CN101440366B - 与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段及其获得方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段，属于生物技术领域，其具有序列表中SEQ ID NO：1～4所述的DNA序列。本发明的优点是：本发明获得的SSR特异片段具有重复性好，标记稳定可靠，便于统计等优点，其特异扩增序列亦是开发其它特异标记的基础，并且在鉴别抗、感病品种时有非常高的利用价值。
Description
技术领域
本发明涉及与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段及其获得方法，属于生物技术领域。
背景技术
甜瓜为葫芦科黄瓜属(Cucumis melo L.)一年生蔓生草本植物，是一种国内外广泛栽培的重要经济作物。我国已有3000多年的甜瓜栽培历史，是世界上最早栽培甜瓜的国家之一，也是目前世界上甜瓜栽培面积最大、产量最高的国家。
白粉病是危害甜瓜生产的一种世界性病害，在许多国家和地区都有发生，严重影响甜瓜的产量和品质，甚至会造成绝产，引起了世界各国的广泛重视。白粉病主要由瓜单囊壳菌(Sphaerotheca fuliginea)和二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)引起。目前人们已较深入地对病原菌的致病性、传播途径、预防措施等进行了研究，也为寻找相关抗源基因做了大量工作，但白粉病菌的危害还是有不断发展的趋势，开展抗病品种的选育是解决这一问题的有效途径。因此，对瓜类白粉病抗病育种的研究已成为育种工作的主要目标之一。
传统育种方式费时费力，需要非常大的群体对白粉病菌的抗性进行严格筛选。利用与抗病性状紧密连锁的特异标记片段进行品种筛选，可大大缩短传统育种的研究周期，加速目标基因的转移。目前，与抗病性状紧密连锁的特异标记片段的获得主要来源于各种分子标记技术，如随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、微卫星DNA或简单重复序列(SSR)、特异序列扩增(SCAR)、单核苷酸多态性(SNP)等。其中，RAPD和AFLP标记技术检测易受环境条件的影响而造成实验结果重现性差，SCAR和SNP标记技术需要利用已知DNA序列设计特异引物进行扩增，而SSR标记技术具有重复性好，标记稳定可靠，便于统计等优点，是目前实际应用中比较稳定的标记工具，而且利用SSR标记技术获得的特异片段序列也是开发SCAR和SNP等其他分子标记的重要基础。因此，本项研究拟利用SSR标记技术寻找与甜瓜白粉病抗性基因紧密连锁的特异标记片段，这将是今后进行甜瓜白粉病抗性分子育种的基础，而由此获得的扩增序列又是开发SCAR和SNP等特异分子标记的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段，该特异片段可用于甜瓜抗白粉病分子标记辅助育种中。
本发明的另一个目的是提供这种特异片段的获得方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段，其具有序列表中SEQ ID NO：1～4所述的DNA序列。
序列表中SEQ ID NO：1为抗病特异扩增片段SSR509-172的序列；
序列表中SEQ ID NO：2为抗病特异扩增片段SSR510-98的序列；
序列表中SEQ ID NO：3为感病特异扩增片段SSR509-170的序列；
序列表中SEQ ID NO：4为感病特异扩增片段SSR510-104的序列。
一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，所述方法包括如下步骤：
(1)与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的筛选：提取基因组DNA，使用SSR引物对基因组DNA进行PCR反应，对PCR产物进行电泳分析；通过BSA法，寻找与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异SSR片段，测定连锁距离并验证连锁关系；
(2)与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异扩增序列的获得：对SSR产物进行回收、克隆和测序，获得特异片段序列。
上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，所述步骤(1)中SSR引物为SSR引物509和SSR引物510；
所述SSR引物509上游引物序列为：5’-CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3’，509下游引物序列为5’-CAAAAAGCATCAAAATGGTTG-3’。
所述SSR引物510上游引物序列为：5’-TTTCACTTTTTCCCGCCG-3’，510下游引物序列为5’-AATGGAAAAGGGAAGTGCAA-3’。
上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，其中，所述步骤(1)中的提取基因组DNA是指将1.5克叶片在液氮中研磨成粉末，加入9ml 2％CTAB提取液，混匀65℃水浴1小时；从水浴中取出离心管，加1/3体积5M醋酸钾，混匀冰浴20分钟；加入等体积氯仿/异戊醇抽提两次；取上清加入2/3体积异丙醇沉淀DNA；洗涤缓冲液洗涤一次，吹干，加TE缓冲液溶解；加入RNase A使其终浓度达100μg/ml，混匀37℃水浴1小时；用等体积氯仿/异戊醇抽提；取上清，加入1/2体积7.5M醋酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀DNA；70％乙醇洗涤沉淀，吹干，加适量ddH2O溶解DNA。
上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，其中，所述步骤(1)中的PCR反应条件是：25μl的反应体系中含有2.5μl 10×buffer，2.0μl 25mM MgCl2，2.0μl 2.5mM dNTP，1U TaqDNA聚合酶，30ng SSR引物，50ng模板DNA；反应程序为，94℃预变性5min，然后94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 2min下循环35次，72℃延伸7min后保存在4℃条件下。
上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，其中，所述步骤(2)中的SSR产物的回收、克隆和测序是指用Gene-Clean试剂盒纯化回收已证明是连锁的SSR特异片段，然后连接到pGEM@-T Vector Easy载体上，将重组质粒DNA用EcoRI进行酶切处理，用SSR-PCR验证扩增产物，观察扩增出的片段是否与原来的目的片段和酶切片段一致，并测序。
本发明应用简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)技术，在甜瓜重组自交系(Recombinant Inbred Line，RIL)群体中采用混合分组分析法(Bulked Segregating Analysis，BSA)筛选了与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的SSR特异片段，并将SSR特异片段克隆测序获得了特异扩增序列。
本发明的优点是：本发明获得的SSR特异片段具有重复性好，标记稳定可靠，便于统计等优点，其特异扩增序列亦是开发其它特异标记的基础。
下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。
附图说明
图1为引物SSR509和510对抗感亲本、F1、抗感池DNA扩增结果图；
图2为引物SSR509对重组自交系群体的PCR扩增结果图；
图3为引物SSR510对重组自交系群体的PCR扩增结果图；
图4为引物SSR509对甜瓜种质资源的PCR扩增结果图；
图5为引物SSR510对甜瓜种质资源的PCR扩增结果图。
具体实施方式
实施例 与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段及其扩增序列的获得
一、材料和方法：
1.1材料
供试材料亲本为日本类型甜瓜材料K7-1和典型的新疆哈密瓜株系K7-2。两材料均由新疆农科院吴明珠院士提供。父本K7-1为日本高抗白粉病材料，母本K7-2高感白粉病，为典型的新疆哈密瓜，果实糖度高，肉质脆，货架期长，有特殊的芳香味。以二者为亲本进行杂交，从它们的杂交后代F2材料中随机抽样自交，通过单粒传获得F8重组自交系构成RIL群体，共106个株系，用于特异片段及序列研究。
为进一步验证获得的标记，还采用了本实验室特有的120份优良甜瓜种质资源，其中13份抗病种质资源，107份感病种质资源。
1.2研究方法
1.2.1基因组DNA的提取
参照Murry等(1980)的方法(Murray M，Thompson W F.Rapidisolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res，1980，8：668-673.)加以改进后进行DNA提取。
将1.5克叶片在液氮中研磨成粉末，加入9ml 2％CTAB提取液(2％CTAB，1.4mM NaCl，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1％PVP-40，0.2％β-巯基乙醇)，混匀65℃水浴1小时；从水浴中取出离心管，加1/3体积5M醋酸钾，混匀，冰浴20分钟；加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)抽提两次；取上清加入2/3体积异丙醇沉淀DNA；洗涤缓冲液(76％乙醇，10mM乙酸铵)洗涤一次，吹干，加TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.4)溶解；加入RNase A使其终浓度达100μg/ml，混匀37℃水浴1小时；用等体积氯仿/异戊醇(24∶1)抽提；取上清，加入1/2体积7.5M醋酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀DNA；70％乙醇洗涤沉淀，吹干，加适量ddH2O溶解DNA。
DNA浓度用紫外分光光度计(Shimadzu UV-1201，日本)以OD260值测定，并用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。
1.2.2 PCR扩增与产物的检测
25μl的反应体系中含有2.5μl 10×buffer，2.0μl 25mM MgCl2，2.0μl 2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，30ng引物，50ng模板DNA。Taq DNA聚合酶及反应缓冲液购自TaKaRa公司。dNTP购自上海Sangon公司。SSR引物由北京奥科生物公司合成。
反应程序为，94℃预变性5min，然后94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 2min下循环35次，72℃延伸7min后保存在4℃条件下。PCR仪为美国Biorad公司制造的PTC-100。
取扩增产物与载样缓冲液(98％甲酰胺，10mM EDTA，0.25％溴酚兰，0.25％二甲苯青)各5μl混合，94℃变性5min，立即置于冰上冷却。每个样品取5μl上样，采用6％聚丙烯酰胺凝胶、75W恒功率电泳分离，至二甲苯青指示剂跑到胶的2/3处结束电泳。银染显现结果并分析。
1.2.3 特异扩增PCR产物与白粉病抗性基因的连锁关系
银染显现PCR扩增产物后，对电泳谱带进行分析。来自父本K7-1的纯合带型记为“a”，来自母本K7-2的纯合带型记为“b”，模糊不清或者丢失的带记为“-”。 利用Joinmap3.0软件分析特异扩增PCR产物与白粉病抗性基因的连锁关系。
1.2.4 特异扩增序列的获得
确定PCR扩增产物与白粉病抗性基因存在紧密连锁关系后，用ddH2O将胶板冲洗干净，用刀片切取差异条带，浸泡在高盐缓冲液中(20％乙醇，1M LiCl，10mM Tris)24h，然后氯仿抽提，乙醇沉淀后吹干，溶于ddH2O中，取5μl用作模板在与选择性扩增相同的PCR条件下重新扩增。产物在1.5％的琼脂糖上检测，如果确定为目标带，采用博奥生物公司的凝胶回收纯化试剂盒Gene-Clean对目的片段进行纯化。PCR产物与载体的连接采用Promega公司的PGEM-T easy Vector系统。参照《分子克隆实验指南》中的方法进行重组质粒的转化与筛选。利用天根生物公司的质粒小提试剂盒提取重组质粒，采用酶切方法与PCR法对其进行检测。将经过PCR和酶切检测为阳性克隆的质粒送于北京奥科生物公司进行测序并提供结果。
1.2.5 父本、母本、F1和重组自交系苗期抗病接种鉴定
1.2.5.1 白粉病菌源及接种菌源制备
从国家蔬菜工程技术研究中心四季青农场收集南瓜上的白粉病菌，采用孢子悬浮液喷雾法接种于西葫芦幼苗上纯化繁殖后，用于白粉病的接种鉴定。
用毛笔刷取西葫芦病叶叶片上的孢子置于无菌水的烧杯中，搅拌均匀配制孢子悬浮液，血球计数板计数分生孢子数。接种浓度为2.0×105个孢子/mL。
1.2.5.2 苗期抗病接种鉴定
父本、母本、F1和重组自交系F8的106个株系，各取20粒种子，设2次重复，1次重复10株苗。种子用纱布包好，55℃温汤浸种消毒后，再浸泡4h，置于28℃恒温培养箱中催芽18小时，播于装有灭菌营养土的72孔穴盘中，生长于空调温室内，昼/夜温度为25～28℃/18～20℃。子叶展平后，采用孢子粉喷雾法接种S.fuliginea小种2F，接种12至15天充分发病后开始调查抗感反应。
1.2.5.3 苗期抗病接种鉴定的分级标准
共分6级。0级：整株没有任何病斑；l级：仅子叶有很少量病斑；2级：仅子叶有较多病斑或子叶有病斑，茎上有很少量病斑；3级：子叶有很多病斑，茎上有少量病斑；4级：子叶和茎上布满病斑；5级：植株死亡。
1.2.5.4 父本、母本、F1和重组自交系苗期抗感表现型的确定标准
根据病情指数DI确定父本、母本、F1和重组自交系的抗感表现型。
病情指数DI＝(∑级别×株数)×100/(总株数×6)。
病情指数大于40定为感病，小于40定为抗病。
二、结果与分析
2.1 甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F遗传规律分析
对抗病亲本K7-1、感病亲本K7-2、F1、重组自交系F8的106个株系进行苗期抗病接种鉴定，按照白粉病病情分级标准调查每个株系的发病率并计算病情指数。结果表明，K7-1、K7-2和F1的病情指数分别是0.00、93.03和3.44，分别表现为抗病、感病、抗病，说明甜瓜K7-1对白粉病S.fuliginea生理小种2F的抗性是由显性基因控制。而重组自交系的抗病鉴定结果表明106个株系有58个抗病株系和48个感病株系，分离比符合1∶1的理论比例，卡平方检验x2＝0.94＜α2 0.05，1＝3.84，表明甜瓜K7-1对白粉病S.fuliginea生理小种2F的抗性为一对基因控制。综合双亲、F1和重组自交系的106个株系的苗期抗病鉴定结果，甜瓜K7-1对白粉病S.fuliginea生理小种2F的抗性受一对显性基因Pm-2F控制。
2.2与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段
采用集团混合分析法获得与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段。
根据重组自交系苗期抗病鉴定结果，各取5份纯合的抗感株系DNA混合构建抗感基因池。以抗病亲本K7-1、感病亲本K7-2、F1和抗感基因池为模板，对660对SSR引物组合进行PCR扩增，筛选出能在双亲和抗感基因池之间产生明显差异条带的引物组合。660对SSR引物序列来自于目前已经发表的论文(Danin-Poleg-2001，Genzalo et al.2005，Joobeur T etal，2004，Fazio et al.2002)和根据互连网中甜瓜EST信息库(http://melon.bti.cornell.edu)自行设计。
集团混合分析结果显示，660对SSR引物中只有引物SSR509和SSR510的抗感亲本扩增条带与抗感池的扩增谱带一致，如图1所示，图1为引物SSR509和SSR510对抗感亲本、F1、抗感池的PCR扩增结果。(M.30-330bpmarker；1，6.K7-2；2，7.K7-1；3，8.F1；4，9.抗病基因池；5，10.感病基因池)
所述SSR引物509上游引物序列为：5’-CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3’，509下游引物序列为5’-CAAAAAGCATCAAAATGGTTG-3’。
所述SSR引物510上游引物序列为：5’-TTTCACTTTTTCCCGCCG-3’，510下游引物序列为5’-AATGGAAAAGGGAAGTGCAA-3’。
将抗病亲本K7-1利用引物SSR509和SSR510进行PCR扩增获得的抗病特异扩增片段分别定名为SSR509-172和SSR510-98。将感病亲本K7-2利用引物SSR509和SSR510进行PCR扩增获得的感病特异扩增片段分别定名为SSR509-170和SSR510-104。
利用引物SSR509和SSR510分别对106个重组自交系的株系进行PCR扩增。
引物SSR509的PCR扩增中，如图2所示，图2为引物SSR509对重组自交系群体的PCR扩增结果图(1：K7-1；2：K7-2；3-57：RIL株系)。58个抗病株系中有56个株系只扩增出SSR509-172抗病特异片段，2个抗病株系同时扩增出SSR509-172抗病特异片段和SSR509-170感病特异片段，F7和F8两代苗期抗病接种鉴定结果显示这2个抗病株系为杂合株系，因此PCR扩增结果与田间抗病鉴定结果一致。48个感病株系中有47个株系只扩增出SSR509-170感病特异片段，1个株系扩增出SSR509-172抗病特异片段，即106个重组自交系株系中只有1个交换株系。经Joinmap3.0软件分析，抗病特异片段SSR509-172与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F的连锁距离为1cm，呈现紧密连锁关系。
引物SSR510扩增中，如图3所示，图3引物SSR510对重组自交系群体的PCR扩增结果图(1：K7-1；2：K7-2；3-50：RIL株系；)。58个抗病株系中有55个株系只扩增出SSR510-98抗病特异片段，2个抗病株系同时扩增出SSR510-98抗病特异片段和SSR510-104感病特异片段，F7和F8两代苗期抗病接种鉴定结果显示这2个抗病株系为杂合株系，1个抗病株系只扩增出SSR510-104感病特异片段，表明该抗病株系为交换株系。48个感病株系中有47个株系只扩增出SSR510-104感病特异片段，1个感病株系扩增出SSR510-98抗病特异片段，说明此感病株系也为交换株系。因此，106个重组自交系株系中共有2个交换株系。经Joinmap3.0软件分析，抗病特异片段SSR510-98与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F的连锁距离为3cM，呈现紧密连锁关系。
为进一步确认抗病特异片段SSR509-172、SSR510-98与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F的连锁关系，利用本实验室的120份优良甜瓜种质资源材料进行验证。田间抗病鉴定结果显示120份甜瓜种质资源材料中有13个抗病品种和107个感病品种。
SSR509的PCR扩增结果显示，如图4所示，图4为引物SSR 509对甜瓜种质资源的PCR扩增结果图；13个抗病品种中有4个品种扩增出SSR509-172抗病特异片段，其余品种扩增出的谱带在另一位置；107个感病品种中有101个扩增出SSR509-170感病特异片段，与田间抗病鉴定结果吻合率为87.5％。
SSR510扩增结果显示，如图5所示，图5为引物SSR 510对甜瓜种质资源的PCR扩增结果图；13个抗病品种中有4个品种扩增出SSR510-98抗病特异片段，107个感病品种中有83个扩增出SSR510-104感病特异片段，与田间调查结果的吻合率达到72.5％。
上述PCR扩增结果进一步证实了抗病特异片段SSR509-172和SSR510-98、感病特异片段SSR509-170和SSR510-104与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F的紧密连锁关系，准确性高，说明上述标记片段在鉴别抗、感病品种时有非常高的利用价值。
2.4特异片段的测序结果
将抗病特异扩增片段SSR509-172和SSR510-98和感病特异扩增片段SSR509-170和SSR510-104进行测序。4个测序片段的两端分别有引物SSR509和SSR510的上下游结合位点，且片段的大小与依分子量标准估计的基本吻合，证实了测序片段的正确性。利用SSR引物509扩增得到的抗、感特异片段长度分别为172bp和170bp，只有2个碱基“CT”的插入。利用SSR引物510扩增得到的抗、感特异片段长度分别为98bp和102bp，只有4个碱基“CTCT”的缺失。
序列表
<110>北京市农林科学院
<120>与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段及其获得方法
<130>
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>172
<212>DNA
<213>葫芦科黄瓜属(Cucumis melo L.)
<400>1
ctggccccct cctaaactaa acacagacgt ctcagaactg cacgactttc gtgcaaaggc 60
tttcagcttg ctctctattg ctggggtctc tggcttctgc caggttctct ctctctctct 120
ctctctctct ctctctctta aaagttaaaa tcaaccattt tgatgctttt tg 172
<210>2
<211>98
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tttcactttt tcccgccgca ctttccctct ctctctctct ctctttctct ttctctctct 60
ctctcactct tcatgccctt gcacttccct tttccatt 98
<210>3
<211>170
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ctggccccct cctaaactaa acacagacgt ctcagaactg cacgactttc gtgcaaaggc 60
tttcagcttg ctctctattg ctggggtctc tggcttctgc caggttctct ctctctctct 120
ctctctctct ctctcttaaa agttaaaatc aaccattttg atgctttttg 170
<210>4
<211>104
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
tttcactttt tcccgccgca ctttccctct ctctctctct ctctctcttt ctctttctct 60
ctctctctca ctcttcatgc ccttgcactt cccttttcca tt 102
Claims (5)
1.一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段，其特征在于，其如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID No.3所示。
2.一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的筛选：提取基因组DNA，使用SSR引物对基因组DNA进行PCR反应，对PCR产物进行电泳分析；通过BSA法，寻找与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异SSR片段，测定连锁距离并验证连锁关系；
(2)与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异扩增序列的获得：对SSR产物进行回收、克隆和测序，获得特异片段序列。
所述步骤(1)中SSR引物为SSR引物509；
所述SSR引物509上游引物序列为：5’-CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3’，509下游引物序列为5’-CAAAAAGCATCAAAATGGTTG-3’。
3.根据权利要求2所述的一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，其特征在于，所述步骤(1)中的提取基因组DNA是指将1.5克叶片在液氮中研磨成粉末，加入9ml 2％CTAB提取液，混匀65℃水浴1小时；从水浴中取出离心管，加1/3体积5M醋酸钾，混匀冰浴20分钟；加入等体积氯仿/异戊醇抽提两次；取上清加入2/3体积异丙醇沉淀DNA；洗涤缓冲液洗涤一次，吹干，加TE缓冲液溶解；加入RNaseA使其终浓度达100μg/ml，混匀37℃水浴1小时；用等体积氯仿/异戊醇抽提；取上清，加入1/2体积7.5M醋酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀DNA；70％乙醇洗涤沉淀，吹干，加适量ddH2O溶解DNA。
4.根据权利要求2所述的一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，其特征在于，所述步骤(1)中的PCR反应条件是：25μl的反应体系中含有2.5μl 10×buffer，2.0μl 25mM MgCl2，2.0μl 2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，30ng SSR引物，50ng模板DNA；反应程序为，94℃预变性5min，然后94℃ 1min，52℃ 1min，72℃2min下循环35次，72℃延伸7min后保存在4℃条件下。
5.根据权利要求2所述的一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，其特征在于，所述步骤(2)中的SSR产物的回收、克隆和测序是指用Gene-Clean试剂盒纯化回收已证明是连锁的SSR特异片段，然后连接到pGEM@-T Vector Easy载体上，将重组质粒DNA用EcoRI进行酶切处理，用SSR-PCR验证扩增产物，观察扩增出的片段是否与原来的目的片段和酶切片段一致，并测序。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: BEIJING JINGYU WEI'ER AGRICULTURAL TECHNOLOGY CO., |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
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Effective date of registration: 20110420 Address after: 100097 Beijing Academy of agricultural and Forestry Sciences in Beijing Co-patentee after: Beijing Jing Jing Weier agricultural science and Technology Co.,Ltd. Patentee after: BEIJING ACADEMY OF AGRICULTURE AND FORESTRY SCIENCES Address before: 100097 Beijing Academy of agricultural and Forestry Sciences in Beijing Patentee before: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210425 Address after: No.1 research and development center of national modern vegetable seed industry innovation and entrepreneurship base, Yongtai Road, Yaoshui street, Luocheng street, Shouguang City, Weifang City, Shandong Province Patentee after: Jingyanyinong Seed Industry Research Institute (Shouguang) Co.,Ltd. Address before: 100097 Beijing Academy of agricultural and Forestry Sciences in Beijing Patentee before: BEIJING ACADEMY OF AGRICULTURE AND FORESTRY SCIENCES Patentee before: Beijing Jing Jing Weier agricultural science and Technology Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230531 Address after: 100097 Room 101, 1st floor, building 33, Banjing Village Vegetable Research Center, Zizhuyuan street, Haidian District, Beijing Patentee after: JINGYAN YINONG (BEIJING) SEED SCI-TECH CO.,LTD. Address before: No. 1 Research and Development Center of National Modern Vegetable Seed Industry Innovation and Entrepreneurship Base, Yongtai Road, Yaoshui Street, Luocheng Street, Shouguang City, Weifang City, Shandong Province, 262700 Patentee before: Jingyanyinong Seed Industry Research Institute (Shouguang) Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right |