CN101434647A - 由HLA-A2402-限制的Ep-CAM-特异的CTL识别的表位/肽及其应用 - Google Patents

由HLA-A2402-限制的Ep-CAM-特异的CTL识别的表位/肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及“由HLA－A2402－限制的Ep－CAM－特异的CTL识别的表位/肽及其应用”，公开了基本上由SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列组成的肽；以及基本上由通过添加，缺失或替换一个或多个氨基酸而衍生自SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列的氨基酸序列组成的突变肽，所述肽能够与HLA－A2402分子形成复合体而被HLA－A2402－限制的胞毒T淋巴细胞识别或诱导这种淋巴细胞。这样的肽可用作具有HLA－A2402的上皮癌患者的癌症疫苗。

Description

由HLA-A2402-限制的Ep-CAM-特异的CTL识别的表位/肽及其应用
本申请为国际申请日2005年1月19日、国际申请号PCT/JP2005/000587于2006年7月20日进入中国国家阶段、申请号200580002807.8、发明名称“由HLA-A2402-限制的Ep-CAM-特异的CTL识别的表位/肽及其应用”的分案申请。
技术领域
本发明涉及由HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴细胞识别的表位肽，抗原呈递细胞和主要组织相容性抗原复合体；含有这些物质作为活性成分的癌症疫苗或胞毒T淋巴细胞诱导剂；含有此种胞毒T淋巴细胞诱导剂作为活性成分的表皮癌的被动免疫治疗药物；利用上述物质的癌症治疗或改善方法；以及特异于癌症的HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴细胞的定量方法。
背景技术
胞毒T淋巴细胞(下文称为“CTL”)被认为是抵抗癌症的重要因子。
在癌症患者的肿瘤部位可观察到针对肿瘤细胞显示胞毒性的CTL渗入。肿瘤抗原为被这种肿瘤特异的CTL靶向的分子，在细胞中分解成含有8-11个氨基酸的肽(肿瘤表位肽)，结合到人白细胞抗原(下文称为“HLA”，为一种主要组织相容性抗原)，然后呈递在肿瘤细胞表面。CTL识别含有HLA和肿瘤抗原肽的复合体，并攻击肿瘤细胞。由此，CTL通过肿瘤抗原的HLA限制识别肿瘤细胞。
HLA为在几乎所有细胞上表达的细胞膜抗原，并被主要分成I型抗原和II型抗原。与表位肽一起被CTL识别的HLA划分为I型抗原。HLA I型抗原进一步被分成HLA-A，HLA-B，HLA-C等，而且它们的基因还具有亚型。例如，HLA-A是多态性的，并具有A1，A2，A24，A26等亚型。因此，各个人个体的HLA不总是相同，CTL在识别HLAI型抗原和肿瘤表位肽的复合体时甚至可识别这些HLA亚型。进一步，能够结合到HLA的表位肽已知具有能够结合到各型HLA之一的肽序列基元(模式序列)。因此，对诱导和/活化CTL而言，选择含有能够结合到每个患者不同型HLA的基元的肽是必要的。
Ep-CAM是在上皮起源的癌细胞表面上广泛表达的分子，并担当非钙依赖性细胞—细胞附着的中间物。Ep-CAM也称作EGP-2，17-1A，GA733-2或KSA。Ep-CAM在衍生自诸如大肠，肺，头和颈，乳腺等不同组织起源的许多肿瘤中是高度表达的，而其表达在正常上皮细胞中是区域性的。进一步，由于肿瘤发展和Ep-CAM表达水平相关，因此Ep-CAM表达的检测作为标记诊断最低存在的肿瘤转移和在预测患者预后中是有用的。
Ep-CAM在源自上皮细胞的癌细胞中广泛表达，但在正常细胞中局部表达。鉴于此，Ep-CAM是利用单克隆抗体进行免疫治疗和基因治疗中的重要靶。
例如，有报道，给其肿瘤已通过手术摘除的患者施用Ep-CAM-特异的鼠单克隆抗体(命名为17-1A)可有效预防远距离转移，以及连续7年给药对提高生存率是有效的。还有报道，命名为17-1A的Ep-CAM-特异的单克隆抗体在用于治疗大肠癌患者时对减少死亡率和肿瘤复发是有效的。
此外，最近的一些报道公开的事实显示利用CTL靶向HLA-限制的Ep-CAM治疗癌症的可能性。
例如，专利文献1报道，HLA-A0201-限制的Ep-CAM-特异性CTL破坏上皮肿瘤细胞，但不影响正常细胞。专利文献1中公开的肽由SEQID NO：12所示的序列YQLDPKFITSI组成，作为被HLA-A0201-限制的CTL识别的Ep-CAM 174-184表位肽。
T-细胞对Ep-CAM的反应还在没有接受免疫治疗的结肠和大肠癌患者中观察到。另外，在大肠癌患者免疫以Ep-CAM表达的重组金丝雀痘病毒时，抗Ep-CAM-特异性CTL反应的获得不会引起自身免疫反应。
在HLA I型抗原的HLA-A型中，日本人的HLA-A24表达最多。结果，HLA-A24-限制的Ep-CAM表位肽推测是理想的癌症疫苗。有关这种表位肽的报道例子如下。
专利文献2公开5种表位肽，由含有9个氨基酸残基的氨基酸序列组成，来自SART-2肿瘤抗原蛋白，作为HLA-A2402-限制的CTL表位肽。
专利文献3公开6种表位肽，由含有8-11个氨基酸残基的氨基酸序列组成，来自ART-4肿瘤抗原蛋白，作为HLA-A2402-限制的CTL表位肽。
专利文献4公开7种表位肽，由含有8-11个氨基酸残基的氨基酸序列组成，来自在大肠癌细胞和小细胞肺癌细胞中异常表达的p56luk蛋白(由luk基因编码的肿瘤抗原蛋白)，作为获自从食道癌患者建立的细胞系的HLA-A2402-限制的CTL表位肽。
专利文献5公开4种PI-9-衍生的表位肽，由含有9-10个氨基酸残基的氨基酸序列组成，获自KE4肿瘤细胞系—衍生的cDNA文库，作为获自从食道癌患者建立的细胞系的HLA-A2402-限制的CTL表位肽。
专利文献6公开17种PI-9-衍生的表位肽，由含有9-10个氨基酸残基的氨基酸序列组成，获自11-18肺腺癌细胞系cDNA文库，作为获自从肺癌患者建立的细胞系的HLA-A2402-限制的CTL表位肽。
专利文献7公开由9-10个氨基酸残基组成的表位肽，具有能够结合到HLA-A24.1的基元(HLA-A2402)，并在N-端具有第一保守残基Y，F或W，以及在C-端具有第二保守残基F，I，W或M，其中第一和第二保守残基由6-7个残基分开。
如上所例证，肿瘤相关抗原中的不同HLA-A2402-限制的CTL表位已被鉴定；然而肿瘤抗原的表达依据组织起源，个体癌症患者和各患者损伤而变化，因此其他新表位预计被指定。
此外，由于通过能够结合到HLA-A2402分子的Ep-CAM表位肽衍生CTL尚未确认，因此对开发能够结合到HLA-A2402分子及能够诱导CTL的新型癌细胞-特异的Ep-CAM表位肽存在需求。
专利文献1：
国际专利公布No.WO 97/15597
专利文献2：
未审日本专利申请公布No.1999-318455
专利文献3：
未审日本专利申请公布No.2000-116383
专利文献4：
国际专利公布No.WO2000-06595
专利文献5：
未审日本专利申请公布No.2001-245675
专利文献6：
未审日本专利申请公布No.2003-270
专利文献7：
未审日本专利申请公布No.1996-500103(权利要求11等)
发明内容
发明解决的问题
本发明目的是提供能够诱导HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴细胞的Ep-CAM表位肽，抗原呈递细胞和主要组织相容性抗原复合体；含有这些物质作为活性成分的癌症疫苗或胞毒T淋巴细胞诱导剂；Ep-CAM-特异性HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴细胞；含有此种淋巴细胞的被动免疫治疗药物；利用上述物质的癌症治疗或改善方法；以及上皮癌特异的HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴细胞的定量方法。
解决问题的方法
为了实现上述目的，本发明人通过生物信息学途径在Ep-CAM蛋白中预测和合成了7种肽序列，找到了具有结合到HLA-A2402分子能力的表位肽序列，HLA-A2402分子在日本人中是最常见的HLA-A类型(60％以上)，以及在欧洲人中约20％。
当通过生物学信息途径预测能够结合到特异性HLA分子的肽时，由这种预测的肽诱导的胞毒T淋巴细胞实际上通常不识别含有这种肽的抗原。
在此情形下，本发明人发现，特异于7种预测的表位肽中的2种的CTL克隆真正对HLA-A2402阳性Ep-CAM表达癌细胞显示胞毒性，但对HLA-A2402阴性癌细胞不显示胞毒性。
而且，冷靶抑制分析证明，这些表位肽被加工，并作为抗原呈递在HLA-A2402阳性Ep-CAM阳性癌细胞上。
结果，这两种肽可用作具有HLA-A2402人的癌症疫苗。
本发明基于上述发现而完成，并提供下列表位肽等。
第1项.下列(1)-(4)任一项的肽：
(1)基本上由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的肽；
(2)基本上由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的肽；
(3)基本上由通过添加，缺失或替换一个或多个氨基酸而衍生自SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的氨基酸序列组成的突变肽，所述肽能够与HLA-A2402分子形成复合体而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴细胞识别或诱导这种淋巴细胞；
(4)基本上由通过添加，缺失或替换一个或多个氨基酸而衍生自SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的氨基酸序列组成的突变肽，所述肽能够与HLA-A2402分子形成复合体而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴细胞识别或诱导这种淋巴细胞。
第2项.下列(1)或(2)的肽：
(1)基本上由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列组成的肽；
(2)基本上由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成的肽。
第3项.包含第1或2项的肽作为活性成分的癌症疫苗。
第4项.第3项的癌症疫苗，其中癌症为上皮癌。
第5项.第3或4项的癌症疫苗，其中癌症选自大肠癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宫癌，前列腺癌，和胆囊癌。
第6项.第3-5任一项的癌症疫苗，其用于治疗具有HLA-A2402作为白细胞抗原的人。
第7项.包含第1或2项的肽作为活性成分的胞毒T淋巴细胞诱导剂。
第8项.第7项的胞毒T淋巴细胞诱导剂，其用于治疗具有HLA-A2402作为白细胞抗原的人。
第9项.下列(5)-(8)任一项的多核苷酸：
(5)基本上由SEQ ID NO：10所示碱基序列组成的多核苷酸；
(6)基本上由SEQ ID NO：11所示碱基序列组成的多核苷酸；
(7)在严格条件下与由SEQ ID NO：10所示碱基序列组成的多核苷酸杂交的突变多核苷酸，其编码的肽能够与HLA-A2402分子形成复合体而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴细胞识别或诱导这种淋巴细胞；
(8)在严格条件下与由SEQ ID NO：11所示碱基序列组成的多核苷酸杂交的突变多核苷酸，其编码的肽能够与HLA-A2402分子形成复合体而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴细胞识别或诱导这种淋巴细胞。
第10项.上皮癌的基因治疗药物，包含第9项的多核苷酸作为活性成分。
第11项.重组载体，包含第9项的多核苷酸。
第12项.转化体，其中导入第11项的重组载体。
第13项.第1或2项的肽的制备方法，包括培育第12项的转化体，以及从培养物中收集第1或2项的肽的步骤。
第14项.抗原呈递细胞，其脉冲以第1或2项的肽。
第15项.癌症疫苗，包含第14项的抗原呈递细胞作为活性成分。
第16项.第15项的癌症疫苗，其中癌症为上皮癌。
第17项.第15或16项的癌症疫苗，其中癌症选自大肠癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宫癌，前列腺癌，和胆囊癌。
第18项.第15-17任一项的癌症疫苗，其用于治疗具有HLA-A2402作为白细胞抗原的人。
第19项.胞毒T淋巴细胞诱导剂，包括第14项的抗原呈递细胞作为活性成分。
第20项.第19项的胞毒T淋巴细胞诱导剂，其用于治疗具有HLA-A2402作为白细胞抗原的人。
第21项.主要组织相容性抗原复合体，包含主要组织相容性抗原，和第1或2项的肽，或者存在于第14项的抗原呈递细胞上的肿瘤抗原表位肽。
第22项.第21项的主要组织相容性抗原复合体，包括HLA-A2402分子，β2-微球蛋白，和第1或2项的肽，或者存在于第14项的抗原呈递细胞上的肿瘤抗原表位肽。
第23项.癌症疫苗，包括第21或22项的主要组织相容性抗原复合体作为活性成分。
第24项.第23项的癌症疫苗，其中癌症为上皮癌。
第25项.第23或24项的癌症疫苗，其中癌症选自大肠癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宫癌，前列腺癌，和胆囊癌。
第26项.第23-25任一项的癌症疫苗，其用于治疗具有HLA-A2402作为白细胞抗原的人。
第27项.胞毒T淋巴细胞诱导剂，包括第21或22项的主要组织相容性抗原复合体作为活性成分。
第28项.第27项的胞毒T淋巴细胞诱导剂，其用于治疗具有HLA-A2402作为白细胞抗原的人。
第29项.主要组织相容性抗原复合体四聚体，包括主要组织相容性抗原，和第1或2项的肽，或者存在于第14项的抗原呈递细胞上的肿瘤抗原表位肽。
第30项.利用一种或多种下列(a)-(d)物质，通过刺激外周血淋巴细胞获得的胞毒T淋巴细胞：
(a)第1或2项的肽；
(b)第14项的抗原呈递细胞；
(c)第21或22项的主要组织相容性抗原复合体；
(d)第29项的主要组织相容性抗原复合体四聚体。
第31项.第30项的胞毒T淋巴细胞，其是通过下列步骤获得的：利用第30项限定的一种或多种(a)-(d)物质，通过刺激外周血淋巴细胞，在主要组织相容性抗原复合体和/或其四聚体与胞毒T淋巴细胞之间形成复合体，并从复合体中分离胞毒T淋巴细胞。
第32项.被动免疫治疗药物，包括第30或31项的胞毒T淋巴细胞作为活性成分。
第33项.第32项的被动免疫治疗药物，其中癌症为上皮癌。
第34项.第32或33项的被动免疫治疗药物，其中癌症选自大肠癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宫癌，前列腺癌，和胆囊癌。
第35项.第32-34任一项的被动免疫治疗药物，其用于治疗具有HLA-A2402作为白细胞抗原的人。
第36项.定量外周血中HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴细胞的方法，其包括下列步骤：
使一种或多种下列(a)-(d)物质作用于外周血：
(a)第1或2项的肽；
(b)第14项的抗原呈递细胞；
(c)第21或22项的主要组织相容性抗原复合体；
(d)第29项的主要组织相容性抗原复合体四聚体，以及
定量外周血中的胞毒T淋巴细胞或者由这样的胞毒淋巴细胞产生的细胞因子。
第37项.癌症治疗和/或改善方法，包括给具有HLA-A2402作为白细胞抗原的人施用一种或多种下列(a)-(d)物质：
(a)第1或2项的肽；
(b)第14项的抗原呈递细胞；
(c)第21或22项的主要组织相容性抗原复合体；
(d)第29项的主要组织相容性抗原复合体四聚体。
第38项.癌症治疗和/或改善方法，包括下列步骤：
从具有HLA-A2402作为白细胞抗原的人患者的外周血中收集单核细胞部分，
采用一种或多种下列(a)-(d)物质培养单核细胞部分：
(a)第1或2项的肽；
(b)第14项的抗原呈递细胞；
(c)第21或22项的主要组织相容性抗原复合体；
(d)第29项的主要组织相容性抗原复合体四聚体，以及
将其中胞毒T淋巴细胞被诱导和/或激活的单核细胞部分返回至患者血液。
第39项.诱导胞毒T淋巴细胞的方法，包括给具有HLA-A2402作为白细胞抗原的人施用一种或多种下列(a)-(d)物质：
(a)第1或2项的肽；
(b)第14项的抗原呈递细胞；
(c)第21或22项的主要组织相容性抗原复合体；
(d)第29项的主要组织相容性抗原复合体四聚体。
第40项.癌症治疗或改善方法，包括给具有HLA-A2402作为白细胞抗原的人施用第30或31项的胞毒T淋巴细胞。
第41项.第21项的主要组织相容性抗原复合体四聚体，其中四聚体为包括HLA-A2402分子，β2-微球蛋白，和第1或2项的肽，或者存在于第14项的抗原呈递细胞上的肿瘤抗原表位肽的复合体。
第42项.癌症疫苗，包括第41项的主要组织相容性抗原复合体四聚体作为活性成分。
第43项.第42项的癌症疫苗，其中癌症为上皮癌。
第44项.第42或43项的癌症疫苗，其中癌症选自大肠癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宫癌，前列腺癌，和胆囊癌。
第45项.第42-44任一项的癌症疫苗，其用于治疗具有HLA-A2402作为白细胞抗原的人。
第46项.胞毒T淋巴细胞诱导剂，包括第41项的主要组织相容性抗原复合体四聚体。
第47项.第46项的胞毒T淋巴细胞诱导剂，其用于治疗具有HLA-A2402作为白细胞抗原的人。
发明效果
本发明提供的表位肽衍生自在上皮癌细胞上广泛表达的Ep-CAM分子，并可被限制至HLA-A2402的胞毒T淋巴细胞识别，HLA-A2402为日本人中最常见的人白细胞抗原类型。结果，这种表位肽可用作癌症疫苗来治疗分布广泛的HLA-A2402-阳性人上皮癌。
附图简述
图1示出多克隆肽激活的CTL细胞系的ELISOT分析评估结果。
图2示出Ep-CAM肽特异的多克隆(A)和单克隆(B)CTL的四聚体染色结果。
图3示出Ep173-特异性-CTL-克隆特征。
图3A示出51Cr释放分析，表明在肽Ep173或对照肽EBV-LMP419存在下C27(Ep173-特异的CTL克隆)针对T2-A24的胞毒性。
图3B示出抗-HLA-A24单克隆抗体对Ep173-特异的CTL克隆(C27)针对HLA-A2402阳性细胞系(PC9)的胞毒性的抑制作用。
图3C示出在Ep173存在下，基于冷靶抑制分析，C27的胞毒性。
图4示出基于PCR的Ep-CAM分析。
图5示出Ep173-特异性CTL克隆(C27)针对多种不同的癌细胞系的胞毒性。
实施发明的最佳方式
本发明详细描述如下。
(I)表位/肽
结构
参照HLA肽结合预测(HLA Peptide Binding Predictions)，BioInformatics & Molecular Analysis Section(BIMAS)，(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/index.html)，这是检索组成为9-10个氨基酸、在氨基酸序列中具有HLA-A2402-结合基元的表位肽的参考位点，所述序列衍生自在起源于上皮细胞的癌细胞上广泛表达的Ep-CAM蛋白，作为筛选潜在的肽为表位肽的结果，本发明的肽经确认是被胞毒T淋巴细胞(下文称为“CTL”)识别的表位肽。
更具体而言，本发明的肽为下列(1)-(4)任一种：
(1)基本上由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的肽；
(2)基本上由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的肽；
(3)基本上由通过添加，缺失或替换一个或多个氨基酸而衍生自SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的氨基酸序列组成的突变肽，所述肽能够与HLA-A2402分子形成复合体而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴细胞识别或诱导这种淋巴细胞；
(4)基本上由通过添加，缺失或替换一个或多个氨基酸而衍生自SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的氨基酸序列组成的突变肽，所述肽能够与HLA-A2402分子形成复合体而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴细胞识别或诱导这种淋巴细胞。
在本发明中，肽表示生物活性氨基酸分子链，其中相邻氨基酸残基的α-氨基和羧基通过肽键连接。
除上述肽之外，肽还包括其盐和衍生物，这是因为它们的生物活性没被破坏。这些衍生物的例子包括那些糖基化、酰胺化、磷酸化、羧化、膦酸化、甲酰化、酰化等衍生物。优选的盐为酸加成盐。这种盐的例子包括盐酸、磷酸、硫酸等无机酸加成盐；以及甲酸、乙酸、丙酸、酒石酸等有机酸加成盐。
(1)-(4)中限定的肽分别衍生自在起源于上皮细胞的癌细胞上广泛表达的Ep-CAM，并被HLA-A2402-限制的CTL识别，或诱导或进一步激活这种CTL。因此，这些肽可合适地用作CTL-诱导或激活肿瘤抗原，即癌症疫苗，来治疗或改善具有HLA-A2402的人癌症。而且，这些肽可用于制备各种不同的肿瘤抗原表位特异的肽。本发明肽的应用如下所述。
(3)和(4)中限定的突变肽的氨基酸最小数通常约为5，优选约为7。氨基酸的最大数不受限制，只要肽可被HLA-A2402-限制的CTL识别，并通常约为12，含有约9至约11个氨基酸的突变肽是优选的。
通过参照上述HLA肽结合预测(HLA Peptide Binding Predictions)，设计HLA-A2402-结合基元的序列，并且从中选择那些真正被HLA-A2402-限制的CTL识别或诱导这种CTL的序列，可获得这种突变肽。
HLA-A2402阳性Ep-CAM表位肽例如通过下列方法鉴定。
淋巴细胞分离自HLA-A2402-阳性成人，并以细胞浓度2×106/ml悬浮于含有10％人血清的RPMI1640培养基。向各细胞悬浮液以浓度1μg/ml加入其中一种表位候选肽。将悬浮液在CO2培养箱中37℃下温育7天，并在第7天加入IL-2。其后，每周1次重复由候选肽刺激和IL-2刺激的循环，以诱导Ep-CAM-特异的CTL。
通过ELISPOT分析(Kuzushima K.等，The Journal of ClinicalInvestigation，(1999)，Vol.104，p.163-171)确定如此诱导的上皮癌-特异的CTL是否被表位候选肽刺激。
利用上述候选肽，合成含有约20个氨基酸的肽的肽文库，覆盖整个Ep-CAM蛋白，对合成的肽进行ELISPOT分析，CTL对其反应的肽逐渐缩短，以致最终包含约9至约10个氨基酸，从而用作本发明的表位肽。
此外，关于氨基酸替换，具有等同活性的突变肽极可能获得，如果氨基酸的电荷，可溶性，亲水性/疏水性，极性等性质类似于那些替换前的氨基酸，则替换后的蛋白结构予以保存。
导入缺失，添加(包括插入)和替换的方法是众所周知的，例子包括Wurmer氏技术(Science，219，666(1983))。
本发明的肽可以与糖类，聚乙二醇，脂质等加成的复合体，放射性同位素衍生物和聚合物等的形式使用。
(II)多核苷酸
本发明的多核苷酸编码上述本发明肽，并具体由下列(5)-(8)任一项限定：
(5)基本上由SEQ ID NO：10所示碱基序列组成的多核苷酸；
(6)基本上由SEQ ID NO：11所示碱基序列组成的多核苷酸；
(7)在严格条件下与由SEQ ID NO：10所示碱基序列组成的多核苷酸杂交的突变多核苷酸，其编码的肽能够与HLA-A2402分子形成复合体而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴细胞识别或诱导这种淋巴细胞；
(8)在严格条件下与由SEQ ID NO：11所示碱基序列组成的多核苷酸杂交的突变多核苷酸，其编码的肽能够与HLA-A2402分子形成复合体而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴细胞识别或诱导这种淋巴细胞。
除非另有说明，本发明的多核苷酸包括DNA和RNA。DNA包括cDNA，基因组DNA和合成DNA。RNA包括mRNA，rRNA和合成RNA。除具有这种碱基序列的多核苷酸之外，那些互补于这种多核苷酸的多核苷酸以及双链多核苷酸也包括在内。
SEQ ID NO：10所示碱基序列的多核苷酸(编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多核苷酸之一)，和SEQ ID NO：11所示碱基序列的多核苷酸(编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多核苷酸之一)是获自人肿瘤相关抗原GA733-2的Ep-CAM基因的部分序列(Szala，S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1990)87(9)，3542-3546)。
(7)和(8)中限定的突变多核苷酸为任一那些在编码本发明表位肽的区域中通常含有15或更多，优选21或更多，但通常45或更少核苷酸的多核苷酸。其中，含有约27至约33个核苷酸的多核苷酸是优选的。
以DNA分子为多核苷酸分子的代表性例子，“在严格条件下可与DNA分子杂交的DNA分子”可通过例如下列文献所述的方法获得：《分子克隆：实验室手册》(Sambrook等编，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)等。在本发明中，“严格条件”是指，例如，在6×SSC，0.5％SDS，和50％甲酰胺的溶液中42℃下加热，并且在0.1×SSC和0.5％SDS的溶液中68℃下洗涤时，观察到阳性杂交信号的条件。
采用下述方法，利用公知的蛋白表达系统，通过确认在具有HLA-A2402的细胞上表达的肽被CTL识别或具有诱导CTL的能力，而选择(7)和(8)的突变多核苷酸。
突变多核苷酸具有3’poly A结构，多核苷酸中poly A的核苷酸数没有限制，因为不影响担当肿瘤抗原的氨基酸编码区。
当利用重组技术来制备本发明的表位肽时，本发明多核苷酸可提供有益的基因信息。这种多核苷酸可用作核酸试剂或标准多核苷酸。
(III)重组载体
通过导入本发明多核苷酸至合适的载体DNA，获得本发明的重组载体。
根据宿主细胞种类和用途目的，可合适地选择载体DNA。载体DNA可以为那些天然存在的载体DNA，或者那些天然存在但有部分DNA从对增殖不必需的区域中丢失的载体DNA。载体DNA的例子包括那些起源于染色体，附加体和病毒的载体DNA。更具体而言，载体DNA包括那些衍生自细菌质粒，噬菌体，转位子，酵母附加体，插入元件，酵母染色体元件，病毒(例如，baculoviruses，乳头状多瘤空泡病毒，SV40，牛痘病毒，腺病毒，禽痘病毒，伪狂犬病毒，逆转录病毒等)等的载体DNA，及其组合，以及那些衍生自质粒和噬菌体(例如，粘粒，噬粒等)的基因元件的载体DNA。
而且，表达载体和克隆载体可用于生物合成本发明肽。
重组载体具有目标多核苷酸的基因序列及编码复制和控制信息的基因序列(例如，启动子，核糖体结合位点，终止子，信号序列，增强子等)的组成元件，并可通过公知方法组合这些序列而制备。
本发明多核苷酸通过公知方法可插入载体DNA。例如，利用合适的限制性酶，DNA和载体DNA可在特异位点连接，并利用连接酶为重组而混合。或者，通过连接合适的接头至本发明多核苷酸，并插入多核苷酸至满足用途目的的载体DNA的多克隆位点可获得载体DNA。
(IV)转化体
利用公知的方法，通过导入含有多核苷酸的上述重组载体至公知的宿主细胞，诸如，大肠杆菌(Escherichia coli)(例如，K12)，属于杆菌属的细菌(例如，MI114)，酵母(例如，AH22)，昆虫细胞(例如，Sf细胞)，动物细胞(例如，COS-7细胞，Vero细胞，CHO细胞等)等，可获得本发明的转化体。
鉴于良好的基因稳定性，基因整合至染色体的方法是优选的基因转移法。利用核外基因自动复制系统为简单可用的方法。载体DNA转移至宿主细胞可通过公开在例如下列文献中的标准方法进行：《分子克隆：实验室手册》(Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)等。更具体的例子包括磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导转染，微注射，阳离子脂质介导的转染，电穿孔，转导，刮载(scrape loading)，弹道导入和感染等。
(V)表位肽的制备方法
本发明的肽可通过公知的肽合成法，诸如固相肽合成法等加以合成。这种肽合成法包括那些公开在“肽合成(Peptide Synthesis)”(Maruzen，1975)和“肽合成(Peptide Synthesis)”(Interscience，New York，1996)中的方法。或者，本发明的表位肽可利用公知的化学合成设备，诸如Applied Biosystems生产的肽合成仪制备。
此外，本发明肽的制备方法包括下列步骤：培养上述本发明的转化体，以及从该培养物中收集本发明的肽。
利用对宿主细胞适合的培养基，通过次培养或分批培养，进行这种培养。持续培养直到本发明肽以所需的量生产，这基于转化体内外生产的肽量，和/或CTL诱导能力，所述能力是由转化体生产的本发明肽显示的作用之一。
在从培养基中收集之后，优选的是进一步纯化本发明肽。纯化可通过公知的方法进行，诸如分子筛层析，离子交换层析，亲和层析等层析技术；利用硫酸铵和/或醇等，基于溶解性差异的分级方式的组合。这种纯化的进行可基于通过CTL的肽识别或通过肽的CTL诱导，更具体例如，通过CTL的IFN-γ产量。
或者，培养基中的本发明肽利用多克隆或单克隆抗体可被特异性吸附回收，所述抗体的生产是基于本发明肽的氨基酸序列，并且特异于该氨基酸序列。
(VI)抗原呈递细胞
本发明的抗原呈递细胞通过用本发明肽脉冲树突细胞，巨噬细胞，B淋巴细胞等抗原呈递细胞而获得。本发明的抗原呈递细胞能够表达在其表面与本发明肽结合的HLA，并具有刺激CTL的能力。
“脉冲”不受限制，并可通过例如在含有约1-10μg/ml的本发明肽的培养基中，约20-约30℃下温育这种抗原呈递细胞约30分钟至约1小时而进行。由HLA-A2402-限制的CTL识别的肿瘤抗原肽由此呈递在抗原呈递细胞表面。
肿瘤抗原是指存在于肿瘤细胞中被肿瘤-特异的CTL识别，或进一步诱导CTL或/和激活CTL的蛋白，多肽或肽。而且，肿瘤抗原肽是指通过分解肿瘤细胞中的肿瘤抗原而产生的肽，作为结合到HLA分子的结果，当呈递在细胞表面上时，这种肽被CTL识别，诱导CTL，或/和激活CTL。
表位序列衍生自肿瘤抗原中的氨基酸序列，并被肿瘤特异的CTL识别，或进一步诱导或激活CTL，称为肿瘤抗原表位(肿瘤抗原决定簇)。
在本说明书中，“识别”表示认识和区分靶和其他物质，以及例如，结合到被认识的靶。在本说明书中，“CTL识别肿瘤细胞或肿瘤抗原表位肽”表示通过T淋巴细胞受体，CTL结合到人白细胞抗原(HLA)或肿瘤抗原肽。
“激活”表示进一步增强或刺激具有某种活性或作用的物质或状态。具体而言，“CTL被激活”表示CTL产生效应子，诸如，INF-γ，或显示针对靶细胞的胞毒性，当CTL识别被HLA呈递的表位肽时，识别这些靶细胞。
“诱导”表示从基本没有某种活性或作用的物质或状态引起这种活性或作用。具体而言，“诱导抗原特异的CTL”表示分化和/或增殖体外或体内特异性识别某种抗原的CTL。
以其脉冲本发明表位肽的抗原呈递细胞可用作癌症疫苗。抗原呈递细胞可进一步用于生产特异于上皮衍生的癌症的CTL，定量人外周血中的这种CTL等。
(VII)主要组织相容性抗原复合体
本发明的主要组织相容性抗原复合体是主要组织相容性抗原和本发明肽或呈递在脉冲以本发明肽的抗原呈递细胞表面上的肿瘤抗原表位肽之间的复合体。
本发明中，主要组织相容性抗原是将被T淋巴细胞识别的肽呈递至T淋巴细胞抗原受体的分子，并且是与表位肽一起被CTL识别的人白细胞抗原(HLA)。
更具体而言，本发明的主要组织相容性抗原复合体(下文简称“MHC”)是MHC I型人白细胞抗原(HLA)和被CTL识别或能够诱导CTL的表位肽之间的复合体，所述HLA表达在与表位肽一起被CTL识别的靶细胞表面。这种复合体包括那些被β2微球蛋白结合的复合体。
Ep-CAM-特异的CTL表位肽是特异位点在Ep-CAM蛋白中的肽，并且是被CTL识别的抗原决定簇，免疫性结合到CTL的抗原受体。进一步，CTL表位肽通过直接进攻表达Ep-CAM分子的细胞能够消除癌细胞。
尤其是，本发明MHC是指表达在靶细胞上的HLA-A2402分子和Ep-CAM蛋白中被CTL识别的特定表位肽之间的复合体，并且还可以是指与β2微球蛋白形成的这种复合体。
本发明中的HLA-A2402是指人白细胞抗原中的I型抗原的亚型，A-24多态性，而HLA-2402分子表示抗原呈递细胞表面上的HLA-A2402基因表达产物。
可用的HLA-A2402分子为纯化自HLA-A2402表达用E.coli培养物的任一HLA-A2402分子，通过转移基因至靶细胞强制表达的HLA-A2402分子，以及天然存在于靶细胞上的HLA-A2402分子。而且，本发明的HLA-A2402分子包括HLA-A2402分子的片段和重链。
本发明的MHC取决于其组成元件可通过多种不同的方法制备，并且通过例如将本发明肽、HLA-A2402分子和β2微球蛋白悬浮于诸如Tris等缓冲液，并在约4-约10℃下温育该悬浮液约24-约72小时而形成。
MHC可以四聚体。MHC四聚体为四个亚复合体的多聚复合体，各亚复合体包括被CTL识别的Ep-CAM表位肽和HLA-A2402分子(通常β2微球蛋白结合的HLA-A2402分子)。
MHC四聚体通过生物素酰化MHC，并以1:4之比混合链亲和素和生物素酰化的MHC而获得。或者，MHC四聚体通过添加生物素结合位点至HLA分子的C端，在形成MHC后使生物素结合至这样的位点，然后以1:4之比混合链亲和素和生物素酰化的MHC而获得。
更具体而言，MHC四聚体可以例如如下方式制备。为制备MHC，HLA-A2402分子重链和β2微球蛋白利用MHC表达的E.coli重组蛋白表达系统大量生产，并且纯化。在HLA-A2402重链C端事先添加识别生物素连接酶的氨基酸序列。纯化的HLA-A2402重链和β2微球蛋白分别溶解于8M尿素。向200ml重折叠缓冲液(pH 8.0，100mMTris-HCl，400mM L-精氨酸-HCl，2mM EDTA，0.5mM氧化型谷胱苷肽，5mM还原型谷胱苷肽)，分别利用27号针的注射器，加入12mg具有SEQ ID NO：1(RYQLDPKFI)所示氨基酸序列的本发明肽，18.6mgHLA-A2402重链，和13.2mg β2微球蛋白。混合物于温度维持在10℃的浴中搅拌48-72小时，以促进MHC形成。含有MHC的重折叠缓冲液随后于温度维持在4℃的浴中对1.8L蒸馏水透析24小时，以及透析的重折叠缓冲液利用Centriprep 10(Millipore Corporation，Bedford MA)浓缩至2ml。在分子量约45kD处被洗脱的MHC通过凝胶过滤层析，利用Superdex 200 HR(Amersham Pharmacia Biotech AB，UppsalaSweden)而分离，从而得到所需的MHC四聚体。
为随后制备生物素酰化的MHC，利用生物素连接酶(AVIDITY，LLC，Denver CO)，将生物素结合至HLA-A2402重链C端的特异位点。生物素结合的MHC通过凝胶过滤层析，利用Superdex 200 HR而纯化。
然后，PE-标记的链亲和素(Molecular Probe，Eugene OR)和纯化的生物素酰化的MHC以1:4之摩尔比混合，以及在分子量约480kD处被洗脱的含有SEQ ID NO：1(RYQLDPKFI)所示氨基酸序列的MHC四聚体通过凝胶过滤层析利用Superdex 200 HR分离，通过Centricon10(Millipore Corporation)浓缩至约3mg/ml，并维持在4℃。诸如叠氮钠，EDTA，亮抑酶肽，和抑肽素等防腐剂可加入其中。
在上述各制备步骤中，理想的是通过诸如凝胶过滤层析等公知的方法纯化备用蛋白和肽。
本发明MHC可用作癌症疫苗。而且，其可用于制备上皮癌特异的CTL，以及用于定量人外周血中的这种CTL。
(VIII)癌症疫苗，CTL诱导剂和基因治疗药物
癌症疫苗和CTL诱导剂
本发明肽可有利地用作癌症疫苗的活性成分，以疫苗被动免疫治疗。该癌症疫苗可用于具有HLA-A2402的人中。
即，给具有HLA-A2402作为白细胞抗原的癌症患者施用本发明肽诱导或激活特异性识别Ep-CAM的HLA-A2402-限制的CTL，由此使得治疗或改善上皮癌等疾病成为可能。
由于癌症患者的CTL为一组识别两种或更多种肿瘤抗原的细胞，因此利用多种表位肽作为癌症疫苗有时比利用单种表位肽具有更好效果。本发明肽可单独或组合多种(两种或更多种)利用。
含有本发明肽的Ep-CAM的mRNA表达在肺癌细胞系(QG56，LU99，LC99A，LC1-sq，LC65A和PC-9)，大肠癌细胞系，胃癌细胞系(MKN28，MKN45)，口腔癌细胞系(HSC-2)，乳腺癌细胞系，白血病细胞系(K562)等。Ep-CAM的表达也在来自肺癌，大肠癌，胃癌，乳腺癌或口腔癌患者的组织中观察到。因此，本发明肽对治疗或改善这种癌症是有益的。
本发明的肽，无论单独还是与多种不同载体组合，可制成制剂。制剂可采用口服或肠胃外的形式。通常，肠胃外的形式是优选的。肠胃外制剂的例子包括皮下注射剂，肌内注射剂，静脉内注射剂，栓剂等。
利用不会抑制本发明表位肽活性的可药用赋形剂，可制备口服制剂。这种赋形剂的例子包括淀粉，甘露醇，乳糖，硬脂酸镁，纤维素，聚合氨基酸，白蛋白等。
利用不会抑制本发明表位肽活性的可药用载体，可制备肠胃外制剂。这种载体的例子包括水，氯化钠，右旋葡萄糖，乙醇，甘油，DMSO等。如需要，肠胃外制剂可进一步含有白蛋白，润湿剂，乳化剂等。为了刺激细胞介导的免疫性，表位肽优选与合适的佐剂组合使用。本发明肽可以天然或盐形式使用。可药用盐的例子包括诸如盐酸，磷酸等无机酸的盐，以及诸如乙酸，酒石酸等有机酸的盐。
通过与化合物、免疫识别肽的抗体等一起配制肽，可调节本发明肽的活性，所述化合物自身或与HLA-A2402相互作用增强肽被CTL的识别。
脉冲以本发明肽的抗原呈递细胞和主要组织相容性抗原复合体，也可有利地用作癌症疫苗。这种疫苗的制剂形式，靶患者，靶癌症，效果等与含有本发明肽的癌症疫苗一样。
治疗方法
本发明的肽，抗原呈递细胞和主要组织相容性抗原复合体，当给药于具有HLA-A2402作为白细胞抗原的人时，诱导或激活Ep-CAM-特异的HLA-A2402-限制的CTL，从而治疗或改善上皮癌。
本发明肽的剂量随肽被CTL识别程度而变化，并基于活性表位肽，成人每天可以例如，约0.01mg-约100mg，以及优选约0.1mg-约30mg。取决于给药目的，剂量间隔可为患者个体合适地加以选择。
或者，向患者血液循环导入单核细胞部分，可实现有效的癌症免疫接种，所述部分已分离自患者外周血，并与本发明肽一起培养以诱导和/或激活CTL。对培养条件，诸如单核细胞和本发明肽的浓度，加以选择，使得成人给药108-1010CTL/天。这种条件可由简单测试方便确定。具有淋巴增殖能力的物质，诸如白介素-2，可在培养过程中加入。
抗原呈递细胞的剂量对成人为例如，约106-109细胞/天，优选107-108细胞/天。而且，通过向患者血液循环导入分离自患者外周血的单核细胞部分与本发明抗原呈递细胞的共培养物，可实现有效的癌症免疫接种。
主要组织相容性抗原复合体对成人为例如1-100mg/天，优选5-50mg/天。而且通过向患者血液循环导入分离自患者外周血的单核细胞部分与本发明主要组织相容性抗原复合体的共培养物，可实现有效的癌症免疫接种。
癌症的基因治疗药物
本发明的多核苷酸(包括互补链)，作为例如肺癌，大肠癌，胃癌，乳腺癌，口腔癌等的基因治疗药物是有益的。
对癌症治疗而言，含有本发明多核苷酸的载体可直接导入体内，或导入收集自人的细胞，所述细胞再返回至体内。载体不受限制，并可选自那些已知用于基因治疗的载体，诸如逆转录病毒，腺病毒，牛痘病毒等，其中逆转录病毒是优选的。这种病毒是复制缺陷的。
本发明多核苷酸通过微注射技术可导入细胞，在所述技术中多核苷酸被封装在脂质体中并转移。
因此，本发明癌症基因治疗药物可为任何形式：单独的本发明多核苷酸，含有本发明多核苷酸的重组载体，使本发明多核苷酸封装的脂质体等。
本发明多核苷酸的剂量随由多核苷酸编码的肽被CTL识别的程度而变化。例如，成人的合适剂量，基于编码本发明表位肽的部分多核苷酸的量，约0.1μg-约100mg/天，优选约1μg-约50mg/天。这种剂量的给药可每几天一次至每数月一次。
本发明的多核苷酸可与细胞因子，诸如IL-2，或与本发明多核苷酸相互作用的物质组合使用，从而增强多核苷酸的表达。
(IX)胞毒T淋巴细胞
利用下列(a)-(d)中的至少一种物质，通过刺激外周血淋巴细胞，可获得本发明的胞毒T淋巴细胞：
(a)本发明的肽，
(b)本发明的抗原呈递细胞；
(c)本发明的主要组织相容性抗原复合体，和
(d)本发明的主要组织相容性抗原复合体四聚体。
本发明CTL的诱导方法是将外周血淋巴细胞与(a)-(d)中的至少一种物质一起在优选含有人血清的RPMI1640培养基中约37℃下培养约7-约14天。当外周血淋巴细胞被主要组织相容性抗原复合体(下文称为“MHC”)或其四聚体刺激时，CTL被诱导并与MHC或四聚体组合。因此，通过合适的方法，CTL从MHC或四聚体中分离。
具体地，CTL可通过例如下列制备方法获得。
当以表位肽或抗原呈递细胞刺激时
将分离自外周血的淋巴细胞与本发明肽或脉冲以该肽的抗原呈递细胞一起在二氧化碳培养箱中约37℃下培养约7-约10天。然后，优选在加入IL-2，PHA，抗-CD3抗体等后，温育约7-约14天，从而刺激和增殖CTL。
以所述肽或抗原呈递细胞刺激，任选接着以IL-2等刺激，实施约3次，从而获得所需数目的CTL。
如此获得的上皮癌特异的CTL例如可以在含有人血清的PBS等中的悬浮液形式，作为上皮癌等的被动免疫治疗药物使用。被动免疫治疗药物的形式通常为注射剂，诸如肌内注射剂，皮下注射剂，静脉内灌输液等。
当以MHC或其四聚体刺激时
染色分离
将淋巴细胞从外周血等中分离，并与合适浓度的MHC或MHC四聚体在例如PBS中约4-约25℃下反应约30-约60分钟。标记染料，诸如FITC或PE，加入反应混合物中，以使结合到MHC或MHC四聚体的CTL染色。随后，染色的CTL利用流式细胞仪或显微镜分离。
通过MHC固定分离
利用其表面固定有MHC或MHC四聚体的无菌板，将分离自外周血的淋巴细胞与板中固定的MHC或MHC四聚体在约4-约25℃下反应约30-约60分钟。清洗掉其他未结合和漂浮的细胞后，板上遗留的上皮癌特异的CTL悬浮在新培养基中。如此分离的上皮癌特异的CTL可以T细胞刺激剂，诸如抗-CD3抗体，PHA，IL-2等刺激，从而使CTL增殖至被动免疫治疗药物应用所需的数目。
磁珠的使用
如上所述制备的生物素酰化的MHC结合至链亲和素标记的磁珠，以制备结合物(下文称为“MHC-磁珠”)。随后，淋巴细胞从外周血等中分离，并以合适的浓度添加MHC-磁珠，使得淋巴细胞:珠之比成1:5-20，接着反应。
当含有结合至MHC-磁珠的上皮癌特异的CTL的测试管置于磁场中时，与珠结合的CTL被吸附至测试管内壁的磁力一侧。
由于与所述珠结合的CTL被附着至测试管内壁，其他细胞被冲洗掉。其后，测试管从磁场移出，测试管中剩余的抗原特异的CTL悬浮在新培养基中。
如此分离的上皮癌特异的CTL可以T淋巴细胞刺激剂，诸如抗-CD3抗体，PHA，IL-2等刺激，从而使CTL增殖至被动免疫治疗药物应用所需的数目。
治疗或改善癌症的方法
本发明的CTL，当其作为被动免疫治疗药物给药至上皮癌患者时，可治疗或改善癌症。
剂量取决于给药目的随患者而变化。例如，成人的合适剂量约107-约1011细胞/天，优选约108-约1010细胞/天。这种剂量的给药可每几天一次至每数月一次。
(X)定量CTL的方法
在癌症治疗管理中，包括适当使用抗癌药和化疗药，重要的是知晓，上皮癌特异的CTL是否存在于高风险癌症患者(由癌细胞或癌组织引起的免疫性降低的患者，并发症患者，老年患者，婴儿患者，孕妇患者)的外周血中。上皮癌特异的HLA-A2402-限制的CTL可通过下列方法定量。
方法包括使下列(a)-(d)中任一物质作用于外周血样品，以及定量样品中的CTL或由此产生的细胞因子的步骤：
(a)本发明肽，
(b)本发明抗原呈递细胞，
(c)本发明MHC，和
(d)本发明MHC四聚体。
将所得值与通过相同方法(除使用含有已知浓度的HLA-A2402-限制的CTL的溶液以外)定量的值进行比较，从而计算外周血样品中HLA-A2402-限制的CTL浓度。
由一种或多种(a)-(d)物质诱导的HLA-A2402-限制的CTL，或由此CTL生产的细胞因子，例如可定量测定如下。
当使用表位肽时
将分离自外周血的淋巴细胞以本发明肽刺激，并测量诱导的CTL的数或由此CTL产生的诸如干扰素-γ(IFN-γ)，白介素等细胞因子(包括趋化因子)的量。具体方法描述如下，以IFN-γ的情形为例。
胞内IFN-γ生产细胞的定量
将分离自外周血的淋巴细胞以细胞浓度2×106/ml悬浮在含有10％人血清的RPMI1640培养基，并以浓度1mg/ml加入本发明的CTL表位肽。此外，加入胞内蛋白转运抑制剂，诸如布雷菲尔德菌素A，接着在二氧化碳培养箱中37℃下培养5-6小时。培养后，细胞固定，进行膜渗透处理，并与荧光标记的抗-IFN-γ抗体反应。利用流式细胞仪等对CD8阳性淋巴细胞中的IFN-γ阳性细胞进行定量测定。
CD8阳性细胞的定量
标记的CD8阳性细胞可按照上述定量胞内IFN-γ生产细胞的方法(除利用抗-CD8抗体代替荧光-标记的抗IFN-γ抗体之外)定量。
细胞因子的定量(ELISPOT分析)
96孔MultiScreen-HA板(Millipore)在4℃下以抗-IFN-γ单克隆抗体包被过夜。以PBS洗涤孔之后，将分离自外周血的淋巴细胞接种至孔中。表位肽置于孔内，并在5％ CO2培养箱中37℃下培养20小时。次日，板以含有0.05％ Tween-20的PBS洗涤，并在室温下与抗-IFN-γ兔血清反应90分钟，然后与过氧化酶标记的抗兔IgG山羊血清反应90分钟。此外，将含有3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma)和0.015％过氧化氢溶液的0.1M乙酸钠缓冲液(pH 5.0)置于孔中，并在室温下反应40分钟。IFN-γ点可视化并以立体显微镜计数。
定量分泌在培养物上清液中的细胞因子的方法
将分离自外周血的淋巴细胞以细胞浓度2×106个细胞/ml悬浮在含有10％人血清的RPMI1640培养基，并以浓度1μg/ml加入本发明的CTL表位肽。在二氧化碳培养箱中37℃下培养24-48小时。培养后，收集上清液，并利用可商购的ELISA试剂盒(例如，ENDOGEN的人IFN-γELISA)测量上清液中IFN-γ的浓度。
当使用MHC四聚体时
淋巴细胞从外周血等中分离，并与浓度为1-100μg/ml的MHC四聚体(荧光标记有链亲和素)在37℃下反应15分钟。与MHC结合的CTL通过添加抗体而染色，所述抗体结合至与MHC结合的CTL，并标记有另一荧光染料。利用流式细胞仪或显微镜，对染色的CTL计数。
实施例
下文，参照实施例，将更详细描述本发明，但本发明并不局限于实施例。
实施例1
1)捐赠者和细胞系
所有捐赠者完全知晓由Aichi癌症中心道德委员会批准的研究计划及其目的。测试用的外周血样品获自5位知情同意后的HLA-A2402阳性健康捐赠者。从获自各捐赠者的外周血样品，通过Ficoll密度梯度离心，分离出外周血单核细胞(PBMC)。
大细胞癌细胞系LU99(JCRB0080)作为人肺癌细胞系；人表皮状癌细胞系HSC-2(JCRB0622)；表皮状癌细胞系MKN28(JCRB0253)和MKN45(JCRB0254)作为人胃癌细胞系；以及表皮状癌细胞系COLO320DM(JCRB0225或ATCC:CCL-220)作为人直肠癌细胞系购自JCRB细胞库(Ministry of Health，Labour and Welfare：http//Cellbank.nihs.go.jp)。表皮状癌细胞系LC-1/sq(RCB0455)作为人肺癌细胞系购自Riken细胞库。
LC/sq细胞维持在45％ RPMI1640培养基和45％ Ham氏F12培养基(Sigma产品)中，所述培养基通过加入液体营养补充物而制备，所述营养补充物包括10％ FCS，L-谷氨酰胺，青霉素，链霉素，和卡那霉素。COLO320DM细胞和MKN28维持在DMEM培养基(Sigma产品)中。K562细胞维持在IMDM培养基(Sigma产品)中，所述培养基通过添加液体营养补充物而制备，所述补充物包括10％ FCS(胎牛血清，LifeTechnology产品)，L-谷氨酰胺，青霉素，链霉素和卡那霉素。
将其他癌细胞系培养在RPMI1640培养基中，所述培养基通过添加液体营养补充物而制备，所述补充物包括10％ FCS，2×10-3M L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，100μg/ml卡那霉素，和5×10-5M β-巯基乙醇(作为完全培养基)。
HLA-A2402基因导入174CEM.T2(下文称作“T2细胞”)，给出呈递HLA-A2402结合肽的细胞(下文称作“T2-24细胞”)作为肽呈递细胞。T2-24细胞培养在含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺，青霉素，链霉素和G418(Gibco产品)的IMDM培养基(Iscove氏修改的Dulbecco氏培养基：Gibco产品)中。
依据“组织抗原”(Tissue Antigens，59：502-511，(2002))中所述的方法，HLA-A2402-阴性QG56细胞系和HLA-A2402-阴性A549(JCRB0076)细胞系以编码HLA-A2402的逆转录病毒感染。为了检测感染的细胞，将感染的QG56细胞维持在含有终浓度为0.6μg/ml的嘌呤霉素的完全培养基中，并命名为QG56-A24。同样，感染的A549细胞维持在含有终浓度为0.9μg/ml的嘌呤霉素的完全培养基中，并命名为A549-A24。
2)肽合成
在Ep-CAM(登录号：M33011)内潜在的HLA-A2402-结合的肽通过计算机预测，基于从环球网生物信息学&分子分析部分(BIMAS：BioInformatics and Molecular AnalysisSection)(htt://bimas.dcrt.gov/molbio/hla_bind)可获得的HLA肽复合体预计的半数时间解离，根据HLA肽结合预测计划(HLA Peptide BindingPrediction Program)，而得以鉴定。
基于Ep-CAM表位肽预测结果选择的7种肽由PepSet(Mimotope产品)合成。如果需要，将所得肽溶解于100μl二甲基亚砜中，并进一步以40％乙腈稀释至0.1M(pH 7.4)。
各肽的生产量预估为1μmol。
7种合成肽分别命名为Ep31，Ep173，Ep185，Ep250，Ep225，Ep296，和Ep304。表1示出Ep-CAM的合成肽序列。
表1
 
肽名 氨基酸序列 氨基酸位置 氨基酸长度 得分a ％MFI增加b
Ep31 NYKLAVNCF 31-39 9 120 85
Ep173 RYQLDPKFI 173-181 9 150 102
Ep185 LYENNVITI 185-193 9 75 79
Ep225 LFHSKKMDL 225-233 9 20 29
Ep250 YYVDEKAPEF 250-259 10 198 57
Ep296 KYEKAEIKEM 296-305 10 83 24
Ep304 EMGEMHREL 304-312 9 5 16
备注：
a：从HLA-A24分子解离的预计半数时间(分钟)，通过访问环球网生物信息学&分子分析部分(BIMAS)HLA肽结合预测而获得。
b：基于MHC稳定性分析，评估合成肽对HLA-A24分子的结合活性。％MFI表示平均荧光强度。
另外，人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)包膜肽RYLRDQQLL(命名为ENV584，J.Immunol，159：6242-6252，1997：残基584-592)和EBV潜在膜蛋白2肽(EBV潜在膜)(命名为EBV-LMP419，J.Immunol，158：3325-3334，1997：残基419-427)合成用作对照(Toray Industriesresearch center company)。
3)细胞染色和流式细胞仪分析
利用表达在细胞表面上的抗HLA-A2402单克隆抗体(One Lambda公司产品)和FITC标记的抗小鼠IgG(ab’)2片段(Immunotech产品)，通过间接免疫荧光抗体分析进行测试。根据“Blood，98：1872-1881，2001，Science，274：94-96，1996”中所述步骤，制备MHC/肽四聚体。
CD8阳性T细胞系或其克隆以含有Ep-CAM肽和Ep173的藻红蛋白(PE)-标记的HLA-A2402四聚体(称作HLA-A2402/Ep173四聚体)，或含有HIV-1肽和ENV584的PE标记的HLA-A2402四聚体(称作HLA-A2402/ENV584四聚体)染色。
利用FACSCalibur(Becton，Dickinson and Company产品)对染色的细胞进行流式细胞仪分析，并通过CellQuest软件(Becton，Dickinson andCompany产品)分析数据。
MHC稳定性分析
为评估合成肽的HLA-A2402结合效率，根据Kuzushima等的步骤(Blood，98：1872-1881，2001)，利用T2-A24细胞(其为表达HLA-A2402分子的质粒被转染至T2[174×CEM.T2:ATCC登录号：CRL-1992]的细胞系)进行MHC稳定性分析。
具体而言，将浓度为10μM的各个肽在200μl含有T2-A24细胞(2×105个细胞)、0.1％ FCS和5×10-5M β-巯基乙醇的RPMI1640培养基中26℃下温育16小时，接着在37℃下继续温育3小时。温育后，细胞表面HLA-A2402分子以上述3)中的抗HLA-A2402单克隆抗体和FITC标记的抗体染色。通过FACSCalibur确定表达水平，并记录平均荧光强度(MFI)。
％MFI增加由下列公式计算：
％MFI增加＝100×(以肽给药的组的MFI—未以肽给药的组的MFI)/(未以肽给药的组的MFI)
表1示出有关％MFI水平增加的结果。如表1所示，细胞表面上的HLA-A2402表达水平对大多数肽是增加的，表明这些肽结合至细胞表面，由此使MHC稳定。
特别是，在上述肽中，Ep173(RYQLDPKFI)对HLA-A2402显示最高的亲合力。Ep304(EMGEMHREL)由于显示最低的亲合力不继续其他试验。
5)Ep-CAM肽特异的CTL及其克隆的生产
根据Dauer等的步骤(J.Immunol，170：4069-4076)生产外周血单核细胞衍生的树突细胞(DC)。
更具体而言，附着至塑料的细胞从HLA-A2402阳性健康志愿者的外周血单核细胞中分离出来，并培养于含有5％热灭活人血血清，10μg/ml重组人白介素-4(hIL-4，R&D systems Company产品)和50ng/ml重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF，R&D systemsCompany产品)的RPMI1640培养基。温育1天之后，为了细胞生长，加入50ng/ml IL-1β(PeproTech，Inc产品)，50ng/ml重组人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α：PeproTech Inc产品)和1μM前列腺素E2(CaymanChemical Company产品)。2或3天过后，收集细胞用于呈递抗原的单核细胞衍生的树突细胞。
生产的细胞明显表达树突细胞介导的抗原，诸如CD1a，CD80，CD83，CD86，和HLA II型分子。
此外，利用CD8微珠(Milteny Biotec产品)，从相同捐献者中分离出CD8阳性T淋巴细胞。
随后，自衍生的树突细胞室温下脉冲以各个Ep-CAM合成肽2-4小时，该肽在含有5×10-5M β-巯基乙醇的AIM-V培养基(Gibco产品)中浓度为10μM，接着辐射(33Gy)。
然后，树突细胞(1×105细胞)与CD8阳性T淋巴细胞(1×106淋巴细胞)共培育在含有10％人血血清，25ng/ml重组人IL-7(R&D systemscomapany产品)，和5ng/ml重组人IL-12(R&D systems company产品)的RPMI1640培养基的培养管中。
培育7天之后，加入1×105个上述制备的肽脉冲的自衍生的树突细胞，来刺激细胞。继续培育7天之后，以相同步骤刺激细胞3次。每次再刺激后，加入人重组IL-2(Takeda Pharmaceutical Company，Ltd.产品)给出终浓度20u/ml。如需要，活性增殖细胞分成2或3个管，并培养在含有20u/ml IL-2的新鲜培养基中。
T-细胞特异性通过ELISPOT分析进行检查。
为建立T-细胞克隆，根据Blood，98：1872-1881，2001中所述的方法，对多克隆CTL进行有限稀释。更具体而言，将多克隆CD8阳性T-细胞接种在96孔环形板(1，3，10个细胞/孔)，板中含有培养基(0.2ml)以及抗-CD3单克隆抗体(30ng/ml)(Orth Diagnostic Inc.产品)，IL-2(50u/ml)，1×105个γ-辐射(33Gy)的PBMC细胞，和2×104个被EBV转化的γ-辐射(55Gy)的B淋巴母细胞(以95.8-细胞(JCRB9123)上清液转化志愿者的外周血B淋巴细胞而获得的细胞)。
温育两周之后，增殖的细胞的特异性以与Lee等方法(J.Immunol，158：3325-3334，1997)的同样方式，通过CTL-CTL-杀伤分析确定。
CTL克隆仅在以终浓度为2μM含有同样起源衍生自Ep-CAM的肽或对照肽ENV584的100μl完全培养基或96孔环形板(300细胞/孔)中温育过夜。
CTL细胞的细胞杀伤能力利用倒置显微镜在次日确定。将这些仅在脉冲以Ep-CAM时显示细胞-杀伤能力的克隆移至烧瓶，并如上所述增殖。
6)IFN-γ的ELISPOT分析
具有硝酸纤维素膜的平底96孔MultiScreen-HA板(Millipore Corp.产品)包被以10μg/ml抗-IFN-γ单克隆抗体(R&D systems company产品)，并在4℃下温育过夜。以PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤后，该板以培养基在37℃下封闭1小时。在各个板孔中，T2-A24细胞(5×104细胞)在100μl含有0.1％ FCS和5×105M β-巯基乙醇的RPMI1640培养基中室温下脉冲以各个表位候选合成肽30分钟。将1×105个悬浮在含有20％FCS的培养基中的CD8-阳性T细胞接种至各孔中。
当有太多点计数时，1×104 CD8阳性T细胞用于对细胞作出反应。整个测量方法一式两份进行。
板在5％ CO2培养箱中37℃下温育20小时，并充分洗涤以含有0.05％ Tween 20的PBS。随后，向各个孔中加入多克隆兔抗-IFN-γ抗体(Genzyme产品)，室温下放置90分钟，然后继续暴露于过氧化酶-结合的山羊抗兔抗免疫球蛋白G(Genzyme产品)90分钟。为了显色IFN-γ特异点，向各孔中加入含有3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma产品)和0.015％过氧化氢溶液的0.1M乙酸钠缓冲液(pH 5.0)。40分钟后，以水洗涤终止反应，并使板干燥。扩散的大点数在显微镜下计数。
结果示于图1和2。
图1显示当5位HLA-A2402阳性健康捐赠者的CD8阳性T-细胞由被6种肽中的一种脉冲的自-衍生的树突细胞刺激时多克隆肽-激活的胞毒淋巴细胞系的ELISOT分析评价结果。
正如图1所见，当5位HLA-A2402阳性健康捐赠者的CD8阳性T-细胞由被6种肽中的一种脉冲的自-衍生的树突细胞刺激时，从4位捐赠者获得的T-细胞系通过与被Ep173脉冲的T2-A24细胞温育显示主要产生IFN-γ点。
CTL系经历获自3号捐赠者的Ep250刺激，通过与Ep250温育，特异性生产IFN-γ点。
图2显示Ep-CAM肽特异的多克隆和单克隆CTL的四聚体染色结果。
图2A显示，以Ep173刺激四次的多克隆CD8阳性T细胞用FITC-标记的抗-CD8抗体，含有Ep173的PE-标记的HLA-A24四聚体，或对照肽ENV584染色，并通过流式细胞仪分析。四聚体阳性细胞在总CD8阳性T-细胞中的比例以右上部的百分比显示。
如图2A所示，在大多数对照肽ENV584中，没有观察到IFN-γ点形成。四次刺激后，从4号捐赠者建立的CTL系以HLA-A24/Ep173四聚体而非以HLA-A24/ENV584四聚体特异性染色(相对总CD8阳性T-细胞，37.2％:0.06％，图2A)。
图2B显示，Ep173-特异的CTL克隆(C27)，以上述同样方式染色。四聚体阳性细胞在CD8阳性T-细胞中的比例以右上部的百分比显示。
如图2B所示，四聚体阳性细胞的强度在对数上等同于或高于四聚体阴性细胞2-至3-倍。本发明人从4号捐赠者的Ep173特异性多克隆CTL系的有限稀释培养基中建立T细胞克隆C27。
利用四聚体的该研究显示，多克隆和单克隆Ep173-特异的CD8阳性T细胞皆具有特异于HLA-A2402/Ep173复合体的高亲和性细胞受体。
因此，Ep173-特异的CTL克隆从该CTL系中建立。
实施例2
肽Ep173特异的CTL克隆的性质，部分1
7)CTL分析
本发明人进一步检查在HLA-A24情形下，C27是否识别自发呈递在肿瘤细胞表面上的肽。
Cr-标记的细胞在加入C27之前与特异于总HLA I型，HLA-A24或HLA-A2中的任一种的单克隆抗体温育，并以效应子与靶之比为10进行CTL分析。
靶细胞(PC9细胞)在100μl培养基中37℃下以镉(51Cr)标记1小时。在有些实验中，为了指定HLA限制，在加入效应细胞之前30分钟，向各孔加入预定量的封闭抗体W6/32(抗-HLA I型)，MA2.1(抗-HLA-A2)，和A11.1(抗-HLA-A24)。
板在37℃下温育4小时，并利用γ-计数仪对上清液计数。
51Cr释放％的计算公式为：100×(实验释放—自发释放)/(最大释放—自发释放)
结果示于图3和5。
图3A显示，在效应子与靶之比为1时，通过51Cr释放分析确定的C27(Ep173-特异性CTL克隆)抗T2-A24在各指定浓度的肽Ep173和对照肽EBV-LMP419处的胞毒性。
结果，Ep173-特异的CTL克隆(C27)证实针对脉冲以低肽浓度100pM的Ep173的T2-A24细胞的胞毒性，而这种胞毒性利用EBV-LMP419(对照肽)并未被观察到。
图5和表2显示C27针对多种不同癌细胞系的胞毒性的评价结果。
表2
 
起源 Ep-CAMRT-PCR HLA-A24(MFIa)
肺癌 +(87.16)
Lu99 大细胞癌 + +(43.53)
PC9 腺癌 ++ +(73.67)
11-18 腺癌 +(96.71)
LC99A 大细胞癌 + —(3.67)
LC65A 小细胞癌 + +(70.56)
LC-1/sq 鳞状细胞癌 + —(3.21)
A549 腺癌 +(109.73)
A549-A24 腺癌 N.D.b —(2.65)
QG56 鳞状细胞癌 + +(84.12)
QG56-A24 鳞状细胞癌 N.D.
胃癌
MKN28 腺癌 + —(7.67)
MKN45 腺癌 + +(47.99)
结肠癌
COLO320DM 腺癌 - +(35.35)
其他癌症
HSC-2 口腔鳞状细胞癌 ± +(34.40)
K562 白血病 ± —(5.23)
T2-A24 B×T杂交细胞 - +(197.75)
备注：
a：利用HLA-A24mAb和FITC标记的抗小鼠IgG抗体F(ab’)2片段，通过免疫荧光，评价平均荧光强度。
b：未做
图2显示C27(Ep173-特异的CTL克隆)对8种HLA-A24阳性癌细胞系和HLA-A24阴性细胞系作为靶细胞的胞毒性的评价结果。
所有细胞系表达Ep-CAM，除肺腺癌细胞系11-18，COLO320DM和A549以外。HLA-A2402基因如逆转录病毒被转化至A549和QG56，命名为A549-A24和QG56-A24的转化体也用作靶细胞。通过51Cr释放分析，在各效应子:靶之比(40:1，20:1，10:1，5:1)处，详细说明胞毒性。K562为敏感于天然杀伤细胞的典型细胞系。
如图5和表2所示，C27有效地施加毒性至肺癌细胞系PC9，LU99，LC-1/sq和LC99A；口腔鳞状癌细胞系HSC-2；和既表达HLA-A24又表达Ep-CAM的胃癌细胞系MKN45。然而，C27未表明针对HLA-A24阳性Ep-CAM阴性细胞系(A549-A24和COLO320DM)，或HLA-A24阴性和Ep-CAM阳性细胞系，或Ep-CAM阴性细胞系(OG56，A549，MKN28)的毒性。当HLA-A2402基因导入HLA-A24阴性QG56细胞系(QG56-A24)时，C27杀伤靶细胞。对K562的细胞毒性是低的。
这些数据表明，Ep173-特异的CTL杀伤既表达HLA-A24又表达Ep-CAM的肿瘤细胞。
图3B显示抗-HLA-A24单克隆抗体对Ep173-特异的CTL克隆(C27)抗HLA-A2402阳性细胞系(PC9)的胞毒性的抑制作用。
C27对肺癌细胞系(HLA-A24阳性Ep-CAM阳性肺癌细胞系)PC9的胞毒性被特异于HLA-A24或I型分子(W6/32)的单克隆抗体封闭，但不被抗-HLA-A2单克隆抗体封闭。
8)冷靶抑制分析
根据Arai等方法(Blood，97：2903-2907，2001)进行冷靶抑制分析。
T2-A24细胞与终浓度为1×105M的表位肽Ep173或EBV-LMP419温育1小时。
数次洗涤后，所得物与2×104效应细胞温育1小时，以生成肽脉冲的T2-A24细胞与靶细胞之比为40:1，20:1，10:1，和5:1。2×103个51Cr-标记的PC9细胞系添加至各孔中。
胞毒性的确定如上述第7项有关CTL分析中所述。
图3C显示冷靶抑制分析结果。
在图3C中，横坐标表示脉冲以Ep173(●)或对照EBV-LMP419(■)肽的T2-A24细胞(冷)与镉标记的PC9细胞(热)之数目比。纵坐标以百分比表示C27针对PC9的胞毒性。空心圆显示没有冷靶的胞毒性。
结果，针对PC9的C27-介导的胞毒性受到Ep173-脉冲的T2-A24细胞的特异性抑制，但未受到非相关肽的抑制。
因此，针对PC9的C27-介导的胞毒性被抗-HLA-A24单克隆抗体或Ep173-脉冲的冷靶细胞封闭。于是表明，CTL克隆对自发呈递在肿瘤细胞表面上的Ep173具有优良的特异性。
实施例3
肽Ep173特异的CTL克隆的性质，部分2
9)RT-PCR
利用GenElute mRNA Miniprep试剂盒(Sigma产品)，从培育的细胞系中抽提全部RNA。基因特异的寡核苷酸引物通过Proligo(ProligoJapan产品)合成，用于Ep-CAM mRNA表达的评价。RT-PCR所用引物如下：
正向引物：ATGGCGCCCCCGCAGGTCCT(SEQ ID NO：8)
反向引物：TTATGCATTGAGTTCCCTATGCATCTCACC(SEQ IDNO：9)
利用热循环仪(Perkin-Elmer产品)，进行RT-PCR，PCR产物通过1.5％凝胶电泳和溴化乙锭显色而分析。
PCR采用1次循环的94℃、5分钟，30次循环的94℃、30秒，58℃、30秒和72℃、1分钟，以及1次循环的72℃、7分钟。
10)蛋白质印迹分析
根据稍有修改的Schwartz等(J.Immunol，165：768-778，2000)的步骤进行蛋白质印迹分析。更具体而言，细胞溶解于缓冲液(50mM Tris/盐酸，pH 7.5，5mM氯化镁，1mM EDTA，0.5％ triton X-100，10μM亮抑酶肽，2.8μM抑胃酶肽，和0.85mM苯甲磺酰氟)中4℃下30分钟。为了确定蛋白浓度，溶解的细胞上清液在280/260nm波长处定量测定。130μg的蛋白进一步添加至12％SDS-PAGE。蛋白被印迹在Immobilon-P膜(Millipore产品)上，并在4℃与含有100％低脂肪干奶粉和0.1％Tween 20的PBS封闭过夜。
利用Ep-CAM特异的单克隆抗体(LabVision产品)进行检索，并利用过氧化物酶-结合的山羊抗小鼠IgG(Zymed产品)进行检测。
利用ECL蛋白质印迹检测系统(Amersham bio-science company产品)使蛋白显色。
图4显示通过RT-PCR和蛋白质印迹分析，癌细胞系表达Ep-CAM的检查结果。
15种癌细胞系中有12种(80％)明显表达Ep-CAM。HLA-A24的表达利用抗-HLA-A24单克隆抗体通过间接免疫荧光测试而检查。在检查的15种癌细胞系中有10种细胞系显示阳性HLA-A24表达。
正如上述实施例所示，本发明人已获得了衍生自Ep-CAM的新型HLA-A2402-限制的表位。至少表位肽Ep173(RYQLDPKFI；SEQ IDNO：1)能够诱导CTL(包括特异于HLA-A2402/肽复合体的高亲和性T-细胞受体)，由此，利用该肽免疫治疗是可预期的。
工业实用性
本发明的肽可合适的用作宽范围的含有HLA-A2402的人癌的癌症疫苗。
序列表
<110>大塚制药株式会社
<120>由HLA-A2402-限制的Ep-CAM-特异的CTL识别的表位/肽及其应用
<130>SPI085342-01
<150>JP 2004-11752
<151>2004-01-20
<160>11
<170>PatentIn version 3.1
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<212>PRT
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<220>
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Figure A200810184646D00493

Claims (17)

1.由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成的肽。
2.胞毒T淋巴细胞诱导剂，包含权利要求1的肽作为活性成分。
3.由SEQ ID NO：11所示碱基序列组成的多核苷酸。
4.上皮癌的基因治疗药物，包含权利要求3的多核苷酸作为活性成分。
5.重组载体，包含权利要求3的多核苷酸。
6.转化体，其中导入权利要求5的重组载体。
7.权利要求1的肽的制备方法，包括下列步骤：培育权利要求6的转化体，以及从培养物中收集权利要求1的肽。
8.抗原呈递细胞，其以权利要求1的肽进行脉冲。
9.胞毒T淋巴细胞诱导剂，包括权利要求8的抗原呈递细胞作为活性成分。
10.主要组织相容性抗原复合体，包含主要组织相容性抗原，和权利要求1的肽或存在于权利要求8的抗原呈递细胞上的肿瘤抗原表位肽。
11.权利要求10的主要组织相容性抗原复合体，包括HLA-A2402分子，β2-微球蛋白，和权利要求1的肽或存在于权利要求8的抗原呈递细胞上的肿瘤抗原表位肽。
12.胞毒T淋巴细胞诱导剂，包括权利要求10或11的主要组织相容性抗原复合体作为活性成分。
13.主要组织相容性抗原复合体四聚体，包括主要组织相容性抗原和权利要求1的肽或存在于权利要求8的抗原呈递细胞上的肿瘤抗原表位肽。
14.权利要求13的主要组织相容性抗原复合体四聚体，其中四聚体为包括HLA-A2402分子，β2-微球蛋白，和权利要求1的肽或存在于权利要求8的抗原呈递细胞上的肿瘤抗原表位肽的复合体。
15.定量外周血中HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴细胞的方法，其包括下列步骤：
体外使一种或多种下列(a)-(d)物质作用于外周血：
(a)权利要求1的肽；
(b)权利要求8的抗原呈递细胞；
(c)权利要求10或11的主要组织相容性抗原复合体；
(d)权利要求13的主要组织相容性抗原复合体四聚体，以及
定量外周血中的胞毒T淋巴细胞或者由这样的胞毒淋巴细胞产生的细胞因子。
16.权利要求15的方法，其中定量外周血胞毒T淋巴细胞或细胞因子的步骤是进行下列定量的任何一种：胞内INF-γ-生产细胞的定量；CD8阳性细胞的定量；通过ELISPOT分析定量；和分泌于培养上清液中的细胞因子的定量。
17.胞毒T淋巴细胞诱导剂，包括权利要求14的主要组织相容性抗原复合体四聚体作为活性成分。
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