WO2021045224A1 - がん免疫療法等における免疫関連有害事象の予測 - Google Patents

がん免疫療法等における免疫関連有害事象の予測 Download PDF

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WO2021045224A1
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lung
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gprc5a
treatment
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博嘉 西川
ビタリー コチン
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国立大学法人東海国立大学機構
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker useful for prediction and diagnosis of lung disorders (particularly interstitial pneumonia).
  • the present invention relates to biomarkers that can be used for predicting lung disorders as immune-related adverse events in cancer immunotherapy and the like, and their uses.
  • Interstitial pneumonia is a disease that causes inflammation mainly in the stroma of the lung, and is known to develop due to various causes (for example, autoimmune diseases such as collagen disease, drugs, and infectious diseases). Unspecified interstitial pneumonia is called "idiopathic interstitial pneumonia". Idiopathic interstitial pneumonia is classified into subtypes such as idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), nonspecific interstitial pneumonia (NSIP), and specific organizing pneumonia (COP). Idiopathic interstitial pneumonia is designated as an intractable disease, and careful treatment is required for its diagnosis / differentiation and treatment. In addition, antifibrotic drugs (pi veneidone, nintedanib), steroids, immunosuppressive drugs, etc.
  • Idiopathic interstitial pneumonia is classified into subtypes such as idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), nonspecific interstitial pneumonia (NSIP), and specific organizing pneumonia (COP). Idiopathic interstitial pneumonia is designated as an intractable disease, and careful treatment is required for its diagnosis
  • cancer immunotherapy generally attacks cancer cells and obtains a therapeutic effect by activating the antitumor immune response in the body.
  • the immune response to the self is also unintentionally activated, which has been a problem of inducing the autoimmune response.
  • interstitial pneumonia which is an autoimmune reaction to lung tissue
  • ICB immune checkpoint inhibitors
  • ICB immune checkpoint blockade
  • irAE immune-related adverse events
  • serious lung damage is recognized, and countermeasures are urgently needed. If the risk (risk) of lung injury represented by interstitial pneumonia is known, it will be possible to avoid it in advance (change of treatment method, etc.) and take early measures, and it will be possible to provide more appropriate and highly effective treatment. ..
  • a determination method using a polymorphism of the STAT3 gene has been proposed as a means for predicting the risk of developing interstitial pneumonia due to a molecular target drug or an immune checkpoint inhibitor (Patent Document 1).
  • the present invention poses a problem as an adverse event such as the onset of lung disorders represented by interstitial pneumonia (particularly, idiopathic interstitial pneumonia) (particularly in cancer immunotherapy and the like).
  • the main task is to find a means for predicting the risk of developing or exacerbating lung damage) and to utilize and apply it.
  • an immune checkpoint inhibitor activates only the antitumor immune response, attacking cancer cells but not normal cells, but sometimes in the thymus. It may activate an immune response (autoimmune response) to normal cells that have bypassed education, which causes immune-related adverse events (irAEs). Therefore, it is important to identify antigens recognized by immune cells attacking normal cells and regulate the immune response to them in order to control irAE.
  • autoimmune response immune response to normal cells that have bypassed education, which causes immune-related adverse events (irAEs). Therefore, it is important to identify antigens recognized by immune cells attacking normal cells and regulate the immune response to them in order to control irAE.
  • HLA-2402 which is a specific HLA (human leukocyte antigen) characteristic of Japanese, has a causative antigen. Therefore, the antigen presented by HLA-2402 was comprehensively analyzed while limiting it to lung-specific peptide antigens.
  • GPRC5A G protein-coupled receptor class C group 5 member A
  • lung damage can also occur in cancer immunotherapy other than immune checkpoint inhibitors and cancer treatment using anticancer drugs.
  • complications are also observed in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, and there are many cases in which the disease worsens with treatment.
  • GPRC5A is expressed specifically in lung tissue
  • the presumed mechanism that lung tissue is damaged by an immune response involving HLA-A2402 and GPRC5A identified as its antigen peptide, as well as anti-cancer agents If we consider that the same immune response may occur in lung disorders caused by treatment and in autoimmune diseases, the onset and exacerbation of lung disorders in various cancer treatments and autoimmune diseases It can be reasonably understood that anti-GPRC5A antibody and HLA-A2402 binding GPRC5A peptide-specific cytotoxic T cells are useful as biomarkers for predicting.
  • anti-GPRC5A antibody and HLA-A2402 restrictive GPRC5A peptide are also biomarkers for predicting the risk of developing idiopathic interstitial pneumonia, which requires careful diagnosis / differentiation and is often difficult to treat. It is suggested that specific cytotoxic T cells and the like are extremely useful. Thus, patients undergoing various cancer treatments, patients with autoimmune diseases, etc., who have lung disorders or who may have exacerbated lung disorders, and patients with idiopathic interstitial pneumonia / potential It is possible to provide a patient with a means for predicting the risk of onset or exacerbation by an objective criterion, that is, the level of a biomarker consisting of a specific substance in the living body.
  • the means include, for example, selection / identification of treatment targets (exclusion of patients who should not be treated) and determination of treatment policy before treatment, and early treatment of lung disorders during treatment (for example, early treatment by monitoring the pathological condition). It is useful for (intervention), review or change of treatment policy, estimation of prognosis after treatment, etc., and can maximize the treatment effect and improve the QOL of patients.
  • a biomarker for lung disease consisting of anti-GPRC5A antibody or HLA-A2402 restrictive GPRC5A peptide-specific cytotoxic T cells.
  • the biomarker according to [1] which is used for predicting the risk of lung injury.
  • [6] A method for predicting the risk of lung injury using the level of a biomarker consisting of anti-GPRC5A antibody or HLA-A2402 binding GPRC5A peptide-specific cytotoxic T cells in a blood sample derived from a subject as an index.
  • the risk prediction method according to [6] wherein the lung disorder is a lung disorder associated with cancer treatment or treatment of an autoimmune disease.
  • the risk prediction method according to [7] wherein the cancer treatment is cancer immunotherapy.
  • cancer immunotherapy is treatment with an immune checkpoint inhibitor.
  • the cancers to be treated are non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, breast cancer, cervical cancer, uterine body cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, vaginal cancer, gastric cancer, duodenal cancer.
  • the cancers to be treated are non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, gastric cancer, colon cancer, esophageal cancer, malignant melanoma, or hepatocellular carcinoma, [7] to [9].
  • Autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, systemic erythematosus, rheumatic fever, scleroderma, dermatomyositis, polymyositis, nodular polyarteritis, Sjogren's syndrome, mixed connective tissue disease (MCTD), and multiple occurrences.
  • Vascular granulomatosis (Wegener's granulomatosis), eosinophilic polyangiitis granulomatosis (Charg-Strauss syndrome), microscopic polyangiitis, Takayasu's arteritis (aortitis syndrome), giant cell arteritis Flame (temporal arteritis), rheumatic polymyositis, eosinophilic granulomatitis, adult Still's disease, tonic spondylitis, psoriatic arteritis, recurrent polychondritis, Bechet's disease or sarcoidosis, [ 7] The risk prediction method described in.
  • the risk prediction method according to any one of [6] to [12], wherein the lung disorder is interstitial pneumonia.
  • the risk prediction method according to [6], wherein the lung disorder is idiopathic interstitial pneumonia.
  • a kit for predicting, diagnosing or differentiating the risk of lung injury which comprises a reagent for measuring an anti-GPRC5A antibody.
  • the kit according to [21] which is a kit based on the principle of enzyme immunoassay or fluorescence immunoassay.
  • a kit for predicting, diagnosing or differentiating the risk of lung injury which comprises a probe labeled with a multimerized HLA-A2402-peptide complex or a reagent for preparing the probe.
  • HLA-A24 antigenic peptides.
  • Peptides presented on HLA-A24 by various cancer cell lines were recovered using immunoprecipitation (center) and analyzed by mass spectrometry (right). Expression of the three identified candidate peptides in each tissue. It was detected and compared by the RT-PCR method.
  • BRAIN brain
  • COLON colon
  • HEART heart
  • INTEST small intestine
  • KIDONEY kidney
  • LEUK white blood cells
  • LIVER liver
  • LUNG lungs
  • OVARY ovary
  • PNCR. PLCNT
  • PROST. Progester
  • the vertical axis shows the average value of the difference in fluorescence intensity between the case with and without the primary antibody, and represents the detected amount of GPRC5A peptide.
  • the horizontal axis shows the peptide concentration at the time of pulse. Detection of GPRC5A antibody in patients with lung injury. It was detected and compared by flow cytometry.
  • the vertical axis shows the number of cells.
  • the horizontal axis indicates the fluorescence intensity and represents the amount of GPRC5A antibody detected. Arrows show a sample of patients who have experienced interstitial pneumonia. Detection of GPRC5A antibody in patients with lung injury. Detected and compared by ELISA.
  • the horizontal line in each column indicates the median value, the cross indicates the average value, the upper end of each column indicates the 75th percentile value, the lower end of each column indicates the 25th percentile value, and the upper end of the line extending from each column is the maximum. The value is shown, and the lower end of the line extending from each column shows the minimum value.
  • Biomarkers of lung injury As described above, according to the study by the present inventors, an immune response targeting GPRC5A is involved in lung injury (particularly interstitial pneumonia) in cancer treatment using immunity checkpoint inhibitors. It was revealed that "the presence of an immune response to GPRC5A” reflects the risk (risk / possibility) of lung damage (particularly interstitial pneumonia). Based on this result, the first aspect of the present invention is a "biomarker of lung injury” (hereinafter, abbreviated as “biomarker of the present invention”, which is a marker substance useful for detecting or grasping the presence of the immunity response. (Sometimes called).
  • the biomarker is particularly useful for predicting the risk of interstitial pneumonia among lung disorders, and can be used, for example, for diagnosing / assessing idiopathic interstitial pneumonia and predicting the risk of developing it.
  • it has high utility value as a means for predicting the risk of lung injury associated with cancer treatment or treatment of autoimmune disease, that is, the biomarker of the present invention is "lung associated with cancer treatment or treatment of autoimmune disease”. It is also extremely useful as a "biomarker that predicts the risk of disability.”
  • Biomarkers that predict the risk of lung damage associated with cancer treatment or treatment of autoimmune diseases are the risks of lung damage or exacerbation of lung damage associated with treatment in cancer treatment or treatment of autoimmune diseases.
  • the biomarkers of the present invention provide an objective judgment material for distinguishing patients at high risk of developing lung injury as an adverse event from other patients.
  • the biomarker of the present invention has high utility value in identifying or selecting a patient who is at high risk of developing lung injury as an adverse event.
  • biomolecule means a molecule (compound) found in a living body.
  • a specific biomolecule is used as a biomarker, but when using it (typically, application to a risk prediction method), a biomolecule in a blood sample / sample separated from the living body is used. ..
  • the present invention utilizes "anti-GPRC5A antibody” or "HLA-A2402 restrictive GPRC5A peptide-specific cytotoxic T cells” that are useful for detecting the presence of an immune response to GPRC5A. That is, the biomarker of the present invention is composed of "anti-GPRC5A antibody” or "HLA-A2402 restrictive GPRC5A peptide-specific cytotoxic T cell".
  • GPRC5A has been reported to be associated with esophageal cancer, pancreatic cancer, etc. (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • the amino acid sequence of GPRC5A NCBI, Gene ID: 9052 registered in the public database and the gene sequence encoding it are shown in the attached sequence listing.
  • SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence of GPRC5A (NCBI Reference Sequence: NP_003970.1 retinoic acid-induced protein 3 [Homo sapiens])
  • SEQ ID NO: 2 cDNA sequence of GPRC5A (NCBI Reference Sequence: NM_003979.3, Homo sapiens G protein-coupled receptor class C group 5 member A (GPRC5A), mRNA)
  • HLA-A2402 binding GPRC5A peptide-specific cytotoxic T cells (hereinafter, may be referred to as "GPRC5A-specific CTL" for convenience of explanation) specifically recognize the complex of HLA-A2402 and GPRC5A peptide. It is a T cell (CTL) that exhibits cytotoxic activity. It is unique and characteristic that a particular CTL becomes a biomarker.
  • CTL T cell
  • the "lung disorder” in the present invention typically occurs with the treatment of cancer or autoimmune diseases, that is, is positioned as an adverse event in these treatments.
  • the term "pulmonary disorder” should be interpreted in a broad sense, and its type, degree, degree of progression, etc. are not particularly limited.
  • interstitial pneumonia is the target of risk prediction.
  • the present invention can also be used for risk prediction, diagnosis / differentiation, etc. of idiopathic interstitial pneumonia.
  • Cancer treatment is not particularly limited as long as lung damage as an adverse event may occur or the lung damage may be exacerbated when it is applied (that is, when it is used for treating a patient). Therefore, cancer immunotherapy, drug therapy targeting cancer (chemotherapy), etc. correspond to cancer treatment. From the mechanism (estimated) that GPRC5A is released and diffused from cancer cells crushed by cancer treatment and an immune response using GPRC5A peptide as an antigen is triggered to cause lung damage, cancer is treated. As far as the subject is concerned, not only immunotherapy and drug therapy (chemotherapy), but also radiotherapy and surgical therapy (surgical resection) can be classified as "cancer treatment” in the present invention.
  • Immunotherapy in cancer treatment includes treatment with immune checkpoint inhibitors (typically antibodies), antibody therapy, and tumor-specific T cells (CAR-).
  • immune checkpoint inhibitors typically antibodies
  • CAR- tumor-specific T cells
  • adoptive immunotherapy using non-specific effector cells adoptive immunotherapy using non-specific effector cells, agonist antibody against costimulatory molecule
  • cytokine therapy cytokine gene therapy, etc.
  • the biomarker of the present invention is particularly useful for predicting the risk of lung injury (particularly interstitial pneumonia) associated with treatment with an immune checkpoint inhibitor or antibody therapy.
  • antibody drugs used for these treatments include anti-PD-1 antibody drugs such as nivolumab (Opdivo®) and pembrolizumab (Keytruda®), avelumab (Bavencio®), and atezolizumab ( Anti-PD-L1 antibody drugs such as Tecentriq (registered trademark) and Durvalumab (Imfinzi (registered trademark)), anti-CTLA-4 antibody drugs such as ipilimumab (Yervoy (registered trademark)) and tremelimumab, rituximab (Rituxan (registered trademark)) ), Trastuzumab (Herceptin®), Alemtuzumab (Campath®), Cetuximab (Erbitux®), Panitumumab (Vectibi
  • cancers are non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, breast cancer, cervical cancer, uterine body cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, vaginal cancer, gastric cancer, duodenal cancer, small intestinal cancer , Colorectal cancer, rectal cancer, colon cancer, anal cancer, esophageal cancer, oral cancer, tongue cancer, pharyngeal cancer, head and neck cancer, gastrointestinal stromal tumor (GIST), malignant melanoma (Melanoma), hepatocellular carcinoma, bile duct cancer (extrahepatic bile duct cancer, intrahepatic bile duct cancer), bile sac cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, renal cell cancer, bladder cancer, urinary tract , Prostate cancer, thyroid cancer, adrenal cancer, pituitary tumor, pineapple tumor, neuroblastoma, glioma, gliogry cell tumor, myeloid blast species, hodgkin lymphoma, B-cell non-ho
  • the biomarker of the present invention can also be used to predict the risk of lung damage associated with the treatment of autoimmune diseases.
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, systemic erythematosus, rheumatic fever, scleroderma, dermatomyositis, polymyositis, nodular polyarteritis, Sjogren's syndrome, mixed connective tissue disease (MCTD), and polyangiitis.
  • Germocytosis (Wegener's granulomatosis), eosinophilia polyangiitis granulomatosis (Charg-Strauss syndrome), microscopic polyangiitis, Takayasu's arteritis (aortitis syndrome), giant cell arteritis ( Temporal arteritis), rheumatic polymyositis, eosinophilic myocarditis, adult Still's disease, tonic spondylitis, psoriatic arteritis, recurrent polychondritis, Bechet's disease and sarcoidosis.
  • a second aspect of the present invention relates to a method for predicting the risk of lung damage with respect to the use of the biomarker of the present invention (hereinafter, may be referred to as "risk prediction method of the present invention").
  • risk prediction method of the present invention the level of the biomarker (anti-GPRC5A antibody or HLA-A2402 binding GPRC5A peptide-specific cytotoxic T cell) of the present invention in a blood sample derived from a subject is used as an index for lung injury.
  • Predict risk Typically, the following steps (1) to (3) will be carried out.
  • a step of preparing a blood sample collected from a subject (2) A step of measuring the biomarker in the blood sample (3) A step of determining the risk of lung injury based on the measured value. A step in which high levels of the biomarker represent a high risk of lung injury
  • Step (1) a blood sample derived from the subject is prepared.
  • cancer treatment or treatment of autoimmune disease is planned or considered, and lung injury as an adverse event occurs or lung injury.
  • patients who are concerned about the possibility of exacerbation are the subjects.
  • the present invention is particularly useful for predicting the risk of interstitial pneumonia among lung disorders, and when the present invention is used for predicting the risk of interstitial pneumonia, for example, interstitial pneumonia (particularly idiopathic) Those who are suspected of developing (interstitial pneumonia) or who may develop it in the future are the subjects.
  • the allele in the antigen and its combination in HLA possessed by the subject are not particularly limited.
  • Examples of alleles in the antigen include A * 02: 01, A * 02: 06, A * 02: 07, A * 02: 10, A * 02: 18, A * 02: 03, A * 24: 02, A.
  • the subject's blood for example, peripheral blood
  • plasma or serum can be used as the blood sample.
  • Blood samples may be collected and prepared by a conventional method. Blood samples are prepared prior to the practice of the present invention. That is, the risk prediction method of the present invention does not include treatment (blood sampling) for a patient to prepare a sample.
  • Step (2) the biomarker in the blood sample is measured.
  • An appropriate measurement method is used depending on the biomarker to be adopted.
  • anti-GPRC5A antibody is adopted as a biomarker, measurement is usually performed using an immunological method. According to the immunological method, rapid and sensitive measurement is possible. Also, the operation is simple. Immunological measurements use substances that have specific binding to the biomarker anti-GPRC5A antibody. As the substance, GPRC5A or an antibody-binding fragment thereof is typically used.
  • the "antibody-binding fragment” is an "GPRC5A fragment” containing an epitope that binds to an anti-GPRC5A antibody, and has a binding property to an anti-GPRC5A antibody as well as a full-length GPRC5A.
  • the measurement method examples include fluorescence immunoassay (FIA method), enzyme immunoassay (EIA method), radioimmunoassay (RIA method), Western blotting, and latex agglutination method.
  • Preferred measurement methods include the FIA method and the EIA method. According to these methods, it is possible to measure with high sensitivity, quickly and easily.
  • FIA method a fluorescent label is used to detect an antigen-antibody complex (immune complex) using fluorescence as a signal.
  • an enzyme label is used to detect an immune complex using color development or luminescence based on an enzyme reaction as a signal.
  • FIA method or the EIA method include an ELISA method (Enzyme Linked Immunosolvent Assay), an indirect fluorescent antibody method (IIF), a fluorescent enzyme immunoassay (FEIA), and a chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA). ..
  • the ELISA method has many advantages such as high detection sensitivity, high specificity, excellent quantification, easy operation, and suitable for simultaneous processing of multiple samples.
  • An example of a specific operation method when using the ELISA method is shown below.
  • an antigen GPRC5A (eg, human recombinant GPRC5A) or an antibody-binding fragment thereof) is immobilized on an insoluble support.
  • the surface of a microplate is sensitized (coated) with an antigen (GPRC5A or an antibody-binding fragment thereof).
  • the sample is brought into contact with the immobilized antigen.
  • the anti-GPRC5A antibody As a result of this operation, if the anti-GPRC5A antibody is present in the sample, the immobilized antigen and the anti-GPRC5A antibody bind to each other to form an immune complex. After removing the non-specific binding component by a washing operation, the immune complex is detected using a labeled secondary antibody. Instead of such an indirect method, the detection may be performed by a direct method, a sandwich method, a competitive method, or the like. The details of the ELISA method are described in many books and treatises, which can be referred to when setting the experimental procedure and experimental conditions of each method.
  • HLA-A2402 binding GPRC5A peptide-specific cytotoxic T cells are adopted as biomarkers, for example, the binding between biotin and avidin (preferably streptavidin) is used.
  • GPRC5A-specific CTL in a sample is measured using a reagent obtained by tetramerizing the complex of HLA and antigen peptide (HLA tetramer) as a probe.
  • a multimerized probe in which a plurality of MHC-peptide complexes are bound to a fluorescently labeled polymer (for example, a dextran polymer) has also been developed, and measurement using the probe is also possible.
  • the amount of GPRC5A-specific CTL is very small even if it is present in the sample, it is usually amplified prior to detection in order to improve measurement accuracy and detection sensitivity.
  • contact between the complex of the HLA-A2402 molecule and the GPRC5A peptide and the GPRC5A-specific CTL that may be present in the sample in the presence of the HLA / antigen peptide is required. Incubate the specimen under the conditions that arise. The presence of GPRC5A-specific CTLs in the sample results in specific amplification due to the addition of stimulation by the GPRC5A peptide presented on HLA-A2402.
  • Step (3) the risk of lung injury is determined based on the measurement result of step (2), that is, the level of the biomarker.
  • the “level” here typically means “amount” or “concentration”. However, the term “level” is also used to indicate whether or not the biomarker of the present invention can be detected (that is, whether or not it is apparently present) in accordance with conventional practice and common general knowledge.
  • the "risk of lung disorder” in the present invention means a specific treatment (cancer treatment or self) received by a subject when predicting the risk of lung disorder associated with cancer treatment or treatment of an autoimmune disease. It is a risk that lung damage will occur or worsen with the treatment of immune diseases).
  • the criterion that "a high level of biomarker represents a high risk of lung injury" is adopted.
  • low levels of biomarkers determine a low risk of lung injury.
  • the determination is made by comparing the measured value obtained in step (2) with the measured value of the control (control sample) or by comparing with the reference value set based on the measured value of the control or the like.
  • the control for example, a biomarker level (positive control) of a patient with pulmonary disorder, a biomarker level (negative control) of a patient without pulmonary disorder, and a bimarker level (negative control) of a healthy person can be used. ..
  • the reference value is set based on the measured values obtained from a plurality of control subjects (preferably 50 or more, more preferably 100 or more).
  • the risk of lung injury may be determined either qualitatively or quantitatively. An example of determination is shown below.
  • the judgment in the present invention is automatic / mechanical without the judgment of a person having specialized knowledge such as a doctor or a laboratory technician. Can be done.
  • Biomarker measurement ⁇ a risk of lung injury 10% or less
  • a ⁇ biomarker measurement ⁇ b risk of lung injury 20% to 30%
  • b ⁇ biomarker measurement ⁇ c 40% to 50% risk of lung injury
  • c ⁇ biomarker measurement ⁇ d risk of lung injury 60% to 70%
  • d ⁇ biomarker measurement 80% or more risk of lung injury
  • Biomarker measurement ⁇ a risk of exacerbation of lung injury 10% or less
  • a ⁇ biomarker measurement ⁇ b risk of exacerbation of lung injury 20% to 30%
  • b ⁇ biomarker measurement ⁇ c 40% to 50% risk of exacerbation of lung injury
  • c ⁇ biomarker measurement ⁇ d risk of exacerbation of lung injury 60% to 70%
  • d ⁇ biomarker measurement 80% or more risk of exacerbation of lung damage
  • the current measured value is compared with the measured value at a certain point in the past, and the measured value fluctuates, that is, whether or not the biomarker level is increased or decreased and / or increased or decreased.
  • the resulting data on changes in biomarker levels can be useful information for monitoring the risk of lung injury or for prognosis estimation. Specifically, for example, it can be determined that the risk of lung injury has increased, decreased, or has not changed between the previous examination and the current examination based on the fluctuation of the biomarker level. .. If such an evaluation is performed in parallel with the treatment, the signs of lung damage can be grasped at an early stage, and a more appropriate treatment policy can be determined. As a result, the therapeutic effect can be maximized while avoiding adverse events, which can contribute to the improvement of the patient's QOL.
  • the determination result is that when cancer or autoimmune disease is treated, lung injury as an adverse event occurs or the lung. It provides useful information in identifying patients with exacerbated disabilities. Therefore, in one aspect of the present invention, a subject at risk of or at high risk of adverse events is excluded from the treatment target based on the determination result (step (a)). Excluding subjects at risk of or at high risk of adverse events from treatment means identifying subjects with no or low risk of adverse events as treatment targets and selecting them as treatment targets. Is synonymous with. Therefore, this step makes it possible to narrow down the patients who are suitable for treatment.
  • the judgment result can also be used to determine the treatment policy of the patient. Therefore, in one aspect of the present invention, the treatment policy of the subject is determined based on the determination result (step (b)).
  • the treatment policy is designed or selected according to the judgment result.
  • the subject (patient) is not recommended for scheduled treatment and should be excluded from treatment if it is determined that there is a risk or high risk of adverse events.
  • Other treatments are recommended.
  • the planned treatment is treatment with an immune checkpoint inhibitor
  • other treatments include, for example, antimetabolites, alkylating agents, treatment with anticancer agents such as microtubule agents, and surgical resection. Can be mentioned.
  • the subject can recommend the application of the planned treatment. If the subject is treated at risk or at high risk of adverse events, the course should be carefully monitored and early action should be taken.
  • the determination result can be used for reviewing or changing the treatment policy of the patient. Therefore, in one aspect of the present invention, the treatment policy of the subject is reviewed or changed based on the determination result (step (c)).
  • the determination result may be used for prognosis estimation.
  • a more appropriate treatment policy can be established for each subject (patient).
  • therapeutic intervention can be performed earlier, and the therapeutic effect (for example, prevention of progression or exacerbation of pathological condition / pathological condition) can be increased. ..
  • kits useful for predicting, diagnosing or distinguishing risk of lung disorder.
  • the risk prediction method of the present invention can be easily implemented.
  • the kit of the present invention can also be used for simple diagnosis or differentiation of interstitial pneumonia (particularly, idiopathic interstitial pneumonia).
  • One aspect of the kit of the present invention targets an anti-GPRC5A antibody and includes a reagent for measuring an anti-GPRC5A antibody.
  • a reagent for measuring an anti-GPRC5A antibody is constructed by using a substance exhibiting specific binding property to an anti-GPRC5A antibody, that is, GPRC5A or an antibody-binding fragment thereof (hereinafter, these are collectively referred to as a “binding molecule”).
  • the binding molecule can be prepared, for example, as a recombinant protein.
  • it can be prepared by transforming a suitable host cell with DNA encoding the target binding molecule (GPRC5A or an antibody binding fragment thereof) and recovering the protein expressed in the transformant.
  • the recovered protein is appropriately purified according to the purpose. If a binding molecule is obtained as a recombinant protein in this way, various modifications are possible.
  • a DNA encoding a binding molecule and another suitable DNA are inserted into the same vector and a recombinant protein is produced using the vector, a bond consisting of the recombinant protein to which an arbitrary peptide is linked is produced.
  • Sex molecules can be obtained.
  • modifications may be made so as to add sugar chains and / or lipids, or to process the N-terminal or C-terminal. With the above modifications, it is possible to extract the recombinant protein, simplify the purification, add a biological function, and the like.
  • the binding molecule may be prepared using a cell-free synthesis system.
  • Cell-free synthesis system (cell-free transcription system, cell-free transcription / translation system) does not use living cells, but ribosomes derived from living cells (or obtained by genetic engineering methods), transcription / translation factors, etc. Is used to synthesize the mRNA or protein encoded by the template nucleic acid (DNA or mRNA) in vitro.
  • the method for preparing the binding molecule is not limited to the genetic engineering method. For example, if it is naturally occurring, the binding molecule constituting the reagent of the present invention can be prepared from a natural material by a standard method (crushing, extraction, purification, etc.).
  • the kit of the present invention for measuring the anti-GPRC5A antibody is constructed as, for example, an ELISA kit.
  • a reagent for measuring an anti-GPRC5A antibody (including a binding molecule) may be immobilized in advance.
  • the insoluble support used for immobilization is not particularly limited.
  • a resin such as polystyrene resin, polycarbonate resin, silicon resin, nylon resin, or an insoluble support made of a water-insoluble substance such as glass or magnetic material can be used.
  • the shape of the insoluble support is also not particularly limited, and examples thereof include a dish (culture dish), a multi-well plate, and particles (for example, magnetic beads). Support on an insoluble support can be performed by physical adsorption or chemisorption.
  • the enzyme-labeled secondary antibody may be included in the kit.
  • Horseradish peroxidase, microperoxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase and the like can be used for the enzyme labeling.
  • a reagent for measuring anti-GPRC5A antibody may be constructed using the labeled binding molecule, and a kit capable of directly measuring the amount of anti-GPRC5A antibody using the labeled amount as an index may be used.
  • labeling substances in this case are fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), europium, 7-AAD, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 350, Alexa.
  • the kit of the present invention is configured with HLA-A2402 restrictive GPRC5A peptide-specific cytotoxic T cells (GPRC5A-specific CTL) as measurement targets.
  • a probe labeled with a multimerized HLA-peptide complex or a reagent for preparing the probe (for example, HLA heavy chain ( ⁇ chain), ⁇ 2-microglobulin light chain, antigen peptide (GPRC5A peptide), etc.) is included in the kit.
  • HLA-A2402 is used as the HLA molecule so that the detection and measurement characteristic of the present invention can be performed.
  • HLA-A2402 may be a mutant or a variant as long as it retains the binding property to the peptide antigen.
  • the probe include a probe in which the HLA-peptide complex is tetramerized using fluorescently labeled avidin (preferably streptavidin), and a plurality of MHC-peptide complexes on a fluorescently labeled polymer (for example, dextran polymer).
  • fluorescently labeled avidin preferably streptavidin
  • MHC-peptide complexes on a fluorescently labeled polymer for example, dextran polymer
  • kits In order to enhance the convenience of the kit, other reagents (buffer solution, reaction reagent, purification reagent, etc.), containers, devices, etc. used when using the kit (for example, when implementing the risk prediction method of the present invention) are used. It may be included in the kit of the present invention. It is also preferable to include the standard sample in the kit. An instruction manual is usually attached to the kit of the present invention.
  • HLA-A24 1.
  • Various cancer cell lines (lung cancer; Sq-1, LHK2, colon cancer; SW480, HCT15, Colo320, gastric cancer; Kato-3, MKN45, hepatocellular carcinoma; HepG2, malignant melanoma; SK-MEL-128)
  • the peptide presented in HLA-A24 was recovered by immunoprecipitation, and identification was attempted by mass spectrometry.
  • HLA-A24 non-expressing colorectal cancer cell line HCT116 was used as a negative control.
  • GPRC5A is highly expressed in a lung-specific manner is an indicator that the presence of antibodies and CTLs against GPRC5A causes lung damage, that is, a general-purpose biomarker for lung damage (particularly interstitial pneumonia). Suggest that
  • Peptide bond assay (1) Method Pulse T2-A24 cells with a synthetic peptide (control peptide: HPGPRPAL (SEQ ID NO: 18), LAMB3 peptide: KYAELKDRL (SEQ ID NO: 4), GPRC5A peptide: LYAPYSTHF (SEQ ID NO: 5)). It was incubated at 27 ° C for 3 hours and then incubated at 37 ° C for 2.5 hours. Cells were incubated with anti-HLA-A24 mAb (C7709A2), followed by PE-conjugated anti-mouse antibody and then analyzed by flow cytometry.
  • control peptide control peptide: HPGPRPAL (SEQ ID NO: 18)
  • LAMB3 peptide KYAELKDRL (SEQ ID NO: 4)
  • GPRC5A peptide LYAPYSTHF (SEQ ID NO: 5)
  • GPRC5A antibody in patients with lung injury 1
  • Method Eight patients who received T2 cells that stably express GPRC5A and immune checkpoint inhibitors (nivolumab (Niv), pembrolizumab (Pem), ipilimumab (Ipi), or durvalumab (Dur)).
  • the name was subsequently experienced with lung injury (interstitial pneumonia)) serum PBS 1/10 dilution was incubated on ice, washed with PBS, and then secondary BV510-conjugated anti-human antibody (BD Horizon, BD Horizon,). Incubated with # 563247). After washing several times, it was analyzed by flow cytometry.
  • the present invention provides a means for predicting the risk of lung injury.
  • the present invention is useful for determining and changing the treatment policy, and can contribute to maximizing the therapeutic effect and improving the QOL of patients.
  • diagnosis / differentiation of idiopathic interstitial pneumonia, etc. is expected.

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Abstract

間質性肺炎（特に、特発性間質性肺炎）に代表される肺障害の発症リスク（特に、がん免疫療法等で有害事象として問題となる肺障害が発症又は増悪するリスク）を予測する手段を見出し、その利用・応用を図ることを主たる課題とする。抗GPRC5A抗体又はHLA-A2402拘束性GPRC5Aペプチド特異的細胞傷害性T細胞からなる、肺障害のバイオマーカー及びそれを利用した各種用途が提供される。

Description

がん免疫療法等における免疫関連有害事象の予測
　本発明は肺障害（特に間質性肺炎）の予測や診断等に有用なバイオマーカーに関する。特に、がん免疫療法等における免疫関連有害事象としての肺障害の予測に利用可能なバイオマーカー及びその用途等に関する。
　間質性肺炎は肺の間質を中心に炎症をきたす疾患であり、様々な原因（例えば膠原病等の自己免疫疾患、薬剤、感染症）で発症することが知られているが、原因を特定できない間質性肺炎は「特発性間質性肺炎」と呼ばれる。特発性間質性肺炎は、特発性肺線維症（IPF）、非特異性間質性肺炎（NSIP）、特異性器質化肺炎（COP）等の亜型に分類される。特発性間質性肺炎は難病に指定されており、その診断／鑑別、治療には慎重な対応が要求される。また、抗線維化薬（ピルフェニドン、ニンテダニブ）やステロイド、免疫抑制薬等が治療に使用されるが、奏効せず、治療が困難な症例（特に特発性肺線維症の場合）も多い。間質性肺炎（特に特発性間質性肺炎）を発症するリスクが事前に把握できれば、早期且つより適切な対処が可能になり、その恩恵は計り知れない。
　ところで、がん免疫療法は、一般に、体内の抗腫瘍免疫応答を活性化させることで、がん細胞を攻撃し治療効果を得るものである。しかしながら、同時に自己に対する免疫応答も意図せず活性化してしまい、自己免疫反応を誘導してしまうことが問題となっていた。とりわけ、肺組織に対する自己免疫反応である間質性肺炎は重篤な有害事象の一つとして問題視されているが、その具体的な分子メカニズムは不明であった。近年、進行癌の有効な治療法として免疫チェックポイント阻害剤（Immune checkpoint blockade: ICB）が注目され、臨床応用されているが、一部の症例では免疫関連有害事象（immune-related adverse event： irAE）として重篤な肺障害が認められ、その対策が急務となっている。間質性肺炎に代表される肺障害が起きるリスク（危険性）がわかれば、事前の回避（治療法の変更等）や早期対処等が可能になり、より適切且つ効果の高い治療を提供できる。
　尚、分子標的薬ないし免疫チェックポイント阻害剤による間質性肺炎の発症リスクを予測する手段として、STAT3遺伝子の多型を利用した判定方法が提案されている（特許文献１）。
特開２０１７－２３０９０号公報
Exp. Mol. Pathol. 107, 51-56 (2019) Int J Mol Sci 19 (7), E1870 (2018)
　以上の背景の下で本発明は、間質性肺炎（特に、特発性間質性肺炎）に代表される肺障害の発症等のリスク（特に、がん免疫療法等で有害事象として問題となる肺障害が発症又は増悪するリスク）を予測する手段を見出し、その利用・応用を図ることを主たる課題とする。
　免疫チェックポイント阻害剤（ICB）を用いた治療では抗腫瘍免疫応答のみを活性化し、がん細胞を攻撃するものの正常細胞には影響を及ぼさないことが理想的であるが、時として胸腺での教育をすり抜けた正常細胞に対する免疫応答（自己免疫応答）を活性化させてしまうことがあり、これが免疫関連有害事象（irAE）の原因となる。従って、正常細胞を攻撃している免疫細胞が認識している抗原を同定し、それらに対する免疫応答を調節することがirAEをコントロールする上で重要である。本発明者らは、間質性肺炎を引き起こしている免疫反応に着目し、それに関与するT細胞及びB細胞が認識している抗原を同定することを試みた。その際、日本人患者が間質性肺炎を起こしやすいことに注目し、日本人に特徴的な特定のHLA（ヒト白血球抗原）であるHLA-2402上に提示されているペプチドに原因抗原があると考え、HLA-2402が提示する抗原を、肺特異的なペプチド抗原に限定しつつ網羅的に解析した。その結果、肺障害の原因分子としてGPRC5A（G protein-coupled receptor class C group 5 member A）を特定することに成功した。GPRC5Aは正常組織では肺のみに限局して発現している一方、様々な組織由来のがん細胞で高発現を認めた。この事実は、がん治療によってがん細胞が破砕しGPRC5Aが放出・拡散されることにより、GPRC5Aペプチドを抗原とした免疫応答が惹起され、その結果、正常肺が攻撃を受けて肺障害が起きる、という分子機構（発症メカニズム）の存在を示唆する。従って、GPRC5Aペプチドが引き起こす免疫応答の存在、即ち、自己のGPRC5Aに対する免疫応答（自己免疫応答）が起きていることが肺障害のリスクを反映し、当該免疫応答に関与する抗GPRC5A抗体やHLA-A2402拘束性GPRC5Aペプチド特異的細胞傷害性T細胞等が肺障害のリスク予測に有用なバイオマーカーになるといえる。また、上記の実験結果に鑑みれば、抗GPRC5A抗体やHLA-A2402拘束性GPRC5Aペプチド特異的細胞傷害性T細胞等は、特発性間質性肺炎のバイオマーカーになり得る。
　ここで重要なことは、肺障害は、免疫チェックポイント阻害剤以外のがん免疫療法や、抗がん剤などを用いたがん治療でも起きうる。また、関節リウマチ等の自己免疫疾患においても併発が認められ、治療に伴い増悪する症例も少なくない。肺組織特異的にGPRC5Aが発現している事実に加え、HLA-A2402とその抗原ペプチドとして同定されたGPRC5Aが関与する免疫応答によって肺組織が障害されるという推定メカニズム、更には、抗がん剤治療による肺障害や自己免疫疾患での肺障害でも同様の免疫応答が生じている可能性があること等を総合すれば、様々ながん治療や自己免疫疾患においても、肺障害の発症や増悪を予測するバイオマーカーとして抗GPRC5A抗体やHLA-A2402拘束性GPRC5Aペプチド特異的細胞傷害性T細胞等が有用であると合理的に理解できる。また、その診断／鑑別に慎重な対応が要求され、且つ治療に苦慮することも多い特発性間質性肺炎の発症リスクを予測するバイオマーカーとしても、抗GPRC5A抗体やHLA-A2402拘束性GPRC5Aペプチド特異的細胞傷害性T細胞等が極めて有用であることが示唆される。このように、各種がん治療を受ける患者や自己免疫疾患の患者等、肺障害が起きる又は肺障害が増悪する可能性がある状態の被検者や特発性間質性肺炎の患者／潜在的患者に対して、生体内の特定の物質からなるバイオマーカーのレベルという、客観的判定指標による、発症又は増悪のリスクを予測する手段を提供できる。当該手段は、例えば、治療前においては治療対象の選定／特定（治療すべきでない患者の除外）や治療方針の決定、治療中においては肺障害への早期対処（例えば病態のモニタリングによる早期の治療介入）や治療方針の見直しないし変更、治療後においては予後の推定等に有用であり、治療効果の最大化及び患者のQOL向上を図ることができる。
　以下の発明は上記の成果及び考察に基づく。
　［１］抗GPRC5A抗体又はHLA-A2402拘束性GPRC5Aペプチド特異的細胞傷害性T細胞からなる、肺障害のバイオマーカー。
　［２］肺障害のリスク予測用である、［１］に記載のバイオマーカー。
　［３］肺障害の診断又は鑑別用である、［１］に記載のバイオマーカー。
　［４］肺障害が、がん治療又は自己免疫疾患の治療に伴う肺障害である、［１］～［３］のいずれか一項に記載のバイオマーカー。
　［５］肺障害が特発性間質性肺炎である、［１］～［３］のいずれか一項に記載のバイオマーカー。
　［６］被検者由来の血液検体における、抗GPRC5A抗体又はHLA-A2402拘束性GPRC5Aペプチド特異的細胞傷害性T細胞からなるバイオマーカーのレベルを指標にした、肺障害のリスクを予測する方法。
　［７］肺障害が、がん治療又は自己免疫疾患の治療に伴う肺障害である、［６］に記載のリスク予測方法。
　［８］がん治療が、がん免疫療法である、［７］に記載のリスク予測方法。
　［９］がん免疫療法が、免疫チェックポイント阻害剤による治療である、［８］に記載のリスク予測方法。
　［１０］治療対象のがんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、子宮頸がん、子宮体がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膣がん、胃がん、十二指腸がん、小腸がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、肛門がん、食道がん、口腔がん、舌がん、咽頭がん、頭頸部がん、消化管間質腫瘍（GIST）、悪性黒色腫（メラノーマ）、肝細胞がん、胆管がん（肝外胆管がん、肝内胆管がん）、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、尿管がん、前立腺がん、甲状腺がん、副腎がん、脳下垂体腫瘍、松果体腫瘍、神経芽腫、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、髄芽種、ホジキンリンパ腫、B細胞性非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、成人Ｔ細胞白血、末梢性T細胞リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性中皮腫（胸膜中皮腫、心膜中皮腫、腹膜中皮腫、精巣漿膜中皮腫）又は胸腺腫瘍である、［７］～［９］のいずれか一項に記載のリスク予測方法。
　［１１］治療対象のがんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、胃がん、大腸がん、食道がん、悪性黒色腫（メラノーマ）又は肝細胞がんである、［７］～［９］のいずれか一項に記載のリスク予測方法。
　［１２］自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、リウマチ熱、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、結節性多発性動脈周囲炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病（MCTD）、多発血管炎性肉芽腫症（ウェゲナー肉芽腫症）、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（チャーグ・シュトラウス症候群）、顕微鏡的多発血管炎、高安動脈炎（大動脈炎症候群）、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、リウマチ性多発筋痛症、好酸球性筋膜炎、成人スティル病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、再発性多発軟骨炎、ベーチェット病又はサルコイドーシスである、［７］に記載のリスク予測方法。
　［１３］肺障害が、間質性肺炎である、［６］～［１２］のいずれか一項に記載のリスク予測方法。
　［１４］肺障害が、特発性間質性肺炎である、［６］に記載のリスク予測方法。
　［１５］以下のステップ（１）～（３）を含む、［６］～［１４］のいずれか一項に記載のリスク予測方法：
　（１）被検者から採取された血液検体を用意するステップ；
　（２）前記血液検体中の前記バイオマーカーを測定するステップ；及び
　（３）測定値に基づき肺障害のリスクを判定するステップであって、前記バイオマーカーのレベルが高いことが肺障害の高リスクを表すステップ。
　［１６］前記バイオマーカーとして抗GPRC5A抗体が用いられ、ステップ（２）の測定に酵素免疫測定法又は蛍光免疫測定法が用いられる、［１５］に記載のリスク予測方法。
　［１７］ステップ（２）で得られた測定値と、同一の被検者から過去に採取された検体中の測定値との比較に基づきステップ（３）の判定を行う、［１５］又は［１６］に記載のリスク予測方法。
　［１８］以下のステップ（ａ）を更に含む、［１５］又は［１６］に記載のリスク予測方法：
　（ａ）判定結果に基づき、肺障害のリスクが高い被検者を治療対象から除外するステップ。
　［１９］以下のステップ（ｂ）を更に含む、［１５］又は［１６］に記載のリスク予測方法：
　（ｂ）判定結果に基づき、被検者の治療方針を決定するステップ。
　［２０］以下のステップ（ｃ）を更に含む、［１５］又は［１６］に記載のリスク予測方法：
　（ｃ）判定結果に基づき、被検者の治療方針を見直す又は変更するステップ。
　［２１］抗GPRC5A抗体測定用試薬を含む、肺障害のリスク予測、診断又は鑑別用キット。
　［２２］酵素免疫測定法又は蛍光免疫測定法の原理に基づくキットである、［２１］に記載のキット。
　［２３］ELISAキットである、［２２］に記載のキット。
　［２４］マルチマー化したHLA-A2402-ペプチド複合体を標識したプローブ又は該プローブ作製用の試薬含む、肺障害のリスク予測、診断又は鑑別用キット。
HLA-A24提示抗原ペプチドの網羅的解析。各種がん細胞株がHLA-A24上に提示するペプチド（左）を免疫沈降法を利用して回収し（中央）、質量分析法で解析した（右）。 同定された３つの候補ペプチドの各組織での発現。RT-PCR法で検出・比較した。BRAIN（脳）、COLON（大腸）、HEART（心臓）、INTEST（小腸）、KIDONEY（腎臓）、LEUK（白血球）、LIVER（肝臓）、LUNG（肺）、OVARY（卵巣）、PNCR.（膵臓）、PLCNT（胎盤）、PROST.（前立腺）、SK.MUSC.（皮膚筋肉）、SPLEEN（脾臓）、TESITS（睾丸）、THYMUS（胸腺） 各種がん細胞株におけるGPRC5Aの発現。RT-PCR法で検出・比較した。LUNG（肺）、COLON（大腸）、STMACH（胃）、ESOPHAGUS（食道）、LIVER（肝臓）、SKIN（皮膚） 神経膠芽腫腫瘍組織及び正常脳におけるGPRC5Aの発現。RT-PCR法で検出・比較した。M5346T5、M5654T3、及びM5859T3は、それぞれ、神経膠芽腫腫瘍組織のサンプルコードを示す。 GPRC5AペプチドとT2-A24との結合。フローサイトメトリーで検出・比較した。縦軸は、一次抗体有りの場合と無しの場合との蛍光強度の差の平均値を示し、GPRC5Aペプチドの検出量を表す。横軸は、パルス時のペプチド濃度を示す。 肺障害罹患患者におけるGPRC5A抗体の検出。フローサイトメトリーで検出・比較した。縦軸は、細胞数を示す。横軸は、蛍光強度を示し、GPRC5A抗体の検出量を表す。矢印は間質性肺炎罹患を経験した患者のサンプルを示す。 肺障害罹患患者におけるGPRC5A抗体の検出。ELISAで検出・比較した。縦軸は、吸光度（＝GPRC5A抗体の検出量）を示す。各カラム中の横線は中央値を示し、×印は平均値を示し、各カラムの上端は75パーセンタイル値を示し、各カラムの下端は25パーセンタイル値を示し、各カラムから伸びる線の上端は最大値を示し、各カラムから伸びる線の下端は最小値を示す。
１．肺障害のバイオマーカー
　上記の通り、本発明者らの検討によって、免役チェックポイント阻害剤を利用したがん治療等における肺障害（特に間質性肺炎）に、GPRC5Aを標的とした免疫応答が関与していることが明らかとなり、「GPRC5Aに対する免疫応答の存在」が、肺障害（特に間質性肺炎）のリスク（危険性／可能性）を反映することが示唆された。この成果に基づき本発明の第１の局面は、当該免役応答の存在の検出ないし把握に有用なマーカー物質である、「肺障害のバイオマーカー」（以下、略して「本発明のバイオマーカー」と呼ぶこともある）を提供する。当該バイオマーカーは、肺障害の中でも間質性肺炎のリスクを予測することに特に有用であり、例えば、特発性間質性肺炎の診断／鑑定、発症リスクの予測に利用され得る。一方、がん治療又は自己免疫疾患の治療に伴う肺障害のリスクを予測する手段としての利用価値も高く、即ち、本発明のバイオマーカーは、「がん治療又は自己免疫疾患の治療に伴う肺障害のリスクを予測するバイオマーカー」としても極めて有用である。「がん治療又は自己免疫疾患の治療に伴う肺障害のリスクを予測するバイオマーカー」とは、がん治療又は自己免疫疾患の治療において、治療に伴い肺障害が起きる又は肺障害が増悪するリスクの予測に有用な生体分子のことをいう。本発明のバイオマーカーを利用すれば、治療した際に肺障害が起きるか（治療開始時に被検者に肺障害を認めない場合）、或いは治療した際に肺障害が増悪するか（治療開始時に被検者に肺障害を認める場合）を事前に評価することができる。従って本発明のバイオマーカーは、有害事象としての肺障害を起こすリスクが高い患者とそれ以外の患者を区別するための客観的判断材料を提供する。特に、有害事象としての肺障害を起こすリスクが高い患者を特定ないし選択する上で本発明のバイオマーカーは利用価値が高い。
　本明細書において「生体分子」とは、生体中に見出される分子（化合物）をいう。本発明では特定の生体分子をバイオマーカーとして用いるが、その利用（典型的にはリスク予測方法への適用）に際しては、生体から分離された血液検体／試料中の生体分子が用いられることになる。
　本発明では、GPRC5Aに対する免疫応答の存在の検出に有用である「抗GPRC5A抗体」又は「HLA-A2402拘束性GPRC5Aペプチド特異的細胞傷害性T細胞」を利用する。即ち、本発明のバイオマーカーは「抗GPRC5A抗体」又は「HLA-A2402拘束性GPRC5Aペプチド特異的細胞傷害性T細胞」から構成される。GPRC5Aについては食道癌、膵臓癌等と関連が報告されている（例えば、非特許文献１、２をを参照）。公共のデータベースに登録されているGPRC5A（NCBI, Gene ID: 9052）のアミノ酸配列とそれをコードする遺伝子配列を添付の配列表に示す。配列番号と配列の対応関係は以下の通りである。
　配列番号１：GPRC5Aのアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_003970.1 retinoic acid-induced protein 3 [Homo sapiens]）
　配列番号２：GPRC5AのcDNA配列（NCBI Reference Sequence: NM_003979.3, Homo sapiens G protein-coupled receptor class C group 5 member A (GPRC5A), mRNA）
　HLA-A2402拘束性GPRC5Aペプチド特異的細胞傷害性T細胞（以下、説明の便宜上、「GPRC5A特異的CTL」と呼ぶことがある）とは、HLA-A2402とGPRC5Aペプチドの複合体を特異的に認識し、細胞障害活性を示すT細胞（CTL）である。特定のCTLがバイオマーカーになることはユニークで特徴的である。
　本発明における「肺障害」は、典型的には、がん治療又は自己免疫疾患の治療に伴って生じるものであり、即ち、これらの治療における有害事象に位置づけられる。但し、特に言及のない限り、用語「肺障害」は広義に解釈されるべきであり、その種類、程度、進行度等は特に限定されない。典型的な一態様では間質性肺炎がリスク予測の対象となる。この場合、特発性間質性肺炎のリスク予測や診断／鑑別等にも本発明を利用することができる。
　「がん治療」は、それを適用した場合（即ち、患者の治療に用いた場合）に有害事象としての肺障害が起きる又は肺障害が増悪する可能性がある限り特に限定されない。従って、がん免疫療法、がんを標的とした薬物療法（化学療法）等が、がん治療に該当する。がん治療によって破砕されたがん細胞からGPRC5Aが放出・拡散し、GPRC5Aペプチドを抗原とした免疫応答が惹起されることによって肺障害が引き起こされるというメカニズム（推定）からすれば、がんを治療対象にする限り、免疫療法や薬物療法（化学療法）に限らず、放射線療法、手術療法（外科的切除）も、本発明における「がん治療」に該当し得る。
　がん治療における免疫療法（一般に「がん免疫療法」とも呼ばれる）には、免疫チェックポイント阻害剤（典型的には抗体）を用いた治療の他、抗体療法、腫瘍特異的T細胞（CAR-T細胞等）を用いた養子免疫療法、腫瘍細胞ワクチン、腫瘍抗原ペプチドワクチン、樹状細胞ワクチン等を用いるワクチン療法、非特異的なエフェクター細胞を用いた養子免疫療法、共刺激分子に対するアゴニスト抗体を用いた治療、サイトカイン療法、サイトカイン遺伝子治療等がある。
　本発明のバイオマーカーは、免疫チェックポイント阻害剤を用いた治療又は抗体療法に伴う肺障害（特に間質性肺炎）のリスク予測に特に有用である。これらの治療に利用される抗体医薬の例として、ニボルマブ（Opdivo（登録商標））、ペムブロリズマブ（Keytruda（登録商標））等の抗PD-1抗体薬、アベルマブ（Bavencio（登録商標））、アテゾリズマブ（Tecentriq（登録商標））、デュルバルマブ（Imfinzi（登録商標））等の抗PD-L1抗体薬、イピリムマブ（Yervoy（登録商標））、トレメリムマブ等の抗CTLA-4抗体薬、リツキシマブ（Rituxan（登録商標））、トラスツズマブ（Herceptin（登録商標））、アレムツズマブ（Campath（登録商標））、セツキシマブ（Erbitux（登録商標））、パニツムマブ（Vectibix（登録商標））、オファツムマブ（Arzerra（登録商標））、デノスマブ（Ranmark（登録商標））、モガムリズマブ（Poteligeo（登録商標））、ペルツズマブ（Perjeta（登録商標））、オビヌツズマブ（Gazyva（登録商標））、ラムシルマブ（Cyramza（登録商標））、ブリナツモマブ（Blincyto（登録商標））、ジヌツキシマブ（Unituxin（登録商標））、ダラツムマブ（Darzalex（登録商標））、ネシツムマブ（Portrazza（登録商標））、エロツズマブ（Empliciti（登録商標））を挙げることができる。
　がんの例として、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、子宮頸がん、子宮体がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膣がん、胃がん、十二指腸がん、小腸がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、肛門がん、食道がん、口腔がん、舌がん、咽頭がん、頭頸部がん、消化管間質腫瘍（GIST）、悪性黒色腫（メラノーマ）、肝細胞がん、胆管がん（肝外胆管がん、肝内胆管がん）、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、尿管がん、前立腺がん、甲状腺がん、副腎がん、脳下垂体腫瘍、松果体腫瘍、神経芽腫、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、髄芽種、ホジキンリンパ腫、B細胞性非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、成人Ｔ細胞白血、末梢性T細胞リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性中皮腫（胸膜中皮腫、心膜中皮腫、腹膜中皮腫、精巣漿膜中皮腫）及び胸腺腫瘍を挙げることができる。
　本発明のバイオマーカーは、自己免疫疾患の治療に伴う肺障害のリスク予測にも利用可能である。自己免疫疾患の例として関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、リウマチ熱、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、結節性多発性動脈周囲炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病（MCTD）、多発血管炎性肉芽腫症（ウェゲナー肉芽腫症）、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（チャーグ・シュトラウス症候群）、顕微鏡的多発血管炎、高安動脈炎（大動脈炎症候群）、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、リウマチ性多発筋痛症、好酸球性筋膜炎、成人スティル病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、再発性多発軟骨炎、ベーチェット病及びサルコイドーシスを挙げることができる。
２．肺障害のリスクを予測する方法
　本発明の第２の局面は本発明のバイオマーカーの用途に関し、肺障害のリスクを予測する方法（以下、「本発明のリスク予測方法」と呼ぶことがある）を提供する。本発明のリスク予測方法では、被検者由来の血液検体における本発明のバイオマーカー（抗GPRC5A抗体又はHLA-A2402拘束性GPRC5Aペプチド特異的細胞傷害性T細胞）のレベルを指標として、肺障害のリスクを予測する。典型的には、以下のステップ（１）～（３）が実施されることになる。
　（１）被検者から採取された血液検体を用意するステップ
　（２）前記血液検体中の前記バイオマーカーを測定するステップ
　（３）測定値に基づき肺障害のリスクを判定するステップであって、前記バイオマーカーのレベルが高いことが肺障害の高リスクを表すステップ
　ステップ（１）
　ステップ（１）では被検者に由来する血液検体を用意する。がん治療又は自己免疫疾患の治療に伴う肺障害のリスクを予測する場合には、がん治療又は自己免疫疾患の治療が予定又は検討されており、有害事象としての肺障害が起きる又は肺障害が増悪する可能性が懸念される患者が被検者となる。一方、本発明は、肺障害の中でも間質性肺炎のリスク予測に特に有用であり、本発明を間質性肺炎のリスク予測に利用する場合には、例えば、間質性肺炎（特に特発性間質性肺炎）を発症していることが疑われる者又は将来発症する可能性がある者が被検者となる。
　被検者が有するHLAにおける抗原内アリル及びその組合せは特に制限されない。抗原内アリルとしては、例えばA*02:01、A*02:06、A*02:07、A*02:10、A*02:18、A*02:03、A*24:02、A*24:20、A*24:08、A*24:04、A*26:01、A*26:03、A*26:02、A*26:05、A*26:06、A*26:04、A*11:01、A*11:02、B*13:01、B*13:02、B*39:01、B*39:02、B*39:04、B*40:02、B*40:06、B*40:03、B*15:01、B*15:07、B*15:27、B*15:18、B*15:11、B*15:02、DRB1*15:02、DRB1*15:01、DRB1*16:02、DRB1*04:05、DRB1*04:06、DRB1*04:03、DRB1*04:10、DRB1*04:01、DRB1*04:07、DRB1*04:04、DRB1*08:03、DRB1*08:02、DRB1*12:01、DRB1*12:02、DRB1*13:02、DRB1*13:01、DRB1*14:54、DRB1*14:05、DRB1*14:03、DRB1*14:06、DRB1*14:07等が挙げられる。
　血液検体として被検者の血液（例えば末梢血）、血漿又は血清を用いることができる。血液検体は常法で採取、調製すればよい。血液検体は本発明の実施に先立って調製される。即ち、本発明のリスク予測方法は、検体を調製するための患者への処置（採血）を含むものではない。
　ステップ（２）
　ステップ（２）では血液検体中のバイオマーカーを測定する。採用するバイオマーカーに応じて適切な測定法が用いられる。バイオマーカーとして抗GPRC5A抗体を採用した場合、通常、免疫学的手法を利用して測定を実施する。免疫学的手法によれば迅速且つ感度のよい測定が可能である。また、操作も簡便である。免疫学的手法による測定では、バイオマーカーである抗GPRC5A抗体に特異的結合性を有する物質を使用する。当該物質として、典型的には、GPRC5A又はその抗体結合断片が用いられる。「抗体結合断片」とは、抗GPRC5A抗体と結合するエピトープを含む「GPRC5Aの断片」であり、全長GPRC5Aと同様に抗GPRC5A抗体に対する結合性を有する。
　測定法として、蛍光免疫測定法（FIA法）、酵素免疫測定法（EIA法）、放射免疫測定法（RIA法）、ウエスタンブロット法、ラテックス凝集法を例示することができる。好ましい測定法としてはFIA法及びEIA法を挙げることができる。これらの方法によれば高感度、迅速且つ簡便に測定可能である。FIA法では蛍光標識を利用し、蛍光をシグナルとして抗原抗体複合体（免疫複合体）を検出する。一方、EIA法では酵素標識を利用し、酵素反応に基づく発色ないし発光をシグナルとして免疫複合体を検出する。FIA法ないしEIA法の具体例として、ELISA法（Enzyme Linked Immunosolvent Assay）、間接蛍光抗体法（IIF）、蛍光酵素免疫測定法（FEIA）、化学発光酵素免疫測定法（CLEIA）を挙げることができる。
　ELISA法は検出感度が高いことや特異性が高いこと、定量性に優れること、操作が簡便であること、多検体の同時処理に適することなど、多くの利点を有する。ELISA法を利用する場合の具体的な操作法の例を以下に示す。まず、抗原（GPRC5A（例えばヒト組換えGPRC5A）又はその抗体結合断片）を不溶性支持体に固定化する。具体的には例えばマイクロプレートの表面を抗原（GPRC5A又はその抗体結合断片）で感作する（コートする）。ブロッキング操作の後、固相化した抗原に対し、検体を接触させる。この操作の結果、検体中に抗GPRC5A抗体が存在していれば、固相化抗原と抗GPRC5A抗体が結合して免疫複合体が形成される。洗浄操作によって非特異的結合成分を除去した後、標識化二次抗体を利用して免疫複合体を検出する。このような間接法ではなく直接法やサンドイッチ法、或いは競合法等によって検出することにしてもよい。尚、ELISA法の詳細については数多くの成書や論文に記載されており、各方法の実験手順や実験条件を設定する際にはそれらを参考にできる。
　一方、バイオマーカーとしてHLA-A2402拘束性GPRC5Aペプチド特異的細胞傷害性T細胞（GPRC5A特異的CTL）を採用した場合には、例えば、ビオチンとアビジン（好ましくはストレプトアビジン）との結合を利用してHLAと抗原ペプチドの複合体を４量体化（HLAテトラマー）した試薬をプローブとして検体中のGPRC5A特異的CTLを測定する。蛍光標識したポリマー（例えばデキストランポリマー）に複数のMHC-ペプチド複合体を結合させたマルチマー化プローブも開発されており、当該プローブを用いた測定も可能である。
　GPRC5A特異的CTLは、検体中に存在する場合であっても微量であることから、通常、測定精度や検出感度等を向上させるため、検出に先立って増幅させる。GPRC5A特異的CTLを特異的に増幅させるためには、例えば、HLA／抗原ペプチド存在下（即ち、HLA-A2402分子とGPRC5Aペプチドの複合体と、検体中に存在し得るGPRC5A特異的CTLの接触が生じる条件）で検体をインキュベートする。検体中にGPRC5A特異的CTLが存在すれば、HLA-A2402に提示されたGPRC5Aペプチドによる刺激が加わり、特異的な増幅が生じることになる。
　ステップ（３）
　ステップ（３）では、ステップ（２）の測定結果、即ち、バイオマーカーのレベルに基づき、肺障害のリスクを判定する。ここでの「レベル」は、典型的には「量」ないし「濃度」を意味する。但し、慣例及び技術常識に従い、本発明のバイオマーカーを検出できるか否か（即ち見かけ上の存在の有無）を表す場合にも用語「レベル」が用いられる。一方、本発明における「肺障害のリスク」とは、がん治療又は自己免疫疾患の治療に伴う肺障害のリスクを予測する場合には、被検者が受ける特定の治療（がん治療又は自己免疫疾患の治療）に伴い肺障害が起きる又は増悪するリスクである。本発明では「バイオマーカーのレベルが高いことが肺障害の高リスクを表す」との判定基準を採用する。逆に言えば、バイオマーカーのレベルが低いと肺障害のリスクが低いと判定される。好ましくは、ステップ（２）で得られた測定値をコントロール（対照検体）の測定値と比較しつつ、或いは、コントロールの測定値等に基づき設定された基準値に照らして判定を行う。コントロールには、例えば、肺障害を認める患者のバイオマーカーレベル（陽性コントロール）、肺障害を認めない患者のバイオマーカーレベル（陰性コントロール）、健常者のバイマーカーレベル（陰性コントロール）を用いることができる。好ましくは、複数名（好ましくは50名以上、更に好ましくは100名以上）のコントロール対象者から取得した測定値に基づき、基準値を設定する。
　肺障害のリスクの判定は定性的、定量的のいずれであってもよい。以下、判定の例を示す。尚、本発明における判定は、判定に用いる指標（即ち、本発明のバイオマーカー）及び判定基準から明らかな通り、医師や検査技師など専門知識を有する者の判断によらずとも自動的／機械的に行うことができる。
＜肺障害を認めない被検者の場合＞
（判定例１）
　陰性コントロール（肺障害を認めない患者）の測定値と陽性コントール（肺障害を認める患者）の測定値に基づき設定した基準値よりもバイオマーカーの測定値（検体中レベル）が高いときに「肺障害が起きる」又は「肺障害が起きるリスクが高い」と判定し、基準値よりもバイオマーカーの測定値（検体中レベル）が低いときに「肺障害が起きない」又は「肺障害が起きるリスクが低い」と判定する。
（判定例２）
　肺障害が起きるリスクを分ける複数の基準値を設定し、以下の通り判定する。この例では、４つの基準値（ａ＜ｂ＜ｃ＜ｄ）を設定することにしているが、基準値の数及びそれに伴うリスクのレベルの数はこれに限られるものではない。
　バイオマーカーの測定値＜ａの場合：　肺障害が起きるリスク１０％以下
　ａ≦バイオマーカーの測定値＜ｂの場合：　肺障害が起きるリスク２０％～３０％
　ｂ≦バイオマーカーの測定値＜ｃの場合：　肺障害が起きるリスク４０％～５０％
　ｃ≦バイオマーカーの測定値＜ｄの場合：　肺障害が起きるリスク６０％～７０％
　ｄ≦バイオマーカーの測定値の場合：　肺障害が起きるリスク８０％以上
＜既に肺障害を認める被検者の場合＞
（判定例１）
　陽性コントール（肺障害を認める患者）の測定値に基づき設定した基準値（肺障害を認める患者の標準的なレベル）よりもバイオマーカーの測定値（検体中レベル）が高いときに「肺障害が増悪する」又は「肺障害が増悪するリスクが高い」と判定し、基準値よりもバイオマーカーの測定値（検体中レベル）が低いときに「肺障害が増悪しない」又は「肺障害が増悪するリスクが低い」と判定する。
（判定例２）
　増悪リスクを分ける複数の基準値を設定し、以下の通り判定する。この例では、４つの基準値（ａ＜ｂ＜ｃ＜ｄ）を設定することにしているが、基準値の数及びそれに伴うリスクのレベルの数はこれに限られるものではない。
　バイオマーカーの測定値＜ａの場合：　肺障害が増悪するリスク１０％以下
　ａ≦バイオマーカーの測定値＜ｂの場合：　肺障害が増悪するリスク２０％～３０％
　ｂ≦バイオマーカーの測定値＜ｃの場合：　肺障害が増悪するリスク４０％～５０％
　ｃ≦バイオマーカーの測定値＜ｄの場合：　肺障害が増悪するリスク６０％～７０％
　ｄ≦バイオマーカーの測定値の場合：　肺障害が増悪するリスク８０％以上
　本発明の一態様では、同一の被検者について、現在の測定値と、過去のある時点での測定値とを比較し、測定値の変動、即ちバイオマーカーレベルの増減の有無及び／又は増減の程度を調べる。その結果得られる、バイオマーカーレベルの変動に関するデータは、肺障害のリスクをモニターするため、或いは予後推定に有用な情報となる。具体的には例えば、バイオマーカーレベルの変動を根拠として、前回の検査から今回の検査までの間に肺障害のリスクが高くなった又は低くなった或いは変化がないとの判定を行うことができる。このような評価を治療と並行して行えば肺障害の兆候を早期に把握することができ、より適切な治療方針の決定が可能となる。その結果、有害事象を回避しつつ治療効果の最大化を図ることができ、患者のQOL向上にも貢献し得る。
　がん治療又は自己免疫疾患の治療に伴う肺障害のリスク予測に本発明を利用する場合、判定結果は、がん又は自己免疫疾患の治療をした際、有害事象としての肺障害が起きる又は肺障害が増悪する患者を特定する上で有用な情報を提供する。そこで本発明の一態様では、判定結果に基づき、有害事象が生じるリスクのある又はリスクが高い被検者を治療対象から除外する（ステップ（ａ））。有害事象が生じるリスクのある又はリスクが高い被検者を治療対象から除外することは、有害事象が生じるリスクのない又はリスクが低い被検者を治療対象として特定し、治療対象として選択することと同義である。従って、このステップにより、治療に適合する患者を絞り込むことが可能になる。
　一方、判定結果は患者の治療方針の決定に利用することもできる。そこで本発明の一態様では、判定結果に基づき、被検者の治療方針を決定する（ステップ（ｂ））。治療方針は判定結果に応じて設計ないし選択される。典型的には、有害事象が生じるリスクがある又はリスクが高いと判定された場合、被検者（患者）には、予定されていた治療は推奨されず、治療対象から除外されるべきであり、他の治療法が推奨される。例えば、予定されていた治療が免疫チェックポイント阻害剤による治療の場合、他の治療法としては例えば代謝拮抗剤、アルキル化剤、微小管作用薬等の抗がん剤による治療、外科的切除を挙げることができる。他方、有害事象が生じるリスクがない又はリスクが低いと判定された場合、被検者（患者）は、予定されていた治療の適用を推奨できる。尚、有害事象が生じるリスクがある又はリスクが高いと判定されたものの当該被検者を治療対象とした場合は、経過を注意深く観察し、早期の対処をするとよい。
　治療中又は治療後に本発明のリスク予測方法を実施する場合、判定結果を患者の治療方針の見直し又は変更に利用することもできる。そこで本発明の一態様では、判定結果に基づき、被検者の治療方針を見直す又は変更する（ステップ（ｃ））。判定結果を予後の推定に利用するこにしてもよい。
　以上のように、本発明を利用すれば被検者（患者）毎、より適切な治療方針を立てることができる。その結果、有害事象の回避が可能になることはもとより、不要な治療を行わずに済み、患者の負担軽減、医療費削減等の利益が得られる。また、例えば、免疫チェックポイント阻害剤による治療を躊躇していた症例に対しては、より早く治療介入でき、治療効果（例えば、病態／病状の進展ないし増悪の阻止）の増大を図ることができる。
３．肺障害のリスク予測、診断又は鑑別用キット
　本発明は肺障害のリスク予測、診断又は鑑別に有用なキット（検査キット）も提供する。例えば、当該キットを利用すれば、本発明のリスク予測方法を簡便に実施することができる。また、間質性肺炎（特に、特発性間質性肺炎）の簡便な診断又は鑑別にも本発明のキットは利用され得る。本発明のキットの一態様は、抗GPRC5A抗体を検出対象としたものであり、抗GPRC5A抗体測定用試薬を含む。抗GPRC5A抗体に特異的結合性を示す物質、即ち、GPRC5A又はその抗体結合断片（以下、これらをまとめて「結合性分子」と呼ぶ）を用いて抗GPRC5A抗体測定用試薬が構成される。結合性分子は、例えば、組換え（リコンビナント）タンパク質として調製することができる。例えば、目的の結合性分子（GPRC5A又はその抗体結合断片）をコードするDNAで適当な宿主細胞を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜精製される。このように組換えタンパク質として結合性分子を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、結合性分子をコードするDNAと他の適当なDNAとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドが連結された組換えタンパク質からなる結合性分子を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはN末端若しくはC末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。無細胞合成系を用いて結合性分子を調製することにしてもよい。無細胞合成系（無細胞転写系、無細胞転写／翻訳系）とは、生細胞を用いるのではく、生細胞由来の（或いは遺伝子工学的手法で得られた）リボソームや転写・翻訳因子などを用いて、鋳型である核酸（DNAやmRNA）からそれがコードするmRNAやタンパク質をin vitroで合成することをいう。尚、結合性分子の調製法は遺伝子工学的手法によるものに限られない。例えば天然に存在するものであれば、天然材料から標準的な手法（破砕、抽出、精製など）によって、本発明の試薬を構成する結合性分子を調製することもできる。
　抗GPRC5A抗体を測定対象とした本発明のキットは、例えばELISAキットとして構築される。この場合には、抗GPRC5A抗体測定用試薬（結合性分子を含む）を予め固相化しておいてもよい。固相化に用いる不溶性支持体は特に限定されない。例えばポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等の樹脂や、ガラス、磁性体等の水に不溶性の物質からなる不溶性支持体を用いることができる。不溶性支持体の形状も特に限定されず、その例を挙げるとディッシュ（培養皿）、マルチウェルプレート、粒子（例えば磁気ビーズ）である。不溶性支持体への担持は物理吸着又は化学吸着によって行うことができる。ELISAキットの場合、酵素標識した二次抗体をキットに含めるとよい。酵素標識には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ等を用いることができる。
　標識化された結合性分子を用いて抗GPRC5A抗体測定用試薬を構成し、標識量を指標に抗GPRC5A抗体量を直接的に測定することが可能なキットにしてもよい。この場合の標識物質の例を挙げれば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）、ユーロピウム、7-AAD、Alexa Fluor（登録商標）488、Alexa Fluor（登録商標）350、Alexa Fluor（登録商標）546、Alexa Fluor（登録商標）555、Alexa Fluor（登録商標）568、Alexa Fluor（登録商標）594、Alexa Fluor（登録商標）633、Alexa Fluor（登録商標）647、CyTM 2、DsRED、EGFP、EYFP、FITC、PerCPTM、R-Phycoerythrin、Propidium Iodide、AMCA、DAPI、ECFP、MethylCoumarin、Allophycocyanin、CyTM 3、CyTM 5、Rhodamine-123、Tetramethylrhodamine、Texas Red（登録商標）、PE、PE-CyTM5、PE-CyTM5.5、PE-CyTM7、APC、APC-CyTM7、ピレン、HyLite等の蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ等の酵素、ルミノール、アクリジン色素等の化学又は生物発光化合物、3H、13C、32P、131I、125I等の放射性同位体である。
　別の一態様では、HLA-A2402拘束性GPRC5Aペプチド特異的細胞傷害性T細胞（GPRC5A特異的CTL）を測定対象として本発明のキットは構成される。この場合、マルチマー化したHLA-ペプチド複合体を標識したプローブ又は当該プローブ作製用の試薬（例えば、HLA重鎖（α鎖）、β2-ミクログロブリン軽鎖、抗原ペプチド（GPRC5Aペプチド）等）がキットに含まれる。本発明に特徴的な検出・測定が可能になるように、HLA分子としてHLA-A2402が用いられる。HLA-A2402はペプチド抗原との結合性を保持していればよく、変異体ないし改変体であってもよい。
　プローブの具体例として、蛍光標識したアビジン（好ましくはストレプトアビジンを用いる）を利用してHLA-ペプチド複合体がテトラマー化したプローブ、蛍光標識したポリマー（例えばデキストランポリマー）に複数のMHC-ペプチド複合体を結合させたマルチマー化プローブを挙げることができる。
　キットの利便性を高めるため、その使用の際（例えば本発明のリスク予測方法を実施する際）に使用するその他の試薬（緩衝液、反応用試薬、精製用試薬等）や容器、装置等を本発明のキットに含めてもよい。また、標準試料をキットに含めることが好ましい。尚、通常、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。
１．HLA-A24が提示するペプチドの網羅的解析
（１）方法（図１）
　各種がん細胞株（肺がん；Sq-1, LHK2、大腸がん；SW480, HCT15, Colo320、胃がん；Kato-3, MKN45、肝細胞がん；HepG2、悪性黒色腫；SK-MEL-128）を用い、HLA-A24に提示されているペプチドを免疫沈降法を利用して回収し、質量分析法により同定を試みた。陰性コントロールとしてHLA-A24非発現大腸がん細胞株HCT116を用いた。
　同定されたペプチドから、肺がん細胞株と他のがん細胞株の両者に認められるもの（即ち、共有されているペプチド）は除き、肺に特異的なペプチドを抽出・同定した。同定されたペプチドの遺伝子発現等に関して、報告されているデータベース(Human Protein Atlas：https://www.proteinatlas.org/）も利用し、より詳細に解析した。
（２）結果
　全ての種類のがん細胞株（LHK2, Sq-1, SW480, Colo320, HCT15, KATO-3, MKN45, HepG2, SK-MEL-128）に対する、HLA-A24抗体を用いた免疫沈降及び質量分析によって、23,000種類のペプチドが同定された。肺がん細胞株のみで認められるペプチドを抽出したところ620種類のペプチドが同定された。更に、肺組織での発現パターンから、最終的に３つの候補ペプチド、CAPN2（HQVIVARF：配列番号３）、LAMB3（KYAELKDRL：配列番号４）及びGPRC5A（LYAPYSTHF：配列番号５）が同定された。
２．同定されたペプチドの各組織での発現
（１）方法
　３つの候補ペプチド(CAPN2, LAMB3, GPRC5A)に関して、各組織での発現をRT-PCR法でより詳細に解析した。
（２）結果
　GPRC5Aのみが正常肺で高発現が認められ（図２）、間質性肺炎の原因抗原となっている可能性が示唆された。一方、肺がん以外のがん種の治療でも間質性肺炎の有害事象が認められることから、各種がん細胞株でGPRC5Aの発現を検討したところ、広範ながん細胞株で発現が認められた（図３）。これらの結果は、肺がんを含む様々ながんにおいて、GPRC5Aの発現によって免疫応答が誘導され、間質性肺炎が引き起こされることを示唆する。また、GPRC5Aが肺特異的に高発現している事実は、GPRC5Aに対する抗体やCTLの存在が、肺障害が生じることの指標、即ち、肺障害（特に間質性肺炎）の汎用的なバイオマーカーになることを示唆する。
３．同定された遺伝子の神経/脳での発現
（１）方法
　GPRC5A、神経膠芽腫関連遺伝子（ARID3A、CDCA8、CEP55、CEP170、KDM58、KNL1）、及びHouse keeping遺伝子（G3PDH）に関して、神経膠芽腫腫瘍組織及び正常脳での発現をRT-PCR法でより詳細に解析した。ヒト正常脳のcDNAはクロンテック社より購入した。神経膠芽腫腫瘍組織から、Rneasy Mini Kit（キアゲン社製）を使用してtotalRNAを抽出して、oligo(dT)プライマー及びSuperScript III reverse transcriptase（インビトロジェン社製）を使用してcDNAを合成した。
（２）結果
　結果を図４に示す。GPRC5Aは、神経腫瘍組織では発現が認められるものの、正常脳では発現が認められなかった。
４．ペプチド結合アッセイ
（１）方法
　合成ペプチド（コントロールペプチド：HPGPRPAL（配列番号１８）、LAMB3ペプチド：KYAELKDRL（配列番号４）、GPRC5Aペプチド：LYAPYSTHF（配列番号５））でT2-A24細胞をパルスして、27℃で3時間インキューベートし、さらに37℃で2.5時間インキュベートした。細胞を、anti-HLA-A24 mAb (C7709A2) とインキュベートし、続いてPE-conjugated anti-mouse antibodyとインキュベートした後、フローサイトメトリーで解析した。
（２）結果
　結果を図５に示す。GPRC5AペプチドがT2-A24細胞に結合することが分かった。
５．肺障害罹患患者におけるGPRC5A抗体の検出1
（１）方法
　GPRC5Aを安定発現するT2細胞と、免疫チェックポイント阻害剤（ニボルマブ（Niv）、ペムブロリズマブ（Pem）、イピリムマブ（Ipi）、又はデュルバルマブ（Dur））投与された患者8名（内、4名はその後に肺障害（間質性肺炎）罹患を経験）の血清のPBS1/10希釈液とを、氷上でインキュベートし、PBSで洗浄した後、secondary BV510-conjugated anti-human antibody (BD Horizon, # 563247)とインキュベートさせた。数回洗浄した後、フローサイトメトリーで解析した。
（２）結果
　結果を図６に示す。肺障害（間質性肺炎）罹患を経験した患者のサンプルにおいてのみ、GPRC5A抗体が検出された。
６．肺障害罹患患者におけるGPRC5A抗体の検出2
（１）方法
　96ウェル平底EIA/RIAプレート（Costar #3590）を、2ng/50ul/ウェルのヒトGPRC5A全長タンパク質（Abnova社、#H00009052-G1）の炭酸塩-重炭酸塩緩衝液（Sigma社、#C3041）溶液でコーティングした（4℃、終夜）。300μl/ウェルのPBST（0.05% Tween in PBS）でウェルを洗浄し、300μl/ウェルのブロッキング液（Pierc（商標） Protein-Free Blocking Buffer、ThermoFisher社、#37572）でウェルをブロッキング処理した（室温、1.5時間）。ブロッキング液を除去して、健常者12名及び肺障害（間質性肺炎）患者6名それぞれの血清のPBS1/1000希釈液50μl/ウェルを添加して、振とう器上、室温で1.5時間インキュベートした。300μl/ウェルのPBSTでウェルを複数回洗浄し、50μl/ウェルのHRP-conjugated Donkey anti-human IgG secondary Ab（Biolegend 410902, 1:4000 in Pierc（商標） Protein-Free Blocking Buffer）をウェルに添加し、振とう器上、1時間インキュベートした。300μl/ウェルのPBSTでウェルを6回洗浄した後、同容量のPBSでウェルを1回洗浄した。続いて、100μl/ウェルの3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) 基質をウェルに添加して10-20分間インキュベートし、652nmの波長光の吸光度を測定した。
（２）結果
　結果を図７に示す。肺障害（間質性肺炎）患者のサンプルの方が健常者サンプルよりもGPRC5A抗体の検出量が多かった。
　本発明は肺障害のリスクを予測する手段を提供する。本発明は治療方針の決定、変更等に有用であり、治療効果の最大化及び患者のQOL向上に貢献し得る。特に、がん免疫療法（特に免疫チェックポイント阻害剤ないし分子標的薬を用いた治療）における有害事象としての間質性肺炎の回避や早期対処、特発性間質性肺炎の診断／鑑別等への本発明の利用が期待される。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (24)

  1. 　抗GPRC5A抗体又はHLA-A2402拘束性GPRC5Aペプチド特異的細胞傷害性T細胞からなる、肺障害のバイオマーカー。
  2. 　肺障害のリスク予測用である、請求項１に記載のバイオマーカー。
  3. 　肺障害の診断又は鑑別用である、請求項１に記載のバイオマーカー。
  4. 　肺障害が、がん治療又は自己免疫疾患の治療に伴う肺障害である、請求項１～３のいずれか一項に記載のバイオマーカー。
  5. 　肺障害が特発性間質性肺炎である、請求項１～３のいずれか一項に記載のバイオマーカー。
  6. 　被検者由来の血液検体における、抗GPRC5A抗体又はHLA-A2402拘束性GPRC5Aペプチド特異的細胞傷害性T細胞からなるバイオマーカーのレベルを指標にした、肺障害のリスクを予測する方法。
  7. 　肺障害が、がん治療又は自己免疫疾患の治療に伴う肺障害である、請求項６に記載のリスク予測方法。
  8. 　がん治療が、がん免疫療法である、請求項７に記載のリスク予測方法。
  9. 　がん免疫療法が、免疫チェックポイント阻害剤による治療である、請求項８に記載のリスク予測方法。
  10. 　治療対象のがんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、子宮頸がん、子宮体がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膣がん、胃がん、十二指腸がん、小腸がん、大腸がん、直腸がん、結腸がん、肛門がん、食道がん、口腔がん、舌がん、咽頭がん、頭頸部がん、消化管間質腫瘍（GIST）、悪性黒色腫（メラノーマ）、肝細胞がん、胆管がん（肝外胆管がん、肝内胆管がん）、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がん、腎細胞がん、膀胱がん、尿管がん、前立腺がん、甲状腺がん、副腎がん、脳下垂体腫瘍、松果体腫瘍、神経芽腫、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、髄芽種、ホジキンリンパ腫、B細胞性非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、成人Ｔ細胞白血、末梢性T細胞リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性中皮腫（胸膜中皮腫、心膜中皮腫、腹膜中皮腫、精巣漿膜中皮腫）又は胸腺腫瘍である、請求項７～９のいずれか一項に記載のリスク予測方法。
  11. 　治療対象のがんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、胃がん、大腸がん、食道がん、悪性黒色腫（メラノーマ）又は肝細胞がんである、請求項７～９のいずれか一項に記載のリスク予測方法。
  12. 　自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、リウマチ熱、強皮症、皮膚筋炎、多発性筋炎、結節性多発性動脈周囲炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病（MCTD）、多発血管炎性肉芽腫症（ウェゲナー肉芽腫症）、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（チャーグ・シュトラウス症候群）、顕微鏡的多発血管炎、高安動脈炎（大動脈炎症候群）、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、リウマチ性多発筋痛症、好酸球性筋膜炎、成人スティル病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、再発性多発軟骨炎、ベーチェット病又はサルコイドーシスである、請求項７に記載のリスク予測方法。
  13. 　肺障害が、間質性肺炎である、請求項６～１２のいずれか一項に記載のリスク予測方法。
  14. 　肺障害が、特発性間質性肺炎である、請求項６に記載のリスク予測方法。
  15. 　以下のステップ（１）～（３）を含む、請求項６～１４のいずれか一項に記載のリスク予測方法：
    　（１）被検者から採取された血液検体を用意するステップ；
    　（２）前記血液検体中の前記バイオマーカーを測定するステップ；及び
    　（３）測定値に基づき肺障害のリスクを判定するステップであって、前記バイオマーカーのレベルが高いことが肺障害の高リスクを表すステップ。
  16. 　前記バイオマーカーとして抗GPRC5A抗体が用いられ、ステップ（２）の測定に酵素免疫測定法又は蛍光免疫測定法が用いられる、請求項１５に記載のリスク予測方法。
  17. 　ステップ（２）で得られた測定値と、同一の被検者から過去に採取された検体中の測定値との比較に基づきステップ（３）の判定を行う、請求項１５又は１６に記載のリスク予測方法。
  18. 　以下のステップ（ａ）を更に含む、請求項１５又は１６に記載のリスク予測方法：
    　（ａ）判定結果に基づき、肺障害のリスクが高い被検者を治療対象から除外するステップ。
  19. 　以下のステップ（ｂ）を更に含む、請求項１５又は１６に記載のリスク予測方法：
    　（ｂ）判定結果に基づき、被検者の治療方針を決定するステップ。
  20. 　以下のステップ（ｃ）を更に含む、請求項１５又は１６に記載のリスク予測方法：
    　（ｃ）判定結果に基づき、被検者の治療方針を見直す又は変更するステップ。
  21. 　抗GPRC5A抗体測定用試薬を含む、肺障害のリスク予測、診断又は鑑別用キット。
  22. 　酵素免疫測定法又は蛍光免疫測定法の原理に基づくキットである、請求項２１に記載のキット。
  23. 　ELISAキットである、請求項２２に記載のキット。
  24. 　マルチマー化したHLA-A2402-ペプチド複合体を標識したプローブ又は該プローブ作製用の試薬含む、肺障害のリスク予測、診断又は鑑別用キット。
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