BRPI0615866A2 - processo para monitoramento in vitro do efeito de substáncias em processos in vitro, processo de detecção in vitro, kit - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA MONITORAMENTO IN VITRO DO EFEITO DE SUBSTáNCIAS EM PROCESSOS IN VITRO, PROCESSO DE DETECçãO IN VITRO, KIT. A presente invenção refere-se a um processo para monitoramento in vitro do efeito de substâncias em processos in vivo, assim como um processo de detecção in vitro para a identificação de compostos imunomoduladores e/ou a detecção do efeito de compostos imunomoduladores assim como a identificação de compostos indutores de apoptose e/ou necrose, por meio do sistema imune nos processos in vivo. Os processos de acordo com a presente invenção se prestam especialmente para monitoramento dos efeitos de substâncias sobre células a serem monitoradas, que são mediadas pelo sistema imune. Depois que as células do sistema imune com as substâncias, na incubação primária, conseguem produzir sobre estas seu efeito, os efeitos in vivo das substâncias, na incubação secundária, são comprovados fazendo-se com que os sobrenadantes ou a mistura das células e sobrenadante da incubação primária, que dentre outras coisas contêm os produtos eliminados pelas células do sistema imune, sejam incubados com células alvo. Além disso, o processo de acordo com a presente invenção é adequado para monitoramento invitro subseqúente dos efeitos ín vivo antes, durante e/ou depois da dosagem dos compostos imunomoduladores, assim como de compostos indutores de apoptose e/ou necrose.

Description

PROCESSO PARA MONITORAMENTO IN VITRO DO EFEITO DE SUBSTÂNCIAS EM PROCESSOS IN VITRO, PROCESSO DE DETECÇÃO IN VITRO, KIT

DESCRIÇÃO

A presente invenção se refere a um processo para o monitoramento in vitro do efeito que substâncias terão em processos in vivo, assim como a um processo de detecção in vitro para a identificação de compostos imunomoduladores e/ou a detecção do efeito dos compostos imunomoduladores, assim como a identificação de compostos indutores de apoptose e/ou de necrose por' meio do sistema imune em processos que ocorrerão in vivo.

Na indústria farmacêutica foram recentemente desenvolvidas classes de substâncias completamente inéditas que são previstas para a terapia de diferentes doenças. Dentre elas sè encontram também substâncias da terapia gênica ou substâncias corporais geneticamente modificadas tais como, por exemplo, proteínas ou constructos de DNA.

Como no caso destas classes de substâncias totalmente inéditas não existe ainda nenhuma experiência na terapia farmacêut ica de doenças, ha a necessidade de processos para se testar a eficácia destas substâncias sem que se deva recorrer imediatamente a experimentos com animais e/ou a estudos clínicos com pacientes. Já por motivos éticos tais testes com substâncias novas desconhecidas são indesejáveis. Pelo contrário, é aconselhável se obter, em preparação a esta etapa de estudos clínicos, resultados de monitorações in vitro, que permitam previsões no tocante à eficácia das substâncias in vivo. Neste caso é essencial fazer, nos testes in vitro, o acompanhamento o mais próximo da situação in vivo.

Além disso, é importante se desenvolver métodos simples para um monitoramento do processo de pacientes ante.s, durante e/ou depois de um método de tratamento (imunoterapia ou terapia que influi sobre o sistema imune, por exemplo), sendo monitorada a reação do organismo, ou do sistema imune, ao método de tratamento correspondente. Além dos métodos de tratamento convencionais de doenças, tais como a radioterapia e a quimioterapia, que representam desde os anos 50 a única opção para doenças tumorais adiantadas e disseminadas, pretende-se desenvolver terapias que estejam associadas com menos efeitos colaterais para os pacientes, sendo simultaneamente extremamente eficazes no sentido do direcionamento ao objetivo da terapia.

Uma terapia adicional é a imunoterapia, que tem como objetivo reforçar a resposta imune natural contra a doença tumoral por modificações gênicas, de intensificar, portanto, a "conscientização" do sistema imune em relação às células cancerosas, e de tal modo influir sobre a reação de defesa, que o tumor seja combatido pelo próprio corpo.

A maioria dos estudos clínicos aposta atualmente na eliminação do tumor, em uma transfecção ex vivo subseqüente das células tumorais com um gene terapêutico, na irradiação da população de células tumorais e, em um subseqüente reimplante das células tumorais modificadas. Com esta vacinação com células tumorais pode aumentar até pontos variáveis à resposta antitumoral, dependendo do gene terapêutico transfectado.

Além da transfecção de células tumorais, estão sendo desenvolvidas também substâncias imunomoduladoras que devem estimular o sistema a combater as células tumorais. Através destas substâncias imunomoduladoras, o sistema imune deve ser estimulado, ou "programado", para atacar células tumorais especificamente e finalmente destrui-las. As substâncias imunomoduladoras atuam, portanto, na terapia anticancerígena indiretamente através do sistema imune atacando o tumor ou o tipo de células tumorais que lhe dá origem.

Um método que permite que se monitore o efeito in vitro de substâncias inéditas sobre processos que virão a ocorrer in vivo, tal como, por exemplo, a destruição de células tumorais, por um lado evitaria experiências in vivo eticamente questionáveis e por outro lado permitiria que em pouco tempo pudesse ser testada uma multiplicidade de substâncias em uma multiplicidade de diferentes células tumorais. Além disso, seria possível com um tal tipo de método, demonstrar o progresso de uma terapia no tocante aos efeitos induzidos em um método denominado de "Monitoração de Terapia".

A partir deste estado da técnica, um objetivo da presente invenção consiste em propor um processo que permita se monitorar in vitro o efeito de substâncias sobre os processos que virão a ocorrer in vivo em seres humanos ou mamíferos superiores.

Este objetivo é atingido com as características das reivindicações independentes.

Dentro do sentido da invenção:

Células efetoras do Mistura de células imunes, tais sistema imune como, por exemplo, PBMC [células mononucleares periféricas do sangue (de seres humanos ou de mamíferos superiores), células esplênicas (modelos animais) etc.] ou subpopulações selecionadas por FACS ou MACS, tais como células B, T e NK, monócitos, células dendríticas, etc.

Motivo de CpG Motivo de citosina-guanina não- metilado.

dSLIM Oligodesóxi-ribonucleotídeos imunomoduladores de tronco-alça duplos, apresentando cada alça um motivo de CpG, de preferência três.

ODN Oligodesóxi-ribonucleotídeo.

PBMC Células sangüíneas mononucleares primárias.

Em seguida, será explicada uma série de expressões convencionais.

Compostos imunomoduladores devem ser compreendidos dentro do princípio da presente invenção como sendo aqueles que têm a capacidade de influir sobre a reação do sistema imune ou sobre suas células individuais, especialmente sobre as células efetoras. Nestes termos incidem, além dos compostos químicos, também constructos de DNA, proteínas, anticorpos, moléculas de glicídeos ou outras substâncias que apresentam características que levam a estimular o sistema imune ou células do sistema imune a uma reação. Isto se aplica especialmente às células do sistema imune da presente invenção denominadas células efetoras, que têm a capacidade de produzir ou transferir reações do sistema imune. Esta transferência se produz por meio da secreção de mediadores específicos.

De acordo com a presente invenção é, portanto, proposto um processo que abrange as seguintes etapas de processo:

a) Isolamento das células;

b) Incubação primária das células com a substância de teste;

c) Obtenção do sobrenadante ou da mistura de células e sobrenadante da incubação primária;

d) Incubação secundária de células alvo com o sobrenadante ou a mistura de células e sobrenadante;

e) Análise das células alvo.

Em uma modalidade alternativa propõe-se um processo de detecção in vitro para a identificação de compostos imunomoduladores e/ou para a detecção do efeito dos compostos imunomoduladores assim como da identificação de compostos indutores de apoptose e/ou necrose por meio do sistema imune em processos que virão a ocorrer in vivo, abrangendo tal processo a seguinte seqüência de etapas de processo:

a) Incubação primária de células efetoras do sistema imune com uma substância a ter monitorado o seu efeito imunomodulador ou indutor de apoptose ou necrose, seguida por

b) Obtenção do sobrenadante ou da mistura de células e sobrenadante da incubação primária e, em seguida

c) Incubação secundária de células alvo com o sobrenadante ou com a mistura de células e sobrenadante da incubação primária, e finalmente

d) A análise do efeito imunomodulador e/ou indutor de apoptose e/ou necrose por meio de processo de detecção.

Com as etapas de processo do processo dado é possível se monitorar o efeito de substâncias nos processos que virão a ocorrer in vivo. Deste modo, em determinadas condições, pode- se acompanhar de muito perto a situação que virá a ocorrer in vivo, testando-se compostos inéditos sem se colocar em risco animais e/ou pacientes em estudos clínicos.

Além disso, pode ser acompanhado o efeito de uma terapia já efetuada/conduzida (através de parâmetros relevantes para a análise). Este emprego do processo de acordo com a presente invenção é denominado, dentro do princípio da presente invenção, "monitoração de terapia". Com esta expressão se refere somente ao acompanhamento in vitro dos efeitos terapêuticos in vivo. O processo de acordo com a presente invenção não está associado com a terapia propriamente dita a não ser na medida em que ele controla ou acompanha o sucesso da terapia.

No caso das células isoladas trata-se, em uma modalidade preferida, do processo da presente invenção de células efetoras do sistema imune consoante à definição dada acima. Os processos de acordo com a presente invenção se prestam especialmente para o monitoramento dos efeitos das substâncias sobre as células, efeitos estes que são mediados pelo sistema imune.

Depois das células do sistema imune com as substâncias na incubação primária terem podido desenvolver este seu efeito, na incubação secundária se detectam os efeitos in vivo da substância, incubando-se esta com células alvo ou com o sobrenadante da incubação primária, ou com uma mistura de células e sobrenadante da incubação primária, que dentre outros contêm produtos secretados pelas células do sistema imune.

Como células alvo são preferidas células humanas ou células de mamíferos superiores. Em uma modalidade especialmente preferida do processo de acordo com a presente invenção as células isoladas empregadas para a incubação primária, são especialmente células do sistema imune e como células alvo para a incubação secundária são preferidas células tumorais ou linhagens de células que se originam de células tumorais. Nesta modalidade do processo da presente invenção, este é denominado "imunoensaio funcional in vitro".

Como células tumorais são essencialmente preferidos todos os tipos de células tumorais de diferentes origens. O objetivo de um "imunóensaio funcional in vitro" consiste na identificação ou no monitoramento, os quais se prestam a introduzir por meio do sistema imune a apoptose ou a necrose de células tumorais.

Um outro objetivo dos processos da presente invenção consiste também em monitorar o reconhecimento de células tumorais através do sistema imune, causado por meio de uma expressão intensificada de MHC-I (de HLA-ABC, por exemplo) e de moléculas de adesão (ICAM-I, por exemplo) na superfície das células tumorais. Uma vantagem decisiva dos processos de acordo com a presente invenção consiste em se poder detectar o efeito que terá in vivo, sem que seja necessário se sacrificar animais e/ou pacientes em testes clínicos, com todos os inconvenientes associados com estes testes.

Para se aplicar os processos de acordo com a presente invenção à monitoração da alteração da expressão de moléculas da superfície, resultado de uma reação induzida pela substância imunomoduladora, é proposto um kit. 0 kit contém alíquotas de células preparadas para serem armazenadas, de preferência de células efetoras do sistema imune, para a incubação primária com as substâncias a serem testadas, substância para a condução da incubação primária e secundária, assim como substância adequada para a análise do padrão de expressão das moléculas de superfície das células da incubação secundária. 0 kit de acordo com a presente invenção contém, para a análise do padrão de expressão dos antígenos de superfície das células alvo da incubação secundária, substância para a condução de uma RT-PCR, contendo o kit, para tal fim, iniciadores adequados para a multiplicação do mRNA das moléculas de superfície, enzima para a multiplicação e os tampões necessários e/ou substância para uma análise por FACS, contendo o kit, para tal fim, anticorpos marcados com fluorescência que são lançados contra os antigenos de superfície e marcadores de apoptose/necrose, assim como outras substâncias para a elaboração das células alvo, tais como tampões e substâncias químicas.

Os processos de acordo com a presente invenção são adequados também no seu aperfeiçoamento para o monitoramento de terapia, sendo empregado como substância a ser testada na incubação primária de sangue integral, células sangüíneas, soro sangüíneo ou plasma sangüíneo de um paciente, antes, durante e/ ou depois de um tratamento (imunoterapia ou terapia, que altera ou influi o sistema imune, por exemplo).

Por meio deste aperfeiçoamento dos processos de acordo com a presente invenção é possível testar se os produtos terapêuticos que foram administrados ao paciente e têm de preferência, um efeito estimulador sobre o sistema imune, já têm efeito direcionado in vivo. Embora no processo, seja testado o sangue do paciente com as células e/ou mediadores ou seus componentes (soro ou plasma ou subpopulações de células), o processo da presente invenção nesta modalidade serve somente como um detector indireto do efeito in vivo da substância que foi administrada ao paciente na terapia, de preferência em uma terapia imune.

Na medida em que não se conhecem os anticorpos específicos que podem ser empregados nos processos da presente invenção para a "monitoração de terapia", é possível acompanhar in vivo o efeito depois da administração dos produtos terapêuticos através das alterações do nível de citocinas no sangue (plasma/soro), ou alterações na produção de anticorpos específicos decorrentes de uma reação do sistema imune.

No caso de tratamentos em que os processos da presente invenção são previstos para o monitoramento de terapia para o efeito dos produtos terapêuticos empregados respectivos, trata-se de preferência de doenças como câncer, infecções, alergias e doenças auto-imunes. Devido às vantagens citadas, são propostos para os processos da presente invenção também compostos preferidos que têm um efeito imunomodulador ou têm a capacidade de produzir apoptose ou necrose.

Como compostos imunomoduladores são preferidos de acordo com a presente invenção oligodesóxi-nucleotideos e dSLIM (oligodesóxi-ribonucleotideos imunomoduladores de duplo tronco-alça, veja EP 1 196 178 BI) contendo motivo Cp-G. No entanto, também incide no âmbito da invenção o emprego de outras biomoléculas, tais como, por exemplo, anticorpos naturais ou geneticamente alterados, substâncias à base de DNA ou de RNA (oligodesóxi-nucleotideos anti-sentido, si-RNA etc.), compostos de aminoácidos, mediadores ou outros imunomoduladores (tais como, sais de alumínio, imidazoquinolina, lipopolissacarídeos, derivados de saponina, fosfolipídeos, esqualeno, etc.).

Como compostos indutores de apoptose e/ou necrose consideram-se de acordo com a presente invenção especialmente aqueles compostos que são adequados para perturbar de modo permanente os processos necessários para a sobrevivência das células. Neste caso, cogita-se especialmente em substâncias à base de DNA ou RNA (oligodesóxi-nucleotideos anti-sentido, siRNA, etc.), anticorpos ou quimioterápicos.

Os processos de acordo com a presente invenção podem, além disso, ser empregados, para a identificação de mediadores que resultando da incubação das células isoladas na incubação primária como substâncias imunomoduladoras ou indutoras de apoptose e/ou necrose são secretados pelas células. Para tal fim pré-incuba-se com anticorpos o sobrenadante da incubação primária antes de se acrescentar às células alvo da incubação secundária, anticorpos estes que reconhecem especificamente mediadores potenciais. Através da interação entre os anticorpos e o epítopo do mediador, este último não tem mais a capacidade de emitir sinais às células alvo e assim é bloqueado em sua função. Esta modalidade do processo de acordo com a presente invenção é importante para detectar quais são os mediadores concretos que são responsáveis por um efeito induzido, apoptose, por exemplo.

Dentro do quadro de um kit para colocação em prática do processo de acordo com a presente invenção para a identificação da secreção induzida pelos mediadores são empregados placas de preferência perfuradas com 24-96 poços, sendo a superfície de cada poço de uma placa revestida com um anticorpo, que é lançado contra um epítopo de um mediador (IFN-γ, por exemplo), e depois da incubação de frações do sobrenadante da incubação primária com uma tal placa pré- tratada e da incubação subseqüente das frações das células alvo ocorre a possibilidade de se testar uma multiplicidade de mediadores potenciais em um tempo curto, para se verificar se estes realmente participam na transmissão de uma resposta imune ou na indução de apoptose.

Portanto, um kit para colocação em prática dos processos da presente invenção para a identificação de mediadores, que são secretados como reação da incubação das células da incubação primária com uma substância a ser testada, também constitui um objeto da presente invenção. Um tal kit contém alíquotas de células preparadas para serem armazenadas, células estas que são de preferência células efetoras do sistema imune, para a incubação primária com as substâncias a serem testadas, substâncias para a condução da incubação primária e secundária, assim como ainda placas com poços tendo um número de 24-96 poços, sendo as superfícies dos poços, revestidas com um anticorpo, sendo as superfícies de poços diferentes revestidas com anticorpos diferentes, sendo, de preferência, pelo menos cada 2 poços dotado com um anticorpo idêntico.

As etapas de incubação necessárias para os processos de acordo com a presente invenção ocorrem, de preferência, em uma incubadora com um teor de CO2 de 5%. Podem, no entanto, também ser empregadas outras condições de incubação, dependendo das exigências de cada tipo de células a serem incubadas. A obtenção do sobrenadante ou da mistura de sobrenadantes e de células provenientes da incubação primária se produz de acordo com a presente invenção por centrifugação. Pode, no entanto, dentro do âmbito da presente invenção se empregar todos os outros processos que sejam adequados para uma separação das células dos sobrenadantes, tais como, por exemplo, a filtração das células por uma largura de malha que permitisse somente a passagem do sobrenadante, mas não das células ou dos detritos de células presentes. Além disso, são previstas separações ou seleções de células por meio de anticorpos específicos e por seleção magnética (MACS) ou à base de fluorescência (FACS).

Para a análise das células são propostos métodos da presente invenção, que podem demonstrar quais as alterações que ocorrem na expressão de proteínas nas células alvo. Neste caso, cogita-se especialmente em medições por FACS (Seleção de Células Ativadas fluorescentes), Filtrações por Gel de Western Blots ou zitospins.

Além disso, são propostos métodos para a análise das alterações na expressão de genes determinados, tais como RT- PCR, PCR em tempo real, ensaios de Proteção de RNase assim como Northern Blot e Southern Blot.

Finalmente, no caso da análise dos efeitos a se produzirem in vivo são também previstos ensaios de apoptose, tal como, por exemplo, o tingimento das células com anexina V ou o assim denominado ensaio de túnel ou análises de ciclo celular, por tingimento com iodeto de propídeo, por exemplo.

Os exemplos dados abaixo e os resultados dos testes afirmam que o emprego de um processo da presente invenção não só tem a capacidade com o monitoramento in vitro de determinar o efeito de substâncias em processos in vitro, como também são adequados para se testar e determinar a especificidade dos efeitos encontrados por meio da remoção de um processo da presente invenção para um ensaio de competição.

Outras modalidades vantajosas da invenção se tornarão evidentes com a leitura a seguir. A presente invenção, inclusive a colocação em prática do processo da presente invenção, serão descritas com mais detalhes com recurso aos exemplos de concretização e figuras, sem que a invenção seja imitada a estes exemplos.

Obtenção de células mononucleares

Para a condução do processo da presente invenção foram obtidas células sangüíneas mononucleares periféricas (PBMC) a partir de sangue integral ou a chamada "camada leucocitária". Neste caso, trata-se de um produto secundário que resulta da produção de concentrados de eritrócitos a partir de sangue integral.

O isolamento de PBMC se produziu através de um gradiente de Ficoll por centrifugação para a separação de eritrócitos, granulócitos e células mortas. Ficoll é um polímero de sacarose sem carga, cuja densidade é de tal modo ajustada que por revestimento com sangue integral ou com camada leucocitária e por centrifugação subseqüente, os componentes com menor densidade atravessam a camada de Ficoll e se acumulam no fundo, ao passo que os linfócitos e monócitos se acumulam na fase intermediária entre o plasma (superior) e Ficoll (inferior).

A fase intermediária que contém as células depois da centrifugação foi isolada e lavada muitas vezes com PBS. Em seguida, as células isoladas foram absorvidas em meio de cultura e teve a concentração ajustada para 1-4 χ IO6 células por mililitro.

Oligòdesóxi-nucleotideos imunomoduladores de dois filamentos (dSLIM)

Os oligodesóxi-nucleotídeos imunomoduladores de dois filamentos são moléculas com seqüências de CpG. Para tal fim, oligodesóxi-nucleotídeo (ODN) lineares são fechados por covalência por meio de uma alça de nucleotídeo, de modo que eles são protegidos contra a degradação por exonucleases. Cria-se assim uma molécula em forma de halteres, que se chamam dSLIM "imunomodulador de tronco duplo-alça". 0 efeito imunomodulador se deve a uma ativação não-especifica do sistema imune por meio de seqüências de Cp-G não-metiladas que se ligam a receptores semelhantes a Tollf e principalmente à estrutura especial da molécula de dSLIM. Cada alça do dSLIM contém três motivos de CpG não-metilados.

Os imunomoduladores de dois filamentos dSLIM do tipo ISS30 (dSLIM-30Llf por exemplo) foram produzidos de acordo com SOP e, em seguida por controle de qualidade em laboratório de classe B. Para tal fim ligaram-se oligodesóxi- ribonucleotideos (ODN) 5-fosforilados de um filamento em forma de grampo de cabelo com T4-DNA-Ligase. Depois da digestão dos edutos restantes com T7-polimerase e purificação por cromatografiaf as moléculas de dSLIM resultantes foram concentradas por precipitação com etanol e acetato de sódio- magnésio e dissolvidas em PBS. 0 processo exato é descrito em WO 01/07055.

Incubação primária das células imunes (PBMC) com dSLIM

As células isoladas (PBMC) foram semeadas em placas de muitos poços. 0 volume das preparações e conseqüentemente as dimensões dos poços foram de tal modo selecionados, que o sobrenadante de cultura mais tarde coletado tinha o volume exato que era necessário para a incubação secundária com células alvo.

Em uma primeira preparação se encontravam células sem estimulação (controle negativo). Em uma segunda preparação estimulou-se com OfI - 10 μΜ de dSLIM-30Ll. Em duas outras preparações produziu-se uma estimulação com 0,1 - 10 μΜ de um oligodesóxi-nucleotideo (ODN) que produziu um resultado positivo o mais intenso possível, para que se pudesse proceder aos ajustes de aparelhos e compensação em FACS. Em preparações subseqüentes estimulou-se com 0,1 - 10 μΜ de outras ODNs para comparação. A preparação foi incubada durante 48 horas a 37 graus Celsius em incubadora de CO2. Os sobrenadantes destas preparações foram obtidos por centrifugação e para elaborações subseqüentes congelados a - 80 graus Celsius. Incubação secundária com células alvo (HT-29, por exemplo)

Para a incubação secundária com as células alvo teve inicialmente que ser determinada a concentração ótima e o volume ótimo, nos quais estas células fossem semeadas. 0 objetivo era que houvesse depois da incubação secundária pelo menos 5 χ 105 células alvo por poço para a análise. Neste caso, devia se tomar cuidado para que as células tivessem condições ótimas de crescimento durante 3 dias, sendo semeadas com uma densidade tão grande como fosse necessária e tão pequena que fosse possível, de modo que depois de 3 dias elas quase confluíssem. As condições de crescimento abaixo das ótimas levam também para necrose ou apoptose, mas o resulta um falseamento dos resultados de teste. Como células alvo foram empregadas células HT-29 de carcinoma do cólon.

As células foram semeadas com a densidade ótima previamente determinada em volumes correspondentemente grandes de preparação e incubadas de um dia para o outro a 37 graus Celsius em incubadora de CO2 (2,4 χ 105 células, por exemplo, em 700 μl, por poço em placa de 24 poços) .

No dia seguinte produziu-se a estimuláção por retirada do meio das células que entrementes aderiram o acréscimo dos sobrenadantes provenientes da incubação primária ("estimuláção indireta") ou acréscimo das substâncias dadas (dSLIM-30Ll, lin30Ll) diretamente ao meio ("estimuláção direta"). Como controle negativo foi acrescentado à preparação indireta somente meio de cultura. Estas células foram denominadas para distingui-las das células sem estimuláção (acréscimo de sobrenadante sem estimuláção proveniente da incubação primária) com células sem tratamento.

As preparações - estimuláção direta e estimuláção indireta - foram novamente incubadas durante 4 8 horas a 37 graus Celsius na incubadora de CO2. Em seguida, puderam ser conduzidas com as células as análise desejadas, respectivamente. Para tal, primeiro os sobrenadantes foram extraídos das células, e as células foram lavadas com PBS. As células foram dissolvidas dos poços por meio de tripsina/EDTA e depois de uma outra etapa de lavagem transferidas para um tubinho de centrifugação, para em seguidâ determinar o número de células.

Tingimento de antigenos de superfície

As células provenientes da preparação com estimulação foram centrifugadas e lavadas com um tampão colorante especial. Em seguida, a suspensão de células foi ajustada a uma concentração de 1 χ 10^6 células por mililitro. 500 uL (0,5 χ 10^6 células) desta suspensão de células foram centrifugados em um tubinho de FACS e depois de absorvidos em 50 pL de tampão colorante, foram acrescentados os anticorpos (ICAM-I (CD54), por exemplo, foram conjugados com FITC e HLA- ABC com PE). Para cada anticorpo foi associado um controle de isótipo correspondente, tal como uma única amostra tingida positiva para o ajuste do aparelho e a compensação. Depois de uma etapa de incubação, as células foram duas vezes lavadas com PBS e ressuspensas para a medição em 500 - 1000 uL de PBS. Para a discriminação das células mortas foi acrescentado 7-AAD e incubou-se durante outros 10 minutos. Em seguida, procedeu-se à medição por FACS.

Tingimento de células apoptòticas/necróticas

Células apoptóticas foram tingidas com anexina V-PE, que indica processos apoptóticos na célula. Para se distinguir das células necróticas foi conduzido um contratingimento com 7-AAD.

As células das preparações com estimulação foram centrifugadas e lavadas duas vezes com PBS. Em seguida, as células foram diluídas em um tampão de ligação à anexina especial e ajustou-se a concentração de células a 1 χ 10^6 células por mililitro. .Cada 100 uL (1 χ 10^5 células) desta suspensão de células foi misturado com 5 uL respectivamente de anexina V-PE e 7-AAD, e depois de uma boa mistura durante 15 minutos à temperatura ambiente incubado. Em seguida, foram acrescentados 400 uL de tampão de ligação e procedeu-se imediatamente à medição em FACS.

Medição por citometria de fluxo em FACS

A) Apoptose/Necrose

Foram medidas a fluorescência 2 (anexina V-PE) e a fluorescência 3 (7- ADD). 0 ajuste do aparelho se conduziu com células sem estimulação (preparações diretas) ou com células sem tratamento (preparações indiretas).

Em um Dot Plot FSC (dispersão à frente = volume de células) por SSC (dispersão lateral = granulometria das células), a população de células foi de tal modo ajustada, que esta se encontrava no meio. Em seguida, se procedeu ao ajuste de PMT e à compensação pelas fluorescências 2 e 3. Em seguida mediram-se todas as amostras (5000 células).

B) Antigenos de superfície

Foram medidas a fluorescência 1 (ICAM 1-FITC), fluorescência 2 (HLA-ABC-PE) e fluorescência 3 (7-AAD).

O ajuste do aparelho se fez com células estimuladas com lin-30L1 com controles isotípicos correspondentes (em tingimento duplo) para nivelação de ligações não-específicas e anticorpos marcados com fluorescência (tingimento simples).

Em Dot Plot FSC por SSC a população de células foi de tal modo ajustada que ela se encontrava no meio. Em seguida, se produziram os ajustes de PMT para fluorescências 1, 2 e 3 com os controles isotípicos, assim com a compensação com tingimento simples. Em seguida, todas as amostras foram medidas (10.000 células). Neste caso, as células mortas (células positivas para 7-AAD) foram excluídas (fluorescência 3 por FSC em Dot Blot).

Interpretação do resultado

A. Apoptose/Necrose

Foi construído um Dot Blot de 7-AAD por anexina V. Em seguida, foram dispostos quadrantes por meio das células sem tratamento. Dependendo da sua posição nos quadrantes respectivos, as células pertencem à fração apoptótica ou necrótica.

o Células vivas são negativas para anexina e negativas para 7-AAD (Quadrante LL)

o As células apoptóticas são positivas para anexina e negativas para 7AAD (Quadrante LR)

o As células necróticas são positivas para anexina e positivas para 7AAD (Quadrante UR) ou negativas para anexina e positivas para 7-AAD (Quadrante UL)

B. Marcadores de superfície

Foram construídos dois Dot Blots (fluorescência 1 por FSC ou fluorescência 2 por FSC) com as células vivas. Dependendo da sua posição no Dot Blot respectivo foi lida a intensidade de fluorescência das células (fluorescência 1/ICAM-I ou 2/HLA-ABC). Finalmente, fez-se a comparação com os controles respectivos.

Comparação da preparação de teste com os controles no tocante a

o número de células positivas para marcadores de superfície (= número de células com marcadores de superfície correspondentes)

o intensidade de fluorescência dos marcadores de superfície (= número de moléculas de marcadores de superfície sobre a superfície celular)

Os resultados da condução dos exemplos descritos com o emprego do processo da presente invenção são ilustrados nas Figuras.

Nelas:

A Figura 1 ilustra esquematicamente o processo da presente invenção.

A Figura 2 mostra a análise do efeito in vitro de imunomodulador dSLIM por detecção de apoptose e necrose em células tumorais HT-29.

A Figura 3 mostra a análise do efeito in vitro do imunomodulador dSLIM por detecção da expressão de marcadores de superfície HLA-ABC em células tumorais HT-29.

A Figura 4 mostra a análise do efeito in vitro do imunomodulador dSLIM por detecção de apoptose e necrose em células tumorais HEK-293.

A Figura 5 mostra a análise do efeito in vitro do imunomodulador dSLIM por detecção da expressão de marcadores de superfície HLA-ABC em células tumorais HEK-293.

A Figura 6 mostra a análise do mecanismo da atuação de dSLIM por detecção de apoptose e necrose em células tumorais HT-29 com o emprego do processo de acordo com a presente invenção, A Figura 7 mostra a análise do mecanismo de atuação de dSLIM por detecção da expressão dos marcadores de superfície HLA-ABC em células tumorais HT-29 com o emprego do processo de acordo com a presente invenção, A Figura 8 mostra a comparação do efeito de dSLIM com CpG-ODN linear por detecção da expressão de marcadores de superfície HLA-ABC em células tumorais Renca.

A Figura 9 mostra a comparação do efeito de dSLIM com CpG-ODN linear por detecção apoptose e necrose em células tumorais Renca. A Figura 10 mostra a comparação do efeito de dSLIM com CpG-ODN linear por detecção da expressão de marcadores de superfície HLA-ABC em células tumorais HT-29.

A Figura 11 mostra a comparação do efeito de dSLIM com CpG-ODN linear por detecção de apoptose e necrose em células tumorais HT-29. A Figura 12 Acompanhamento in vitro de células tumorais viáveis durante a terapia de um paciente com câncer.

A Figura 13 Acompanhamento in vitro de células tumorais apoptóticas/necróticas durante a terapia de um paciente com câncer.

A Figura 14 Acompanhamento in vitro de marcadores de superfície de células tumorais durante a terapia de um paciente com câncer.

A Figura 1 mostra uma ilustração esquemática da seqüência das etapas de processo durante um processo de acordo com a presente invenção. À esquerda, na Parte A, se encontra a ilustração de um emprego exemplar in vivo, à direita, na parte B, se encontra o processo da presente invenção correspondente na configuração ilustrado como um imunoensaio funcional in vitro.

A Figura 2 ilustra os resultados de uma análise do efeito in vitro do imunomodulador dSLIM com o emprego do processo da presente invenção.O emprego do sobrenadante de PBMCs incubadas com dSLIM induz a apoptose a a necrose em células tumorais HT-29 (carcinoma do cólon) como se pode ver na parte direita da figura. Aqui pode se ver um aumento na apoptose das células tratadas diretamente com dSLIM, para as células tratadas com o sobrenadante de 17% para 46,7%.

Na Figura 3 foi analisado o efeito in vitro do imunomodulador dSLIM em células HT-29. O emprego do sobrenadante de PBMCs inoculadas com dSLIM induz uma expressão aumentada dos marcadores de superfície HLA-ABC.

Pode ser claramente observado o deslocamento da população de células na parte direita extrema da figura.

Para a segurança dos resultados de teste obtidos de HT- 29 com o emprego do processo da presente invenção foram conduzidos testes análogos em células HEK-293. Os resultados são mostrados nas Figuras 4 e 5.

A Figura 4 mostra que através de dSLIM é induzida a apoptose (anexina V) e necrose (7-AAD). 0 número de células apoptóticas aumenta através do sobrenadante das células tratadas com dSLIM em comparação com o sobrenadante das células sem ODN de 12,1% para 21,7%. 0 número de células necróticas sobe de 9,2% para 16%.

Na Figura 5 ilustra a indução intensificada dos marcadores de superfície HLA-ABC pela incubação das células alvo (HT-29) com o sobrenadante de PBMCs tratadas com dSLIM. A parte superior da Figura mostra o deslocamento (= aumento da expressão) da população de células que foram tratadas com o sobrenadante que provinha das PBMCs que não foram tratadas com ODN, para células que foram incubadas com o sobrenadante das PBMC tratadas com dSLIM.

A Figura 6 mostra os resultados de uma análise do mecanismo de atuação de dSLIM, em células HT-29 com o emprego do processo da presente invenção e com a detecção de apoptose e necrose. Na etapa da incubação primária das PBMC foi acrescentado um anticorpo (anti-iFNy, contorno verde), que tem a capacidade de neutralizar o efeito de dSLIM. Para fins de comparação foram conduzidos testes com anticorpos (anti- IFN-α, anti-TNFα) , para comprovar a especificidade. Pode-se reconhecer bem (contorno verde) que através do anticorpo anti-IFNy tanto o número de células apoptóticas como de necróticas foi minimizado.

Na Figura 7 o emprego do processo da presente invenção corresponde ao da Figura 6, no entanto nas células alvo (HT- 29) foi analisada a expressão do marcador de superfície ICAM- 1 (CD54). Na parte inferior da figura é ilustrado comparativamente o deslocamento da população de células.

As Figuras 8 e 9 mostram resultados de experimentos com o emprego do processo da presente invenção em células tumorais Renca, em que se examina comparativamente o efeito de dSLIM com ODNs lineares. Os oligodesóxi-nucleotídeos lineares contendo CpG, no entanto, também apresentam uma seqüência diferente da dSLIM e são protegidos por meio de fosforotioato contra a decomposição.

A Figura 8 mostra que o tratamento das células alvo com dSLIM leva a uma expressão aumentada do marcador de superfície HLA-ABC (parte superior), ao passo que um CpG-ODN linear não tem nenhum efeito. A tabela na parte direita da figura registra as diferenças quantitativas. Com a indução de apoptose e necrose, Figura 9, dSLIM é nitidamente mais potente do que CpG-ODN linear. Na parte inferior é dada a diferença de indução de apoptose em porcentagem.

As Figuras 10 e 11 comparam respectivamente dSLIM com CpG-ODN linear empregando-se o processo da presente invenção em células HT-2 9 como células alvo. Os resultados deste experimento correspondem aos resultados obtidos com as células tumorais Renca e são ilustrados nas Figuras 8 e 9. A construção das Figuras também corresponde às Figuras 8 e 9.

As Figuras 12, 13 e 14 mostram o emprego do processo da presente invenção para o acompanhamento in vitro do número de células tumorais viáveis (Figura 12) e células apoptóticas/necróticas (Figura 13), e a alteração da expressão do marcador de superfície ICAM-I/HLA-ABC (Figura 14) no decorrer da terapia de um paciente com câncer.

Ao paciente com carcinorria retal e metástase do fígado foram administrados nos primeiros cinco dias da primeira semana da terapia de cada vez 2,5 mg de dSLIM. No sexto dia da primeira semana se procedeu a uma irradiação, seguida por quimioterapia.

Para a análise in vitro dos efeitos in vivo tirou-se sangue do paciente nos seis primeiros dias da primeira semana. Durante a quimioterapia foi também tirado sangue no fim de cada semana.

Das amostras de sangue isolou-se o plasma e incubou-se com células da linhagem de células tumorais HT-29. Em seguida, foi determinado o número de células viáveis (Figura 12) e de células apoptóticas/necróticas, assim como examinada a expressão dos marcadores de superfície ICAM-1/HLA-ABC.

A Figura 12 mostra os resultados da incubação das células HT-2 9 com plasma de oito amostras de sangue. Pode-se reconhecer já no segundo dia da administração de dSLIM uma nítida redução de células HT-29 viáveis. O número de células viáveis cai no segundo dia para menos da metade das células do primeiro dia, o que é comparável com o número de células viáveis dos controles.

Na Figura 13 é ilustrado o acompanhamento in vitro de células tumorais apoptóticas/necróticas durante a terapia do paciente com câncer nos dias 1, 2, 5 e 20. Fica evidente nesta avaliação do acompanhamento dos efeitos in vivo, que um dia depois da administração de dSLIM, o número de células apoptóticas/necróticas já diminui nitidamente.

A Figura 14 apresenta os resultados do exame da alteração da expressão dos marcadores de superfície ICAM- 1/HLA-ABC durante a terapia do paciente com câncer por meio do plasma do sangue das amostras 1, 2, 3 e 8. A amostra 1 serve como valor de referência para a demonstração das alterações da expressão dos dois marcadores de superfície.

ICAM-1 no segundo dia da terapia tem uma expressão nitidamente maior, o quê se pode ver na parte inferior da Figura no deslocamento da posição da intensidade de fluorescência, que mostra que ICAM-1 tinha uma expressão maior.

No caso de HLA-ABC no segundo dia ainda não tinha ocorrido nenhum deslocamento da intensidade de fluorescência. Isto somente ocorre no terceiro dia da terapia e aponta também para um aumento da expressão de HLA-ABC. LISTAGEM DE REFERÊNCIA

A = Situação in vivo

B = Imunoensaio in vitro

1 = Paciente

2 = Tecido alvo, tumoral, por exemplo.

3 = células imunes

4 = substância de teste, dSLIM, por exemplo.

5 = células imunes ativadas

6 = doador

7 = células imunes, PBMC, por exemplo.

8 = substância de teste, dSLIM, por exemplo.

9 = células imunes ativadas, PBMC, por exemplo.

10 = sobrenadante

11 = células alvo, células tumorais, por exemplo

12 = análise

Claims (25)

1. Processo para monitoramento in vitro do efeito de substâncias em processos in vitro, caracterizado pelo fato de que abrange a seguinte seqüência de etapas de processo: a) Isolamento das células; b) Incubação primária das células com a substância de teste; c) Obtenção do sobrenadante ou da mistura de células e sobrenadante da incubação primária; d) Incubação secundária de células alvo com o sobrenadante ou a mistura de células e sobrenadante. e) Análise das células alvo.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, trata-se no caso das células isoladas para a incubação primária, de células efetoras do sistema imune.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que, no caso das células alvo da incubação secundária, trata-se de células humanas ou de células de mamíferos superiores.

4. Processo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as etapas de processo 1.d) e 1.e) são conduzidas com sangue, soro ou plasma de pacientes.

5. Processo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que, no caso das substâncias a serem monitoradas, trata-se de compostos imunomoduladores assim como de indutores de apoptose ou necrose.

6. Processo de detecção in vitro, adequado para identificação de compostos imunomoduladores e/ou detecção do efeito dos compostos imunomoduladores, assim como a identificação de compostos indutores de apoptose e/ou necrose por meio do sistema imune em processos in vivo, caracterizado pelo fato de que abrange a seguinte seqüência de etapas de processo: a) Incubação primária de células efetoras do sistema imune com uma substância monitorando o seu efeito imunomodulador ou indutor de apoptose ou necrose, seguida por; b) Obtenção do sobrenadante ou da mistura de células e sobrenadante da incubação primária e, em seguida; c) Incubação secundária de células alvo com o sobrenadante ou com a mistura de células e sobrenadante da incubação primária, e finalmente; d) A anál ise do efeito imunomodulador e/ou indutor de apoptose e/ou necrose por meio de processo de detecção.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as células para a incubação primária na etapa de processo l.a. são inicialmente isoladas.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que, no caso de células efetoras do sistema imune para a incubação primária, trata-se de preferência, de células mononucleares do sangue periférico, células esplênicas ou subpopulações de misturas de células selecionadas por FACS ou MACS, tais como, por exemplo, as células Β, T e NK, monócitos ou células dendriticas.

9. Processo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que, no caso de células para a incubação primária e de células alvo da secundária, trata-se de células humanas ou de células de mamíferos superiores.

10. Processo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado pelo fato de que as etapas de processo 6.c) e 6. d) são conduzidas com sangue, soro ou plasma de pacientes.

11. Processo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que, no caso de células alvo da incubação secundária, trata-se de células tumorais ou linhagens de células de origem tumorogênica.

12. Processo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que, no caso de compostos imunomoduladores cujo efeito é monitorado, trata-se de oligodesoxinucleotideos contendo CpG ou constructos de DNA tendo parcialmente filamento duplo contendo pelo menos um motivo CpG em um trecho de um só filamento.

13. Processo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que, no caso de compostos indutores de apoptose e/ou necrose, cujo efeito é monitorado, trata-se de preferência, de oligodesoxinucleotideos anti-sentido, siRNA, anticorpos ou quimioterápicos.

14. Processo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que como substância a ser monitorada na incubação primária, é empregado sangue integral, células sangüíneas, subpopulações de células sangüíneas, soro sangüíneo ou plasma sangüíneo antes, durante e/ou após um tratamento.

15. Processo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as incubações ocorrem em uma incubadora.

16. Processo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que os sobrenadantes são obtidos por centrifugação.

17. Processo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que, para a análise das células alvo, é monitorada a expressão de proteínas específicas.

18. Processo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que, para a análise das células alvo, é monitorada a expressão de genes definidos.

19. Processo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as células alvo para a análise são tingidas, especialmente com anexina V ou com colorantes de iodeto de propídio.

20. Processo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que para a análi se das células alvo, são conduzidos processos de detecção de apoptose e/ou necrose.

21. Processo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que são conduzidas análises do ciclo celular.

22. Processo, de acordo com pelo menos uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que, no caso da incubação primária da substância a ser monitorada, são acrescentados anticorpos ou outras substâncias competidoras.

23. Kit, para condução de processo de detecção in vitro, adequado para a identificação de compostos imunomoduladores e/ou a detecção do efeito dos compostos imunomoduladores, assim como a identificação de compostos que induzem apoptose e/ou necrose por meio do sistema imune em processos in vivo, caracterizado pelo fato de conter: alíquotas de células efetoras do sistema imune preparadas de modo a serem armazenáveis, e - substâncias para condução da incubação primária e secundária, e - para a detecção de mensageiros que se precipitam por reação da incubação das células na incubação primária com um composto a ser testado, placas de muitos poços tendo de 24-96 poços, sendo suas superfícies revestidas com um anticorpo e/ou, - para monitoramento das alterações da expressão das moléculas de superfície devido a uma reação imune induzida pelo composto a ser testado, meios para a condução de uma RT- PCR, contendo para tal fim o kit iniciador adequado para a multiplicação do mRNA das moléculas de superfície, enzimas para a sua multiplicação e os tampões necessários, e/ou meios para uma análise de FACS, e para tal fim o kit contém anticorpos adequados marcados com fluorescência que são lançados contra os antígenos de superfície e, além disso, meios para a elaboração das células alvo, tais como tampões e substâncias químicas.

24. Kit, para representação in vitro do efeito dos compostos imunomoduladores, assim como da identificação de compostos indutores de apoptose e/ou necrose por meio do sistema imune em processos in vivo, antes, durante e/ou depois da dosagem de tais compostos, caracterizado pelo fato de apresentar pelo menos os seguintes componentes: - alíquotas de células alvo para incubação com sangue, soro ou plasma de pacientes preparadas de modo a serem armazenáveis, e - substâncias para condução da incubação secundária, e - para a detecção de mensageiros que se precipitam por reação da incubação das células na incubação primária com um composto a ser testado, placas de muitos poços tendo de 24-96 poços, sendo suas superfícies revestidas com um anticorpo, e/ou - para monitoramento das alterações da expressão das moléculas de superfície devido a uma reação imune induzida pelo composto a ser testado, meios para a condução de uma RT- PCR, contendo para tal fim o kit iniciador adequado para a multiplicação do mRNA das moléculas de superfície, enzimas para a sua multiplicação e os tampões necessários, e/ou meios para uma análise de FACS, e para tal fim o kit contém anticorpos adequados marcados com fluorescência que são lançados contra os antígenos de superfície e, além disso, meios para a elaboração das células alvo, tais como tampões e substâncias químicas.

25. Kit, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que, no caso das células alvo obtidas, trata-se de células tumorais ou linhagens de células de origem tumorogênica.