制成乳剂或软膏等外用制剂，制备工艺可才采用常规的药物制剂技术。其化合物在化妆品中或药品的用量以重量百分比计为0.01～10％比较合适。

酪氨酸酶参与了许多果蔬鱼虾的褐变反应，是这些果蔬鱼虾变褐生斑而失鲜的主要原因。而化合物(I)具有酪氨酸酶抑制作用，能够在预防褐变的食物添加剂中应用。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种从黑桑中提取的天然化合物(I)作为酪氨酸酶抑制剂的用途。通过对其抑制活性的测定，证明化合物(I)的活性更强，并且具有较好的稳定性。化合物(I)对于黑色素瘤细胞具有显著的生长抑制作用，并可显著降低黑色素瘤细胞内酪氨酸酶的活性，降低细胞内黑色素的生物合成水平。

附图说明

图1：实施例1中化合物(I)对酪氨酸酶抑制作用曲线图。

图2：实施例2中Linewearver-Burk曲线。

图3：实施例4中化合物(I)对B16细胞活力的影响。

图4：实施例5中化合物(I)对B16细胞酪氨酸酶活性的影响。

图5：实施例6中不同浓度下化合物(I)对B16细胞形态的影响。

图6：实施例6中化合物(I)对B16细胞黑素含量的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但实施例不限制本发明的保护范围。

实施例1：化合物(I)酪氨酸酶抑制活性的测定。

酪氨酸酶抑制活性的测定以曲酸作为对照品，方法如下：

首先将底物多巴溶解在磷酸缓冲液(25mM，pH6.8)中达到8mM浓度。向96孔板中，加入20μL上述底物溶液，90μL磷酸缓冲液，以及20μL不同浓度的化合物。加入70μL含酪氨酸酶的磷酸缓冲液(100U/mL，pH6.8)，开始反应，37℃下反应10分钟。反应前后用Multiscan MK3全自动多功能酶标仪(Thermo)在492nm下，测定每孔的吸光度。

根据在492nm下的吸光度计算化合物对酪氨酸酶的抑制率(％)，并将酶活性抑制率(％)达到50％时抑制剂的浓度测定为IC₅₀值。抑制率(％)可以根据下式进行：

抑制率(％)＝[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100

上式中，A表示反应10分钟后空白孔在492nm下的吸光度，

B表示反应前空白孔在492nm下的吸光度，

C表示反应10分钟后样品孔在492nm下的吸光度，

D表示反应前样品孔在492nm下的吸光度。

结果：见图1及表1

表1：酪氨酸酶抑制活性

化合物	IC50
		曲酸	32.62±1.24μM
化合物(I)	1.17±0.054μM

结论：从图1可以看出，化合物(I)表现出酪氨酸酶抑制活性，成剂量依赖性；从表1可以看出，其IC₅₀为1.17±0.054μM，强于对照品曲酸。

实施例2：对酪氨酸酶抑制的动力学分析。

将底物多巴溶解在磷酸缓冲液(25mM，pH6.8)中，配制成12mM、10mM、8mM、6mM等4个浓度。向96孔板中，加入20μL上述不同浓度的底物溶液，90μl磷酸缓冲液，以及20μl不同浓度的化合物。加入70μL含酪氨酸酶的磷酸缓冲液(100U/mL，pH6.8)，开始反应，37℃下反应10分钟。反应前后在492nm下，测定每孔的吸光度。计算酶抑制率，方法同实施例1，绘制Lineweaver-Burk曲线(见图2)。

结论：从图2的Lineweaver-Burk曲线可以看出，化合物(I)是一个竞争性抑制剂。

实施例3：对酪氨酸酶抑制的时间分析。

首先将底物多巴溶解在磷酸缓冲液(25mM，pH6.8)中达到8mM浓度。向96孔板中，加入20μL上述底物溶液，90μL磷酸缓冲液，以及20μL终浓度为4μM的化合物。加入70μL含酪氨酸酶的磷酸缓冲液(100U/mL，pH6.8)，开始反应，分别在不同时间测定每孔的吸光度。计算酶抑制率，方法同实施例1。

结果见表2。

表2：不同时间的酪氨酸酶抑制活性

时间(min)	抑制率(％)
		5	60.69±3.32
10	70.71±0.30
		15	74.62±2.19
30	73.11±2.42
		60	69.47±2.77
90	68.97±3.05
		120	66.80±3.42
150	65.88±3.43
		180	62.82±2.47

结论：化合物(I)在反应15分钟时酶抑制率为74.62％，随着时间的延长，酶抑制率有所下降，但在180分钟内对酪氨酸酶的抑制率依然保持在60％以上，因此化合物(I)具有一定的稳定性。

实施例4：对B16黑色素瘤细胞活力的影响。

B16细胞接种于96孔板，2×10³个细胞/孔，用DMEM培养基(10％FBS，高糖)培养。第二天换上含100nM的α-MSH培养基，并加入不同浓度的化合物。48小时后弃培养基，加入100μL 5g/L的MTT，4小时后弃去上清液，加入150μL DMSO，酶标仪上检测吸光度值，测定波长为570nm，参考波长为630nm。结果见图3。

结论：化合物(I)在50μM时对细胞有显著的生长抑制作用，但是当浓度低于30μM时对B16细胞活力没有明显影响。

实施例5：对B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响。

B16细胞接种于48孔板，6×10³个细胞/孔，用DMEM培养基(10％FBS，高糖)培养。第二天换上含100nM的α-MSH培养基，并加入不同浓度的化合物。48小时后弃培养基，PBS洗两次，每孔加入190μl的1％TritonX-100溶液，振荡裂解细胞5分钟，加入10μL 20mM的L-Dopa溶液，37℃反应30分钟，于492nm处检测吸光度。结果见图4。

结论：化合物(I)处理B16细胞48小时后，显著降低了细胞内酪氨酸酶活性。在30μM浓度时，酪氨酸酶活性只有空白组的一半(p＜0.05)

实施例6：对B16黑色素瘤细胞黑色素合成的影响。

B16细胞接种于48孔板，6×10³个细胞/孔，用DMEM培养基(10％FBS，高糖)培养。第二天换上含100nM的α-MSH培养基，并加入不同浓度的化合物。48小时后，显微镜观察并拍照(见图5)。弃培养基，PBS洗两次，每孔加入200μl的1N NaOH溶液，60℃水浴30分钟，于405nm处检测吸光度。结果见图6。

结论：从图5可以看出，化合物(I)处理组的黑素颗粒明显少于空白组。而黑素含量测定(图6)显示，化合物(I)显著降低了B16细胞内黑素含量(p＜0.05)，尤其是化合物浓度为30μM时，黑素含量只有空白组的1/4。因此，式化合物(I)可以有效降低B16黑色素瘤细胞内黑素生物合成。

Claims (7)

1.一种自黑桑中提取的结构如下的化合物(I)在制备酪氨酸酶抑制剂中的应用，

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，化合物(I)在制备治疗由酪氨酸酶引起的皮肤变色的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，化合物(I)在制备抑制黑色素生物合成的化妆品中的应用。

4.根据权利要求1、2或3所述的应用，其特征在于，化合物(I)单独使用，或者与其它药学上可接受的药用辅料或其它美白剂混合使用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的美白剂选自熊果苷、L-抗坏血酸及其盐、氢醌及其盐、甘草提取物、芦荟提取物中的一种或几种。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的化合物(I)在药物或化妆品中的含量以重量百分比计为0.01～10％。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，化合物(I)在制备预防褐变的食品添加剂中的应用。

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