CN101292159A

CN101292159A - 功能性体外免疫测定

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Publication number: CN101292159A
Application number: CNA2006800394223A
Authority: CN
Inventors: M·施密特; B·维蒂希; A·桑德尔; Y·陈
Original assignee: Mologen AG
Current assignee: Mologen AG
Priority date: 2005-09-08
Filing date: 2006-09-08
Publication date: 2008-10-22
Also published as: JP2009506780A; RU2008113383A; US20090220931A1; RU2416797C2; CA2621789A1; AU2006289514A1; WO2007028380A1; EP1922545A1

Abstract

本发明涉及用于体外研究物质在体内过程中的效应的方法，以及用于鉴定免疫调节化合物和/或检测免疫调节化合物的效应及鉴定在体内过程中通过免疫系统诱导调亡和/或诱导坏死的化合物的体外检测方法。本发明的方法尤其适于研究物质对细胞的效应，该效应通过免疫系统介导。此外，本发明的方法适于在施用免疫调节化合物以及诱导调亡和/或诱导坏死的化合物之前、期间和/或之后对体内效应进行体外监测。

Description

功能性体外免疫测定

本发明涉及用于体外监测物质在体内过程中的效应的方法，以及用于鉴定免疫调节化合物和/或用于检测免疫调节化合物的效应及用于鉴定在体内过程中通过免疫系统诱导调亡和/或坏死的化合物的体外检测方法。

近年，在制药工业中已经开发了全新类别的物质，这些物质欲用于很多不同疾病的治疗。这还包括基因治疗的手段(Mittel)或已经过基因治疗修饰的机体中天然存在的物质(例如蛋白质或DNA构建体)。

因为迄今为止还没有在疾病的药物治疗中应用这些全新类别的物质中的某些物质的经验，因此对于在不需直接求助于动物试验或对患者进行临床研究的情况下检测这些手段的效力的方法存在需求。这种使用新的、未知物质的试验单纯由于伦理因素受到禁止。相反，在该步骤的准备过程中，表明了体外研究能够获得反映物质的体内效力的结果。在这一点上，在体外试验中必须尽可能近地接近体内状态。

此外，开发用于对接受治疗方法(例如免疫疗法或影响免疫系统的治疗)之前、期间和/或之后的患者进行监测的简单方法是重要的，从而可以在相应的治疗方法中研究生物体或免疫系统的反应。

同时，用于癌症的传统治疗方法(例如放疗和化疗)代表了自19世纪50年代以来用于治疗有转移的晚期癌症的唯一选择，本发明的一个目的是开发对患者具有更少副作用但能够高效地达到治疗目的的疗法。

其中一种方法是免疫疗法，其目标是通过遗传工程修饰加强对癌症的天然免疫应答，即影响免疫系统对癌症细胞的“注意力”从而影响免疫应答以通过机体本身与肿瘤进行斗争。

当前，大多数临床研究是基于肿瘤的去除、随后通过治疗性基因对肿瘤细胞进行离体转染、肿瘤细胞群的放射、并继以经修饰的肿瘤细胞的再植入。这种肿瘤细胞接种允许抗肿瘤应答根据转染的治疗性基因增加至不同的程度。

然而，除了肿瘤细胞的转染外，也正在开发用于诱导免疫系统与肿瘤细胞进行斗争的免疫调节物质。这些免疫调节物质诱导或“程序化”免疫系统使肿瘤细胞被特异性地攻击并最终被消灭。在该方法中，癌症治疗中的免疫调节物质通过免疫系统直接作用于相关的肿瘤或潜在的肿瘤细胞类型。

允许体外研究新物质对体内过程的效应(例如对肿瘤细胞的破坏)的方法一方面将避免涉及较多伦理限制的体内试验，另一方面将有可能在短时间内以大量不同的肿瘤细胞检测大量物质。此外，应用这种方法将有可能显示出某种治疗在所谓的“治疗监测”中诱导的体内效应的进展。

鉴于现有技术的这一现状，本发明的目的是提供一种允许体外研究物质对人或高等哺乳动物的体内过程的效力的方法。

这一目的通过独立权利要求的特征实现。

就本发明而言：

免疫系统的效意指免疫细胞的混合物，例如PBMC((来自人或高

应细胞等哺乳动物的)外周血单个核细胞、脾细胞(动物模

型)等)，或通过FACS或MACS分选的亚群(例如B、

T和NK细胞、单核细胞、树突状细胞等)。

CpG基序意指非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤基序

dSLIM 意指双茎环免疫调节寡脱氧核糖核苷酸，其中每个

环具有CpG基序(优选三个)

ODN 意指寡脱氧核糖核苷酸

PBMC 意指外周血单个核细胞

许多一般性概念应按如下理解：

在本发明中，免疫调节化合物应理解为能够影响免疫系统或仅单独其细胞(尤其是效应细胞)的反应的物质。除化合物外，这还包括DNA构建体、蛋白质、抗体、糖分子或其他展示出导致免疫系统或免疫系统细胞发生反应的特性的物质。在本发明中，这尤其涉及到称作效应细胞的免疫系统细胞，其能够实现或介导免疫系统的反应。这种介导通过特异性信使物质的释放而发生。

因此，本发明涉及包括以下步骤的方法：

a)分离细胞；

b)用待研究的物质对所述细胞进行初次温育；

c)回收来自所述初次温育的上清液或细胞与上清液的混合物；

d)用所述上清液或细胞与上清液的混合物对靶细胞进行第二次温育；以及

e)分析所述靶细胞。

用于鉴定免疫调节化合物和/或检测免疫调节化合物的效应以及鉴定在体内过程中通过免疫系统诱导调亡和/或诱导坏死的化合物的体外检测方法的一种替代实施方式，其包括以下顺序的步骤：

a)用待研究其免疫调节效应的、诱导调亡和/或诱导坏死的物质对免疫系统的效应细胞进行初次温育；随后

b)回收来自所述初次温育的上清液或细胞与上清液的混合物；随后

c)用来自初次温育的上清液或细胞与上清液的混合物对靶细胞进行第二次温育；以及最后

d)通过适当的检测方法分析免疫调节和/或诱导调亡和/或诱导坏死的效应。

该方法中所标明的步骤使得有可能体外研究物质在体内过程中的效应。结果，可以在非常接近体内状态的情况下检测新型化合物，而不危及动物和/或临床研究中的患者。

此外，可以(通过对相关参数的分析)对已计划/实施的治疗的影响进行监测。本发明的方法的这一应用在本发明中也称作“治疗监测”。该术语只应用于体内疗效的体外监测。除可以监测治疗的成功性外，根据本发明的方法本身与治疗没有联系。

在本发明的方法的一个优选实施方式中，根据上述定义，分离的细胞是免疫系统的效应细胞。本发明的方法特别适用于研究由免疫系统介导的物质对细胞的效应。

在初次温育中免疫系统细胞与物质能够发挥它们的效应之后，在第二次温育中通过温育来自初次温育的上清液或细胞与上清液的混合物及靶细胞显示物质的体内效应，所述来自初次温育的上清液或细胞与上清液的混合物还含有免疫系统细胞的分泌产物。

优选的靶细胞是人类细胞或来自高等哺乳动物的细胞。在本发明的方法的一个特别优选的实施方式中，将分离的细胞(尤其是免疫系统的细胞)用于初次温育，并将肿瘤细胞或在遗传上衍生自肿瘤细胞的细胞系作为第二次温育的靶细胞。在本发明的方法的这一实施方式中，将后者称为“功能性体外免疫测定”。

原则上，任何类型不同来源的肿瘤细胞都可认为是肿瘤细胞。“功能性体外免疫测定”的目的是鉴定或研究适于通过免疫系统在肿瘤细胞中启动调亡或坏死的物质。

然而，本发明的方法的另一目的是研究通过肿瘤细胞表面的MHC-I(例如HIA-ABC)和粘着分子(例如ICAM-1)的增强表达而触发的免疫系统对肿瘤细胞的识别。本发明的方法的绝对优势在于可以在无需在动物和/或临床研究的患者中进行试验的情况下检测体内效应，也避免了这样的试验所带来的所有缺点。

本发明提供了一种用于本发明的方法的试剂盒，用于研究由免疫调节物质诱导的免疫反应所致的表面分子的表达变化。所述试剂盒含有用于与待研究的物质一起进行初次温育的制备好并储存的等分细胞(优选免疫系统的效应细胞)、进行初次温育和第二次温育的手段、以及分析来自第二次温育的细胞的表面分子的表达模式的适当手段。为了分析第二次温育的靶细胞的表面抗原的表达模式，本发明的试剂盒含有进行RT-PCR的手段，为此所述试剂盒含有用于对来自表面分子的mRNA进行扩增的适当引物、用于扩增的酶和所需的缓冲液；和/或FACS分析的手段，为此所述试剂盒含有以适当荧光标记的针对表面抗原和调亡/坏死标记的抗体；以及额外地用于制备靶细胞的手段(例如缓冲液和化学制剂)。

进一步地，根据本发明的方法也适用于治疗监测，其中在治疗(例如免疫疗法或改变或影响免疫系统的治疗)之前、期间和/或之后将患者的全血、血细胞、血清或血浆用作初次温育中的待研究的物质。

通过上述本发明的方法的进一步应用，有可能对施用给患者的治疗剂(优选对免疫系统有刺激作用的治疗剂)是否已经产生体内效应进行检测。尽管在该方法中，就血液中所含细胞和/或信使物质或其一部分(例如血清和/或血浆或细胞亚群)对患者血液进行了研究，在该实施方式中本发明的方法最终用于间接检测在治疗(优选免疫疗法)中施用给患者的物质的体内效应。

如果不知道可在本发明的方法中用于“治疗监测”的特异性抗体，则可能通过施用治疗剂之后血液(血浆/血清)中细胞因子水平的变化或在免疫系统的反应后产生特异性抗体的变化对体内效应进行监测。

将本发明的方法用作用于每一病例的治疗剂的效应的治疗监测的治疗优选用于例如癌症、感染、过敏反应和自身免疫疾病等疾病。

由于提及的优点，因此优选将具有免疫调节效应或能够诱导调亡或坏死的化合物用于本发明的方法中。

根据本发明，优选将含有CpG-基序的寡脱氧核苷酸和dSLIM(双茎环免疫调节寡脱氧核糖核苷酸，参见EP 1,196,178 B1)用作免疫调节化合物。然而，在本发明的范围内，也可以使用其它生物分子，例如天然或遗传修饰的抗体、基于DNA和/或基于RNA的物质(反义寡脱氧核苷酸、si-RNA等)、氨基酸化合物、信使物质或其它免疫调节剂(例如铝盐、咪唑并喹啉、脂多糖、皂苷衍生物、磷脂、角鲨烯等)。

根据本发明，特别地，所述化合物可考虑作为适于永久性地打断细胞维持所必须的过程的诱导调亡和/或诱导坏死的化合物。在本发明中，可优选考虑基于DNA和/或基于RNA的物质(反义寡脱氧核苷酸、si-RNA等)、抗体或化疗剂。

此外，根据本发明的方法可用以鉴定在分离的细胞与免疫调节物质或诱导调亡和/或诱导坏死的物质经过初次温育之后由细胞所释放的信使物质。为此，在添加至第二次温育的靶细胞之前，将来自初次温育的上清液与特异性地识别潜在的信使物质的抗体预温育。抗体与信使物质的表位间的相互作用使得后者不能向靶细胞发送信号，从而其功能被阻断。根据本发明的方法的该实施方式对于检测负责诱导效应(例如调亡)的特定信使物质而言很重要。

优选将24孔至96孔的多孔板用于实施本发明的方法的试剂盒中，用于对所诱导的信使物质的释放进行鉴定，其中用针对信使物质(例如IFN-γ)的表位的抗体包被板的每个孔的表面，在温育来自初次温育物的上清液的组分和以该方式预处理的板并随后温育所述组分和靶细胞之后，有可能在短时间内检测大量潜在的信使物质以找出它们是否事实上参与了介导免疫应答或诱导调亡。

因此，本发明还涉及用于实施本发明的方法的试剂盒，用于对信使物质进行鉴定，所述信使物质随着初次温育中的细胞与待研究的物质的温育反应而释放。这一类型的试剂盒含有用于与待研究的物质一起进行初次温育的制备好并储存的等分细胞(优选免疫系统的效应细胞)、进行初次温育和第二次温育的手段、以及额外的24孔至96孔的多孔板，其中所述孔的表面以抗体包被，各个不同的孔的表面以不同的抗体包被，但是优选至少两孔具有相同抗体。

在根据本发明的方法中所必需的温育步骤优选在含有5％CO₂的培养箱中进行。然而，适于各种情况下的待温育细胞的要求的其它温育条件也是可以想到的。

通过离心回收根据本发明进行的初次温育的上清液或上清液与细胞的混合物。然而，其它适用于分离来自上清液的细胞的方法也可用于本发明，例如以仅允许上清液通过而不允许细胞或存在的任何细胞碎片通过的孔径对细胞进行过滤。此外，利用特异性抗体及随后通过磁性活化细胞分选(MACS)或荧光活化细胞分选(FACS)构建细胞分离系统和/或细胞分选系统。

为对细胞进行分析，将本发明的方法设计成能够显示靶细胞中蛋白质表达的变化。在本申请中，尤其可考虑FACS测量法(荧光活化细胞分选)、蛋白质印迹、凝胶过滤或细胞离心涂片器。

此外，构建了用于分析某些基因表达的变化的方法，例如RT-PCR、实时PCR、核糖核酸酶保护测定以及RNA和DNA印迹。

最后，在体内效应的分析中，还构建了调亡测定法，例如用膜联蛋白V进行细胞染色或TUNEL测定法、或例如通过碘化丙啶染色进行细胞周期分析。

下述的实施例和试验结果证明本发明的方法的应用不仅能利用体外研究表示物质在体外过程中的效应，而且还适于对通过将本发明的方法延展到竞争分析中所发现的效应的特异性进行检测和记录。

本发明的其它优选实施方式见从属权利要求和说明书。利用下述实施方式的实例和附图对本发明包括本发明的实用性进行详述，但并非将本发明限制于这些实施例。

单个核细胞的回收

为实施本发明的方法，从全血或所谓的“血沉棕黄层(buffy coat)”提取外周血单个核细胞(PBMC)。血沉棕黄层是在从全血制备红细胞浓缩物的过程中产生的副产物。

利用聚蔗糖梯度通过离心分离PBMC以分离红细胞、粒细胞和死细胞。聚蔗糖是一种不带电的蔗糖聚合物，其密度设置为当其被全血或血沉棕黄层覆盖然后离心时，低密度组分通过聚蔗糖层并聚集在底部，而淋巴细胞和单核细胞聚集在血浆(上层)和聚蔗糖(下层)之间的界面中。

分离离心后含细胞的界面并用PBS洗涤几遍。之后，将分离的细胞加入细胞培养基中，并调节至1-4×10⁶个细胞/mL的浓度。

双茎环免疫调节寡脱氧核糖核苷酸(dSLIM)

双茎环免疫调节寡脱氧核糖核苷酸是具有CpG序列的分子。它们经核苷酸环共价地封闭线性寡脱氧核苷酸(ODN)而获得，从而使它们免遭核酸外切酶降解。从而获得了哑铃状分子，称为dSLIM、“双茎环免疫调节剂”。它们的免疫调节活性基于结合Toll样受体的非甲基化CpG序列对免疫系统的非特异性激活，以及dSLIM分子的上述全部特殊结构。dSLIM的每个环含有3个非甲基化CpG基序。

在B类试验室中，根据带有随后的质量控制的标准操作规程(SOP)合成ISS30型双链环免疫调节剂(dSLIM)(例如dSLIM-30L1)。为此，用T4DNA连接酶连接单链发夹形5′-磷酸化寡脱氧核糖核苷酸(ODN)。用T7DNA聚合酶消化剩余的起始材料并进行层析纯化之后，通过乙醇/醋酸镁钠沉淀浓缩所得的dSLIM并溶于PBS中。提取程序见WO 01/07055。

用dSLIM初次温育免疫细胞(PBMC)

将分离的细胞(PBMC)接种于多孔盘中。选择各批次的大小及相应的孔的大小，使得随后收获的培养物上清液的体积具有与靶细胞进行第二次温育所需的精确体积。

第一批次含有未受激细胞(阴性对照)。用0.1-10μM dSLIM-30L1刺激第二批次。在另外两个批次中，用0.1-10μM寡脱氧核苷酸(ODN)刺激细胞，以产生最大可能的阳性结果，从而允许在FACS中对装置进行校准和补偿。在其它的批次中，用0.1-10μM的其它ODN刺激细胞用于比较。于37℃，在CO₂培养箱中温育各批次48小时。通过离心回收这些批次的上清液，并冷冻于-80℃用于进一步操作。

与靶细胞(例如HT-29)进行第二次温育

为了与靶细胞进行第二次温育，预先测定接种靶细胞的最佳浓度和体积。目的是在第二次温育之后，至少有5×10⁵个靶细胞/孔可用于分析。在本发明中，必须确保所述细胞有3天的最佳生长条件并按所需的密度并尽可能稀地进行接种，以使3天后细胞基本汇合。非最佳生长条件同样导致坏死或调亡，这将破坏试验结果。在本实施例中，将HT-29结肠癌细胞用作靶细胞。

在相应大小的批次中，以先前测定的最佳密度(例如在24孔板的每孔700μl中2.4×10⁵个细胞)接种细胞，并于37℃、在CO₂培养箱中温育过夜。

次日，通过从贴壁细胞除去培养基并将来自初次温育的上清液(“间接刺激”)或直接标明的物质(dSLIM-30L1、lin30L1)(“直接刺激”)添加到培养基中进行刺激。作为阴性对照，仅将培养基添加到间接批次中。将这些细胞称作未处理细胞，以将它们与未受激细胞(添加来次初次温育的未受激上清液)区分开。

于37℃、在CO₂培养箱中再次温育各批次(直接刺激和间接刺激)48小时。之后，可以在细胞上进行所需的分析。为此，首先从细胞除去上清液，并用PBS洗涤所述细胞。利用胰蛋白酶/EDTA从孔中除去细胞并进行进一步的洗涤，随后将它们转移至离心管中用于随后测定细胞数目。

表面抗原的染色

从受激批次离心出细胞并用特定的染色缓冲液洗涤。之后将细胞悬浮液调节至1×10⁶个细胞/mL的浓度。将500μl(0.5×10⁶个细胞)该细胞悬浮液在FACS管中离心，置于50μl染色缓冲液中后加入抗体(例如与FITC缀合的ICAM-1(CD54)、以及与PE缀合的HLA-ABC)。给每种抗体提供一个相应的同型对照，即用于装置校准和补偿的单染色的阳性样本。经过温度育步骤后，用PBS洗涤细胞两遍，并将细胞重悬于500-1000μl PBS中用于测量。为区分死细胞，添加7-AAD并再温育10分钟。然后进行FACS测量。

调亡/坏死细胞的染色

用膜联蛋白V-PE给调亡细胞染色，指示细胞中的调亡过程。用7-AAD进行复染以将这些细胞与坏死细胞区分开。

离心出来自受激批次的细胞并用PBS洗涤两遍。之后，将细胞稀释在特异性膜联蛋白结合缓冲液中，并调节至1×10⁶个细胞/mL的细胞浓度。每100μl(1×10⁵个细胞)该细胞悬浮液添加5μl膜联蛋白V-PE和7-AAD，充分混合后，将其于室温下温育15分钟。然后，添加400μl结合缓冲液并立即进行FACS测量。

以FACS进行流式细胞计数测量

A.调亡/坏死

测量荧光2(膜联蛋白V-PE)和荧光3(7-AAD)。利用未受激细胞(直接批次)和/或未处理细胞(间接批次)进行装置校准。

在FSC(前向散射光＝细胞大小)对SSC(侧向散射光＝细胞粒度)的点阵图中，调节细胞群使其位于中央。然后对荧光2和荧光3进行PMT校准和补偿。之后，对所有样本进行测量(5000个细胞)。

B.表面抗原

测量荧光1(ICAM 1-FITC)、荧光2(HLA-ABC-PE)和荧光3(7-AAD)。

利用经lin-30L1刺激的细胞对装置进行校准，lin-30L1设有用于非特异性结合的比较的相应同型对照(复染)和荧光标记抗体(单染)。

在FSC对SSC的点阵图中，调节细胞群使其位于中央。随后利用所述同型对照对荧光1、2和3进行PMT校准，并用单染进行补偿。之后，对所有样本进行测量(10000个细胞)。排除死细胞(7-AAD阳性细胞)(在点阵图中荧光3对FSC)。

结果说明

A.调亡/坏死

制作显示7-AAD与膜联蛋白V的比较的点阵图。然后基于未处理细胞划分象限。根据细胞在各象限中的位置，它们分属于调亡或坏死组分。

●活细胞为膜联蛋白阴性和7AAD阴性(LL象限)

●调亡细胞为膜联蛋白阳性和7AAD阴性(LR象限)

●坏死细胞为膜联蛋白阳性和7AAD阳性(UR象限)，或膜联蛋白阴性和7AAD阳性(UL象限)

B.表面标记

以活细胞制作两张点阵图(荧光1对FSC、和荧光2对FSC)。根据细胞在各点阵图中的位置，读出细胞的荧光强度(荧光1/ICAM-1或荧光2/HLA-ABC)。然后与相关的对照进行比较。

●就以下将检测批次与对照进行比较：

○表面标记阳性的细胞的数目(＝具有相应的表面标记的细胞的数目)

○表面标记的荧光强度(＝细胞表面的表面标记分子的数目)

实施本发明的方法的实例的结果示于附图中。

附图说明如下：

图1：根据本发明的方法的示意图。

图2：通过检测HT-29肿瘤细胞的调亡和坏死对dSLIM免疫调节剂的体外效应的分析。

图3：通过检测HT-29肿瘤细胞中HLA-ABC表面标记的表达对dSLIM免疫调节剂的体外效应的分析。

图4：通过检测HEK-293肿瘤细胞的调亡和坏死对dSLIM免疫调节剂的体外效应的分析。

图5：通过检测HEK-293肿瘤细胞中HLA-ABC表面标记的表达对dSLIM免疫调节剂的体外效应的分析。

图6：通过利用根据本发明的方法检测HT-29肿瘤细胞的调亡和坏死对dSLIM的作用机制的分析。

图7：通过利用根据本发明的方法检测HT-29肿瘤细胞中HLA-ABC表面标记的表达对dSLIM的作用机制的分析。

图8：通过检测RENCA肿瘤细胞中HLA-ABC表面标记的表达对dSLIM与线性CpG ODN的效力的比较。

图9：通过检测RENCA肿瘤细胞的调亡和坏死对dSLIM与线性CpGODN的效力的比较。

图10：通过检测HT-29肿瘤细胞中HLA-ABC表面标记的表达对dSLIM与线性CpG ODN的效力的比较。

图11：通过检测HT-29肿瘤细胞的调亡和坏死对dSLIM与线性CpGODN的效力的比较。

图12：在癌症患者治疗期间对存活的肿瘤细胞的体外监测。

图13：在癌症患者治疗期间对调亡/坏死的肿瘤细胞的体外监测。

图14：在癌症患者治疗期间对肿瘤细胞的表面标记的体外监测。

图1是根据本发明的方法的步骤的顺序的示意图。左侧的A部分记录了典型的体内应用；右侧的B部分表示“功能性体外免疫测定”的实施方式中根据本发明的相关方法。

图2显示应用根据本发明的方法的dSLIM免疫调节剂的体外效应的分析结果。从该图的右边部分可见，来自与dSLIM一起温育的PBMC的上清液的使用在HT-29肿瘤(结肠癌)细胞中诱导调亡和坏死。从图中可见，用dSLIM直接处理的细胞相对于用上清液处理的细胞，细胞调亡从17％增加至46.7％。

在图3中，分析了dSLIM免疫调节剂在HT-29细胞中的体外效应。来自与dSLIM一起温育的PBMC的上清液的使用诱导了HLA-ABC表面标记的加强表达。在该图中的最右端可见细胞群的迁移。

为支持在应用本发明的方法的HT-29中获得的试验结果，在HEK-293细胞中进行类似试验。结果示于图4和图5中。

图4显示dSLIM诱导了调亡(膜联蛋白V)和坏死(7-AAD)。因此，与无ODN的上清液处理的细胞相比较，来自用dSLIM处理的细胞的上清液导致调亡细胞的数目从12.1％增加至21.7％。坏死细胞的数目从9.2％增加至16％。

图5显示了用来自PBMC的dSLIM上清液温育靶细胞(HT-29)对HLA-ABC表面标记的加强诱导。该图的上面部分显示了用源自未经ODN处理的PBMC的上清液处理的细胞群相对于用来自经dSLIM处理的PBMC的上清液温育的细胞的迁移(＝表达的增加)。

图6显示了在应用根据本发明的方法的HT-29细胞中对dSLIM的作用机制的分析结果，以及对调亡和坏死的检测结果。在PBMC的初次温育步骤中，添加能够抵销dSLIM的效应的抗体(抗-IFN-γ、绿框)。为进行比较，用抗体(抗-IFN-α、抗-TNFα)进行试验对特异性进行证实。可以容易地看到(绿框)抗-IFN-γ抗体使得调亡细胞和坏死细胞的数目都减少至最少。

在图7中，对本发明的方法的应用对应于图6中对本发明的方法的应用，但还对靶细胞(HT-29)上的表面标记ICAM-1(CD54)的表达进行了分析。细胞群的迁移显示于该图的下面部分用于比较。

图8和图9显示了在RENCA肿瘤细胞中应用本发明的方法的试验结果，其中研究了具有线性ODN的dSLIM的效应用于比较。然而，含CpG的线性寡脱氧核苷酸也与dSLIM具有不同的序列且通过磷硫酰保护其不被分解。

图8显示了用dSLIM处理靶细胞导致表面标记HLA-ABC(上面部分)的加强表达，而线性CpG ODN没有效果。该图右侧的表显示了数值差异。如图9中所示，dSLIM在调亡和坏死的诱导上显然比线性CpG ODN更有效。在诱导调亡上的差异以百分比的形式显示在该图的下面部分。

图10和图11对在作为靶细胞的HT-29细胞中应用本发明的方法的dSLIM和线性CpG ODN进行了比较。这些试验的结果对应于以RENCA肿瘤细胞获得的并示于图8和图9中的结果。图10和图11的布置也对应于图8和图9。

图12、图13和图14显示了将本发明的方法应用于体外监测存活肿瘤细胞(图12)和调亡/坏死细胞(图13)的数目，以及在癌症患者的治疗过程中ICAM-1/HLA-ABC表面标记的表达的变化(图14)。

在治疗第一周的头五天的每一天，将2.5mg dSLIM施用给患有直肠癌和肝脏转移的患者。在第一周的第六天进行放疗，然后进行化疗。

在第一周的头六天的每一天从患者采取血液样本用于对体内效应进行体外分析。化疗的过程中，仍然采取血液样本直至每一周的结束。

自血液样本分离血浆，并与肿瘤细胞系HT-29的细胞进行温育。之后，测定活细胞(图12)和调亡/坏死细胞的数目，并研究表面标记ICAM-1/HLA-ABC的表达。

图12显示了HT-29细胞与来自8个血液样本的血浆温育的结果。在施用dSLIM的第二天可以清楚地观察到存活HT-29细胞的数目的明显减少。与对照组中的活细胞数目相比较，其活细胞数目在第二天下降至少于第一天的细胞数的一半。

图13显示在治疗癌症患者的第1、2、5和20天，对调亡/坏死的肿瘤细胞的体外监测。在体内效应的这一监测中，可以看到施用dSLIM后一天，调亡/坏死的细胞的数目已经明显地增加。

图14显示了在癌症患者的治疗过程中，利用来自样本1、2、3和8的血液的血浆对表面标记ICAM-1/HLA-ABC的表达的变化进行研究的结果。其中，将样本1用作表示两种表面标记的表达的变化的参考值。

在治疗的第二天，ICAM-1已经更强地表达，这可在图中下面部分通过荧光强度位置的迁移看出，这表明ICAM-1被更强地表达。

对于HLA-ABC，在第二天仍未发生荧光强度的迁移。直至治疗的第三天才发生荧光强度的迁移，这同样也表明HLA-ABC被更强地表达。

附图标记列表

A＝体内状态

B＝体外免疫测定

1＝患者

2＝靶组织，例如肿瘤

3＝免疫细胞

4＝检测物质，例如dSLIM

5＝活化免疫细胞

6＝供体

7＝免疫细胞，例如PBMC

8＝检测物质，例如dSLIM

9＝活化免疫细胞，例如PBMC

10＝上清液

11＝靶细胞，例如肿瘤细胞

12＝分析

Claims

1.用于体外研究物质在体内过程中的效应的方法，该方法包括以下顺序的步骤：

a)分离细胞；

b)用待研究的物质对所述细胞进行初次温育；

e)分析所述靶细胞。

2.根据权利要求1的方法，其中用于初次温育的分离的细胞是免疫系统的效应细胞。

3.根据权利要求1或2的方法，其中第二次温育的靶细胞是人类细胞或来自高等哺乳动物的细胞。

4.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中利用患者的血液、血清或血浆进行步骤1.d)和1.e)。

5.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中所述待研究的物质是免疫调节化合物以及诱导调亡或诱导坏死的化合物。

6.适于鉴定免疫调节化合物和/或检测免疫调节化合物的效应及鉴定在体内过程中通过免疫系统诱导调亡和/或诱导坏死的化合物的体外检测方法，该方法包括以下顺序的步骤：

a)用待研究其免疫调节效应的物质或诱导调亡或坏死的物质对免疫系统的效应细胞进行初次温育；随后

7.根据权利要求6的方法，其中用于初次温育的细胞是预先在步骤1.a)中分离的细胞。

8.根据权利要求6或7的方法，其中用于初次温育的免疫系统的效应细胞优选是来自血液的外周血单个核细胞、脾细胞、或利用FACS或MACS分选的细胞混合物的亚群例如B、T和NK细胞、单核细胞或树突状细胞。

9.根据权利要求6-8中至少一项的方法，其中用于初次温育的细胞和第二次温育的靶细胞是人类细胞或来自高等哺乳动物的细胞。

10.根据权利要求6-9中至少一项的方法，其中利用患者的血液、血清或血浆进行步骤6.c)和6.d)。

11.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中第二次温育的靶细胞是肿瘤细胞或在遗传上衍生自肿瘤的细胞系。

12.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中其效应被研究的免疫调节化合物是含有CpG的寡脱氧核苷酸或在单链区域具有至少1个CpG基序的部分双链DNA构建体。

13.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中其效应被研究的诱导调亡和/或诱导坏死的化合物优选是反义寡脱氧核苷酸、siRNA、抗体或化疗剂。

14.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中在治疗之前、期间和/或之后将全血、血细胞、血细胞亚群、血清或血浆用作初次温育中的待研究的物质。

15.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中在培养箱中进行温育。

16.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中通过离心回收上清液。

17.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中研究特异性蛋白质的表达用于对靶细胞进行分析。

18.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中研究所定义基因的表达用于对靶细胞进行分析。

19.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中对靶细胞染色用于分析，尤其是用膜联蛋白V或碘化丙啶染色剂进行染色。

20.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中实施调亡和/或坏死检测方法用于对靶细胞进行分析。

21.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中进行细胞周期分析。

22.根据前述权利要求中至少一项的方法，其中将抗体或其它竞争性物质添加至具有待研究物质的初次温育物中。

23.用于实施适于鉴定免疫调节化合物和/或检测免疫调节化合物的效应及鉴定在体内过程中通过免疫系统诱导调亡和/或诱导坏死的化合物的体外检测方法的试剂盒，所述试剂盒包含：

●制备好并储存的等分免疫系统效应细胞；和

●进行初次温育和第二次温育的手段(Mittel)；和

●24孔至96孔的多孔板，其用于检测随着初次温育中的细胞与待研究的化合物的温育反应而释放的信使物质，其中所述孔的表面以抗体包被；和/或

●用于研究由待研究的化合物诱导的免疫反应所致的表面分子表达的变化的，进行RT-PCR的手段，为此所述试剂盒含有用于扩增表面分子的mRNA的适当引物、用于扩增的酶和所需的缓冲液；和/或FACS分析的手段，为此所述试剂盒含有以适当荧光标记的针对表面抗原的抗体；以及额外地，用于制备靶细胞的手段，例如缓冲液和化学制剂。

24.用于在施用之前、期间和/或之后在体外证实免疫调节化合物的效应及鉴定在体内过程中通过免疫系统诱导调亡和/或诱导坏死的化合物的试剂盒，所述试剂盒至少包含以下组分：

●用于与患者的血液、血清或血浆一起进行温育的制备好并储存的等分靶细胞；和

●进行第二次温育的手段；和

●用于研究由待研究的化合物诱导的免疫反应所致的表面分子表达的变化，进行RT-PCR的手段，为此所述试剂盒含有用于扩增表面分子的mRNA的适当引物、用于扩增的酶和所需的缓冲液；和/或FACS分析的手段，为此所述试剂盒含有以适当荧光标记的针对表面抗原的抗体；以及额外地，用于制备靶细胞的手段，例如缓冲液和化学制剂。

●根据权利要求24的试剂盒，其中所含靶细胞是肿瘤细胞或在遗传上衍生自肿瘤的细胞系。

25.根据权利要求24的试剂盒，其中所含靶细胞是肿瘤细胞或在遗传上衍生自肿瘤的细胞系。