JP2011024585A - 細胞傷害性tリンパ球 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定の配列で表されるヒト主要組織適合性抗原(HLA)−A24拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドとHLA−A24分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を認識するCD8陽性の細胞傷害性Tリンパ球、該細胞傷害性Tリンパ球を有効成分として含有する制がん剤及び該Tリンパ球の誘導剤。
【選択図】なし
Description
さらに、ウイルス、細菌や原虫、真菌による感染においても、これらの微生物の有する抗原に対するCTLが感染防御に重要な役割を果していることが明らかにされている。
テトラマーは細胞傷害性Tリンパ球のモニタリングに有用である。
(1)材料と方法
HHDA2402+/− β2m−/− mice
HLA−A2402のリーダー配列、ヒトβ2 ミクログロブリン、HLA−A2402 α1およびα2ドメイン、H−2Db α3のトランスメンブレンドメイン、および細胞質ドメインからなるDNAコンストラクト(HHDA2402)を構築し、これを発現ベクターpcDNA3.1(インビロジェン社製)にクローニングした。HHDA2402の4−kbのSalI−NotI断片を妊娠C57BL/6マウス由来の卵子に注入した。HHDA2402発現マウスをβ2m−/− mice(Jackson Laboratory, Bar Harbor、ME)と交配させ、得られるHHDA2402 +/−β2m +/−をβ2m−/−マウスと交配させ、HHDA2402+/− β2m−/−マウス(以下、HHDA2402マウス)を作製した。
TAPトランスポーター欠損株T2にHLA−A2402cDNAをトランスフェクトしてT2A24株を作製した。その他以下の細胞株を使用した。乳癌細胞株R27(A2402陰性)、食道癌株KE−4(A2402陽性)、同TE−10(A2402陽性)、慢性骨髄性白血病株K562(A2402陰性)、肺癌株11−18(A2402陽性)、胎児性腎細胞293(A2402陰性)。R27A244、K562A24、293A24はHLA−A2402cDNAをトランスフェクトして作製した。ヒトB−リンパ芽球(LCL)はHLA−A2402陽性または陰性のボランティア由来の細胞よりEBVウイルスを用いて常法により作製した。
全長のMAGE−A4、SAGE、EBNA−3AのcDNAをpcDNA3.1にクローニングした。
HHDA2402マウス(6〜8週齢、雌)の腹壁内にプラスミドDNAをコートした金粒子をHelios Gene Gun System(Bio-Rad)を用いてヘリウム加圧350〜400psiで投与した。なお、金粒子は製造元のマニュアルに従って調製した。2週後にブースターの投与を行い、その1週後に脾細胞を採取した。
最終免疫後1週目に、CD8 alpha(Lyt2)マイクロビーズを用いたMACS system(Miltenyi Biotec, Germany)により、CD8陽性細胞をポジティブセレクションした。得られたT細胞画分はフローサイトメトリー分析で95%以上の純度であった。
96ウェルのニトロセルロースELISPOTプレート(MAHA S4510; Millipore, Bedford, MA)を2μg/mlのanti-mouse IFN-gamma mAb(clone R4-6A2, PharMingen)で4℃にて一夜コートした。各ウェルをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄後、FCS入り培地でブロッキングした(37℃、2時間)。免疫マウス由来の分離した新鮮CD8陽性細胞(1×105/well)および各種ペプチドパルスしたCD8陰性細胞(1×106/well)を各ウェルに撒き、最終液量が200μlになるようにした。37℃で22時間培養後、0.05%Tween20入りPBS(PBS−Tween)で十分に洗浄し、1.25μg/ml biotinylated anti-mouse IFN-gamma mAb(PharMingen)を加え、4℃で一夜培養した。PBS−Tweenで洗浄後、1μg/ml streptavidin-alkaline phosphatase conjugate(Mabtech)を100μl加え、室温で90分反応、PBS−Tweenで洗浄後、alkaline phosphatase conjugate substrate kit(BioRad, Hercules, CA)で染色した。そして、蒸留水で洗浄し反応を停止、その後プレートを乾燥、スポットをカウントした。
HLA−A2402結合能を持つ可能性のある9残基ペプチドを、BioInformatics & Molecular Analysis Section(BIMAS) HLA Peptide Binding Predictionウェブサイト(URL;http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla-bind/)で検索した。下記表1記載のSAGE由来の5個のペプチド、MAGE−A4由来の10ペプチドを選び、ペプチド合成機により化学合成した。その他、EBウイルス由来のEBNA3A246-254(RYSIFFDYM)およびHER2由来のHER263-71(TYLPTNASL)を合成した。使用したペプチドの純度は90%以上である。
(1)mRNAの調製
MAGE−A4及びSAGEプラスミドを直鎖にした。インビトロ転写はT7ポリメラ−ゼ(mMESSAGE mMACHINE T7 Kit; Ambion, Austin, TX)を使用して製造元のマニュアルに従って行った。その後、ポリAポリメラーゼ(Poly(A) Tailing Kit; Ambion, Austin, TX)を使用して製造元のマニュアルに従ってポリアデニル化した。得られたRNAを水に懸濁し、−80℃で使用前まで保存した。
MACS CD4マイクロビーズ(Miltenyi Biotec, Germany)を用いたポジティブ選択によって分離して得られた新鮮なCD4陽性細胞を、24ウェルプレート(Corning, NY)に1ウェル当り1〜2×106個/ml RPMI−1640培地(25mM Hepes、10%非働化ヒトAB血清、2mM L−グルタミン、100U/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシン)の細胞濃度で植えた。Day 0に10μg/mlのPHA(HA15, Murex, UK)を培地に添加した。Day 3に培地の半量をIL−2(20U/ml)及びIL−7(40ng/ml)を含む完全培地に交換した。同じ操作を3日ごとに繰り返した。得られた活性化CD4陽性細胞を培養後14〜28日目にエレクトロポレーションを行い、抗原提示細胞として使用した。
PBMCよりMACS CD8 Microbeads(Miltenyi Biotec)を用いて分離したCD8+T細胞5×105個を、1×105個の放射線(30Gy)照射したmRNA導入CD4+PHA幼芽細胞で、96ウェル丸底プレート(Nunc)中で刺激した。7日後、CD8+T細胞を1×105個の放射線(30Gy)照射したmRNA導入CD4+PHA幼芽細胞で再刺激し、さらにIL−2(20IU/m)入り培地で7日間培養した。
抗原特異的CTLを含有する、感作CD8+T細胞を増幅するために、標的抗原mRNAをエレクトロポレーションで導入した自己LCL(5×106個)、自己PBMC(2.5×107個)とIL−2(20IU/ml)を加え、抗CD3抗体なしで25mlフラスコ(Corning)で培養した。
96ウェル丸底プレート(Nunc)に0.3個/ウェルとなるように希釈し、自家PBMC(5×104個/ウェル)、放射線照射LCL(1×104個/ウェル)、IL−2(20IU/ml)、および抗CD3mAb(30ng/ml)を加えて培養した。標的である抗原提示細胞を溶解するCD8+T細胞はさらに放射線照射PBMC、放射線照射LCLおよび抗CD3mAb存在下で増幅した。
96ウェルのニトロセルロースELISPOTプレート(MAHA S4510; Millipore, Bedford, MA)を2μg/ml antihuman IFN-γ mAb(1-D1K)で4℃にて一夜コートした。各ウェルをPBSで洗浄後、10%ヒトAB血清入り培地でブロッキングした(37℃、2時間)。エフェクター細胞(2×104/well)およびペプチドパルスしたT2A24細胞(5×104/well)を各ウェルに撒いた。37℃で18時間培養後、PBS−Tweenで十分に洗浄し、1.25μg/ml biotinylated anti-mouse IFN-gamma mAb(PharMingen)を加え、4℃で一夜培養した。PBS−Tweenで洗浄後、1μg/ml streptavidin-alkaline phosphatase conjugate(Mabtech)を100μl加え、室温で60分反応、PBS−Tweenで洗浄後、alkaline phosphatase conjugate substrate kit(BioRad, Hercules, CA)で染色した。そして、蒸留水で洗浄し反応を停止、その後プレートを乾燥、スポット数をカウントした。
細胞傷害性は常法に従って行った。標的細胞は100μCi(3.7×106Bq) 51Crで標識し、1×104個を96ウェルのV底プレート(Nunc)で細胞数を変えたエフェクター細胞と37℃で反応させた。5時間後、100μlの上清を集め、測定した。アッセイは3連で行い、3ウェルの特異的溶解%の平均を計算した。
特異的細胞傷害活性(%)=〔(各ウェルの測定値−最小放出値)/(最大放出値−最小放出値)〕×100
上式において、最小放出値は標的細胞及びK562細胞のみ入っているウェルの51Cr量であり、標的細胞からの51Crの自然遊離量を示す。また、最大放出値は、標的細胞に界面活性剤トリトンX−100を加えて細胞を破壊した際の51Cr遊離量を示している。
in vitroでのペプチドをパルスしたCD8−のPBMCを用いたヒトCTLの誘導
1×107個のCD8陰性PBMCに10μMのペプチドで室温で1時間、37℃で5%CO2で1時間パルスした後、抗原提示細胞として使用した。次に、分離した5×105個のCD8+T細胞に対して、ペプチドをパルスした1×106個のCD8−PBMCで10〜12日間刺激した。1、4、7日目に、培地を半量交換し、ヒトIL−2(20IU/ml)、IL−7(50ng/ml)を追加した。誘導は24ウェル(Nunc)プレートで200μlのRPMI培地(25mM Hepes、10%非働化ヒトAB血清、2mM L−グルタミン、100U/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシン)で行った。
MHC−ペプチドテトラマーの作製は、HLA−A2402重鎖とβ2−ミクログロブリンは不溶性重合体として大腸菌で発現させた。重鎖のC末端は、ビオチン化酵素BirAの基質となる配列を付加した。モノマーのHLA/β2−ミクログロブリン/ペプチド複合体は、in vitroでMAGE-A4143-151ペプチドまたはSAGE715-723の存在下にフォールディングさせた。MHCはBirA酵素組換え体(Avidity, Denver, CO, USA)でビオチン化され、phycoerythrin-labelled streptavidin(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)を使用して4量体化された。
〔1〕 目的とする抗原をコードするRNAを導入した、前記抗原を認識するTリンパ球を誘導する活性を有するTリンパ球。
〔2〕 Tリンパ球がフィトヘムアグルチニンで活性化されたCD4陽性細胞である前記〔1〕記載のTリンパ球。
〔3〕 前記〔1〕または〔2〕記載のTリンパ球を含有する免疫誘導剤。
〔4〕 目的とする抗原をコードするRNAを導入したTリンパ球を抗原提示細胞として使用することを特徴とする、前記抗原を認識するTリンパ球の誘導方法。
〔5〕 Tリンパ球がフィトヘムアグルチニンで活性化されたCD4陽性細胞である前記〔4〕記載の誘導方法。
〔6〕 抗原を認識するTリンパ球がCD8陽性の細胞傷害性Tリンパ球であることを特徴とする前記〔4〕記載の誘導方法。
〔7〕 抗原が腫瘍関連抗原または感染性微生物抗原である前記〔4〕〜〔6〕いずれか記載の誘導方法。
〔8〕 癌組織から調製したRNAを使用することを特徴とする前記〔7〕記載の誘導方法。
〔9〕 EBNA3A、CMVpp65の少なくとも一つのウイルス抗原を発現するRNAを使用することを特徴とする前記〔7〕記載の誘導方法。
〔10〕 前記〔4〕〜〔9〕いずれか記載の方法によって誘導されたTリンパ球を有効成分として含有してなるがんまたは感染症の治療剤。
〔11〕 配列番号1又は2で表されるヒト主要組織適合性抗原(HLA)−A24拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドとHLA−A24分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を認識するCD8陽性の細胞傷害性Tリンパ球。
〔12〕 前記〔11〕記載の細胞傷害性Tリンパ球を有効成分として含有してなる制がん剤。
〔13〕 配列番号1又は2で表されるヒト主要組織適合性抗原(HLA)−A24拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分として含有してなる、前記〔11〕記載の細胞傷害性Tリンパ球の誘導剤。
〔14〕 配列番号1又は2で表されるヒト主要組織適合性抗原(HLA)−A24拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分として含有してなる制がん剤。
〔15〕 配列番号1又は2で表されるヒト主要組織適合性抗原(HLA)−A24拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体を含有する、前記〔11〕記載の細胞傷害性Tリンパ球の有するT細胞レセプター検出用のテトラマー。
Claims (5)
- 配列番号1又は2で表されるヒト主要組織適合性抗原(HLA)−A24拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドとHLA−A24分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を認識するCD8陽性の細胞傷害性Tリンパ球。
- 請求項1記載の細胞傷害性Tリンパ球を有効成分として含有してなる制がん剤。
- 配列番号1又は2で表されるヒト主要組織適合性抗原(HLA)−A24拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分として含有してなる、請求項1記載の細胞傷害性Tリンパ球の誘導剤。
- 配列番号1又は2で表されるヒト主要組織適合性抗原(HLA)−A24拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体から選択される少なくとも一つの抗原ペプチドを有効成分として含有してなる制がん剤。
- 配列番号1又は2で表されるヒト主要組織適合性抗原(HLA)−A24拘束性抗原ペプチド及びその機能的誘導体を含有する、請求項1記載の細胞傷害性Tリンパ球の有するT細胞レセプター検出用のテトラマー。
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