CN108642128A

CN108642128A - 一种平阴玫瑰细胞液的体外美白功效评价方法

Info

Publication number: CN108642128A
Application number: CN201810425933.3A
Authority: CN
Inventors: 潘仙华; 曹阳
Original assignee: Shanghai Institute of Technology
Current assignee: Shanghai Institute of Technology
Priority date: 2018-05-07
Filing date: 2018-05-07
Publication date: 2018-10-12

Abstract

一种平阴玫瑰细胞液的体外美白功效评价方法，将平阴玫瑰细胞液溶于10%FBS/无酚红DMEM中，玫瑰细胞液浓度分组，用10%FBS/无酚红DMEM培养液培养小鼠源B16F10黑色素瘤细胞，置于离心管中，接种，待细胞贴壁，清洗，之后置于冰上，清洗后每孔加入Triton X‑100裂解，将裂解完的细胞收集至冰EP管中离心，离心结束取上清转移至冰好的EP管，BCA进行蛋白定量，定量结束50μg蛋白+PBS+10μl 10mM L‑DOPA=100μl置于每孔，将孔板置于烘箱475nm下读OD值。本发明可由分光光度法检测获得的酪氨酸酶活性测定方法来验证玫瑰细胞液的美白功效检测效果。

Description

一种平阴玫瑰细胞液的体外美白功效评价方法

技术领域

本发明属于化工领域，涉及一种平阴玫瑰细胞液，具体来说是一种平阴玫瑰细胞液的美白功效评价方法。

背景技术

平阴县是国家命名的“中国玫瑰之乡”玫瑰栽培已有二千多年历史，平阴玫瑰以花大、色艳、香味浓郁、出油率高而蜚声中外。中国科学院大连物理研究所的化验数据证明平阴玫瑰所含的香叶醇、香叶酸等成分的含量数倍于保加利亚等国的玫瑰。且其他国家的玫瑰只能作化妆品，不能作食品，而平阴玫瑰不仅能作化妆品，而且能作食品、保健品。据《中药大辞典》等中国药典记载，玫瑰是药食同源的花卉。玫瑰在中药学被称为君子药，其性温和，香气甜润，具有排毒养颜、行气和血、开窍化瘀、疏肝醒脾、促进胆汁分泌、帮助消化、调节机理功效。玫瑰鲜花中有效成分最全面，但是玫瑰花在当地每年5月中旬是盛花期，整个花期不超过一个月，而玫瑰花不便于运输和储存，即使在摘花的当天早摘和晚摘的玫瑰花其香气也不相同。

人类的皮肤有不同的颜色，这主要是因为皮肤内黑色素的数量及分布情况不同所致。由于黑色素的数量、大小、类型及分布情况不同，从而决定了不同的肤色。人体皮肤的颜色主要决定于表皮内黑色素含量的多少。现在消费者对皮肤美白越来越重视，拥有健康、白皙，白净细嫩，白里透红，富有弹性的皮肤是所有人追求的目标，特别是在亚洲，美白产品是一年四季旺销护肤品类。

化妆品中的美白功能性成分(美白剂)的美白机理是：美白剂通过作用于皮肤黑色素形成或代谢途径的某个阶段，控制或抑制黑色素生成，从而实现对皮肤的美白功效。目前多数化妆品中添加的美白剂是通过抑制酪氨酸酶活性或阻断从酪氨酸生成黑色素的氧化反应，从而减少黑色素的生成而达到美白皮肤的效果。因此，该类美白剂对酪氨酸酶活性抑制率的高低成为衡量其美白功效的重要指标，抑制率越高则其美白功效越好。目前常用的美白剂功效检测方法有细胞水平功效测定法(陆晔，周名权，吕小枫等.)特殊用途化妆品的功效评价.环境与健康.2001,18(2):121–124)、动物实验法(黄畋，仲王旬. 某些化妆品致色素作用的实验研究.中华皮肤科.1996,(6):430–431)和人体实验法(Kawada A,KameyamaH,Asai M,et al.A new approach to the evaluation of whitening effect of acosmetic using computer analysis of video-captured image.J Dermatol Sci.,2002,29(1):10-18)，但大多存在操作复杂、实验技术要求高、检测周期长、精度较差等问题。目前市售常用的美白剂有熊果苷、曲酸、维生素C及其衍生物等物质。

黑色素生成途径中有3个关键的限速酶：酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸相关蛋白酶1(TYRP1)和酪氨酸相关蛋白酶2(TYRP2)。酪氨酸酶(TYR)可催化酪氨酸羟化生成多巴，之后又催化多巴氧化生成多巴醌，从而启动黑色素合成过程，所以酪氨酸酶在黑色素生成途径中具有酪氨酸羟化酶(TH)和多巴氧化酶的双重活性。多巴醌经多聚化反应与氧化反应生成多巴色素，多巴色素进一步羟化生成5,6－二羟基吲哚羧酸(DHICA)，脱羧生成5,6－二羟基吲哚 (DHI)，在酪氨酸酶氧化作用下生成5,6－吲哚醌，最后与其他中间产物结合形成真黑色素。

针对上述美白原料的特点和市场需要，要求产品具有较好美白效果，且有较低的过敏，刺激性，将受清费者青睐。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种平阴玫瑰细胞液的美白功效评价方法，所述的这种平阴玫瑰细胞液的美白功效评价方法要解决现有技术中针对玫瑰细胞液在美白功效的检测方法上存在的欠缺的技术问题。

本发明提供了一种平阴玫瑰细胞液的体外美白功效评价方法，包括如下步骤:

1)将平阴玫瑰细胞液溶于培养液中，所述的培养液为10％胎牛血清/无酚红达尔伯克改良伊格尔培养基溶液，在所述的10％胎牛血清/无酚红达尔伯克改良伊格尔培养基溶液中(其中，胎牛血清是购买自Gibico的胎牛血清，达尔伯克改良伊格尔培养基是购买自Gibico的无酚红DMEM培养基)

2)一个配制平阴玫瑰细胞液梯度浓度和阳性对照浓度的步骤，所述的梯度浓度分别为体积分数6.25％、体积分数12.5％、体积分数25％，阳性对照为曲酸，其浓度为25μg/mlKA；

3)采用10％FBS/无酚红DMEM培养液培养小鼠源B16F10黑色素瘤细胞,采用质量百分比浓度为0.25％的Trpsin-EDTA消化细胞1min，最后用10％FBS/ 无酚红DMEM培养液终止消化；

4)配制细胞浓度为9.6*10⁴cell/ml的B16F10小鼠黑色素瘤细胞，置于离心管中，以2.5ml每孔的体积接种，待24h后细胞贴壁，用PBS清洗每孔，之后加样从CO₂培养箱取出，置于冰上，用冰PBS清洗每孔2遍；

5)每孔加入250μl质量百分比浓度为1％的Triton X-100裂解，并置于振荡器上裂解30min；

6)将裂解完的细胞收集至冰EP管中，4℃，13000r离心20min，离心结束，取上清，转移至冰好的EP管；

7)BCA法进行蛋白定量，定量结束，50μg蛋白+PBS+10μl 10mM L-DOPA＝100 μl置于孔板每孔，将孔板置于37℃烘箱，15min后，475nm下读OD值。

本发明检测的原理：在黑色素生成的前两个步骤中，酪氨酸酶是主要的限速酶，其中L-酪氨酸被羟化成L-多巴(L-二羟基苯丙氨酸)，L-DOPA进一步被氧化成多巴醌，此外，微相联的转录因子都与酪氨酸酶相关。所以我们要通过检测酪氨酸酶的活性，来判断是否平阴玫瑰提取物是否具有美白功效。

本发明的突出优点在于提供了一种对天然提取物的美白功效进行检测的方法，该检测方法对天然提取物美白的检测均采用分光光度法，操作简单、快速，准确性高，试剂用量少，检测成本低，检测范围广。

本发明主要应用于天然提取物的美容功效检测领域，尤其应用于化妆品天然提取物原料的美白功效的检测。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的玫瑰细胞液的美白功效检测效果，可由分光光度法检测获得的酪氨酸酶活性测定方法来验证。本发明主要应用于天然提取物的美容功效检测领域，尤其应用于化妆品天然提取物原料的美白功效的检测。

附图说明

图1为酪氨酸酶活性测定图。

具体实施方式：

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

本发明将平阴玫瑰细胞液溶于10％FBS/无酚红DMEM培养液。

本发明所述的培养传代B16F10细胞的具体步骤为：用上述培养液传代 B16F10细胞，0.25％trpsin-EDTA消化1min，最后用10％FBS/无酚红DMEM培养液终止消化。

本发明所述的6孔板接种B16F10细胞的具体配制步骤为：

首先，配好培养液，其次，配30ml所需细胞数，每孔接种2.5ml细胞。

玫瑰细胞液美白功效检测方法的详细实施例步骤为：首先配制10％FBS/ 无酚红DMEM培养液，再分别在15ml离心管中配制不同浓度的玫瑰细胞液，计算相应的玫瑰细胞液体积和所需培养液体积，配置好体积分数分别为6.25％、 12.5％、25％的玫瑰细胞液和浓度为25μg/ml的曲酸，每个浓度梯度接种1 孔，每孔2.5ml培养液。所测结果如图1所示。

以下给出玫瑰细胞液的美白功效检测方法的实施例。

配制细胞浓度为9.6*10⁴cell/ml的B16F10小鼠黑色素瘤细胞，置于15ml 离心管，以2.5ml每孔的体积接种于6孔板。待24h后细胞贴壁，用PBS清洗每孔，之后加样，加样24h后，玫瑰细胞液美白功效测定的详细操作方法：从 CO2培养箱取出6孔板，用真空泵上的移液枪吸去6孔板中培养基，不吸尽，留些许，之后用冰PBS清洗每孔，1-2次，每孔1ml。将6孔板置于冰上，每孔 250μl冰的1％Triton X-100进行裂解，用振荡器振荡裂解30min，中途反复吹打，使之充分裂解。裂解完，用移液枪反复吹打，尽可能把细胞都刮下来，收集至冰冷的EP管中。将收集的细胞裂解液，置于4℃离心机，13000r,离心 20min。离心结束，将每个浓度的裂解液，转移至另外冰好的EP管。

BCA试剂盒进行蛋白定量，定量50μg的蛋白，575nm下测OD值。定量结束，50μg蛋白+PBS+10μl 10Mm L-DOPA＝100μl置于96孔板每孔，每个浓度梯度3个平行。将96孔板置于37℃烘箱15min后，475nm下测OD值。测得吸光度值，经计算得不同浓度的玫瑰细胞液作用于B16F10细胞的酪氨酸酶活性如下：

6.25％，12.5％，25％的玫瑰细胞液作用于B16F10细胞的酪氨酸酶活性分别为：95.3125％95.3125％92.1875％

阳性对照组，25μg/ml KA作用于B16F10细胞的酪氨酸酶活性为： 88.167939％。

Claims

1.一种平阴玫瑰细胞液的体外美白功效评价方法，其特征在于包括如下步骤:

1）将平阴玫瑰细胞液溶于培养液中，所述的培养液为10% 胎牛血清/无酚红达尔伯克改良伊格尔培养基溶液，在所述的10% 胎牛血清/无酚红达尔伯克改良伊格尔培养基溶液中，胎牛血清的质量百分比浓度为10%；

2）一个配制平阴玫瑰细胞液梯度浓度和阳性对照浓度的步骤，所述的梯度浓度分别为体积分数6.25%、体积分数12.5%、体积分数25% ，阳性对照为曲酸，其浓度为25μg/ml KA；

3）采用10% FBS/无酚红DMEM 培养液培养小鼠源B16F10黑色素瘤细胞,采用质量百分比浓度为0.25% 的Trpsin-EDTA消化细胞1min，最后用10% FBS/无酚红DMEM 培养液终止消化；

4）配制细胞浓度为9.6*10⁴cell/ml的B16F10小鼠黑色素瘤细胞，置于离心管中，以2.5ml每孔的体积接种，待24h后细胞贴壁，用PBS清洗每孔，之后加样从CO₂培养箱取出，置于冰上，用冰PBS清洗每孔2遍；

5）每孔加入250μl 质量百分比浓度为1%的Triton X-100裂解，并置于振荡器上裂解30min；

6）将裂解完的细胞收集至冰EP管中，4℃，13000r离心20min，离心结束，取上清，转移至冰好的EP管；

7）BCA法进行蛋白定量，定量结束，50μg蛋白+PBS+10μl 10mM L-DOPA=100 μl置于孔板每孔，将孔板置于37℃烘箱，15min后，475nm下读OD值。