WO2023214086A1 - Nouvel actif de cicatrisation et son utilisation - Google Patents
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Classifications
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Definitions
- the subject of the present document is a new peptide active ingredient and its use to promote healing.
- the epidermis also known as interfollicular epidermis (EIF)
- EIF interfollicular epidermis
- the remaining 10% are represented by melanocytes, cells responsible for skin pigmentation and photoprotection from ultraviolet rays, Langerhans cells, immune cells, and Merkel cells, sensory cells of the epidermis.
- Keratinocytes express and synthesize different structural and lipid proteins during their maturation. Keratinocytes in the basal layer give rise to cells which will begin a process of terminal differentiation during which they undergo a large number of morphological modifications and gene expressions. This outward-oriented differentiation leads to the stratification of the epidermis and thus gives rise to 4 distinct layers: the basal layer, the spinous layer, the granular layer and the stratum corneum.
- the interfollicular epidermis is the seat of a continuous renewal process, which process is ensured by epidermal stem cells at the basal layer. Within this layer, keratinocytes proliferate and then end up exiting the cell cycle, leaving the basal layer and migrating into the suprabasal layers to differentiate. To ensure constant renewal and therefore homeostasis of the epidermis, a fine balance between the processes of proliferation and differentiation is essential.
- a fibrino-platelet clot is formed immediately after the lesion, which clot constitutes a provisional matrix composed of fibrin, fibronectin, vitronectin and thrombospondin. This matrix serves as a reservoir of growth factors and a scaffolding structure for the migration of immune cells, keratinocytes, fibroblasts and endothelial cells.
- a proliferation phase follows during which fibroblasts proliferate and migrate towards the center of the wound. Once in place, these will synthesize and remodel a new extracellular matrix (ECM).
- ECM extracellular matrix
- neoangiogenesis takes place, which was triggered by the migration and reorganization of surrounding endothelial cells. All these changes lead to the differentiation of fibroblasts into myofibroblasts and the formation of granulation tissue. This results in an increase in mechanical properties which, under the influence of surrounding growth factors, induces the active multiplication of keratinocytes and their migration from the edge of the edges towards the center of the wound. Once the area is covered with a monolayer of keratinocytes, the keratinocytes differentiate to give rise to a new stratified epithelium.
- the ECM is gradually remodeled, due to a balance between its degradation by matrix metalloproteinases (MMPs) and the synthesis of its constituents.
- MMPs matrix metalloproteinases
- the vascular network changes as the granulation tissue disappears and gives way to a more or less fibrous scar.
- the aim of this phase is to obtain a tissue with a structure and function as close as possible to the original tissue.
- the wound closure process corresponding to contraction then re-epithelialization, excluding remodeling, can last for a period of a few days to a few weeks depending on the extent of the wound and the physiopathological state. of the individual.
- the wound may be subject to any type of invasion (pathogenic organisms or foreign substance) until the regeneration of a new epidermis which completely closes the wound. breach.
- the wound is usually treated to remove any contaminant likely to introduce pathogenic material into the injured area. We then carry out debridement of the tissues in this area and sanitization. In some cases, a certain number of stitches are also made to facilitate closure of the wound. Once these steps have been completed, the wound is maintained in an environment favorable to healing. To do this, different types of dressings are used to prevent the intrusion of pathogens and/or their proliferation.
- GPRC5A protein G protein-coupled receptor class C group 5 member A
- G protein-coupled receptor class C group 5 member A had the capacity, like the entire GPRC5A protein, to induce the loss of adhesion of keratinocytes and, therefore, facilitate their cellular mobility within the wound and, therefore, re-epithelialization.
- a first object of the invention relates to a polypeptide whose size is less than or equal to 60 amino acids and which comprises the sequence chosen from the C-terminal sequence of the GPRC5A protein going from residue 321 to residue 357, its orthologues, their fragments or their derivatives.
- a second subject of the invention relates to a polynucleotide (DNA or RNA) encoding a polypeptide as described above.
- a third object of the invention relates to a vector comprising the polynucleotide as described above.
- a fourth object of the invention relates to a cell transformed by a vector as described above.
- a sixth subject of the invention relates to a composition comprising such a polypeptide.
- a seventh object of the invention relates to a dressing comprising such a composition.
- An eighth subject of the invention relates to a pharmaceutical composition
- a pharmaceutical composition comprising such a polypeptide and a pharmaceutically acceptable support.
- a ninth object of the invention relates to a composition comprising such a polypeptide for its use to promote and/or accelerate the healing of a lesion of an epithelium in a subject, preferably to promote and/or accelerate the healing of an epithelium. re-epithelialization.
- Figure 1 represents an alignment of the sequence going from residue 321 to 357 of the GPRC5A sequence of Homo sapiens (SEQ ID NO: 2), with the corresponding GPRC5A sequences of Mus musculus (SEQ ID NO: 5 ), Camelus bactrianus (SEQ ID NO: 6), F elis catus (SEQ ID NO: 7), Canis lupus familiaris (SEQ ID NO: 8), Talpa occidentalis (SEQ ID NO: 9), Halichoerus grypus (SEQ ID NO: 10), Tursiops truncatus (SEQ ID NO: 11), Loxodonta africana (SEQ ID NO: 12), Gallus gallus (SEQ ID NO: 13), Cygnus olor (SEQ ID NO: 14), Aptenodytes patagonicus (SEQ ID NO: 15), Haliaeetus leucocephalus (SEQ ID NO: 16), Chelonia mydas (SEQ ID NO: 17), Tra
- Figure 2 represents an alignment of the sequence going from residue 321 to 357 of the GPRC5A sequence of Homo sapiens (SEQ ID NO: 2), with the corresponding sequences of GPRC5A of Mus musculus (SEQ ID NO: 5 ), Camelus bactrianus (SEQ ID NO:6), Felis catus (SEQ ID NO:7), Canis lupus familiaris (SEQ ID NO:8), Talpa occidentalis (SEQ ID NO:9), Halichoerus grypus (SEQ ID NO:10), Tursiops truncatus (SEQ ID NO:11) and Loxodonta africana (SEQ ID NO:12).
- Figure 3 shows the result of an adhesion test for primary keratinocytes and immortalized N/TERT-1 keratinocytes, whose GPRC5A gene has been partially disabled or not.
- Figure 4 shows the result of a cell migration test for primary keratinocytes and immortalized N/TERT-1 keratinocytes, whose GPRC5A gene has been partially disabled or not.
- Figure 5 shows the relocalization of the C-terminal region of GPRC5A in the nucleus in primary keratinocytes.
- Figure 6 shows the cleavage sites of a recombinant polypeptide mimicking the C-terminal region of GPRC5A.
- Figure 7 shows the effects of the recombinant polypeptide on the migration and adhesion of N/TERT-1 cells partially disabled for the GPRC5A gene.
- Figure 8 shows the result of a cell migration test and an adhesion test for immortalized N/TERT-1 keratinocytes, whose GPRC5A gene has been partially disabled, which have been pretreated or not with different fragments of the C-terminal region of GPRC5A.
- the polypeptide according to the invention will have a length less than or equal to 50 amino acids, preferably less than or equal to 40 amino acids and, particularly preferably less than or equal to 25 amino acids.
- the polypeptide according to the invention will have a size between 20 and 60 amino acids, preferably between 25 and 50 amino acids and, particularly preferably, the polypeptide according to the invention will have a size of 25 to 40 amino acids.
- the polypeptide according to the invention will have a size between 12 and 40 amino acids, preferably between 12 and 30 amino acids and, particularly preferably, the polypeptide according to the invention will have a size of between 12 and 25 amino acids.
- the GPRC5A protein (G protein-coupled receptor class C group 5 member A), also known under the names RAI3; TIG1; RAIG1; GPCR5A and PEIG-1, belong to the type 3 G protein-coupled receptor family and have their characteristic transmembrane domain (with 7 segments). This protein is involved in the interaction between the retinoid acid and G protein signaling pathways.
- GPRC5A sequence Homo sapiens (NP 003970.1) and its orthologs in other mammal species including Mus musculus (NP_852109.2), Camelus bactrianus (XP 010944750.1), Felis catus (XP_019690106.1), Canis lupus familiaris (XP 038294887.1), Talpa occidentalis (XP_037370212.1), Halichoerus grypus (XP_035967917.1), Tursiops truncatus (XP_033722915.1), and Loxodonta africana (XP_023410262.1).
- polypeptide according to the invention comprises the sequence X1X2HX3QX4X5X6X7X8X9X10X11X12FSIPRX13
- Xi is S, A or Y;
- X 2 is T, A or P;
- X 3 is F or L
- X 4 is M or L
- X 5 is Q, K or E;
- X 6 is N, T or S
- X 7 is Q, H, R, L or I;
- Xs is P, N, T, A, S, D, K, E or no amino acid
- X9 is P, S, A, T or no amino acid
- X10 is Q, P, K or R;
- Xu is K, R, N, Q or E
- X12 is E, D or N;
- X13 is A or P
- X14 is H, Q or K
- X15 is S, A, T or no amino acid
- Xi6 is W, P, R, H, Q or no amino acid
- X17 is P, A, T, V or L;
- Xi8 is K, N, S, H, Q or E; [0064] Xi9 is D, N or E;
- X 2 o is E, T, S or A;
- X21 is V or G
- X22 is K, R or G
- X23 is K, N or Q
- X24 is E, G, D or V;
- X25 is G, D, V, P, T or I;
- X 2 6 is S, M or K.
- amino acid refers to the 20 natural standard amino acid residues (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H , K, R, Q, N, E, D, S and T), to rare naturally occurring amino acid residues (e.g. hydroxyproline, hydroxylysine, allohydroxylysine, 6 N-methylysine, N- ethylglycine, N-methylglycine, N-ethylasparagine, allo-isoleucine, N-methylisoleucine, N-methylvaline, or aminobutyric acid) and unnatural amino acids (e.g.
- this term refers to the 20 natural standard amino acid residues (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, 5 R, Q, N, E, D, S and T).
- the L and D isomers of the amino acids are considered. Indeed, the D isomers are not sensitive to proteases and the polypeptide according to the present invention also comprises molecules comprising D amino acids, in particular polypeptides comprising only or essentially D amino acids. In a particular mode, L amino acids are preferred.
- the polypeptide according to the invention will comprise a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 21, their fragments and their derivatives.
- the polypeptide comprises the sequence X1THFQLQNX2X3 X 4 [0076] In which:
- Xi is S or A
- X 2 is Q, H or R;
- X3 is P, N, T, A, S or no amino acid
- X4 is P, S, A or no amino acid
- X 5 is Q or P
- X ⁇ is E, D or N;
- X 7 is H or Q
- Xs is S, A, T or no amino acid
- X9 is W, P, R or no amino acid
- X10 is P, A, T or V;
- Xn is K, N or S
- X12 is D or N
- Xu is V or G
- X14 is K or R
- X15 is E, G or D
- Xi 6 is G, D or V.
- the polypeptide according to the invention will comprise a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 12, their fragments and their derivatives.
- the polypeptide according to the invention will comprise a sequence chosen from the sequence SEQ ID NO: 2, its fragments and its derivatives.
- the sequence alignments (see Figure 1) also show less conservation at both ends of the sequence going from residue 321 to residue 357 of the human GPRC5A protein (SEQ ID NO: 1).
- SEQ ID NO: 1 the residues corresponding to those present at positions 321 and 322 of the human GPRC5A protein (SEQ ID NO: 1) are not necessarily conserved.
- conservation between residues 323 and 328 is required only for efficient cleavage of the C-terminus of GPRC5a.
- fragments by fragments is meant the sequences going from residue 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334 or 335 to residue 350, 351 , 352, 353, 354, 355, 356 or 357 of the human GPRC5A protein (SEQ ID NO: 1) or their orthologs, with the natural exception of the sequence going from residue 321 to residue 357 of the human GPRC5A protein (SEQ ID NO:1) and its orthologs.
- fragments are also meant the sequence going from residue 321 to residue 335 (SEQ ID NO: 33) of the human GPRC5A protein (SEQ ID NO: 1) and its orthologs and the sequence going from residue 336 to residue 347 (SEQ ID NO: 32) of the human GPRC5A protein (SEQ ID NO: 1) and its orthologs.
- derivative is meant a sequence which has a percentage of identity of at least 80% with the sequence going from residue 321 to residue 357 of the human GPRC5A protein (SEQ ID NO: 1), with the orthologous sequences thereof, with the sequence SEQ ID NO: 3 with the sequence SEQ ID NO: 4 or with the sequences of their fragments, preferably an identity of at least 85% and, particularly preferably, an identity of at least 90% with these sequences.
- Percentage of identity between two polypeptide sequences means the percentage of identical amino acids, between two sequences to be compared, obtained with the best possible alignment of said sequences. This percentage is purely statistical and the differences between the two sequences are randomly distributed over the entire length of the amino acid sequences.
- Best possible alignment or optimal alignment we mean the alignment making it possible to obtain the highest percentage of identity. Sequence comparisons between two amino acid sequences are usually carried out by comparing said sequences after they have been aligned according to the best possible alignment; the comparison is then carried out on comparison segments so as to identify and compare regions of similarity.
- the best possible alignment to perform a comparison can be achieved using the global homology algorithm developed by SMITH and WATERMAN (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), using the algorithm d local homology developed by NEDDLEMAN and WUNSCH (J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970), using the similarity method developed by PEARSON and LIPMAN (Proc. Natl. Acd. Sci.
- the identity percentage is determined by comparing the two optimally aligned sequences, said sequences may include additions or deletions with regard to the reference sequence so as to obtain the best possible alignment between these two sequences.
- the percentage identity is calculated by determining the number of identical positions between the two sequences, dividing the number obtained by the total number of positions compared and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage identity between these two sequences .
- substitution designates the replacement of an amino acid residue by another chosen from the 20 natural standard amino acid residues, the residues rare natural amino acids and unnatural amino acids.
- substitution refers to the replacement of an amino acid residue by another chosen from the 20 natural standard amino acid residues (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S and T).
- the substitution(s) may be conservative or non-conservative substitutions.
- substitution refers to a substitution of one amino acid residue for another that has similar chemical or physical properties (size, charge or polarity). Examples of conservative substitutions are shown in the following tables.
- substitutions within these derivatives are located at only the positions Xi to X26 within the consensus sequence SEQ ID NO: 3, preferably at the only positions Xi to Xi6 within the consensus sequence. SEQ ID NO:4.
- polypeptide according to the invention may also comprise other peptide sequences, whether on the N-terminal side and/or on the C-terminal side.
- the polypeptide according to the invention may also comprise at the N-terminal a tag (or label) useful for the purification or immobilization of the polypeptide.
- tags are well known to those skilled in the art and include for example the tags histidine (His&), FLAG, HA (epitope derived from the hemagglutinin of the influenza virus), MYC (epitope derived from the human protooncoprotein MYC) or GST (glutathione-S-transferase).
- the polypeptide may include a cleavage site by a protease or a chemical agent making it possible to remove this tag.
- the polypeptide may also comprise an element facilitating cellular penetration of the molecule, preferably at its C-terminal end.
- this element is a peptide facilitating the cellular penetration of the molecule (CPP element).
- CPP element a peptide facilitating the cellular penetration of the molecule
- these peptides are well known to those skilled in the art (for example, VIVES et al, Biochimica et Biophysica Acta, vol.1786, p H26-138, 2008).
- the peptide facilitating cell penetration can be chosen from the group consisting of a Tat peptide, an antennapedia or penetratin peptide, and a peptide rich in arginine and lysine.
- the polypeptide according to the invention comprises a sequence rich in arginine and lysine at its C-terminal end so as to promote nuclear localization.
- the polypeptide according to the invention does not comprise all or part of the residues X22 to it includes a sequence rich in arginine and lysine at its C-terminal end.
- the peptide bond(s) of the polypeptide according to the present invention can be modified to make them resistant to proteolysis.
- all peptide bonds can be replaced.
- the polypeptide according to the invention may comprise either a carboxylic (-COO) or amidated (-CONH2) C-terminal end.
- the polypeptide according to the invention can also be modified at its N-terminal end, for example by the addition of an acetyl radical.
- the invention also relates to the salts of said polypeptide, preferably pharmaceutically or veterinary acceptable salts.
- a pharmaceutically or veterinary acceptable salt is a salt which does not present significant toxicity, at the dose at which it is used.
- the salts may be, for example, salts with acceptable mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid; salts with acceptable organic acids such as acetic acid, citric acid, maleic acid, malic acid, succinic acid, ascorbic acid and tartaric acid; salts with acceptable mineral bases such as sodium, potassium, calcium, magnesium or ammonium salts; or salts with organic bases which have a salifiable nitrogen.
- These salts are commonly used and their preparation methods are well known to those skilled in the art.
- polypeptide instability or degradation such as hydrolysis and denaturation, which can result in decreased induction of the humoral or cellular response.
- polypeptide according to the invention will advantageously be associated with at least one stabilizer to reduce or prevent such stability problems.
- stabilizers As an example of stabilizers, mention may be made of monosaccharides, disaccharides, polysaccharides, ionic and non-ionic detergents, alkali metal salts, phospholipids, fatty acids, polyols and stabilizing peptides. like bovine serum albumin.
- composition according to the invention is a topical composition.
- topical composition refers to a composition which is applied externally to any part of the body except the mucous membranes such as the eyes, the mouth, etc.
- the topical composition can thus be applied to any part of the body except the mucous membranes such as the eyes, mouth, etc.
- composition according to the invention takes the form of an ointment, a cream, a lotion or a gel.
- the composition according to the invention may comprise numerous types of adjuvants or active ingredients used in cosmetic formulations, whether fatty substances, organic solvents, thickeners, gelling agents, softeners, antioxidants, opacifiers, stabilizers, foaming surfactants and/or detergents, emollients, superfatting agents, perfumes, ionic or non-ionic emulsifiers, fillers, sequestrants, chelators , preservatives, essential oils, coloring materials, pigments, hydrophilic or lipophilic active ingredients, humectants, such as for example glycerin or glycols, preservatives, dyes, cosmetic active ingredients, sun filters mineral and/or organic, mineral fillers such as iron oxides, titanium oxides and talc, synthetic fillers such as nylons and poly(methyl methacrylate) crosslinked or not, silicone elastomers, or extracts plants or even lipid vesicles, or any other ingredient usually used in cosmetics.
- oils we can cite paraffins, isoparaffins, white mineral oils, vegetable oils (from flowers, fruits, vegetables, trees, cereals, oilseeds, etc.), animal oils, synthetic oils, silicone oils and fluorinated oils; and more particularly: oils of plant origin, such as sweet almond oil, coconut oil, castor oil, jojoba oil, olive oil, coconut oil, rapeseed, peanut oil, sunflower oil, wheat germ oil, corn germ oil, soybean oil, cottonseed oil, alfalfa oil, poppy oil, pumpkin oil, evening primrose oil, millet oil, barley oil, rye oil, safflower oil, candlenut oil, passionflower oil, hazelnut oil, palm oil, shea butter, apricot kernel oil, calophyllum oil, sysymbrium oil, avocado oil, calendula oil, oils from flowers or vegetables; ethoxylated vegetable oils; oils of animal origin, such as squalene, squalane; mineral oils,
- dimethylpolysiloxanes methylphenylpolysiloxanes
- silicones modified by amines silicones modified by fatty acids
- silicones modified by alcohols silicones modified by alcohols and fatty acids
- modified silicones. by polyether groups, modified epoxy silicones, silicones modified by fluorinated groups, cyclic silicones and silicones modified by alkyl groups.
- fatty materials mention may be made of linear or branched, saturated or unsaturated fatty alcohols, mixtures of linear and/or branched, saturated and/or unsaturated fatty alcohols, or linear or branched fatty acids. , saturated or unsaturated, mixtures of linear or branched, saturated or unsaturated fatty acids.
- thickening and/or emulsifying polymers that can be used, there are for example homopolymers or copolymers of acrylic acid or derivatives of acrylic acid, homopolymers or copolymers of methacrylic acid or derivatives of methacrylic acid, homopolymers or copolymers of acrylamide, homopolymers or copolymers of acrylamide derivatives, homopolymers or copolymers of acrylamidomethyl propanesulfonic acid, homopolymers or copolymers of vinyl monomers, homopolymers or copolymers of trimethylaminoethylacrylate chloride, hydrocolloids of plant or bio-synthetic origin such as for example xanthan gum, karaya gum, carrageenates, alginates; silicates; cellulose and its derivatives; starch and its hydrophilic derivatives; polyurethanes.
- homopolymers or copolymers of acrylic acid or derivatives of acrylic acid homopolymers or copolymers of me
- polyelectrolyte type polymers which can be used in the production of a gelled aqueous phase suitable for use in the preparation of W/O, O/W, W/O/W or O/W/ emulsions.
- H or an aqueous gel comprising SEPIBIOTM POTENTILLA 217
- the copolymers of acrylic acid and 2-methyl-[(l-oxo-2-propenyl)amino] acid there are for example, the copolymers of acrylic acid and 2-methyl-[(l-oxo-2-propenyl)amino] acid.
- AMPS 1 -propane sulfonic acid
- fatty acids ethoxylated fatty acids, fatty acid and sorbitol esters, ethoxylated fatty acid esters, polysorbates, polyglycerol esters, ethoxylated fatty alcohols, sucrose esters, alkylpolyglycosides, sulfated and phosphated fatty alcohols or mixtures of alkylpolyglycosides and fatty alcohols;
- surfactants which can be used in the compositions according to the invention, mention may be made of: topically acceptable anionic, cationic, amphoteric or nonionic surfactants usually used in this field of activity.
- alkali metal salts alkaline earth metal salts, ammonium salts, amine salts, amino alcohol salts.
- alkyl ether sulfates alkyl sulfates, alkylamidoethers sulfates, alkylarylpolyethersulfates, monoglyceride sulfates, alpha-olefinsulfonates, paraffin sulfonates, alkylphosphates, alkyletherphosphates, alkylsulfonates, alkylamidesulfonates, alkylarylsulfonates, alkylcarboxylates, alkylsulfates osuccinates , alkyl ethersulfosuccinates, alkylamidesulfosuccinates, alkylsulfoacetates, alkylsarco
- amphoteric surfactants which can be used in the compositions according to the invention, mention may be made of alkylbetaines, alkylamidobetaines, sultaines, alkylamidoalkylsulfobetaines, imidazoline derivatives, phosphobetaines, amphopolyacetates and amphopropionates.
- composition according to the invention may be associated with other ingredients/active ingredients, in particular those known for their antioxidant, anti-radical, conservative, stabilizing, anti-aging, firming, restructuring, stimulating, energizing, oxygenating, anti-wrinkle, relaxing, moisturizing, antimicrobial, purifying, soothing, relaxing, relaxing, anti-stress, lightening, immunomodulating, stimulating action cell renewal, etc.
- other ingredients/active ingredients in particular those known for their antioxidant, anti-radical, conservative, stabilizing, anti-aging, firming, restructuring, stimulating, energizing, oxygenating, anti-wrinkle, relaxing, moisturizing, antimicrobial, purifying, soothing, relaxing, relaxing, anti-stress, lightening, immunomodulating, stimulating action cell renewal, etc.
- composition comprising the polypeptide described above may be present in the mass constituting the dressing or on a separate layer of the dressing or in a coating covering the surface of the dressing intended to come into use. contact with the wound in order to treat it.
- dressing we mean here to cover all types of known dressings and, in a preferred way, interface dressings.
- Such dressings are marketed for example under the trade names TULLE GRAS (by SOLVAY PHARMA), PHYSIOTULLE (by COLOPLAST) or even URGOTUL (by Laboratoires URGO) and described in patent EP 1 143 895.
- These interface dressings are generally in the form of a frame or a net coated with a mass, usually an elastomeric mass. They can also be made up of a mass without weft or net, having the shape of a plate with or without through holes, depending on the type of wound on which the dressing is applied (we will preferably use a plate with through holes on an exuding wound when the mass has little or no absorbent power, the holes thus allowing the evacuation of exudates from the wound).
- the present invention also finds application for the production of dressings based on hydrogels or hydrocolloids in which the aforementioned polypeptide is incorporated.
- Dressings based on known hydrocolloids are for example marketed under the names ALGOPLAQUE (by Laboratoires URGO), DUODERM (by CONVATEC), COMFEEL (by COLOPLAST).
- ALGOPLAQUE by Laboratoires URGO
- DUODERM by CONVATEC
- COMFEEL by COLOPLAST
- the polypeptide used in the context of the present invention can be incorporated into an absorbent element such as a compress or a foam, for example by depositing it on the surface intended to come into contact with the wound, as described in the WO patent application 2006/007844.
- the present invention also finds application for the production of interface dressings complexed with an absorbent layer such as a foam or a compress, or a hydrocolloid mass complexed with an absorbent foam.
- Such dressings are known and marketed for example under the trade names URGOTULDUO and CELLOSORB (by URGO Laboratories).
- the term “subject” corresponds to a mammal, preferably said subject is a human.
- lesion of an epithelium lesions likely to appear following trauma or following medical, surgical, invasive or non-invasive, curative or aesthetic procedures.
- the lesion of an epithelium is a skin lesion.
- therapeutically effective quantity we mean a quantity making it possible to induce re-epithelization within the wound. Those skilled in the art will be able to determine said therapeutically effective quantity in view of the description of the invention made in this patent application and with regard to his general knowledge and/or using simple routine experiments.
- the cells were cultured in a complete KGM-2 medium (KERATINOCYTE GROWTH MEDIUM, PROMOCELL), under an atmosphere saturated with humidity, at 37° C. and under 5% CO2 throughout the experiments.
- KERATINOCYTE GROWTH MEDIUM PROMOCELL
- GPRC5A The expression of the GPRC5A gene was negatively regulated by RNA interference approaches.
- the primary strains were transiently transfected in the presence of LIPOFECTAMINE 2000 (THERMO FISHER SCIENTIFIC) with 20nM of commercial siRNA specific for GPRC5A mRNA (siGPRC5A) (SI04438021, QIAGEN) or a control siRNA (siNT) not targeting any mRNA sequence. known mammal (SI03650318, QIAGEN).
- the N/TERT-1 line was infected with a lentiviral vector whose transcriptional activity makes it possible to release sequences of small interfering RNAs, a shRNA (“short hairpin” RNA) specific to the GPRC5A (shGPRC5A) mRNA sequence (TRCN0000005 , SIGMA ALDRICH) or a control shRNA (shCTR) composed of the same nucleotides but not targeting any known sequence (SHC002V, SIGMA ALDRICH).
- shRNA short hairpin
- RNA interference was evaluated on the quantity of protein by westem-blot.
- Proteins were extracted in RIPA buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS) supplemented with ortho 1 mM sodium vanadate and a protease inhibitor cocktail (SIGMA ALDRICH). Lysates were centrifuged for 10 min at 14,000 g at 4°C to remove cell debris. Proteins were separated by SDS-PAGE and then transferred to a polyvinylidene fluoride membrane (EMD-MILLIPORE).
- RIPA buffer 50 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS
- SIGMA ALDRICH protease inhibitor cocktail
- the membrane was blocked with 5% skim milk in Tris-buffered saline (TBS) containing 0.1% TWEEN-20, and incubated with an anti-GPRC5A antibody (HPA007928, SIGMA ALDRICH) at 1:250 and a anti-actin antibody (C4, MAB1501, SIGMA ALDRICH) at 1:5000 overnight at 4°C.
- TBS Tris-buffered saline
- an anti-GPRC5A antibody HPA007928, SIGMA ALDRICH
- C4, MAB1501, SIGMA ALDRICH anti-actin antibody
- the membrane was incubated with secondary antibodies for 1 h at room temperature: goat anti-rabbit-HRP antibody (170 -6510, BIO-RAD) or a goat anti-mouse-HRP antibody (170-6516, BIO-RAD) at 1:10000.
- Antibody binding was detected by the SUPER SIGNAL WEST PICO PLUS chemiluminescence system (THERMO FISHER SCIENTIFIC) using the
- the proliferation of the latter was determined following inactivation of the GPRC5A gene.
- the cell proliferation rate of keratinocytes transfected with siNT or siGPRC5A or transduced with shCTR or shGPRC5A lentivirus was measured using the QUANT-ITTM PICOGREENTM dsDNA Assay Kit (THERMO FISHER SCIENTIFIC ). For this, 10 4 cells have were seeded in 96-well microplates and the DNA concentration was evaluated at 1, 2 and 3 days after seeding according to the manufacturer's instructions.
- the adhesion test was carried out according to the Percoll method (GOOWIN & PAULI, J Immunol Methods 1995).
- 96-well plates were coated with either 100 pg/ml type I collagen (THERMO FISHER SCIENTIFIC) or 1% bovine serum albumin (BSA) in phosphate-buffered saline (PBS) (negative control ).
- BSA bovine serum albumin
- Cells were detached with 10 mM EDTA for 10 min at 37°C and washed twice with serum-free medium. Then, 2.5x10 4 cells/well were resuspended in serum-free medium and plated in 5 replicates for each condition.
- Cells were fixed for 5, 10, 30, 60, 120, and 240 min at 37°C, and then unfixed cells were removed with Percoll solution containing 0.57 mM NaCl. The remaining cells were fixed with Percoll solution containing 5% w/v glutaraldehyde for 15 min at room temperature. Cells were stained with 0.1% w/v crystal violet for 30 min at room temperature, and then the plates were washed with tap water. The plates were air dried and crystal violet was then extracted using 2% SDS in distilled water for 30 min on a shaker. The absorbance at 570 nm was measured spectrophotometrically on TEC AN INFINITE Ml 000. The background absorbance (from the blank wells) was subtracted from all test wells. The assay was carried out in 5 technical replicates and 3 biological replicates.
- the migration capacity of keratinocytes was determined following inactivation of the GPRC5A gene.
- the cells (2x10 4 cells/well) were seeded in a 2-well silicone insert (IBIDI) for 30 hours. After confluence, the culture insert was removed slowly. After washing with PBS, cells were cultured with full-length KGM2. The cells were then allowed to migrate in space (500 pm) and imaged in phase contract under an inverted microscope (NIKON TI-E) at times 12 p.m., 2 p.m., 4 p.m., 6 p.m., 8 p.m. and 10 p.m. for primary cells, and at times 3h, 6h, 8h, 1 Oh and 12h for N/TERT-1 cells. Quantification of cell migration was carried out by measuring uncovered areas using Image J software. Each experiment was repeated 3 technical replicates and 3 biological replicates.
- Fibroblasts (2.5x10 4 ) were seeded under the polycarbonate membrane of a cell culture insert with a porosity of 0.4 ⁇ m (NUNC, THERMO FISHER SCIENTIFIC). After 4 hours, the inserts were inverted and placed in 24-well plates, and the fibroblasts were cultured for 2 days in DMEM/F12 (1/1) supplemented with 10% fetal bovine serum (Fetal Clone II; HYCLONE , THERMO FISHER SCIENTIFIC) and 1% penicillin/streptomycin (SIGMA ALDRICH).
- keratinocytes were placed at the air/liquid interface and cultured for 2 days with the same medium, except that EGF and adenine were omitted and the final concentration of calcium chloride was adjusted to 2 mM and 50 pg/ml vitamin C. The cells were then cultured for an additional 14 days in the same medium, except that the fetal bovine serum was reduced to 1%. During the emergence phase, the culture medium was changed every day.
- Sections were blocked with 5% bovine serum albumin and incubated with the following primary antibodies overnight at 4°C: rabbit anti-GPRC5A (HPA007928, SIGMA ALDRICH, 1:250); mouse anti-E-cadherin (abl416, ABCAM, 1:1000); rabbit anti-cytokeratin 10 (ab76318, ABCAM, 1:500); and rabbit anti-involucrin (ab53112, ABCAM, 1:500).
- the secondary antibodies were: goat alexa-488 and alexa-546 anti-mouse or anti-rabbit (THERMO FISHER SCIENTIFIC). Nuclear counterstaining with DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) (SIGMA ALDRICH) was performed. The sections were then mounted in PROLONGTM GOLD ANTIFADE MOUNTANT solution (THERMO FISHER SCIENTIFIC). Image acquisition was carried out using a NIKON TI-E fluorescence microscope.
- the histological staining results showed two characteristics of the epidermis reconstructed from N/TERT-1 shGPRC5A cells, areas of less thickness than the control epidermis (shCTR), and areas showing detachment of the suprabasal layers. (see Figure 4c). These histological defects are associated with a differentiation defect characterized by a decrease in the expression and localization of E-cadherin, cytokeratin 10 and involucrin. These results demonstrate the involvement of GPRC5A in epidermal morphogenesis.
- the cells were permeabilized by adding 0.1% triton XI 00 then saturated with a solution of 5% BSA in PBS for 1 hour. Immunostaining of the N-terminal and C-terminal regions was carried out respectively by incubation of anti-GPRC5A antibodies HPA007928 (SIGMA ALDRICH, 1:250) and PA5-28738 (THERMO FISHER SCIENTIFIC, 1:250) overnight at 4 °C.
- the secondary antibody was a goat anti-rabbit antibody coupled to Alexa-546 (THERMO FISHER SCIENTIFIC).
- nucleolus Localization in the nucleolus was demonstrated by direct immunofluorescence of nucleolin by a murine antibody coupled to Alexa-488 (abl54028, ABCAM, 1:1000). Nuclear counterstaining with DAPI was performed. The sections were then mounted in PROLONGTM GOLD ANTIFADE MOUNTANT solution (THERMO FISHER SCIENTIFIC). Image acquisition was carried out using a Nikon Ti-E fluorescence microscope or a ZEISS LSM800 confocal microscope.
- the total proteins were extracted with a RIPA lysis buffer in the presence of protease inhibitors, and the proteins were labeled using the TMTSIXPLEXTM isobaric labeling reagent kit (THERMO FISCHER SCIENTIFIC ) according to the manufacturer's recommendations.
- TMTSIXPLEXTM isobaric labeling reagent kit THERMO FISCHER SCIENTIFIC
- BL21 bacteria (LIFE TECH 44-048) were transformed with the plasmid pET30a_GPRC5A-C-terminal _poIy (R/K) TEV-cleavage-site_2x-6Histidines, then cultured on a LB-agar petri dish supplemented with kanamycin . A pre-culture is then carried out in which an isolated bacterial colony is inoculated into 100ml of LB BROTH LENNOX medium (Formedium LBX0102) overnight at 37°C and 150rpm.
- LB BROTH LENNOX medium Formmedium LBX0102
- the bacteria are seeded at an OD of 0.15 in HYPER BROTH medium (ATHENAES AE-0107), then are cultivated at 37°C 150rpm.
- the evolution of the OD of the culture is monitored every hour in order to draw a growth curve (ln(OD) over time).
- ImM of IPTG is added to the culture medium in order to stimulate the production of the polypeptide.
- the culture is then continued until the stationary phase (approximately 6 hours post-seeding), then the bacterial pellets are recovered by centrifugation (4000g, 1 Ominutes at 4°C), separated from the supernatant and frozen at -20°C.
- the bacteria are lysed in a lysis buffer (PBS1X, 500mM NaCl, lOmM MgC12, 0.5 % Triton TM PROTEASE INHIBITOR COKTAIL, ROCHE), DNAse (100pg/ml) and lysozyme (10mg/ml); and incubated for 3 Ominutes on a wheel at 4°C before undergoing sonication (2x5minutes, pulse 3seconds, amplitude 30). The cellular debris as well as the insoluble fraction are separated from the soluble fraction by centrifugation (15,000 g, 15 minutes at 4°C).
- a lysis buffer PBS1X, 500mM NaCl, lOmM MgC12, 0.5 % Triton TM PROTEASE INHIBITOR COKTAIL, ROCHE
- DNAse 100pg/ml
- lysozyme 10mg/ml
- DNAse (1 OOpg/ml
- the beads previously washed with PBS1X are added to the protein suspension and incubated for 1 hour on a wheel at 4°C.
- the beads are then placed on a column (cotton filter whose porosity does not exceed the size of the beads) and the unretained fraction is eliminated by suction using a peristaltic pump (Iml/minute).
- the mixture obtained is placed in a dialysis rod rinsed with PBS1X (MWCO: 3500Da) and diffusion against a solution of PBS1X 500mM NaCl takes place in a beaker with magnetic stirring overnight at 4°C.
- the cleaved peptide is finally purified by adding, as previously, Ni-NTA beads which will fix the released ôHistidines tag (1ml of beads/50mg of peptide) for 1h on a wheel at 4°C. After depositing the peptide-bead suspension on a column identical to the previous one, the cleaved peptide is recovered in the unretained fraction, measured then aliquoted and frozen at -80°C.
- the N/TERT-1 shGPRC5A cells at confluence were treated for 1 hour with the peptides at a concentration of 30 pg/mL before wounding using a pipette cone (scratch test). Closure of the wound was observed by video microscopy for 16 hours.
- Figure 8a illustrates the percentage of wound closure during the first 9 hours for cells treated with the synthetic peptides MP66 (SEQ ID No. 28) and MP68 (SEQ ID No. 30).
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Abstract
L'invention concerne un polypeptide dont la taille est inférieure ou égale à 60 acides aminés et qui comprend la séquence choisie parmi la séquence C-terminale de la protéine GPRC5A (G protein-coupled receptor class C group 5 member A) allant du résidu 321 au résidu 357 de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1), ses orthologues, leurs fragments ou leurs dérivés; et leur utilisation pour favoriser et/ou accélérer la cicatrisation d'une lésion cutanée chez un sujet, de préférence pour favoriser et/ou accélérer la ré-épithélisation.
Description
Nouvel actif de cicatrisation et son utilisation
[0001] La présente demande de brevet revendique la priorité de la demande de brevet Français FR2204336 déposée en date du 6 mai 2022, laquelle est incorporée à la présente par référence.
Domaine de l’invention
[0002] La présente a pour objet un nouvel actif peptidique et son utilisation pour favoriser la cicatrisation.
Etat de l’art
[0003] L’épiderme, connu aussi sous le nom d’épiderme interfolliculaire (EIF), forme la couche la plus externe de la peau qui est constitué à 90% de kératinocytes. Les 10% restants sont représentés par les mélanocytes, cellules responsables de la pigmentation cutanée et de la photoprotection des rayons ultraviolets, les cellules de Langerhans, cellules immunes, et les cellules de Merkel, cellules sensorielles de l’épiderme.
[0004] Les kératinocytes expriment et synthétisent différentes protéines structurales et lipidiques au cours de leur maturation. Les kératinocytes au niveau de la couche basale donnent naissance à des cellules qui vont entamer un processus de différenciation terminale durant lequel elles subissent un grand nombre de modifications morphologiques et d’expressions géniques. Cette différenciation orientée vers l’extérieur conduit à la stratification de l’épiderme et donne ainsi lieu à 4 couches distinctes : la couche basale, la couche épineuse, la couche granuleuse et la couche cornée.
[0005] L’épiderme interfolliculaire est le siège d’un processus de renouvellement continu, lequel processus est assuré par des cellules souches épidermiques au niveau de la couche basale. Au sein de cette couche, les kératinocytes prolifèrent puis finissent par sortir du cycle cellulaire, par quitter la couche basale et migrer dans les couches suprabasales pour se différencier. Pour assurer le renouvellement constant et donc l’homéostasie de l’épiderme, un équilibre fin entre les processus de prolifération et de différenciation est primordial.
[0006] Dans le cas d’une lésion de la peau, le processus de cicatrisation va exiger une série d’évènements contrôlés avec précision au sein de l’épiderme et du derme. La cicatrisation est ainsi divisée en quatre phases : l’hémostase, l’inflammation, la prolifération et le remodelage.
[0007] En lien avec l’hémostase, un caillot fibrino-plaquettaire est formé immédiatement après la lésion, lequel caillot constitue une matrice provisoire composée de fibrine, de fibronectine, de vitronectine et de thrombospondine. Cette matrice sert de réservoir de facteurs de croissance et de structure d’échafaudage pour la migration des cellules immunes, des kératinocytes, des fibroblastes et des cellules endothéliales.
[0008] La présence de médiateurs chimiques conduit, lors de la phase inflammatoire, au recrutement de cellules immunes telles que les polynucléaires neutrophiles et les monocytes, au niveau de la zone lésionnelle, assurant le nettoyage de la plaie. Ces cellules sont responsables de la synthèse de nombreuses cytokines qui permettent d’amplifier la réponse immunitaire et de stimuler la formation du tissu de granulation.
[0009] S’ensuit une phase de prolifération au cours de laquelle des fibroblastes prolifèrent et migrent vers le centre de la plaie. Une fois en place, ces derniers vont synthétiser et remodeler une nouvelle matrice extracellulaire (MEC). En parallèle, une néoangiogénèse se met en place, laquelle a été déclenchée par la migration et la réorganisation de cellules endothéliales environnantes. Tous ces changements entrainent la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes et la formation du tissu de granulation. Il en résulte une augmentation des propriétés mécaniques qui, sous l’influence des facteurs de croissance environnants, induit la multiplication active des kératinocytes et leur migration du bord des berges vers le centre de la plaie. Une fois la zone recouverte d’une monocouche de kératinocytes, les kératinocytes se différencient pour donner lieu à un nouvel épithélium stratifié.
[0010] Enfin, la MEC est progressivement remodelée, du fait d’un équilibre entre sa dégradation par les métalloprotéinases matricielles (MMPs) et la synthèse de ses constituants. Le réseau vasculaire se modifie alors que le tissu de granulation disparait et laisse place à une cicatrise plus ou moins fibreuse. Cette phase a pour but d’obtenir un tissu ayant une structure et une fonction aussi proche que possible du tissu d’origine.
[0011] Le processus de fermeture de la plaie, correspondant à la contraction puis la ré- épithélialisation, hors remodelage, peut durer pendant une période de quelques jours à quelques semaines en fonction de l’étendue de la plaie et de l’état physiopathologique de l’individu.
[0012] Durant cette période, qu’elle soit de courte ou de longue durée, la plaie peut être sujette à tout type d’invasions (organismes pathogènes ou substance étrangères) jusqu’à la régénération d’un nouvel épiderme qui ferme complètement la brèche.
[0013] Pour éviter toute infection, la plaie est habituellement traitée afin d’enlever tout contaminant susceptible d’introduire une matière pathogène au niveau de la zone lésée. On effectue ensuite un débridement des tissus au niveau de cette zone et une aseptisation. Dans certains cas, on réalise en outre un certain nombre de points de suture afin de faciliter la fermeture de la plaie. Une fois ces étapes réalisées, la plaie est maintenue dans un environnement favorable à la cicatrisation. Pour se faire, différents types de pansements sont utilisés afin d’éviter l’intrusion de pathogènes et/ou leur prolifération.
[0014] Il est donc important, lorsque l’on traite une plaie, de favoriser le phénomène de fermeture de celle-ci afin d’éviter, par exemple, l’invasion de la plaie par des microorganismes ou des substances étrangères et, par voie de conséquence, l’infection de cette même plaie.
Sommaire de l’invention :
[0015] Afin d’induire ou d’accélérer la cicatrisation de la plaie, on peut administrer un certain nombre d’actifs susceptibles d’agir à différents niveaux et à différentes phases de la cicatrisation.
[0016] Maintenant, les inventeurs ont découvert qu’un polypeptide issu de la région C- terminale de la protéine GPRC5A (G protein-coupled receptor class C group 5 member A) avait la capacité, comme la protéine entière GPRC5A, d’induire la perte d’adhérence des kératinocytes et, de ce fait, de faciliter leur mobilité cellulaire au sein de la plaie et, de ce fait la ré-épithélialisation.
[0017] En conséquence, un premier objet de l’invention porte sur un polypeptide dont la taille est inférieure ou égale à 60 acides aminés et qui comprend la séquence choisie parmi la séquence C-terminale de la protéine GPRC5A allant du résidu 321 au résidu 357, ses orthologues, leurs fragments ou leurs dérivés.
[0018] Un deuxième objet de l’invention porte sur un polynucléotide (ADN ou ARN) codant pour un polypeptide tel que décrit précédemment.
[0019] Un troisième objet de l’invention porte sur un vecteur comprenant le polynucléotide tel que décrit précédemment.
[0020] Un quatrième objet de l’invention porte sur une cellule transformée par un vecteur tel que décrit précédemment.
[0021] Un sixième objet de l’invention porte sur une composition comprenant un tel polypeptide.
[0022] Un septième objet de l’invention porte sur un pansement comprenant une telle composition.
[0023] Un huitième objet de l’invention porte sur une composition pharmaceutique comprenant un tel polypeptide et un support pharmaceutiquement acceptable.
[0024] Un neuvième objet de l’invention porte sur une composition comprenant un tel polypeptide pour son utilisation pour favoriser et/ou accélérer la cicatrisation d’une lésion d’un épithélium chez un sujet, de préférence pour favoriser et/ou accélérer la ré-épithélialisation.
Description des figures :
[0025] La figure 1 représente un alignement de la séquence allant du résidu 321 à 357 de la séquence de GPRC5A d'Homo sapiens (SEQ ID NO :2), avec les séquences correspondantes de GPRC5A de Mus musculus (SEQ ID NO : 5), de Camelus bactrianus (SEQ ID NO :6), de F élis catus (SEQ ID NO :7), de Canis lupus familiaris (SEQ ID NO : 8), de Talpa occidentalis (SEQ ID NO :9), de Halichoerus grypus (SEQ ID NO : 10), de Tursiops truncatus (SEQ ID NO :11), de Loxodonta africana (SEQ ID NO :12), de Gallus gallus (SEQ ID NO :13), de Cygnus olor (SEQ ID NO : 14), d’ Aptenodytes patagonicus (SEQ ID NO : 15), de Haliaeetus leucocephalus (SEQ ID NO : 16), de Chelonia mydas (SEQ ID NO : 17), de Trachemys scripta elegans (SEQ ID NO :18), de Pseudonaja textilis (SEQ ID NO :19), de Python bivittatus (SEQ ID NO :20) et de Ranitomeya imitator (SEQ ID NO :21 ).
[0026] La figure 2 représente un alignement de la séquence allant du résidu 321 à 357 de la séquence de GPRC5A d'Homo sapiens (SEQ ID NO :2), avec les séquences correspondantes de GPRC5A de Mus musculus (SEQ ID NO :5), de Camelus bactrianus (SEQ ID NO :6), de Felis catus (SEQ ID NO :7), de Canis lupus familiaris (SEQ ID NO :8), de Talpa occidentalis
(SEQ ID NO :9), de Halichoerus grypus (SEQ ID NO :10), de Tursiops truncatus (SEQ ID NO :11) et de Loxodonta africana (SEQ ID NO :12).,
[0027] La figure 3 montre le résultat d’un test d’adhérence pour des kératinocytes primaires et des kératinocytes immortalisés N/TERT-1, dont le gène GPRC5A a été partiellement invalidé ou non.
[0028] La figure 4 montre le résultat d’un test de migration cellulaire pour des kératinocytes primaires et des kératinocytes immortalisés N/TERT-1, dont le gène GPRC5A a été partiellement invalidé ou non.
[0029] La figure 5 montre la relocalisation de la région C-terminale de GPRC5A dans le noyau dans des kératinocytes primaires.
[0030] La figure 6 montre les sites de clivage d’un polypeptide recombinant mimant la région C-terminale de GPRC5A.
[0031] La figure 7 montre les effets du polypeptide recombinant sur la migration et l’adhérence de cellules N/TERT-1 partiellement invalidées pour le gène GPRC5A.
[0032] La figure 8 montre le résultat d’un test de migration cellulaire et d’un test d’adhérence pour des kératinocytes immortalisés N/TERT-1, dont le gène GPRC5A a été partiellement invalidé, lesquels ont été prétraités ou non par différents fragments de la région C-terminale de GPRC5A.
Description détaillée de l’invention ;
[0033] Avantageusement, le polypeptide selon l’invention présentera une longueur inférieure ou égale à 50 acides aminés, de préférence inférieure ou égale à 40 acides aminés et, de manière particulièrement préférée inférieure ou égale à 25 acides aminés.
[0034] Selon un mode de réalisation particulier, le polypeptide selon l'invention aura une taille comprise entre 20 et 60 acides aminés de préférence, comprise entre 25 et 50 acides aminés et, de manière particulièrement préférée, le polypeptide selon l'invention aura une taille de 25 à 40 acides aminés.
[0035] Selon un mode de réalisation alternatif, le polypeptide selon l'invention aura une taille comprise entre 12 et 40 acides aminés, de préférence comprise entre 12 et 30 acides aminés et,
de manière particulièrement préférée, le polypeptide selon l'invention aura une taille comprise entre 12 et 25 acides aminés.
[0036] La protéine GPRC5A (G protein-coupled receptor class C group 5 member A), également connue sous les dénominations RAI3; TIG1; RAIG1 ; GPCR5A et PEIG-1, appartient à la famille des récepteurs couplés à la protéine G de type 3 et comporte leur domaine transmembranaire (à 7 segments) caractéristique. Cette protéine est impliquée dans l'interaction entre les voies de signalisation de l'acide rétinoïde et celle de la protéine G.
[0037] La séquence de la protéine GPRC5A dans différentes espèces d’animaux, notamment de mammifères, de reptiles, d’amphibiens ou d’oiseaux fait partie des connaissances générales de l’homme du métier. De ce fait, l’homme du métier sera à même d’identifier simplement et sans difficultés les orthologues du fragment allant du résidu 321 au résidu 357 de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1) et donc également du fragment allant du résidu 321 au résidu 335 ou du fragment allant du résidu 336 au résidu 347 357 de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1).
[0038] A titre d’exemple de séquences de mammifères, on peut citer la séquence de la GPRC5A à.' Homo sapiens (NP 003970.1 ) et ses orthologues dans les autres espèces de mammifères parmi lesquelles Mus musculus (NP_852109.2), Camelus bactrianus (XP 010944750.1), Felis catus (XP_019690106.1), Canis lupus familiaris (XP 038294887.1), Talpa occidentalis (XP_037370212.1), Halichoerus grypus (XP_035967917.1), Tursiops truncatus (XP_033722915.1), et Loxodonta africana (XP_023410262.1).
[0039] A titre d’exemple de séquences d’oiseaux, on peut citer la séquence de la GPRC5A de Gallus gallus (XP 040516431.1), de Cygnus olor (XP_040411303), à.' Aptenodytes patagonicus (KAF 1666521.1), et de Haliaeetus leucocephalus (XP 010564139.1).
[0040] A titre d’exemple de séquences de reptiles, on peut citer la séquence de la GPRC5A de Chelonia mydas (XP_043400668.1), de Trachemys scripta elegans (XP_034630427.1), de Pseudonaja textilis (XP_006024224.1), de Python bivittatus (XP_025019164.1).
[0041] A titre d’exemple de séquences d’amphibien, on peut citer la séquence de la GPRC5A de Ranitomeya imitator (CAF4926718.1).
[0042] La conservation de séquences du fragment C-terminal de la protéine GPRC5A entre les espèces apparaît clairement au regard de la figure 1 qui montre un alignement de l’ensemble des séquences décrites précédemment.
[0043] Cette conservation a permis de déterminer une séquence consensus.
[0044] Avantageusement, le polypeptide selon l’invention comprend la séquence X1X2HX3QX4X5X6X7X8X9X10X11X12FSIPRX13 X14X15X16X17SPYX18X19Y
X20X21X22X23X24X25X26 (SEQ ID NO :3), leurs fragments et leurs dérivés ;
[0045] Dans laquelle :
[0046] Xi est S, A ou Y ;
[0047] X2 est T, A ou P ;
[0048] X3 est F ou L ;
[0049] X4 est M ou L ;
[0050] X5 est Q, K ou E ;
[0051] X6 est N, T ou S ;
[0052] X7 est Q, H, R, L ou I ;
[0053] Xs est P, N, T, A, S, D, K, E ou aucun acide aminé ;
[0054] X9 est P, S, A, T ou aucun acide aminé ;
[0055] X10 est Q, P, K ou R ;
[0056] Xu est K, R, N, Q ou E ;
[0057] X12 est E, D ou N ;
[0058] X13 est A ou P ;
[0059] X14 est H, Q ou K ;
[0060] X15 est S, A, T ou aucun acide aminé ;
[0061] Xi6 est W, P, R, H, Q ou aucun acide aminé ;
[0062] X17 est P, A, T, V ou L ;
[0063] Xi8 est K, N, S, H, Q ou E ;
[0064] Xi9 est D, N ou E ;
[0065] X2o est E, T, S ou A ;
[0066] X21 est V ou G ;
[0067] X22 est K, R ou G ;
[0068] X23 est K, N ou Q ;
[0069] X24 est E, G, D ou V ;
[0070] X25 est G, D, V, P, T ou I ; et
[0071] X26 est S, M ou K.
[0072] Tel qu'utilisé ici, le terme « acide aminé » se réfère aux 20 résidus d'acides aminés standard naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T), aux résidus d'acides aminés naturels rares (par exemple l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, l'allohydroxylysine, la 6 N-méthylysine, la N-éthylglycine, la N-méthylglycine, la N- éthylasparagine, l'allo-isoleucine, la N-méthylisoleucine, la N-méthylvaline, ou l'acide aminobutyrique) et aux acides aminés non naturels (par exemple norleucine, norvaline et cyclohexyl-alanine). De préférence, ce terme se réfère aux 20 résidus d'acides aminés standard naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, 5 R, Q, N, E, D, S et T).
[0073] Les isomères L et D des acides aminés sont envisagés. En effet, les isomères D ne sont pas sensibles aux protéases et le polypeptide selon la présente invention comprend également des molécules comprenant des D acides aminés, notamment des polypeptides comprenant uniquement ou essentiellement des D acides aminés. Dans un mode particulier, les acides aminés L sont préférés.
[0074] Typiquement, le polypeptide selon l’invention comprendra une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 5 à SEQ ID NO : 21, leurs fragments et leurs dérivés.
[0075] Avantageusement encore, le polypeptide comprend la séquence X1THFQLQNX2X3 X4X5KX6FSIPRA X7X8X9X10SPYX11X12Y EX13X14KX15X16S (SEQ ID NO :4), leurs fragments et leurs dérivés ;
[0076] Dans laquelle :
[0077] Xi est S ou A ;
[0078] X2 est Q, H ou R ;
[0079] X3 est P, N, T, A, S ou aucun acide aminé ;
[0080] X4 est P, S, A ou aucun acide aminé ;
[0081] X5 est Q ou P ;
[0082] XÔ est E, D ou N ;
[0083] X7 est H ou Q ;
[0084] Xs est S, A, T ou aucun acide aminé ;
[0085] X9 est W, P, R ou aucun acide aminé ;
[0086] X10 est P, A, T ou V ;
[0087] Xn est K, N ou S ;
[0088] X12 est D ou N ;
[0089] Xu est V ou G ;
[0090] X14 est K ou R ;
[0091] X15 est E, G ou D ; et
[0092] Xi6 est G, D ou V.
[0093] Typiquement, le polypeptide selon l’invention comprendra une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 5 à SEQ ID NO : 12, leurs fragments et leurs dérivés.
[0094] De préférence, le polypeptide selon l’invention comprendra une séquence choisie parmi la séquence SEQ ID NO :2, ses fragments et ses dérivés.
[0095] Les alignements de séquences (cf. figure 1) font également apparaître une conservation moindre aux deux extrémités de la séquence allant du résidu 321 au résidu 357 de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO : 1 ). A l’extrémité C-terminale, on observe ainsi que les résidus correspondant à ceux présents aux positions 321 et 322 de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1) ne sont pas forcément conservés. En outre, il est possible que la conservation entre les résidus 323 et 328 soit nécessaire uniquement pour le clivage efficace de l’extrémité C- terminale de GPRC5a. Dès lors, le maintien de cette séquence dans un fragment pour obtenir un polypeptide fonctionnel ne serait pas forcément nécessaire et il serait seulement essentiel de maintenir la séquence à partir du résidu 335. De même, et à l’extrémité C-terminale, on observe ainsi que les résidus correspondant à ceux présents aux positions 351 à 357 de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1) ne sont pas forcément conservés.
[0096] En conséquence, on entend par fragments, les séquences allant du résidu 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334 ou 335 au résidu 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356 ou 357 de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1) ou leurs orthologues, à l’exception naturellement de la séquence allant du résidu 321 au résidu 357 de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1) et de ses orthologues.
[0097] Maintenant, les résultats des inventeurs ont permis de montrer que les peptides présentant une séquence allant du résidu 321 au résidu 335 (SEQ ID NO :33) de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1) ou allant du résidu 336 au résidu 347 (SEQ ID NO :32) de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO : 1) présentent finalement une activité de cicatrisation.
[0098] Aussi, on entend également par fragments, la séquence allant du résidu 321 au résidu 335 (SEQ ID NO :33) de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1) et ses orthologues et la séquence allant du résidu 336 au résidu 347 (SEQ ID NO :32) de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1) et ses orthologues.
[0099] Par dérivé, on entend une séquence qui présente un pourcentage d’identité d’au moins 80% avec la séquence allant du résidu 321 au résidu 357 de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1), avec les séquences orthologues de celle-ci, avec la séquence SEQ ID NO :3 avec la séquence SEQ ID NO :4 ou avec les séquences de leurs fragments, de préférence une identité d’au moins 85% et, de manière particulièrement préférée, une identité d’au moins 90% avec ces séquences.
[0100] Par pourcentage d’identité entre deux séquences polypeptidiques, on entend le pourcentage d’acides aminés identiques, entre deux séquences devant être comparées, obtenu avec le meilleur alignement possible desdites séquences. Ce pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties aléatoirement sur toute la longueur des séquences d’acides aminés. Par meilleur alignement possible ou alignement optimal, on entend l’alignement permettant d’obtenir le pourcentage d’identité le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d’acides aminés sont habituellement réalisées en comparant lesdites séquences après que celles-ci aient été alignées selon le meilleur alignement possible ; la comparaison est alors réalisée sur des segments de comparaison de façon à identifier et comparer des régions de similarité. Le meilleur alignement possible pour effectuer une comparaison peut être réalisé en utilisant l’algorithme d’homologie globale développé par SMITH et WATERMAN (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), en utilisant l’algorithme d’homologie locale développé par NEDDLEMAN et WUNSCH (J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970), en utilisant la méthode de similarité développé par PEARSON et LIPMAN (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), en utilisant des programmes d’ordinateur basés sur de tels algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FAST A, TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), en utilisant les algorithmes d’alignement multiples MUSCLE (Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004 ). Pour obtenir le meilleur alignement possible, on utilisera de préférence le programme BLAST avec la matrice BLOSUM 62 ou la matrice PAM 30. Le pourcentage d’identité est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale, lesdites séquences pourront comprendre des additions ou des délétions au regard de la séquence de référence de sorte d’obtenir le meilleur alignement possible entre ces deux séquences. Le pourcentage d’identité est calculé en déterminant le nombre de position identique entre les deux séquences, en divisant le nombre obtenu par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d’identité entre ces deux séquences.
[0101] Les acides aminés de ces dérivés qui ne correspondent pas à ceux présents au sein des séquences de référence correspondent à des substitutions.
[0102] Le terme « substitution », tel qu'utilisé ici désigne le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standard naturels, les résidus
d'acides aminés naturels rares et d'acides aminés non naturels. De préférence, le terme « substitution » se réfère au remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi 10 parmi les 20 résidus d'acides aminés standards naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T). La ou les substitutions peuvent être des substitutions conservatives ou non conservatives. Le terme « substitution conservative » tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à une substitution d'un résidu d'acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité). Des exemples de substitutions 15 conservatives sont présentés dans les tableaux suivants.
[0103] Avantageusement, les substitutions au sein de ces dérivés sont localisées au niveau des seules positions Xi à X26 au sein de la séquence consensus SEQ ID NO :3, de préférence au niveau des seules positions Xi à Xi6 au sein de la séquence consensus SEQ ID NO :4.
[0104] Facultativement, le polypeptide selon l’invention peut comprendre en outre d'autres séquences peptidiques, que ce soit du côté N-terminal et/ou du côté C-terminal.
[0105] Le polypeptide selon l’invention peut également comprendre en N-terminal un tag (ou étiquette) utile pour la purification ou l'immobilisation du polypeptide. De tels tags sont bien connus de l'homme du métier et incluent par exemple les tags histidine (His&), FLAG, HA (épitope dérivé de l'hémagglutinine du virus de la grippe), MYC (épitope dérivé de la protooncoprotéine humaine MYC) ou GST (glutathion- S -transférase). Optionnellement, le polypeptide peut comprendre un site de clivage par une protéase ou un agent chimique permettant de supprimer ce tag.
[0106] Le polypeptide peut également comprendre un élément facilitant la pénétration cellulaire de la molécule, de préférence à son extrémité C-terminale. En particulier, cet élément est un peptide facilitant la pénétration cellulaire de la molécule (élément CPP). Ces peptides sont bien connus de l'homme du métier (par exemple, VIVES et al, Biochimica et Biophysica Acta, vol.1786, p H26-138, 2008). Par exemple et à titre non limitatif, le peptide facilitant la pénétration cellulaire peut être choisi par le groupe consistant en un peptide de Tat, un peptide d'antennapédia ou pénétratine, et un peptide riche en arginine et en lysine.
[0107] De préférence, le polypeptide selon l’invention comprend une séquence riche en arginine et en lysine à son extrémité C-terminale de sorte à favoriser une localisation nucléaire.
Avantageusement, le polypeptide selon l’invention ne comprend pas tout ou partie des résidus X22 à X26 de SEQ ID NO :3 ou tout ou partie de la séquence EX13X14KX15X16S de SEQ ID NO :4 (SEQ ID NO :22), dès lors qu’il comprend une séquence riche en arginine et en lysine à son extrémité C-terminale.
[0108] Par ailleurs, les ou des liaisons peptidiques du polypeptide selon la présente invention peuvent être modifiées pour les rendre résistantes à la protéolyse. Par exemple, au moins une liaison peptidique (-CO-NH-) peut être remplacée par une liaison divalente choisie parmi (- CH2-NH-), (-NH-CO-), (-CH2-O-), (-CH2-S-), (-CH2-CH2-), (-CO-CH2-), (-CHOH-CH2-), (N=N-), et (-CH=CH-). Facultativement, toutes les liaisons peptidiques peuvent être remplacées.
[0109] Le polypeptide selon l’invention peut comprendre soit une extrémité C-terminale carboxylique (-COO ) ou amidée (-CONH2). Le polypeptide selon l’invention peut également être modifié à son extrémité N-terminale, par exemple par l’ajout d’un radical acétyle.
[0110] L'invention concerne également les sels dudit polypeptide, de préférence de sels acceptables sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire. Un sel acceptable sur le plan pharmaceutique ou vétérinaire est un sel qui ne présente pas de toxicité notable, à la dose où il est utilisé. Les sels peuvent être, par exemple, les sels avec des acides minéraux acceptables tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique et l'acide phosphorique ; les sels avec des acides organiques acceptables tels que l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide succinique, l'acide ascorbique et l'acide tartrique ; les sels avec des bases minérales acceptables tels que les sels de sodium, de potassium, de calcium, de magnésium ou d'ammonium ; ou les sels avec des bases organiques qui ont un azote salifiable. Ces sels sont couramment utilisés et leurs méthodes de préparation sont bien connues de l'homme du métier.
[OU I] Il existe de nombreuses causes d’instabilité ou de dégradation des polypeptides telles que l’hydrolyse et la dénaturation, pouvant entraîner une diminution de l’induction de la réponse humorale ou cellulaire.
[0112] En conséquence, et dans une composition, le polypeptide selon l’invention sera avantageusement associé à au moins un stabilisateur pour diminuer ou prévenir de tels problèmes de stabilité.
[0113] À titre d’exemple de stabilisateurs, on peut citer les monosaccharides, les disaccharides, les polysaccharides, les détergents ioniques et non-ioniques, les sels de métaux alcalins, les phospholipides, les acides gras, les polyols et les peptides stabilisants comme la sérum albumine bovine.
[0114] Avantageusement, la composition selon l’invention est une composition topique.
[0115] Dans le présent document, le terme « composition topique » fait référence à une composition qui est appliquée extérieurement sur n’importe quelle partie du corps sauf les membranes muqueuses telles que les yeux, la bouche, etc. La composition topique peut, ainsi, être appliquée à n’importe quelle partie du corps sauf les membranes muqueuses telles que les yeux, la bouche, etc.
[0116] A ce titre, la composition selon l’invention prend la forme d’une pommade, d’une crème, d’une lotion ou d’un gel.
[0117] De façon générale, la composition selon l’invention pourra comprendre de nombreux types d'adjuvants ou de principes actifs utilisés dans les formulations cosmétiques, qu'il s'agisse de corps gras, de solvants organiques, d'épaississants, de gélifiants, d'adoucissants, d'antioxydants, d'opacifiants, de stabilisants, de tensioactifs moussants et/ou détergents, d'émollients, de surgraissants, de parfums, d'émulsionnants ioniques ou non, de charges, de séquestrants, de chélateurs, de conservateurs, d'huiles essentielles, de matières colorantes, de pigments, d'actifs hydrophiles ou lipophiles, d'humectants, comme par exemple la glycérine ou les glycols, de conservateurs, de colorants, d'actifs cosmétiques, de filtres solaires minéraux et/ou organiques, de charges minérales comme les oxydes de fer, les oxydes de titane et le talc, de charges synthétiques comme les nylons et les poly(méthacrylate de méthyle) réticulés ou non, d'élastomères siliconés, ou d'extraits de plantes ou encore de vésicules lipidiques, ou bien tout autre ingrédient habituellement utilisé en cosmétique.
[0118] Comme exemples d'huiles, on peut citer les paraffines, les isoparaffines, les huiles blanches minérales, les huiles végétales (provenant de fleurs, de fruits, de légumes, d'arbres, de
céréales, d'oléagineux ...), les huiles animales, les huiles de synthèse, les huiles siliconées et les huiles fluorées ; et plus particulièrement : les huiles d'origine végétale, telles que l'huile d'amandes douces, l'huile de coprah, l'huile de ricin, l'huile de jojoba, l'huile d'olive, l'huile de colza, l'huile d'arachide, l'huile de tournesol, l'huile de germes de blé, l'huile de germes de maïs, l'huile de soja, l'huile de coton, l'huile de luzerne, l'huile de pavot, l'huile de potiron, l'huile d'onagre, l'huile de millet, l'huile d'orge, l'huile de seigle, l'huile de carthame, l'huile de bancoulier, l'huile de passiflore, l’huile de noisette, l'huile de palme, le beurre de karité, l'huile de noyau d'abricot, l'huile de calophyllum, l'huile de sysymbrium, l'huile d'avocat, l'huile de calendula, les huiles issues de fleurs ou de légumes; les huiles végétales éthoxylées ; les huiles d'origine animale, telles que le squalène, le squalane ; les huiles minérales, telles que l'huile de paraffine, l'huile de vaseline et les isoparaffines ; les huiles synthétiques, notamment les esters d'acides gras tels que le myristate de butyle, le myristate de propyle, le myristate de cétyle, le palmitate d'isopropyle, le stéarate de butyle, le stéarate d'hexadécyle, le stéarate d'isopropyle, le stéarate d'octyle, le stéarate d'isocétyle, l'oléate dodécyle, le laurate d'hexyle, le dicaprylate de propylène glycol ; les esters dérivés d'acide lanolique, tels que le lanolate d'isopropyle, le lanolate d'isocétyle, les monoglycérides, diglycérides et triglycérides d'acides gras comme le triheptanoate de glycérol, les alkylbenzoates, les polyalphaoléfines, les polyoléfines comme le polyisobutène, les isoalcanes de synthèse comme l'isohexadécane, l'isododécane, les huiles perfluorées et les huiles de silicone. Parmi ces dernières, on peut plus particulièrement citer les diméthylpolysiloxanes, méthylphénylpolysiloxanes, les silicones modifiées par des aminés, les silicones modifiées par des acides gras, les silicones modifiées par des alcools, les silicones modifiées par des alcools et des acides gras, des silicones modifiées par des groupements polyéther, des silicones époxy modifiées, des silicones modifiées par des groupements fluorés, des silicones cycliques et des silicones modifiées par des groupements alkyles.
[0119] Comme autre matière grasse, on peut citer les alcools gras, linéaires ou ramifiés, saturés ou insaturés, les mélanges d'alcools gras, linéaires et/ou ramifiés, saturés et/ou insaturés, ou les acides gras, linéaires ou ramifiés, saturés ou insaturés, des mélanges d'acides gras linéaires ou ramifiés, saturés ou insaturés.
[0120] Parmi les polymères épaississants et/ou émulsionnant utilisables, il y a par exemple, les homopolymères ou copolymères de l'acide acrylique ou de dérivés de l'acide acrylique, les homopolymères ou copolymères de l'acide méthacrylique ou dérivés de l'acide méthacrylique,
les homopolymères ou copolymères de l'acrylamide, les homopolymères ou copolymères de dérivés de l'acrylamide, les homopolymères ou copolymères de l'acide acrylamidométhyl propanesulfonique, les homopolymères ou copolymères de monomères vinyliques, les homopolymères ou copolymères de chlorure de triméthylaminoéthylacrylate, les hydrocolloïdes d'origine végétale ou bio synthétique comme par exemple la gomme de xanthane, la gomme de karaya, les carraghénates, les alginates ; les silicates ; la cellulose et ses dérivés ; l'amidon et ses dérivés hydrophiles ; les polyuréthanes.
[0121] Parmi les polymères de type polyélectrolytes pouvant être mis enjeu dans la production d'une phase aqueuse gélifiée apte à être utilisée dans la préparation d'émulsions E/H, H/E, E/H/E ou H/E/H, ou d'un gel aqueux comprenant le SEPIBIO™ POTENTILLA 217, il y a par exemple, les copolymères de l'acide acrylique et de l'acide-2-méthyl-[(l-oxo-2-propényl)amino]
1 -propane sulfonique (AMPS), les copolymères de l'acrylamide et de l'acide-2-méthyl-[(l-oxo-
2-propényl)amino] 1 -propane sulfonique, les copolymères de l'acide-2-méthyl-[(l-oxo-2- propényljamino] 1 -propane sulfonique et de l'acrylate de (2-hydroxyéthyle), l'homopolymère de l'acide-2-méthyl-[(l-oxo-2-propényl)amino] 1 -propane sulfonique, l'homopolymère de l'acide acrylique, les copolymères du chlorure d'acryloyl éthyl triméthyl ammonium et de l'acrylamide, les copolymères de l'AMPS et de la vinylpyrolidone, les copolymères de l'AMPS et du N5N Diméthyl acrylamide, les terpolymères de l'AMPS, de l'acide acrylique et du N5N Diméthyl acrylamide, les copolymères de l'acide acrylique et d'acrylates d'alkyle dont la chaîne carbonée comprend entre dix et trente atomes de carbone, les copolymères de l'AMPS et d'acrylates d'alkyle dont la chaîne carbonée comprend entre dix et trente atomes de carbone.
[0122] Parmi les cires utilisables dans les compositions selon l’invention, on peut citer par exemple la cire d'abeille, la cire de camauba, la cire de candelilla, la cire d'ouricoury, la cire du Japon, la cire de fibre de liège ou de canne à sucre, les cires de paraffines, les cires de lignite, les cires microcristallines, la cire de lanoline, l'ozokérite, la cire de polyéthylène, les huiles hydrogénées, les cires de silicone, les cires végétales, les alcools gras et les acides gras solides à température ambiante, les glycérides solides à température ambiante.
[0123] Parmi les émulsionnants utilisables dans les compositions selon l’invention, on peut citer :
[0124] - les esters gras d'alkylpolyglycosides éventuellement alcoxylés ;
[0125] - les esters gras alcoxylés ;
[0126] - les carbamates de polyalkylène glycols à chaînes grasses ;
[0127] - les acides gras, les acides gras éthoxylés, les esters d'acide gras et de sorbitol, les esters d'acides gras éthoxylés, les polysorbates, les esters de polyglycérol, les alcools gras éthoxylés, les esters de sucrose, les alkylpolyglycosides, les alcools gras sulfatés et phosphatés ou les mélanges d'alkylpolyglycosides et d'alcools gras ;
[0128] - les associations de tensioactifs émulsionnants choisis parmi les alkylpolyglycosides; et
[0129] - les associations d'alkylpolyglycosides et d'alcools gras, les esters de polyglycérols ou de polyglycols ou de polyols.
[0130] Parmi les tensioactifs utilisables dans les compositions selon l’invention, on peut citer : les tensioactifs anioniques, cationiques, amphotères ou non ioniques topiquement acceptables habituellement utilisés dans ce domaine d'activité.
[0131] Parmi les tensioactifs anioniques utilisables dans les compositions selon l’invention, on citera particulièrement les sels de métaux alcalins, les sels de métaux alcalino-terreux, les sels d'ammonium, les sels d'aminés, les sels d'aminoalcools des composés suivants : les alkyléthers sulfates, les alkylsulfates, les alkylamidoéthersulfates, les alkylarylpolyéthersulfates, les monoglycérides sulfates, les alpha-oléfînesulfonates, les paraffines sulfonates, les alkylphosphates, les alkylétherphosphates, les alkylsulfonates, les alkylamidesulfonates, les alkylarylsulfonates, les alkylcarboxylates, les alkylsulfosuccinates, les alkyléthersulfosuccinates, les alkylamidesulfosuccinates, les alkylsulfoacétates, les alkylsarcosinates, les acyliséthionates, les N-acyltaurates, les acyllactylates.
[0132] Parmi les tensioactifs amphotères utilisables dans les compositions selon l’invention, on pourra citer les alkylbétaines, les alkylamidobétaines, les sultaines, les alkylamidoalkylsulfobétaines, les dérivés d'imidazolines, les phosphobétaïnes, les amphopolyacétates et les amphopropionates.
[0133] Afin de potentialiser encore l’activité obtenue par la composition selon l’invention, celle-ci pourra être associée avec d’autres ingrédients/actifs notamment ceux connus pour leur
action antioxydante, antiradicalaire, conservatrice, stabilisante, anti-âge, raffermissante, restructurante, stimulante, énergisante, oxygénante, anti-ride, décontractante, hydratante, antimicrobienne, purifiante, apaisante, relaxante, décontractante, anti-stress, éclaircissante, immunomodulatrice, stimulatrice du renouvellement cellulaire, etc....
[0134] En lien avec le pansement selon l’invention, la composition comprenant le polypeptide décrit précédemment pourra être présente dans la masse constituant le pansement ou sur une couche séparée du pansement ou encore dans un revêtement couvrant la surface du pansement destinée à venir en contact avec la plaie afin de la traiter.
[0135] Par pansement on entend couvrir ici tout type de pansements connus et d'une façon préférée les pansements interfaces. De tels pansements sont commercialisés par exemple sous les dénominations commerciales TULLE GRAS (par SOLVAY PHARMA), PHYSIOTULLE (par COLOPLAST) ou encore URGOTUL (par les Laboratoires URGO) et décrits dans le brevet EP 1 143 895.
[0136] Ces pansements interfaces se présentent généralement sous forme d'une trame ou d'un filet enduit d'une masse habituellement une masse élastomérique. Ils peuvent également être constitués d'une masse sans trame ou filet, ayant la forme d'une plaque présentant ou non des trous traversants, en fonction du type de plaie sur lequel le pansement est appliqué (on utilisera préférentiellement une plaque présentant des trous traversants sur une plaie exsudative lorsque la masse n'a qu'un faible ou aucun pouvoir absorbant, les trous permettant ainsi l'évacuation des exsudats de la plaie).
[0137] La présente invention trouve également application pour la réalisation de pansements à base d'hydrogels ou d'hydrocolloïdes dans lesquels est incorporé le polypeptide précité. Des pansements à base d'hydrocolloïdes connus sont par exemple commercialisés sous les dénominations ALGOPLAQUE (par les Laboratoires URGO), DUODERM (par CONVATEC), COMFEEL (par COLOPLAST). De tels pansements sont décrits dans les demandes de brevet suivantes : FR 2 392 076, FR 2 495 473, WO 98/10801, EP 264 299.
[0138] Le polypeptide utilisé dans le cadre de la présente invention peut être incorporé à un élément absorbant telle qu'une compresse ou une mousse, par exemple en le déposant sur la surface destinée à venir au contact avec la plaie, comme décrit dans la demande de brevet WO
2006/007844. La présente invention trouve également application pour la réalisation de pansements interfaces complexés à une couche absorbante telle qu'une mousse ou une compresse, ou d'une masse hydrocolloïde complexée à une mousse absorbante. De tels pansements sont connus et commercialisés par exemple sous les dénominations commerciales URGOTULDUO et CELLOSORB (par les Laboratoires URGO).
[0139] Tel qu’utilisé dans la présente demande, le terme « sujet » correspond à un mammifère, de préférence ledit sujet est un humain.
[0140] Par lésion d’un épithélium, on entend les lésions susceptibles d’apparaître à la suite de traumatismes ou à la suite d’actes médicaux, chirurgicaux, invasifs ou non invasifs, curatifs ou à visée esthétique.
[0141] Il peut alors s’agir d’un épithélium cutané ou encore d’un épithélium gastrique ou intestinal.
[0142] Avantageusement, la lésion d’un épithélium est une lésion cutanée.
[0143] Comme actes médicaux ou chirurgicaux invasifs, on peut citer les actes chirurgicaux (exérèses, shavings) avec ou sans suture, la cryothérapie, le laser ablatif, les peelings moyens ou forts, la suture, la mésothérapie ou encore le curetage par exemple.
[0144] Comme lésions cutanées post-traumatiques, on peut citer par exemple celles faisant suite à une altération extérieure légère de la peau, comme les coupures, les griffures, égratignures et les brûlures superficielles ou les coups de soleil par exemple.
[0145] Comme acte médical non invasif superficiel nécessitant un produit cicatrisant qui accélère la récupération cutanée, on peut citer par exemple les peelings légers, les épilations au laser, les traitements vasculaires superficiels (couperose).
[0146] Une telle utilisation se fera au moyen d’une quantité thérapeutiquement efficace de la composition.
[0147] Par « quantité thérapeutiquement efficace », on entend une quantité permettant d’induire une ré-épithélisation au sein de la plaie. L’homme du métier sera à même de déterminer ladite quantité thérapeutiquement efficace aux vues du descriptif de l’invention fait
dans la présente demande de brevet et au regard de ses connaissances générales et/ou à l’aide de simples expériences de routine.
[0148] Les expériences suivantes sont fournies pour illustrer les réalisations de l’invention et ne doivent pas être considérées comme limitant la portée de l’invention.
Exemples :
1 -Etude fonctionnelle de GPRC5A dans les kératinocytes primaires
[0149] Suite à l’identification de l’expression de la protéine GPRC5A dans les berges d’une plaie, la fonction de cette protéine a été recherchée dans le mécanisme de cicatrisation en réalisant une inactivation de l’expression du gène correspondant.
[0150] Pour ce faire, trois souches de kératinocytes primaires humains et une lignée immortalisée de kératinocytes humains (N/TERT-1) ont été utilisées.
[0151] Les cellules ont été cultivées dans un milieu complet KGM-2 (KERATINOCYTE GROWTH MEDIUM, PROMOCELL), sous atmosphère saturée en humidité, à 37°C et sous 5% de CO2 tout au long des expériences.
[0152] L’expression du gène GPRC5A a été régulée négativement par des approches d’ARN interférence. Les souches primaires ont été transfectées transitoirement en présence de LIPOFECTAMINE 2000 (THERMO FISHER SCIENTIFIC) par 20nM de siARN commerciale spécifique de l’ARNm GPRC5A (siGPRC5A) (SI04438021, QIAGEN) ou un siARN contrôle (siNT) ne visant aucune séquence d’ARNm mammifère connue (SI03650318, QIAGEN). La lignée N/TERT-1 a été infectée avec un vecteur lentiviral dont l’activité transcriptionnelle permet de libérer des séquences de petits ARN interférents, un shARN (« short hairpin » RNA) spécifique de la séquence ARNm de GPRC5A (shGPRC5A) (TRCN0000005, SIGMA ALDRICH) ou un shARN contrôle (shCTR) composé des mêmes nucléotides mais ne visant aucune séquence connue (SHC002V, SIGMA ALDRICH).
[0153] L’efficacité d’interférence dans les différentes souches a été évaluée par PCR quantitative. Pour cela les ARN totaux ont été isolés aux temps indiqués après tranfection par le kit RNEASY (QIAGEN). Pour chaque condition, 500 ng d’ARN ont été rétro-transcrits par le kit PRIMESCRIPTt™ RT Reagent Kit (TAKARA). La PCR quantitative a été réalisée dans
un thermocycleur ARIAMX (AGILENT TECHNOLOGIES) en présence du kit SYBR® PREMIX EXx TAQ™ II (TAKARA) et en utilisant des amorces spécifiques pour GPRC5A (sens : TCTCAAGAGGAAATCACTCAAGGT, SEQ ID NO 23 ; anti-sens :
GTGGGATGGAGAATTCCTTTT, SEQ ID NO 24) et le gène ribosomique de ménage RPLPO (sens : CCATTCTATCATCAACGGGTACAA, SEQ ID NO 25 ; anti-sens :
TCAGCAAGTGGGAAGGTGTAATC, SEQ ID NO 26 ).
[0154] Parallèlement, l’effet de l’interférence ARN a été évaluée sur la quantité de protéine par westem-blot. Les protéines ont été extraites dans un tampon RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 8, NaCl 150 mM, Nonidet P-40 1 %, désoxycholate de sodium 0,1 %, SDS 0,1 %) complété par de 1’ ortho vanadate de sodium 1 mM et un cocktail inhibiteur de protéase (SIGMA ALDRICH). Les lysats ont été centrifugés pendant 10 min à 14 000 g à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires. Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE, puis transférées sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (EMD-MILLIPORE). La membrane a été bloquée avec 5 % de lait écrémé dans un tampon salin tamponné Tris (TBS) contenant 0,1 % de TWEEN-20, et incubé avec un anticorps anti-GPRC5A (HPA007928, SIGMA ALDRICH) au 1 :250 et un anticorps anti-actine (C4, MAB1501, SIGMA ALDRICH) au 1 :5000 pendant une nuit à 4 ° C. La membrane a été incubée avec des anticorps secondaires pendant 1 h à température ambiante : anticorps de chèvre anti-lapin-HRP (170-6510, BIO-RAD) ou un anticorps de chèvre anti- souris-HRP (170-6516, BIO-RAD) au 1 :10000. La fixation d'anticorps a été détectée par le système de chimiluminescence SUPER SIGNAL WEST PICO PLUS (THERMO FISHER SCIENTIFIC) en utilisant la caméra Fusion Fx (VILBER LOURMAT).
[0155] Les résultats ont montré que, consécutivement à la transfection avec le siARN GPRC5A ou la transduction par le shARN GPRC5A, l’expression du gène GPRC5A est diminué de l’ordre de 70% dans les différentes souches cellulaires (cf. Figures 3a et 3e). Dans des conditions similaires, une diminution franche de la quantité de protéine GPRC5A est observable dans les kératinocytes primaires et dans la lignée N/TERT-1 (cf. Figures 3b et 3 f).
[0156] En vue de déterminer l’impact de cette inactivation sur les kératinocytes, la prolifération de ces derniers a été déterminée suite à l’inactivation du gène GPRC5A. Dans le détail, le taux de prolifération cellulaire des kératinocytes transfectés avec le siNT ou le siGPRC5A ou transduis avec le lentivirus shCTR ou shGPRC5A a été mesuré à l'aide du kit de test d'ADNdb QUANT-IT™ PICOGREEN™ (THERMO FISHER SCIENTIFIC). Pour celà, 104 cellules ont
été ensemencées dans des micro-plaques 96 puits et la concentration d'ADN a été évaluée à 1 , 2 et 3 jours après l'ensemencement conformément aux instructions du fabricant.
[0157] Les résultats ont montré que l’inactivation du gène GPRC5A n’a pas d’impact sur la prolifération des kératinocytes (cf. Figures 3c et 3g).
[0158] La détermination de la capacité d’adhérence des kératinocytes primaires a également été déterminée suite à l’inactivation du gène GPRC5A.
[0159] Dans le détail, le test d'adhérence a été réalisé selon la méthode au Percoll (GOOWIN & PAULI, J Immunol Methods 1995). Des plaques à 96 puits ont été recouvertes soit de 100 pg/ml de collagène de type I (THERMO FISHER SCIENTIFIC) soit d'albumine de sérum bovin (BSA) à 1% dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (témoin négatif). Les cellules ont été détachées avec 10 mM d'EDTA pendant 10 min à 37°C et lavées deux fois avec du milieu sans sérum. Ensuite, 2,5x104 cellules/puits ont été remises en suspension dans un milieu sans sérum et étalées en 5 réplicas pour chaque condition. Les cellules ont été fixées pendant 5, 10, 30, 60, 120 et 240 min à 37 °C, puis les cellules non fixées ont été éliminées avec une solution de Percoll contenant 0,57 mM de NaCl. Les cellules restantes ont été fixées avec une solution de Percoll contenant 5 % p/v de glutaraldéhyde pendant 15 min à température ambiante. Les cellules ont été colorées avec du cristal violet à 0,1 % p/v pendant 30 min à température ambiante, puis les plaques ont été lavées à l'eau du robinet. Les plaques ont été séchées à l'air et le cristal violet a ensuite été extrait en utilisant du SDS à 2 % dans de l'eau distillée pendant 30 minutes sur un agitateur. L'absorbance à 570 nm a été mesurée par spectrophotométrie sur TEC AN INFINITE Ml 000. L'absorbance de fond (des puits blancs) a été soustraite de tous les puits de test. Le dosage a été réalisé en 5 réplicas techniques et 3 réplicas biologiques.
[0160] Les résultats montrent que l’inactivation du gène GPRC5A induit une adhérence significativement plus importante des kératinocytes primaires (cf. Figure 3d) et des cellules N/TERT-1 (cf. Figure 3 h) dès 5 minutes.
[0161] A la lueur de ces résultats en termes d’adhérence, la capacité de migration des kératinocytes a été déterminée suite à l’inactivation du gène GPRC5A.
[0162] Dans le détail, dans une plaque à 6 puits, les cellules (2x104 cellules/puits) ont été ensemencées dans un insert en silicone à 2 puits (IBIDI) pendant 30 heures. Après confluence, l'insert de culture a été retiré lentement. Après lavage au PBS, les cellules ont été cultivées avec le KGM2 complet. Les cellules ont ensuite été autorisées à migrer dans l'espace (500 pm) et imagées en contracte de phase au microscope inversé (NIKON TI-E) aux temps 12h, 14h, 16h, 18h, 20h et 22h pour les cellules primaires, et aux temps 3h, 6h, 8h, 1 Oh et 12h pour les cellules N/TERT-1. La quantification de la migration cellulaire a été réalisée en mesurant les zones non couvertes à l'aide du logiciel Image J. Chaque expérience a été répétée 3 réplicas techniques et 3 réplicas biologiques.
[0163] Les résultats sont présentés dans la figure 4 et montrent que les kératinocytes primaires dont le gène GPRC5A a été réprimé présentent un retard de migration significatif dès 12h (cf. Figure 4a), et dès 6h pour les cellules N/TERT-1 (cf. Figure 4b).
[0164] Au vu de ces résultats, la caractérisation d’épidermes reconstruits, comprenant des kératinocytes immortalisés N/TERT-1 dont le gène GPRC5A a été réprimé de façon stable (shGPRC5A), a été effectuée.
[0165] Des fibroblastes (2,5x104) ont été ensemencés sous la membrane en polycarbonate d'un insert de culture cellulaire de porosité 0,4 pm (NUNC, THERMO FISHER SCIENTIFIC). Après 4 heures, les inserts ont été retournés et placés dans des plaques 24 puits, et les fibroblastes ont été cultivés pendant 2 jours dans du DMEM/F12 (1/1) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (Fetal Clone II ; HYCLONE, THERMO FISHER SCIENTIFIC) et 1 % de pénicilline/streptomycine (SIGMA ALDRICH). 2,5xl05 cellules N/TERT-1 shARN contrôle (shCTR) ou shARN GPRC5A (shGPRC5A) ont été ensemencés sur le dessus de la membrane et cultivés pendant 3 jours dans du DMEM/F12 (1/1) additionné de 5 % de sérum bovin fœtal (FETAL CLONE II ; HYCLONE), 0,2 ng/ml d'EGF (THERMO FISHER SCIENTIFIC), 0,4 pg/ml d'hydrocortisone (SIGMA ALDRICH), 5 pg/ml d'insuline (SIGMA ALDRICH), 8 ng/ml de toxine du choléra (SIGMA ALDRICH), 2xl0~n M de tri-iodothyronine (SIGMA ALDRICH), 24 pg/ml d'adénine (SIGMA ALDRICH) et 1 % de pénicilline/streptomycine. Pour induire la stratification et la différenciation, les kératinocytes ont été placés à l'interface air/liquide et cultivés pendant 2 jours avec le même milieu, sauf que l'EGF et l'adénine ont été omis et la concentration finale de chlorure de calcium a été ajustée à 2 mM et 50 pg /ml de vitamine C. Les cellules ont ensuite été cultivées pendant 14 jours supplémentaires dans le
même milieu, sauf que le sérum bovin fœtal a été réduit à 1 %. Pendant la phase d'émersion, le milieu de culture a été changé tous les jours.
[0166] Pour les expériences d’histologie et d’immunofluorescence, les échantillons ont été fixés dans une solution de paraformaldéhyde à 4 %, pendant 24h à 4°C. Les échantillons ont ensuite été déshydratés et inclus dans de la paraffine et coupés au microtome en sections de 5 pm d’épaisseur. Après déparaffinage et réhydratation, les coupes ont été colorées avec des solutions d'hématoxyline et d'éosine pour l'histologie de routine ou perméabilisées par 0, 1% de triton XI 00 pendant 10 min, puis bouillies dans un tampon citrate 10 nM pH 6 pour la récupération de l'antigène. Les coupes ont été bloquées par 5 % de sérum d'albumine bovine et incubées avec les anticorps primaires suivants pendant une nuit à 4°C : lapin anti-GPRC5A (HPA007928, SIGMA ALDRICH, 1 :250) ; souris anti-E-cadhérine (abl416, ABCAM, 1 :1000); lapin anti-cytokératine 10 (ab76318, ABCAM, 1 :500); et lapin anti-involucrine (ab53112, ABCAM, 1 :500). Les anticorps secondaires étaient : chèvre alexa-488 et alexa-546 anti-souris ou anti-lapin (THERMO FISHER SCIENTIFIC). Une contre-coloration nucléaire au DAPI (4',6-diamino-2-phénylindole) (SIGMA ALDRICH) a été réalisée. Les coupes ont ensuite été montées dans une solution PROLONG™ GOLD ANTIFADE MOUNTANT (THERMO FISHER SCIENTIFIC). L'acquisition des images a été réalisée à l'aide d'un microscope à fluorescence NIKON TI-E.
[0167] Les résultats de coloration histologique ont montré deux caractéristiques des épidermes reconstruits à partir des cellules N/TERT-1 shGPRC5A, des zones d’épaisseur moindre que les épidermes contrôles (shCTR), et des zones faisant apparaitre un décollement des couches suprabasales (cf. Figure 4c). Ces défauts histologiques sont associés à un défaut de différenciation caractérisé par une baisse d’expression et de localisation de l’E-cadhérine, de la cytokératine 10 et de l’involucrine. Ces résultats démontrent l’implication de GPRC5A dans la morphogenèse de l’épiderme.
2- Translocation au noyau de la partie C-terminale de GPRC5A
[0168] Des kératinocytes primaires en phase proliférative ont été rincés 3 fois avec du PBS, puis détachés par action de trypsine/EDTA (THERMO FISHER SCIENTIFIC) afin d’obtenir une suspension cellulaire. Une partie des cellules en suspension a été fixée par ajout de paraformaldéhyde 4% pendant 20 minutes, et les cellules non-fixées ont été ensemencées dans
des boîtes 12-puits à une densité de 2xl04 cellules/puits. Aux temps 30 min, 60 min, 24h, à confluence et 5 jours post confluence, les cellules ont été fixée en paraformaldéhyde 4% pendant 20 minutes. Après 3 lavages en PBS, les cellules ont été perméabilisées par ajout de triton XI 00 à 0,1% puis saturées par une solution de de BSA 5% dans du PBS pendant Ih. L’immunomarquage des régions N-terminale et C-terminale a été réalisé respectivement par incubation des anticorps anti-GPRC5A HPA007928 (SIGMA ALDRICH, 1 :250) et PA5-28738 (THERMO FISHER SCIENTIFIC, 1 :250) sur la nuit à 4°C. L’anticorps secondaires était un anticorps de chèvre anti-lapin couplé à l’alexa-546 (THERMO FISHER SCIENTIFIC). La localisation dans le nucléole a été mise en évidence par immunofluorescence directe de la nucléoline par un anticorps murin couplé à l’alexa-488 (abl54028, ABCAM, 1 :1000). Une contre-coloration nucléaire au DAPI a été réalisée. Les coupes ont ensuite été montées dans une solution PROLONG™ GOLD ANTIFADE MOUNTANT (THERMO FISHER SCIENTIFIC). L'acquisition des images a été réalisée à l'aide d'un microscope à fluorescence Nikon Ti-E ou un microscope confocal ZEISS LSM800.
[0169] Les résultats ont montré que seule l’extrémité C-terminale de GPRC5A est transloquée au noyau, dès les phases précoces d’adhérence et jusqu’à l’entrée en différenciation des kératinocytes primaires (cf. Figure 5a). Plus exactement, la région C-terminale de GPRC5A est retrouvée dans le nucléole (cf. Figure 5b). Ceci suggère que GPRC5A subit une protéolyse dans l’espace périnucléaire en amont de la translocation au noyau.
3- Sites de clivage de la région C-terminale de GPRC5A
[0170] Le clivage de l’extrémité C-terminale de GPRC5A a été analysé dans les cellules N/TERT-1 24h après repiquage par un test N-TAILS. Un tel test N-TAILS permet d’identifier les amines libres N-terminales par spectrométrie de masse.
[0171] Pour se faire, les protéines totales ont été extraites par un tampon de lyse RIPA en présence d’inhibiteurs de protéases, et les protéines ont été marquées à l’aide du kit de réactifs de marquage isobare TMTSIXPLEX™ (THERMO FISCHER SCIENTIFIC) selon les recommandations du fabriquant.
[0172] L’analyse par spectrométrie de masse (LC-MS/MS) a permis d’identifier 3 peptides associés à 3 sites de clivage en positions 269, 321 et 336 de la protéine GPRC5A (cf. tableau 1).
[0173] [Tableau 1]
4- Production de la région C-terminale de GPRC5A
[0174] La partie C-terminale de la protéine GPRC5A (89 acides aminés) a été produite en bactérie.
[0175] Des bactéries BL21 (LIFE TECH 44-048) ont été transformées par le plasmide pET30a_GPRC5A-C-terminal _poIy(R/K) TEV-cleavage-site_2x-6Histidines, puis cultivées sur boîte de pétri LB-agar supplémenté en kanamycine. Une pré-culture est ensuite réalisée dans laquelle une colonie bactérienne isolée est inoculée dans 100ml de milieu LB BROTH LENNOX (Formedium LBX0102) pendant une nuit à 37°C et 150rpm. A partir de cette préculture, les bactéries sont ensemencées à une D.O de 0.15 en milieu HYPER BROTH (ATHENAES AE-0107), puis sont cultivées à 37°C 150rpm. L’évolution de D.O de la culture est suivie toutes les heures afin de tracer une courbe de croissance (ln(DO) au cours du temps). Lors de la phase exponentielle de doublement des bactéries (D.O=0.8-1, environ 2 heures postensemencement), ImM d’IPTG est ajouté au milieu de culture afin de stimuler la production du polypeptide. La culture est ensuite poursuivie jusqu’à la phase stationnaire (environ 6h postensemencement), puis les culots bactériens sont récupérés par centrifugation (4000g, 1 Ominutes à 4°C), séparés du surnageant et congelés à -20°C. Lors de l’extraction protéique, les bactéries sont lysées dans un tampon de lyse (PBS1X, 500mM NaCl, lOmM MgC12, 0.5% Triton X100 - v=l/10e du volume de culture bactérienne) supplémenté d’inhibiteur de protéases (COMPLETE™ PROTEASE INHIBITOR COKTAIL, ROCHE), DNAse (100pg/ml) et lysozyme (10mg/ml) ; et incubées pendant 3 Ominutes sur roue à 4°C avant de subir une sonication (2x5minutes, puise 3secondes, amplitude 30). Les débris cellulaires ainsi que la fraction insoluble sont séparés de la fraction soluble par centrifugation (15000g, 15minutes à 4°C). La fraction soluble est ensuite conservée à 4°C, tandis que la fraction insoluble est remise en suspension dans un tampon urée (PBS1X, 8M urée, 500mM NaCl, v=l/4 du volume de
tampon de lyse) supplémenté de DNAse ( l OOpg/ml), puis incubée pendant 1 heure sur roue à 4°C. Les protéines libérées dans le tampon sont récupérées dans le surnageant par centrifugation (15000g, 15minutes à 4°C) et ajoutées à la fraction soluble préalablement mise de côté. Par la suite, le polypeptide entier est purifié par affinité de son tag ôHisti dines avec des billes Ni-NTA (745400 Propino, MACHERY-NAGEL, v= 1/1000e du volume de culture bactérienne). Les billes préalablement lavées au PBS1X sont ajoutées à la suspension protéique et incubées pendant 1 heure sur roue à 4°C. Les billes sont ensuite déposées sur colonne (filtre en coton dont la porosité n’excède pas la taille des billes) et la fraction non retenue est éliminée par aspiration grâce à une pompe péristaltique (Iml/minute). Les billes sont ensuite lavées par ajout d’un volume de billes de NaCl à IM, suivi de 5 volumes de billes de tampon de lavage (PBS1X, 500mM NaCl, lOmM MgC12, 15mM imidazole). Enfin le polypeptide est élué des billes Ni- NTA par ajout d’un tampon d’élution (PBS1X, EDTA 50mM, v= environ 10 volumes de billes), et dosé (PIERCE™ BCA PROTEIN ASSAY Kit). Sans attendre, le polypeptide en solution est supplémenté de ImM de DTT puis digéré par ajout de la TEV protéase (SFR BIOSCIENCES - 0,5mg pour lOmg de protéines). Le mélange obtenu est déposé dans un boudin de dialyse rincé au PBS1X (MWCO : 3500Da) et la diffusion contre une solution de PBS1X 500mM NaCl a lieu dans un bêcher sous agitation magnétique pendant une nuit à 4°C. Le peptide clivé est finalement purifié en ajoutant comme précédemment des billes Ni-NTA qui fixeront le tag ôHistidines libéré (1ml de billes/50mg de peptide) pendant Ih sur roue à 4°C. Après dépôt de la suspension peptide-billes sur une colonne identique à la précédente, le peptide clivé est récupéré dans la fraction non retenue, dosé puis aliquoté et congelé à -80°C.
[0176] L’analyse sur gel du polypeptide après purification, fait apparaître des bandes multiples à un poids moléculaire inférieur à celui attendu. Les analyses par HPLC-UV (216nm) montrent cependant la pureté du peptide purifié avec un seul et unique pic d’absorbance. Aussi, les résultats établissent que le polypeptide produit en bactérie a été clivé, à priori à différents sites. L’analyse par microséquençage d’EDMAN (N-terminal) a permis d’identifier la séquence STHFQLQNQP (SEQ ID NO :27), laquelle séquence permet de conclure au fait que le clivage a été effectué en amont de la position 321 de la GPRC5A humaine (cf. Figure 6).
5- Activité du polypeptide GPRC5A produit sur l’adhérence et la migration des kératinocytes
[0177] L’activité du polypeptide purifié précédemment a été testé sur l’adhérence et la migration des kératinocytes.
[0178] Les protocoles d’adhérence et de migration cellulaire sont ceux décrits précédemment. L’effet du polypeptide recombinant purifié a été analysé par pré-incubation de 12 à 24 heures dans le milieu de culture des cellules N/TERT-1 shGPRC5A aux concentrations de 5 et 10 pg/ml.
[0179] Les résultats montrent que l’ajout de polypeptide à 5 ou 10 pg/ml permet d’induire une capacité de migration supérieure dès 5h de migration des cellules N/TERT-1 déficientes en GPRC5A (cf. Figures 7a et 7b). Aucune différence notable n’a été remarquée entre les deux concentrations utilisées. Le polypeptide a en revanche un effet moindre sur la capacité d’adhérence de ces cellules (cf. Figure 7c).
[0180] Les résultats ont montré que, même si le polypeptide purifié est clivé, ce dernier présente malgré tout une activité significative sur l’adhérence et la migration des kératinocytes. En conséquence, ces résultats permettent de conclure au fait que l’activité d’induction de la migration des kératinocytes est associée à des éléments de séquence au sein du fragment allant des résidus 321 à 357 de la GPRC5A humaine.
[0181] Il est à noter que, pour différentes espèces, on distingue deux iso formes de GPRC5A, dont l’un est tronqué et ne comprend précisément pas ce segment C-terminal (comme par exemple chez Gallus gallus). Il est possible que l’activité de ce fragment C-tcrminal justifie de l’existence de ces différents iso formes.
[0182] Les alignements de séquences entre fragments C-terminaux de protéines GPRC5A de différentes origines font apparaître des résidus fortement conservés parmi lesquels les résidus sérine et tyrosine. Outre ces résidus, le consensus fait apparaître une forte conservation de la séquence EFSIPR que l’on retrouve spécifiquement et quasi à l’identique (QFSIPR) chez plusieurs protéines à domaine CUB. Le domaine CUB est un motif structurel d'environ 110 résidus trouvés presque exclusivement dans des protéines associées à la membrane extracellulaire et plasmatique, dont beaucoup sont régulées par le développement. Maintenant, aucune activité n’a été associée à ce jour à cette séquence.
6- Phosphorylation de la partie C-terminale de GPRC5A
[0183] En vue de déterminer l’état de phosphorylation de l’extrémité C-terminale de GPRC5A transloquée au noyau, les fractions cytoplasmique et nucléaire des kératinocytes ont été isolées.
[0184] Une immunoprécipitation a ensuite été effectuée sur ces fractions en utilisant ou non un anticorps dirigé contre les sérines phosphorylées ou contre les tyrosines phosphorylées.
[0185] Les résultats ont montré que l’extrémité C-terminale de GPRC5A comprend des résidus sérines phosphorylés.
[0186] En vue d’évaluer l’importance de la phosphorylation, les peptides listés dans le tableau I suivant ont été synthétisés dans lesquels les résidus sérine et/ou tyrosine ont été phosphorylés. A noter qu’une pégylation a été effectué à l’extrémité N-terminale.
[0188] L’activité des différents polypeptides est ensuite testée sur l’adhérence et la migration des kératinocytes comme décrit précédemment et à différentes concentrations.
[0189] Pour se faire, les cellules N/TERT-1 shGPRC5A à confluence ont été traitée pendant Ih par les peptides à la concentration de 30 pg/mL avant de réaliser une blessure à l’aide d’un cône de pipette (scratch test). La fermeture de la blessure a été observée par vidéo-microscopie pendant 16h.
[0190] La Figure 8a illustre le pourcentage de fermeture de la plaie pendant les 9 premières heures pour les cellules traitées avec les peptides synthétiques MP66 (SEQ ID N°28) et MP68 (SEQ ID N°30).
[0191] Les résultats montrent que le traitement par les peptides MP66 (SEQ ID N°28) et MP68 (SEQ ID N°30) permet d’accélérer la fermeture. Il est à noter que nous n’observons pas de différence significative entre les 2 peptides, indiquant que la phosphorylation n’intervient pas dans ce processus et que le peptide « nu » suffit à induire un effet biologique.
[0192] L’adhérence cellulaire a également été analysée par le dispositif XCELLIGENCE (AGILENT) basé sur l’analyse des changements d’impédance lorsque les cellules adhèrent dans le fond des puits de culture soumis à un courant électrique faible (cf. Figure 8b).
[0193] Les résultats montrent que les cellules shGPRC5A présentent une adhérence plus importante que les cellules contrôles. Maintenant, le prétraitement par les peptides MP66 (SEQ ID N°28) et MP68 (SEQ ID N°30) permet de diminuer la capacité d’adhérence cellulaire, et ce de façon encore plus importante que dans les cellules contrôles. Comme pour la migration, nous n’observons pas de différence significative entre les 2 peptides, indiquant que la phosphorylation n’intervient pas dans ce processus et que le peptide « nu » suffit à induire un effet biologique.
[0194] En vue de préciser les fragments impliqués dans l’activité biologique de l’extrémité C- terminale de GPRC5A, les fragments listés dans le tableau 3 ont été testés sur l’adhérence et à la migration cellulaire . A noter qu’une pégylation a été effectué à l’extrémité N-terminale.
Claims
REVENDICATIONS Une composition pour son utilisation pour favoriser et/ou accélérer la cicatrisation d’une lésion d’un épithélium chez un sujet, laquelle composition comprend un polypeptide dont la taille est inférieure ou égale à 60 acides aminés et qui comprend la séquence choisie parmi la séquence C-terminale de la protéine GPRC5A (G protein-coupled receptor class C group 5 member A) allant du résidu 321 au résidu 357, ses orthologues, leurs fragments ou leurs dérivés, un polynucléotide codant pour un tel polypeptide, un vecteur comprenant un tel polynucléotide ou une cellule transformée par un tel vecteur; où :
- les orthologues sont choisis dans le groupe comprenant la séquence de la GPRC5A de Mus musculus (NP_852109.2), de Camelus bactrianus (XP_010944750.1), de Felis catus (XP_019690106.1), de Canis lupus familiaris (XP_038294887.1), de Talpa occidentalis (XP_037370212.1), d’ Halichoerus grypus (XP_035967917.1), de Tursiops truncatus (XP_033722915.1), de Loxodonta africana (XP_023410262.1), de Gallus gallus (XP_040516431.1), de Cygnus olor (XP_040411303), à.' Aptenodytes patagonicus (KAF 1666521.1), de Haliaeetus leucocephalus (XP_010564139.1), de Chelonia mydas (XP_043400668.1), de Trachemys scripta elegans (XP 034630427.1), de Pseudonaja textilis (XP_006024224.1), de Python bivittatus (XP 025019164.1), et de Ranitomeya imitator (CAF4926718.1) ;
- les fragments sont choisis dans le groupe consistant en les séquences allant du résidu 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334 ou 335 au résidu 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356 ou 357 de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1), la séquence allant du résidu 321 au résidu 335 (SEQ ID NO :33) de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1), la séquence allant du résidu 336 au résidu 347 (SEQ ID NO :32) de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1), et leurs orthologues, à l’exception naturellement de la séquence allant du résidu 321 au résidu 357 de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1) et de ses orthologues; et
- les dérivés sont choisi dans le groupe consistant en les séquences présentant une identité de séquence d’au moins 80% avec la séquence allant du résidu 321 au résidu 357 de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO : 1 ) et avec les séquences orthologues de celle-ci.
La composition selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le polypeptide comprend la séquence X1X2HX3QX4X5X6X7X8X9X10X11X12FSIPRX13
X14X15X16X17SPYX18X19Y X20X21X22X23X24X25X26 (SEQ ID NO :3), leurs fragments et leurs dérivés ; dans laquelle:
- Xi est S, A ou Y ;
- X2 est T, A ou P ;
- X3 est F ou L ;
- X4 est M ou L ;
- X5 est Q, K ou E ;
- XÔ est N, T ou S ;
- X7 est Q, H, R, L ou I ;
- Xg est P, N, T, A, S, D, K, E ou aucun acide aminé ;
- X9 est P, S, A, T ou aucun acide aminé ;
- X10 est Q, P, K ou R ;
- Xi 1 est K, R, N, Q ou E ;
- X12 est E, D ou N ;XB est A ou P ;
- X14 est H, Q ou K ;
- Xi 5 est S, A, T ou aucun acide aminé ;
- Xi6 est W, P, R, H, Q ou aucun acide aminé ;
- X17 est P, A, T, V ou L ;
- Xi8 est K, N, S, H, Q ou E ;
- X19 est D, N ou E ;
- X20 est E, T, S ou A ;
- X21 est V ou G ;
- X22 est K, R ou G ;
- X23 est K, N ou Q ;
- X24 est E, G, D ou V ;
- X25 est G, D, V, P, T ou I ; et
- X26 est S, M ou K. La composition selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le polypeptide comprend une séquence choisie parmi les séquences
SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 5 à SEQ ID NO : 21 , leurs fragments et leurs dérivés. La composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le polypeptide comprend une séquence choisie parmi la séquence STHFQLQNQP PQKEFSIPRA HAWPSPYKDY EVKKEGS (SEQ ID NO :2), ses fragments et ses dérivés. La composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdits fragment du polypeptide sont choisis dans le groupe consistant en les séquences allant du résidu 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334 ou 335 au résidu 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356 ou 357 de la protéine GP RC5A humaine (SEQ ID NO :1) et leurs orthologues, à l’exception naturellement de la séquence allant du résidu 321 au résidu 357 de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1) et de ses orthologues. La composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdits fragment du polypeptide sont choisis dans le groupe consistant en la séquence allant du résidu 321 au résidu 335 (SEQ ID NO :33) de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1), la séquence allant du résidu 336 au résidu 347 (SEQ ID NO :32) de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1) et leurs orthologues. La composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que lesdits dérivés du polypeptide sont choisis dans le groupe consistant en les séquences présente un pourcentage d’identité d’au moins 80% avec la séquence allant du résidu 321 au résidu 357 de laprotéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1), avec les séquences orthologues de celle-ci, avec la séquence SEQ ID NO :3 avec la séquence SEQ ID NO :4 ou avec les séquences de leurs fragments.
Un pansement comprenant une composition comprenant un polypeptide dont la taille est inférieure ou égale à 60 acides aminés et qui comprend la séquence choisie parmi la séquence C-terminale de la protéine GPRC5A (G protein-coupled receptor class C group 5 member A) allant du résidu 321 au résidu 357 de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1), ses orthologues, leurs fragments ou leurs dérivés où :
- les orthologues sont choisis dans le groupe comprenant la séquence de la GPRC5A de Mus musculus (NP_852109.2), de Camelus bactrianus (XP 010944750.1), de Felis catus (XP_019690106.1), de Canis lupus familiaris (XP_038294887.1), de Talpa occidentalis (XP_037370212.1), d’ Halichoerus grypus (XP 035967917.1), de Tursiops truncatus (XP_033722915.1), de Loxodonta africana (XP 023410262.1), de Gallus gallus (XP 040516431.1 ), de Cygnus olor (XP 040411303), CAptenodytes patagonicus (KAF 1666521.1), de Haliaeetus leucocephalus (XP 010564139.1 ), de Chelonia mydas (XP 043400668.1), de Trachemys scripta elegans (XP_034630427.1), de Pseudonaja textilis (XP_006024224.1), de Python bivittatus (XP_025019164.1), et de Ranitomeya imitator (CAF4926718.1) ;
- les fragments sont choisis dans le groupe consistant en les séquences allant du résidu 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334 ou 335 au résidu 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356 ou 357 de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO : 1 ) ou leurs orthologues, à l’exception naturellement de la séquence allant du résidu 321 au résidu 357 de la protéine GPRC5A humaine (SEQ ID NO :1) et de ses orthologues ; et
- les dérivés sont choisi dans le groupe consistant en les séquences présentant une identité de séquence d’au moins 80% avec la séquence allant du résidu 321 au résidu 357 de la protéine GPRC5 A humaine (SEQ ID NO : 1 ) et avec les séquences orthologues de celle-ci. Une composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, pour son utilisation pour favoriser et/ou accélérer la ré-épithélisation chez un sujet.
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