JP7273987B2 - 腫瘍細胞群の特性を決定する方法、キット及びプログラム - Google Patents

Description

本発明の実施形態は、腫瘍細胞群の特性を決定する方法、キット及びプログラムに関する。

乳がんの患者数は年々増加している。医療費削減、並びに患者及び医療従事者の負担軽減のために、乳がんの薬剤感受性を正確に予測することが求められている。近年では、乳がんの薬剤感受性を予測するための種々のマーカーが発見されてきている。

例えば、患者から採取された乳がん細胞におけるマーカー遺伝子の転写物（ｍＲＮＡ）量をＰＣＲ法やマイクロアレイ法で検出することにより、乳がんの薬剤感受性を予測することができる。

特表２０１９－５１４９３０号公報 特表２０１２－５２３８２８号公報

本発明の実施形態は、腫瘍細胞群の特性を正確に決定することができる方法、キット及びプログラムを提供することを目的とする。

実施形態に従う方法は、腫瘍細胞群の特性を決定する方法である。本方法は、脂質膜と、脂質膜に内包された第１核酸とを含む脂質粒子を腫瘍細胞群に接触させる接触工程（第１核酸は、特性を予測するためのマーカー遺伝子のプロモーター配列と、プロモーター配列の下流に機能可能に連結されたレポーター遺伝子とを有する）、腫瘍細胞群を培養する培養工程、腫瘍細胞群に含まれる各腫瘍細胞において、レポーター遺伝子から発現するレポータータンパク質からの信号の有無又は量を検出する検出工程、及び検出工程の結果から、特性を有する腫瘍細胞の数を計測する計数工程を含む。

図１は、第１実施形態の方法の一例を示すフローチャートである。 図２は、第１実施形態の脂質粒子の一例を示す断面図である。 図３は、第１実施形態の第１核酸の一例を示す模式図である。 図４は、第１実施形態の方法の一例を示すフローチャートである。 図５は、第１実施形態の方法における信号の得られる様式を示す模式図及びグラフである。 図６は、第２実施形態の方法の一例を示すフローチャートである。 図７は、第２実施形態の方法の一例を示すフローチャートである。 図８は、第３実施形態に用いる第１核酸の一例を示す模式図である。 図９は、第３実施形態に用いる第１核酸の一例を示す模式図である。 図１０は、第３実施形態の方法の一例を示すフローチャートである。 図１１は、第３実施形態の方法の一例を示すフローチャートである。 図１２は、第４実施形態の方法の一例を示すフローチャートである。 図１３は、第４実施形態の方法の一例を示すフローチャートである。 図１４は、第５実施形態の細胞培養検出デバイスの使用時の様子の一例を示す斜視図である。 図１５は、図１４に示す光学センサをＡ－Ａ’に沿って切断したときの断面の拡大図である。 図１６は、第５実施形態の細胞特性決定システムの一例を示すブロック図である。 図１７は、例１において用いたベクターを示す模式図である。 図１８は、例１において用いたベクターを示す模式図である。 図１９は、例３の実験結果を示すグラフである。 図２０は、例３の実験結果を示すグラフである。 図２１は、例４の実験結果を示す顕微鏡写真（ＪＰＥＧ形式）である。 図２２は、例４の実験結果を示す顕微鏡写真（ビットマップ形式）である。

以下に、図面を参照しながら種々の実施形態について説明する。各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比などは実際と異なる箇所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。

実施形態に従う方法は、腫瘍細胞の特性を予測する方法である。本方法は、脂質膜と、脂質膜に内包された第１核酸とを含む脂質粒子を腫瘍細胞群に接触させる接触工程（第１核酸は、特性を予測するためのマーカー遺伝子のプロモーター配列と、プロモーター配列の下流に機能可能に連結されたレポーター遺伝子とを有する）、腫瘍細胞群を培養する培養工程、腫瘍細胞群に含まれる各腫瘍細胞において、レポーター遺伝子から発現するレポータータンパク質からの信号の有無又は量を検出する検出工程、及び検出工程の結果から、特性を有する腫瘍細胞の数を計測する計数工程を含む。

以下、各実施の形態について説明する。

・第１の実施形態
（乳がん細胞群の薬剤への感受性を決定する方法）
第１の実施形態に従う方法は、乳がん細胞群の薬剤への感受性を決定する方法である。

実施形態に従う乳がんは、例えば、動物の乳腺に形成される悪性腫瘍（新生物）をいう。乳がんは、「乳癌」又は「乳腺腫瘍」等と一般に称されるもの、並びに、乳管がん及び小葉がんを含む。また、乳がんは、何れの病期のものも含み、例えば、がんが乳腺に留まった状態、更に周辺の組織までがんが及んだ状態、更にリンパ節へのがんの転移がある状態、及び更に離れた臓器へのがんの転移がある状態等を含む。

乳がん細胞群とは、好ましくは乳がんに罹患した対象から採取された乳がん細胞群であり、複数の乳がん細胞を含む。乳がん細胞群は、例えば、乳がんの病変部の針による吸引（穿刺吸引、針生検若しくはマンモトーム生検等）又は外科的切除、或いは乳腺分泌液（乳汁）の採取等により得られた試料に含まれるものである。

対象は、例えば哺乳動物であり、好ましくはヒトである。

乳がん細胞群は、採取後に適切に処理したものであってもよい。適切な処理とは、例えば、細切、分散、他の細胞群の除去又は乳がん細胞群の単離等である。或いは、乳がん細胞群は、採取又は前処理された乳がん細胞群を乳がんの特性を失わない方式で培養した培養細胞であってもよい。或いは、乳がん細胞群は、株化した乳がん細胞群等であってもよい。以下、「乳がん細胞群」を単に「細胞群」とも称する。また、「乳がん細胞」を単に「細胞」とも称する。

細胞群の薬剤への感受性とは、細胞群が薬剤の治療効果を受けるか否か又は治療効果を受ける程度をいう。例えば、細胞群が特定の薬剤への感受性を有するとは、細胞群がその薬剤による治療効果を受けることをいい、例えば、その薬剤によって細胞群に含まれる細胞が減少するか又は消滅するか、或いは細胞の増殖が抑制されることを意味する。反対に、細胞群が特定の薬剤への感受性を有しないとは、細胞群がその薬剤に対して抵抗性（耐性）を有し、治療効果が無いか又は少ないことをいう。

薬剤は、例えば乳がんの治療に一般的に用いられる抗腫瘍活性を有する薬剤から選択され得る。例えば、薬剤は、抗がん剤、ホルモン療法剤、分子標的薬又は免疫賦活剤等の何れかから選択される。抗がん剤は、例えば、アントラサイクリン系薬剤、微小管作用薬、アルキル化薬、代謝拮抗薬又は白金錯体等を含み、ホルモン療法剤は、例えば、アロマターゼ阻害剤、ＬＨ－ＲＨアゴニスト製剤、抗エストロゲン薬又は黄体ホルモン薬等を含む。しかしながら、薬剤は、上記のものに限定されるものではない。

例えば、実施形態に係る方法においては、乳がん細胞群における感受性が調査される薬剤が上記の何れかから１種選択される。或いは、第３実施形態で説明するように複数種の薬剤が選択されてもよい。以下、１つの薬剤について調査する例を示す。

実施形態に係る乳がん細胞の薬剤への感受性を決定する方法は、例えば、図１に示す次の工程を含む。

（Ｓ１）脂質膜と、脂質膜に内包された第１核酸とを含む脂質粒子を乳がん細胞群に接触させる接触工程（第１核酸は、乳がん細胞の薬剤への感受性を決定するためのマーカー遺伝子のプロモーター配列と、プロモーター配列の下流に機能可能に連結されたレポーター遺伝子とを有する）、
（Ｓ２）乳がん細胞群を培養する培養工程、
（Ｓ３）乳がん細胞群に含まれる各乳がん細胞において、レポーター遺伝子から発現するレポータータンパク質からの信号の有無又は量を検出する検出工程、及び
（Ｓ４）検出工程の結果から、薬剤感受性を有する腫瘍細胞の数を計測する計数工程。

まず、接触工程Ｓ１で用いる脂質粒子について説明する。図２に示すように、脂質粒子１は、例えば脂質膜２と脂質膜２の内腔２ａに内包された第１核酸３とを備える。第１核酸３は、例えば核酸凝縮ペプチド４により凝縮されて脂質膜２に内包されている。詳しくは後述するが、第１核酸３を乳がん細胞内に導入するためのキャリアとして用いられる。

脂質膜２は、複数の脂質分子２ｂが非共有結合で配列してできた略球状の中空体である。脂質膜２は、脂質単分子膜であってもよいし、脂質二重膜であってもよい。また、脂質膜２は、一層の膜からなっていてもよいし、多重層の膜からなっていてもよい。

脂質膜２の材料となる脂質は、例えば、生体膜の主成分である脂質（以下、「ベース脂質」と称する）を含む。ベース脂質は、リン脂質又はスフィンゴ脂質、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン又はセレブロシド、或いはこれらの組み合わせ等である。

例えば、ベース脂質として、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２－ジ－Ｏ－オクタデシル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、
１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０ ＤＡＰ）、
１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０ ＤＡＰ）、
１，２－ジステアロイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０ ＤＡＰ）、
Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、
１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン（ＤＯＰＳ）、又は
コレステロール、
或いはこれらの何れかの組み合わせ等を用いることが好ましい。

脂質膜２はベース脂質の他に、以下に説明する第１の脂質化合物、第２の脂質化合物、又はその両方を更に含むことが好ましい。

第１の脂質化合物は、Ｑ－ＣＨＲ_２の式で表すことができる。

（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立に、Ｃ_１２～Ｃ_２４の脂肪族基であり、
少なくとも一つのＲは、その主鎖中又は側鎖中に、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、及び－ＮＨＣ（＝Ｏ）－からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）。

第１の脂質化合物として、例えば、下記式で表される構造を有する脂質を用いれば、核酸の導入効率がより優れているため好ましい。

第２の脂質化合物は、Ｐ－［Ｘ－Ｗ－Ｙ－Ｗ’－Ｚ］_２の式で表すことができる。

（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｗは、それぞれ独立に、Ｃ_１～Ｃ_６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合及び尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｗ’は、それぞれ独立に、単結合又はＣ_１～Ｃ_６アルキレンであり、
Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、又はＣ_１２～Ｃ_２２脂肪族炭化水素基である）。

第２の脂質化合物を含む場合、Ｐに含まれるエーテル結合を構成する酸素が、内包される核酸と水素結合を形成するため、核酸の内包量が多くなる。

例えば、以下の構造を有する第２の脂質化合物を用いれば、核酸内包量がより優れているため好ましい。

脂質膜２に含まれる脂質分子２ｂの全体に対して１００％近くがベース脂質であってもよいが、第１の脂質化合物及び／又は第２の脂質化合物が脂質分子２ｂの全体に対して約２０％～約７０％（モル比）で含まれることが好ましい。

脂質膜２は、例えば、ＰＥＧ修飾した脂質、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）、オメガ－アミノ（オリゴエチレングリコール）アルカン酸モノマーから誘導されるポリアミドオリゴマー（例えば、米国特許第６，３２０，０１７号に記載のもの）、モノシアロガングリオシドを更に含むことが好ましい。このような脂質は、脂質分子２ｂ全体に対して約１％～約５％（モル比）で含まれることが好ましい。

脂質膜２は、脂質粒子１の生体適合性を調整するための相対的に生体適合性の高い脂質、脂質膜２に配位子を結合させる官能基を有する脂質、コレステロール等の内包物の漏出を抑制するための脂質等の脂質を含んでもよい。

特に、上記式（１－０１）を有する第１の脂質化合物及び／又は式（２－０１）を有する第２の脂質化合物を用いる場合、乳がん細胞に第１核酸３が導入されやすいため更に好ましい。例えば、脂質粒子１は、式（１－０１）の化合物と、式（２－０１）の化合物と、ＤＯＴＡＰと、ＤＯＰＥと、コレステロールと、ＤＭＧ－ＰＥＧとを含む場合、乳がん細胞への導入効率が特に優れているため好ましい。例えば、これらの成分を３７：１５：１０．５：１０．５：３０：２（モル比）で含むことがより好ましい。

第１核酸３は、例えば、図３に示すように第１レポーター発現ユニットＵ１を含む。第１レポーター発現ユニットＵ１は、例えば、プロモーター配列５とレポーター遺伝子６と転写終結配列７とを含む。

プロモーター配列５は、乳がん細胞の薬剤への感受性を決定するためのマーカー遺伝子のプロモーター配列である。

マーカー遺伝子は、本方法で調査される薬剤の種類に対応して選択される。マーカー遺伝子は、例えば、薬剤に対して感受性を有する乳がん細胞と、感受性が無い乳がん細胞とで発現量に差がある遺伝子である。或いは、マーカー遺伝子は、乳がん細胞中において、選択された薬剤の存在によって発現量が変化する遺伝子であってもよい。発現量が変化するとは、発現量が増加することと発現量が減少することとの両方を含む。

例えば、当該マーカー遺伝子として、薬剤の感受性予測マーカー、治療効果予測マーカー又は薬剤選択マーカー等として本分野で知られる遺伝子を用いることも可能である。

例えば、薬剤がアントラサイクリン系薬剤である場合、マーカー遺伝子としてＴＯＰ２Ａ、ＲＡＲＡ、ＣＤＣ６、ＴＨＲＡ、ＧＳＤＭ１、ＰＳＭＤ３、ＣＳＦ３、ＭＥＤ２４、ＳＮＯＲＤ１２４、ＮＲ１Ｄ１、ＴＲＮＡＳＴＯＰ－ＵＣＡ、ＭＳＬ－１、ＣＡＳＣ３、ＲＡＰＧＥＦＬ１、ＷＩＰＦ２、ＬＯＣ１００１３１８２１、ＧＪＤ３、ＬＯＣ３９０７９１、ＬＯＣ７２８２０７、ＩＧＦＢＰ４、ＴＮＳ４、ＣＣＲ７又はＳＭＡＲＣＥ１等を用いることができる。

例えば、薬剤がアロマターゼ阻害剤である場合、マーカー遺伝子として、ＳＴＣ２、ＳＬＣ３９Ａ６、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、ＫＣＮＥ４、ＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２又はＴＲＩＭ２等を用いることができる。

しかしながら、マーカー遺伝子は上記のものに限定されるものではない。

或いは、薬剤に対して感受性を有する乳がん細胞と感受性が無い乳がん細胞とにおいて発現量に差がある遺伝子、或いは乳がん細胞に薬剤を添加したときに発現量が変化する遺伝子を調査し、それをマーカー遺伝子として用いてもよい。

プロモーター配列５として、マーカー遺伝子のプロモーター配列の全長を用いてもよいし、そのプロモーター活性に影響を与えない限り、その一部や改変した配列を用いてもよい。プロモーター配列５は脂質粒子１内での安定性や、内包量の観点からより短いことが好ましい。

例えば、マーカー遺伝子としてスタニオカルチン２（ＳＴＣ２）を用いる場合、プロモーター配列として下記表１の配列（配列番号１）を用いることが好ましい。

例えば、マーカー遺伝子としてトポイソメラーゼ２アルファ（ＴＯＰ２Ａ）を用いる場合、プロモーター配列として下記表２の配列（配列番号２）を用いることが好ましい。

レポーター遺伝子６は、プロモーター配列５の下流に機能可能に連結されている。機能可能に連結されているとは、レポーター遺伝子６がプロモーター配列５のプロモーター活性によりレポータータンパク質を発現することを意味する。

レポーター遺伝子６として、レポーターアッセイにおいて一般的に用いられる遺伝子を用いることができる。レポーター遺伝子６は、検出可能な信号を生ずるレポータータンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子若しくはＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ遺伝子などの発光酵素タンパク質をコードした遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子、青色蛍光タンパク質遺伝子若しくは赤色蛍光タンパク質遺伝子等の蛍光蛋白質をコードする遺伝子等であることが好ましい。或いは、レポーター遺伝子６は、アンピシリン耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子；キサンチンオキシダーゼ遺伝子若しくは一酸化窒素合成酵素遺伝子などの活性酸素生成酵素をコードした遺伝子；β－ガラクトシダーゼ遺伝子若しくはクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子等の発色酵素タンパク質をコードする遺伝子；又は重金属結合タンパク質をコードする遺伝子等であってもよい。

転写終結配列７は、例えば、レポーター遺伝子６の転写を終結ポリ（Ａ）配列を含む配列であってもよく、例えば、ポリ（Ａ）付加シグナル配列であり得る。ポリ（Ａ）付加シグナル配列は、例えば、シアミン・ウイルス（ＳＶ）４０のポリ（Ａ）付加シグナル配列、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナル配列、これらの配列を転写終結の機能が維持される限りにおいて改変した配列又は人工的に合成されたポリ（Ａ）付加シグナル配列などを用いることができる。

第１核酸３は、例えば環状の二本鎖ＤＮＡである。第１核酸３はベクターであってもよい。環状である場合、第１核酸３は脂質粒子１中で安定して存在させることが可能であり、第１核酸３の分解や破損が防止される。又は第１核酸３は直鎖状の核酸であってもよい。直鎖状である場合、第１核酸３のサイズが環状の場合と比較して小さくすることができるため、脂質膜２内により多く内包させることが可能である。

第１核酸３は、上記の配列に加え、更なる配列を含んでもよい。例えば、第１核酸３がベクターである場合、第１核酸３自身の複製をするための複製開始配列及び複製開始に関与する複製開始タンパク質をコードする遺伝子を発現するための配列等を含んでもよい。

核酸凝縮ペプチド４は、例えば、カチオン性のペプチドである。好ましい核酸凝縮ペプチド４は、例えば、カチオン性のアミノ酸を全体の４５％以上含むペプチドである。より好ましい核酸凝縮ペプチド４は、一方の端にＲＲＲＲＲＲ（第１のアミノ酸配列）を有し、他方の端が配列ＲＱＲＱＲ（第２のアミノ酸配列）を有する。そして、両アミノ酸配列の間に、ＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲからなる中間配列を０個又は１個以上含む。また、第１のアミノ酸配列、第２のアミノ酸配列及び中間配列のうち、隣り合う２つの配列の間に２つ以上の中性アミノ酸を含む。中性アミノ酸は、例えば、Ｇ又はＹである。

上記核酸凝縮ペプチド４は、好ましくは、以下のアミノ酸配列を有する。

ＲＱＲＱＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号３）
ＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号４）。

或いは、核酸凝縮ペプチド４は、一方の端にＲＲＲＲＲＲ（第３のアミノ酸配列）を有し、他方の端にＲＲＲＲＲＲ（第４のアミノ酸配列）を有する。そして、両アミノ酸配列の間に、ＲＲＲＲＲＲ又はＲＱＲＱＲからなる中間配列を０個又は１個以上含む。また、第３のアミノ酸配列、第４のアミノ酸配列及び中間配列のうち、隣り合う２つの配列の間に２つ以上の中性アミノ酸を含む。

このような核酸凝縮ペプチド４は、好ましくは、以下のアミノ酸配列を有する。

ＲＲＲＲＲＲＹＹＲＱＲＱＲＧＧＲＲＲＲＲＲ （配列番号５）。

更に、次のようなアミノ酸配列を有する核酸凝縮ペプチド４を上記の何れかの核酸凝縮ペプチド４と組み合わせて用いることもできる。

ＧＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ
（Ｍ９）（配列番号６）
核酸凝縮ペプチド４を用いる場合、第１核酸３が凝縮され、より多くの第１核酸３を脂質膜２内に内包することが可能であり、また脂質粒子１のサイズを小さくすることができる。その結果、乳がん細胞への第１核酸３の導入効率が高まる。核酸凝縮ペプチド４を用いることが好ましいが、用いる核酸の種類等によっては核酸凝縮ペプチド４を用いなくともよい。

脂質粒子１は、第１核酸３の他に、更なる成分を内包していてもよい。例えば、レチノイン酸、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）又はアスコルビン酸等の細胞内での核酸の発現を調節する化合物；ペプチド、ポリペプチド、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘発因子、他の細胞表面受容体及びそのリガンド等を内包することも可能である。

脂質粒子１は、次のように製造することができる。例えば、まず第１核酸３を核酸凝縮ペプチド４と撹拌混合することによって第１核酸３を凝縮する。次いで、脂質膜２の材料である脂質を含む溶液に、第１核酸３等の脂質膜に内包されるべき成分を含む水性緩衝液を添加し、撹拌して懸濁する。又は、小分子を脂質粒子等に封入する際に用いられる公知の方法、例えば、バンガム法、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法、凍結融解法等を用いて作製することができる。第１核酸３の内包量の確認は、例えば、市販のＤＮＡ及びＲＮＡ定量キット等を用いて行うことができる。

脂質粒子１の平均粒子径は、例えば約５０ｎｍ～約３００ｎｍであり、好ましくは約５０ｎｍ～約２００ｎｍである。例えば、超音波処理によって粒子径を小さくすることができる。また、ポリカーボネート膜やセラミック膜を透過させて、脂質粒子１のサイズを調整することも可能である。脂質粒子１の平均粒子径は、例えば動的光散乱法を用いたゼータサイザーによって測定することができる。

脂質粒子１は、例えば適切な溶媒中に含められて組成物として用意されてもよい。溶媒は、例えば、水、生理食塩水のような食塩水、グリシン水溶液又は緩衝液等である。或いは、脂質粒子１は乾燥した状態で提供されてもよい。

以上に説明した脂質粒子１と乳がん細胞群とを接触させる（接触工程Ｓ１）。例えば、接触工程Ｓ１は、適切な溶媒に懸濁されるか又は培地上に播種された乳がん細胞群に脂質粒子１を添加することにより行われる。或いは、接触工程Ｓ１は、脂質粒子１が内側表面に付着又は固定された容器等に乳がん細胞群を添加する方法により行われてもよい。

次に、乳がん細胞群を培養する（培養工程Ｓ２）。培養は、乳がん細胞群が乳がんとしての性質を維持し、且つ乳がん細胞群の生存に有利な条件で行われ得る。培養は、例えば、固体培地又は液体培地等の適切な培地を用いて、ディッシュ上又はチューブ内などで行われる。培養条件は、３０～３７℃、２～５％のＣＯ_２雰囲気下で行うことが好ましい。培養時間は、２～７２時間であることが好ましい。

上記接触工程Ｓ１及び培養工程Ｓ２を行うことによって、培養工程Ｓ２の間にエンドサイトーシス等により脂質粒子１が乳がん細胞群に含まれる乳がん細胞に取り込まれ、細胞内に第１核酸３が放出される。実施形態に従う脂質粒子１によれば、効率よく簡便に第１核酸３を乳がん細胞に導入することが可能である。

その後、乳がん細胞内に存在するマーカー遺伝子のプロモーターの強度に応じて第１核酸３のプロモーター配列５が活性化され、その下流にあるレポーター遺伝子６が発現する。したがって、第１核酸３により、乳がん細胞のマーカー遺伝子のプロモーターの強度がレポータータンパク質の量、即ち、そこから生ずる信号量に反映される。ここで、マーカー遺伝子のプロモーターの強度とは、マーカー遺伝子の発現頻度をいい、プロモーター強度が強いとは、遺伝子の転写量、発現量が多いこと、マーカー遺伝子の発現が誘導される速度が速いこと（初期遺伝子等）を含む。反対に、プロモーター強度が弱いとは、遺伝子の転写量、発現量が少ない又は無いこと、マーカー遺伝子の発現が誘導される速度が遅いこと（後期遺伝子等）を含む。

１つの乳がん細胞群中には薬剤感受性の有無又は程度が異なる複数種の乳がん細胞が含まれ得る。例えば、乳がん細胞群中で薬剤感受性予測マーカー遺伝子が発現している乳がん細胞においては、レポータータンパク質からの信号が得られる。反対に薬剤感受性予測マーカー遺伝子が発現していない乳がん細胞においてはレポータータンパク質からの信号が得られない。また、マーカー遺伝子のプロモーターの強度が高い乳がん細胞においてはより多くの信号が得られる。

培養時間は、上記のように２～７２時間であることが好ましいが、所望の信号量（レポータータンパク質の発現量）が得られるまで培養を行うことが好ましい。培養時間を長くするほどより多くのレポータータンパク質が生成して信号量が増加し得るが、その後信号量が減衰する場合もある。例えば、培養時間は、用いるマーカー遺伝子の種類に応じて選択される。例えば、プロモーター強度が高い遺伝子（初期遺伝子等）の場合、培養時間は２～４時間でよい場合もある。反対に、プロモーター強度が低い遺伝子（後期遺伝子等）の場合、２４～７２時間培養を行うことが好ましい。

培養により、例えば、採取した試料に含まれる乳がん細胞以外の細胞、例えば、血球、線維芽細胞、脂肪細胞等を死滅させて除去してもよい。また、培養により乳がん細胞が増殖してもよい。培養で増加した乳がん細胞も脂質粒子１と接触して第１核酸３が導入されるか、又は第１核酸３が導入された乳がん細胞が増殖した場合には、分裂時に第１核酸３も複製されて分裂した各細胞に含まれ得る。

検出工程Ｓ３において、乳がん細胞群に含まれる各乳がん細胞において、レポータータンパク質からの信号を個別に検出する。

レポーター遺伝子６が発光酵素タンパク質をコードした遺伝子である場合、検出の前に乳がん細胞群に当該発光酵素タンパク質の基質を添加し、レポータータンパク質（発光酵素タンパク質）により基質が代謝されて得られた代謝物からの蛍光が信号となり得る。レポーター遺伝子が蛍光タンパク質をコードした遺伝子である場合は、レポータータンパク質自体からの蛍光が信号となり得る。

例えば、次の計数工程Ｓ４において信号が得られた細胞の数を数えるために、信号は各乳がん細胞において検出し、信号の有無又は量を乳がん細胞毎に個別に決定することが好ましい。

このような信号の検出は、細胞毎に信号の有無を検出できる光学センサ、顕微鏡、カメラ又はセルソーター等の検出装置を用いて行われることが好ましい。

検出工程Ｓ３は培養工程Ｓ２後に行ってもよいが、培養を行いながら経時的に行うことが好ましい。それによって、マーカー遺伝子の種類に従う適切な培養時間が不明である場合も、信号量が最大となったときの信号を用いることができる。その結果、後の計数工程において正確に信号が得られた細胞数を計測することが可能である。経時的とは、連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。

次に検出工程Ｓ３の結果から、薬剤感受性を有する乳がん細胞の数を計測する。例えば、発現量が薬剤の感受性と正の相関にあるマーカー遺伝子を用いる場合、信号が得られた細胞（以下、「信号発生細胞」とも称する）は、プロモーター活性が高いとみなして薬剤への感受性を有する細胞（以下、「薬剤感受性細胞」とも称する）と決定し、その数を計測すればよい。又は、信号が閾値以上得られた細胞を信号発生細胞とみなして、薬剤感受性細胞として計測してもよい。閾値は、例えば、薬剤感受性の有無が既知である乳がん細胞に第１核酸３を導入して得られた信号量に従って決定することができる。

反対に、発現量が薬剤の感受性と負の相関にあるマーカー遺伝子を用いる場合、信号が得られない細胞又は得られた信号量が閾値以下である細胞（以下、「信号非発生細胞」とも称する）を薬剤感受性細胞として計測することができる。

細胞の計数は、得られた顕微鏡画像や映像から目視で行ってもよいし、画像処理ソフトなどを用いて行ってもよい。又は、後述する複数のセンサ素子を有する光学センサやセルソーター等を用いて自動的に行ってもよい。

更に、乳がん細胞群に含まれる全乳がん細胞数を計測してもよい。例えば、全乳がん細胞数を用いて、薬剤感受性細胞の存在率、即ち、乳がん細胞群中の全乳がん細胞数に対する薬剤感受性細胞の数の割合を算出してもよい。

レポーター遺伝子が薬剤耐性遺伝子である場合は、例えば、まず乳がん細胞群に含まれる全細胞数を計測しておき、次に乳がん細胞群を薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤で処理し、生存して残った乳がん細胞を信号として検出し、その数を計測すればよい。検出及び細胞数の計測は、光学センサ、顕微鏡、カメラ又はセルソーター等の検出装置を用いて行うことができる。

検出工程Ｓ３及び計数工程Ｓ４では、必ずしも乳がん細胞群全体において信号発生細胞数を検出及び計数する必要はない。例えば、乳がん細胞群の一部についてそこに含まれる全細胞数と信号発生細胞数とを計数し、その値を代表値とし、乳がん細胞群全体の結果として用いてもよい。例えば、乳がん細胞群の一部を撮影した画像や、乳がん細胞群の一部を含む顕微鏡の視野等を用いて検出工程Ｓ３及び計数工程Ｓ４を行ってもよい。例えば、一部から得られた結果から、乳がん細胞群の単位数当たりの信号発生細胞数を算出して用いてもよい。また、乳がん細胞群の複数の一部について検出工程Ｓ３及び計数工程Ｓ４を行い、その結果の平均値を当該乳がん細胞群における結果として用いてもよい。

上記工程Ｓ１～Ｓ４によって薬剤感受性細胞の数又はその存在率を得ることができる。これらの情報は、例えば、対象から採取された乳がん細胞群又は対象中に存在する乳がんの薬剤感受性を決定するために使用することができる。

更なる実施形態に従う方法は、図４に示すように、計数工程Ｓ４の結果から、乳がん細胞群の薬剤への感受性の有無又は程度を決定する決定工程Ｓ５を更に含み得る。この工程において「乳がん細胞群」は、工程Ｓ１で使用された、対象の体内から体外へ取り出された状態の乳がん細胞群であり得る。

例えば、乳がん細胞群中の薬剤感受性細胞数がより多いほど、乳がん細胞群の薬剤への感受性が高いと決定することができる。反対に、乳がん細胞群中に薬剤感受性細胞が少ないか、又は存在しないとき、乳がん細胞群の薬剤への感受性が低いと決定することができる。

薬剤感受性細胞の存在率を算出した場合は、当該存在率が高いほど乳がん細胞群の薬剤への感受性が高いと決定することができる。或いは、存在率に閾値を設けて、存在率が閾値より高い場合に乳がん細胞群は薬剤への感受性を有すると決定してもよい。閾値は、薬剤の種類やマーカー遺伝子の種類に応じて決定されるものであり限定されるものではないが、例えば、薬剤感受性細胞の存在率が１０％以上であるとき乳がん細胞群が薬剤への感受性を有する決定することができる。

決定工程Ｓ５においては、本方法実施時点又は乳がん細胞群採取時点での乳がん細胞群の薬剤感受性の有無又は程度を決定してもよいし、乳がん細胞群の将来の薬剤感受性の有無又は程度を決定してもよい。例えば、得られた信号が微弱であっても薬剤感受性細胞数が閾値以上である場合には、将来薬剤感受性を有する可能性があると決定してもよい。「将来」は、例えば、乳がん細胞群が得られた対象の体内に存在する乳がんのその後、又は方法後に生存に適切な状態で維持された乳がん細胞群のその後を含む。本明細書において、「決定」するとは、本方法実施時点での又は乳がん細胞群採取時点での乳がん細胞群の薬剤感受性の決定と、将来の薬剤感受性の決定（即ち、予測）を含む。

また、検出工程Ｓ３において信号の強度を更に測定し、強度の情報を乳がん細胞群の薬剤感受性の程度の決定に用いてもよい。例えば、薬剤感受性細胞が同じ数であるが、得られた信号の強度が異なる場合には、信号の強度がより強い細胞群の方が薬剤感受性が高いと判断され得る。

以上に説明した実施形態の方法によれば、脂質粒子１を用いて第１核酸を効率よく乳がん細胞群に導入し、また生きた乳がん細胞群において薬剤感受性細胞の数（存在率）を指標とするため、乳がん細胞群の薬剤への感受性をより正確に決定することができる。

また、実施形態の方法によれば、偽陰性及び偽陽性を防止して正確に決定することができる。その理由の一例について図５を用いて説明する。

例えば、図５の（ａ）に示す３種類の細胞群、即ち、
細胞群Ａ：マーカー遺伝子の発現量が多い細胞８ａを４個、マーカー遺伝子を発現しない細胞８ｃを５個含む、
細胞群Ｂ：マーカー遺伝子の発現量が少ない細胞８ｂを４個、細胞８ｃを５個含む、
細胞群Ｃ：マーカー遺伝子の発現量が多い細胞８ａを１個、細胞８ｃを９個含む
を用いる場合、培養する前（培養０時間）においては、図５の（ｂ）に示すように、細胞群全体としてのマーカー遺伝子発現量は、細胞群Ａは高く、細胞群Ｂ、Ｃでは低くなり得る。このことから、従来のような、培養を行わず且つ細胞数を数えないＰＣＲ法やマイクロアレイ法を用いた場合では、細胞群Ｂは、マーカー遺伝子を発現する細胞数が細胞群Ａと同じであるのにも関わらず陰性と判定される場合がある（偽陰性）。また、細胞群Ｂと細胞群Ｃとを比較した場合、細胞群Ｃはマーカー遺伝子を発現する細胞数が少ないにも関わらずマーカー遺伝子を発現量は細胞群Ｂと同等の結果となり、薬剤感受性の決定結果が細胞群Ｂと同じと判定される場合がある（偽陽性）。

一方で、実施形態の方法によれば、第１核酸を用いて生きた乳がん細胞のプロモーター活性を検出し、更に培養工程Ｓ２を行うことにより、培養期間中にレポータータンパク質が発現し続ける。培養後ではマーカー遺伝子の発現は増強された信号として検出できるため、図５の（ｃ）に示すように細胞群Ｂにおける細胞８ｂも細胞８ａと同様に信号発生細胞９として検出することができる。その結果、図５の（ｄ）に示すように信号発生細胞の数は、細胞群Ｂは細胞群Ａと同様に薬剤への感受性が有る又は感受性が高いと判定することができ、一方で信号が得られた細胞の少ない細胞群Ｃを薬剤感受性が無い又は低いと判定することができる。

細胞群Ｃのようにマーカー遺伝子を多く発現する細胞が僅かに存在するよりも、細胞群Ｂのように微弱にマーカー遺伝子を発現する細胞数が多い方が、乳がん細胞群全体としての薬剤に対する感受性が高い場合が多い。例えば、マーカー遺伝子の発現量の少ない細胞８ｂが、将来発現量の多い細胞８ａになり得ることも考えられる。また例えば、細胞群Ｃおける細胞８ａは外れ値、異常値であることも考えられる。

したがって、実施形態の方法によれば、細胞群Ｂのように少なくともマーカー遺伝子が発現している細胞を多く含む乳がん細胞群を偽陰性とせず陽性として検出し、細胞群Ｃのようにマーカー遺伝子が発現している細胞数が少ない乳がん細胞群を偽陽性とせず陰性として検出することができる。そのため、正確に薬剤感受性を決定することが可能である。乳がん細胞群に含まれる細胞数やマーカー遺伝子の発現量は、図５に示すものに限定されるものではない。

以上のことから、第１実施形態の方法によれば、偽陰性及び偽陽性を防止し、正確に乳がん細胞群の薬剤感受性を決定することが可能である。

更なる実施形態によれば、乳がん細胞群として対象由来の乳がん細胞群を用いる場合、第１実施形態の方法で得られた乳がん細胞群（培養細胞）の薬剤感受性の決定結果は、対象の体内に存在する乳がんの薬剤への感受性の決定を補助するために用いられ得る。

・第２実施形態
第２実施形態によれば、対象の体内に存在する乳がんの薬剤への感受性を決定、例えば、診断する方法が提供される。この方法は、図６に示すように、上記工程Ｓ１～Ｓ５に加え、決定工程Ｓ５（ここでは、「第１決定工程Ｓ５」と称する）の結果から、当該対象の体内に存在している乳がんの薬剤への感受性の有無又は程度を決定する第２決定工程Ｓ６を含む。

この方法において使用される乳がん細胞群は、当該対象から採取したものである。例えば、この乳がん細胞群における結果を対象の体内の乳がんの代表値とみなすことができる。

従って、例えば、第１決定工程Ｓ５で乳がん細胞群に特定の薬剤への感受性がある又は感受性が高いと決定した場合、第２決定工程Ｓ６において当該対象の体内の乳がんにおいても同様に当該薬剤への感受性がある又は高いと決定することができる。反対に、第１決定工程Ｓ５で乳がん細胞群に特定の薬剤への感受性が無い又は感受性が低いと決定した場合、第２決定工程Ｓ６において当該対象の体内の乳がんにおいても同様に当該薬剤への感受性が無い又は低いと決定することができる。

第２実施形態の方法も偽陰性及び偽陽性を防止し、正確に対象の体内の乳がんの薬剤への感受性を決定することが可能である。

更なる実施形態において、第１決定工程Ｓ５及び／又は第２決定工程Ｓ６の結果に応じて、対象へ投与する薬剤を選択してもよい。この方法は、例えば、図７に示すように、第１決定工程Ｓ５又は第２決定工程Ｓ６の後に、対象へ投与する薬剤を選択する第３決定工程Ｓ７を含む。

第３決定工程Ｓ７は、例えば、第１決定工程Ｓ５又は第２決定工程Ｓ６で決定された乳がん細胞群又は対象の乳がんの特定の薬剤への感受性の有無又は感受性の高さの程度から、当該薬剤を当該対象に投与するか否かを決定すること、他の薬剤を当該対象に投与するか否かを決定すること、又はそれらの薬剤の投与計画を決定すること等を含む。

実施形態の方法によれば、より正確に適切な薬剤を選択することが可能である。本方法によれば、偽陰性及び偽陽性を防止できるため、対象に対して不適切な薬剤を選択することが防止される。

更なる実施形態において、第２決定工程Ｓ６は、計数工程Ｓ４の後、第１決定工程Ｓ５を行わずに行われてもよい。即ち、計数工程Ｓ４において得られた薬剤感受性細胞の数及び存在率から、対象の体内の乳がんの薬剤感受性を決定してもよい。

・第３実施形態
第３実施形態において、複数種類のプロモーター配列を用いた方法が提供される。第３実施形態の方法によれば、複数種類のプロモーター配列について同時に発現レベルを調査することができる。例えば、（ｉ）複数種類のプロモーター配列として、互いに異なる複数の薬剤にそれぞれ対応する複数の感受性予測マーカー遺伝子のプロモーター配列を選択することにより、１つの乳がん細胞群について複数の薬剤への感受性を決定することができる。或いは、（ｉｉ）複数種類のプロモーター配列として、１種の薬剤に対応する複数種類の感受性予測マーカー遺伝子のプロモーター配列を選択することにより、当該１種の薬剤への感受性を更に正確に決定することも可能である。

第３実施形態に用いる第１核酸は、乳がん細胞の薬剤への感受性を決定するための第１～第ｎのマーカー遺伝子の各プロモーター配列（以下、「前記第１～第ｎのプロモーター配列」と称する）と、第１～第ｎのプロモーター配列の下流にそれぞれ機能可能に連結された第１～第ｎのレポーター遺伝子とを有する。第１～第ｎのプロモーター配列は互いに異なり、第１～第ｎのレポーター遺伝子は互いに異なり、ｎは２以上の自然数である。

このような第１核酸の一例について図８を用いて説明する。例えば、第１核酸３０は、２つのレポーター遺伝子発現ユニットを有する。第１レポーター発現ユニットＵ１は、第１プロモーター配列３１と、第１レポーター遺伝子３２と、第１転写終結配列３３とを含む。第２レポーター発現ユニットＵ２は、第２プロモーター配列３４と、第２レポーター遺伝子３５と、第２転写終結配列３６とを含む。

第１プロモーター配列３１及び第２プロモーター配列３４は、互いに異なるマーカー遺伝子のプロモーター配列をそれぞれ含む。ここで、第１プロモーター配列３１及び第２プロモーター配列３４は、互いに異なる２つの薬剤の感受性をそれぞれ決定するためのマーカー遺伝子のプロモーター配列（上記（ｉ）に対応）であってもよいし、同じ薬剤の感受性を決定するための、互いに異なる２つのマーカー遺伝子のプロモーター配列（上記（ｉｉ）に対応）であってもよい。例えば、薬剤及びマーカー遺伝子は、第１実施形態に列挙したものから選択され得る。

第１レポーター遺伝子３２及び第２レポーター遺伝子３５は、互いに異なる種類のレポーター遺伝子であり、そこから発現するレポータータンパク質の信号は互いに異なるものであることが好ましい。これらのレポーター遺伝子は、第１実施形態で列挙したものから選択され得る。例えば、蛍光の波長が互いに異なる蛍光タンパク質遺伝子又は代謝物の発する蛍光の波長が互いに異なる発光酵素タンパク質遺伝子等を用いることが好ましい。

第１転写終結配列３３及び第２転写終結配列３６は、それぞれ上記の何れかの転写終結配列から選択され、互いに同じ配列からなってもよいし、異なる配列からなってもよい。

この例において第１核酸３０に含ませるレポーター発現ユニットの種類は、図８に示すように２種に限られるものではなく、３種以上を含んだ第１核酸を用いてもよい。また、各レポーター発現ユニットの向き（５’側から３’側へ向かうか又は３’側から５’側へ向かうか）は、全てのユニットで同じである必要はなく、何れかが異なる向きで配置されてもよい。

更なる実施形態において、第１核酸は、異なるレポーター遺伝子発現ユニットをそれぞれ含む複数のサブ核酸を含んでもよい。例えば、図９に示すように、第１レポーター発現ユニットＵ１を含む第１サブ核酸３７ａと、第２レポーター発現ユニットＵ２を含む第２サブ核酸３７ｂとを用いてもよい。

第１サブ核酸３７ａ及び第２サブ核酸３７ｂは、同じ脂質膜２に内包されて１種の脂質粒子１として調製されてもよい。その場合、各サブ核酸を核酸凝縮ペプチドで一度に凝縮して脂質膜２に内包してもよいし、別々に凝縮して脂質膜２に内包してもよい。或いは、第１サブ核酸３７ａ及び第２サブ核酸３７ｂは、別々の脂質膜２に内包されて２種の脂質粒子１として別々に調製されてもよい。

この例においても用いる複数のプロモーター配列の種類は図９に示すように２種に限られるものではなく、３種以上を用いてもよい。

また、本実施形態においても核酸の形態は図８、図９に示すように環状である必要はなく、直鎖状の核酸であってもよい。

第３実施形態に係る方法は、例えば、図１０に示すように、以下の工程を含む。

（Ｓ１１）脂質膜と、脂質膜に内包された第１核酸とを含む脂質粒子を乳がん細胞群に接触させる接触工程、
（Ｓ１２）乳がん細胞群を培養する培養工程、
（Ｓ１３）乳がん細胞群に含まれる各乳がん細胞において、第１～第ｎのレポーター遺伝子からそれぞれ発現する第１～第ｎのレポータータンパク質からの第１～第ｎの信号の有無又は量をそれぞれ検出する検出工程、及び
（Ｓ１４）検出工程の結果から、特性を有する乳がん細胞の数を第１～第ｎの信号毎に個別に計測する計数工程。

接触工程Ｓ１１は、第１核酸として複数のプロモーター配列を含むものを用いることを除いて、上記接触工程Ｓ１と同様に行うことができる。別々の脂質膜２に内包された第１サブ核酸３７ａ及び第２サブ核酸３７ｂのような第１核酸を用いる場合は、乳がん細胞群に同時又は順次それぞれを内包する脂質粒子を接触させればよい。その時、培養時間を調節したり検出工程Ｓ１３を行う適切な時間を合わせたりするために、プロモーター強度が弱いマーカー遺伝子のプロモーター配列を含むサブ核酸をより早く導入し、プロモーター強度が強いマーカー遺伝子のプロモーター配列を含むサブ核酸をより遅く導入してもよい。

培養工程Ｓ１２は、上記培養工程Ｓ２と同様に行うことができる。

検出工程Ｓ１３においては、各乳がん細胞から第１～第ｎの信号を個別に検出する。第１～第ｎの信号はそれぞれ上記検出工程Ｓ３と同様の方法で検出する。例えば、信号が光学的信号である場合は、波長の異なる複数の光を検出することができる顕微鏡、光学センサ、カメラ等が用いられ得る。

計数工程Ｓ１４は、第１～第ｎの信号毎に、計数工程Ｓ４と同様の方法で薬剤感受性細胞の数を計測すればよい。

例えば、培養を行いながら各信号を経時的に検出し、各信号において信号量が最大となるときの薬剤感受性細胞数を計測することが好ましい。その結果、複数のプロモーター配列の強度の差に従う最適な培養時間、検出時間の差に関わらず正確に細胞数を計測することができる。

第３実施形態に係る方法は、図１１に示すように、計数工程の結果から、乳がん細胞群の薬剤への感受性の有無又は程度を決定する決定工程（Ｓ１５）を更に含み得る。決定工程Ｓ１５においては、
（ｉ）複数のプロモーター配列が複数種類の薬剤にそれぞれ対応するものである場合、第１～第ｎの信号の個別の検出によって得られた各薬剤感受性細胞の数又はその存在率から、上記決定工程Ｓ５と同様に、複数種類の薬剤への感受性の有無又は程度を個別に決定する。それによって、複数の薬剤について同時に感受性を決定することができる。

（ｉｉ）複数のプロモーター配列が１種の薬剤に対応する複数のマーカー遺伝子である場合、第１～第ｎの信号の個別の検出によって得られた各薬剤感受性細胞の数又はその存在率から、総合的に当該薬剤への感受性を決定してもよい。例えば、各信号における薬剤感受性細胞数の平均値から上記決定工程Ｓ５と同様の方法で感受性を決定してもよい。それによって、１種の薬剤に対する感受性をより正確に決定することができる。

以上の工程により、複数のプロモーター配列を用いて乳がん細胞群の薬剤感受性を正確に決定することができる。

また、第３実施形態の方法は、第２の実施形態（例えば、図６及び図７に示す例）と同様に、対象の体内に存在する乳がんの薬剤への感受性を決定する第２決定工程、薬剤を選択する第３決定工程を更に含んでもよい。

・第４実施形態
第４実施形態に係る方法は、腫瘍細胞の特性を決定する方法である。即ち、第４実施形態においては、第１実施形態に係る方法の乳がん細胞群に代えて他の腫瘍細胞群を用いてもよく、また第１実施形態に係る方法の薬剤への感受性に代えて、腫瘍細胞の他の特性を決定してもよい。

第４実施形態に係る方法は、図１２に示すように、例えば、次の工程を含む。

（Ｓ２１）脂質膜と、脂質膜に内包された第１核酸とを含む脂質粒子を腫瘍細胞群に接触させる接触工程（第１核酸は、腫瘍細胞の特性を決定するためのマーカー遺伝子のプロモーター配列と、プロモーター配列の下流に機能可能に連結されたレポーター遺伝子とを有する）、
（Ｓ２２）腫瘍細胞群を培養する培養工程、
（Ｓ２３）腫瘍細胞群に含まれる各腫瘍細胞において、レポーター遺伝子から発現するレポータータンパク質からの信号の有無又は量を検出する検出工程、及び
（Ｓ２４）検出工程の結果から、特性を有する腫瘍細胞の数を計測する計数工程。

他の腫瘍とは、動物の体内に形成される何れかの悪性腫瘍であり、肺がん、食道がん、胃がん、大腸がん、胆管がん、膵臓がん、肝臓がん、膀胱がん、卵巣がん、前立腺がん、脳腫瘍、肉腫、子宮体がん、子宮肉腫及び造血器悪性腫瘍等を含むが、これらに限定されるものではない。

他の特性とは、例えば、腫瘍細胞の予後、転移性又は浸潤性等である。また、腫瘍細胞の特性とは、健常細胞が将来腫瘍細胞になるか否かも含む。

この例において、第１核酸３のプロモーター配列５として、所望の腫瘍における、所望の特性を決定するためのマーカー遺伝子のプロモーター配列を用いる。それらは、当分野で知られた所望の腫瘍に関するマーカー遺伝子、例えば、予後マーカー遺伝子、転移性マーカー遺伝子、浸潤性マーカー遺伝子又は腫瘍細胞マーカー遺伝子等のプロモーター配列であり得る。

レポーター遺伝子６及び転写終結配列７として、例えば、第１実施形態において列挙した何れかのものを用いることができる。

脂質膜２の材料として、第１実施形態において説明したベース脂質、第１の脂質化合物、第２の脂質化合物及び／又は他の脂質を含むものを用いることができる。

第４実施形態に従う方法の工程Ｓ２１～Ｓ２５は、上記工程Ｓ１～Ｓ５とそれぞれ同様に行うことができる。ただし、第１実施形態の方法の乳がん細胞群に代えて所望の腫瘍細胞群を用い、薬剤への感受性に代えて当該腫瘍細胞の他の特性を決定するマーカー遺伝子のプロモーター配列を含む第１核酸を用い、決定工程Ｓ２５において所望の特性を決定する。

第４実施形態に係る方法は、図１３に示すように、計数工程の結果から、腫瘍細胞群の特性を決定する決定工程（Ｓ２５）を更に含み得る。決定工程Ｓ２５における腫瘍細胞の各特性の決定は、マーカー遺伝子の種類にしたがって当業者の知識にしたがって行うことが可能である。

第４実施形態によれば、偽陰性及び偽陽性を防止して腫瘍細胞の特性をより正確に決定することができる。

また、第４実施形態の方法は、第２実施形態と同様の方法で、対象の体内に存在する腫瘍の特性を決定する工程を更に含んでもよい。また、第３実施形態と同様の方法で、複数のプロモーター配列を用いて本方法を行ってもよい。

・第５実施形態
（細胞培養検出デバイス）
第５実施形態において、上記第１～第４実施形態における培養工程、検出工程及び計数工程を行うための細胞培養検出デバイスが提供される。図１４に示すように、細胞培養検出デバイス１０は、例えば、試料収容部１１と、光学センサ１２とを備える。

試料収容部１１は、例えば、底部１３と、底部１３の周縁から立設する壁部１４とを備え、上部が開放された液密な容器の形状を有する。底部１３及び壁部１４は、光透過性材料からなる。光透過性材料は、例えば、可視光、紫外線、赤外線、蛍光、又は化学、生物若しくは化学生物発光などの光を透過する材料であり得る。そのような材料の例は、例えば、ガラス、二酸化ケイ素、ポリスチレン又はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などを含む。

或いは、例えば、試料収容部１１として、市販のガラス、二酸化ケイ素、ポリスチレン又はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製のシャーレ、ディッシュ若しくはマルチウェルプレート等が使用されてもよい。

試料収容部１１の底部１３上に細胞群１５及び培地１６等を収容し、細胞群１５の培養を行うことができる。

光学センサ１２は、基板１７上にマトリックス状に並ぶ複数のセンサ素子１８を備える。センサ素子１８は、マトリックス状に複数並ぶことによって全体として光学的信号を二次元的に検出できるセンサ面１８ａを形成している。

図１５に図１４のＡ－Ａ’に沿って切断した断面における３つのセンサ素子１８の拡大図を示す。センサ素子１８は、基板１７の試料収容部１１側の表面上に埋め込まれたセンシング部１９を備える。センシング部１９は、例えば、光学的信号を電気的信号に変換することで光を検知する受光素子であり、公知の何れかのものを使用することができる。センシング部１９は、例えば、フォトダイオードである。センシング部１９の光学的信号を受け取るセンシング面１９ａが基板１７の表面に露出している。

センシング部１９のセンシング面１９ａ上には、例えば配線層２０が設けられていてもよい。配線層２０には、センシング部１９で検知された光学的情報を伝達する一層又は複数層の配線２２が配置されている。複数の配線２２は、例えば、導体材料のビア２３により互いに電気的に接続されている。

配線２２及びビア２３は、光透過層２１内に設けられることによって所望の位置に固定されている。光透過層２１は、例えば、ＳｉＯ_２等の光透過性の材料からなる。配線２２及びビア２３は、光学センサ１２を平面視したとき、試料収容部１１からの光が光透過層２１を介してセンシング部１９まで到達するのを妨害しないような位置、例えば、隣り合う２つのセンシング部１９の間に設けられる。

また配線２２及びビア２３は遮光部材としての役割を有し、センシング部１９に、隣り合う他のセンサ素子１８で検出されるべき光が侵入するのを防止して、検出の感度を向上させる。

光透過層２１の基板１７と反対側の表面には、更に保護層２４が設けられていてもよい。保護層２４は、光透過層２１の表面を保護するための部材であり、窒化シリコン膜などの光透過性の材料からなる。

なお、図１４において隣り合うセンサ素子１８の境界線として描写された実線は、センサ素子１８の配列を表現するために便宜上描写されたものであり、必ずしもこれらの実線の部分にセンサ素子１８を区画する部材を備えなくてもよい。

当該光学センサ１２は、例えば次のように半導体プロセスによって形成され得る。まず、基板１７上のセンシング部１９が形成される場所に、不純物を打ち込むことによりセンシング部１９を形成する。続いてその上に、光透過層２１を堆積する。配線２２は、光透過層２１を堆積する際に、その途中の所望の位置にビア２３で接続しながら形成され得る。保護層２４は、例えばＣＶＤ法により光透過層２１の表面に堆積することによって形成され得る。

各センサ素子１８の、センサ面１８ａと平行な面における面積は、例えば、５００ｎｍ×５００ｎｍ～１０μｍ×１０μｍであり得る。光学センサ１２に含まれるセンサ素子１８の数は、約１００個～１億個であり得る。センサ素子１８の数及び大きさは、例えば、試料収容部１１に収容される細胞群１５に含まれる細胞の大きさ、又は取得される画像の所望の解像度などによって決定され得、上記に限定されるものではない。センサ素子１８の数及び大きさは、例えば、１つの細胞からの光学的情報を１つのセンサ素子１８で検出できるように調整されることが好ましい。

光学センサ１２の厚さは、数μｍ、例えば、１μｍ～４μｍであり得るが、この範囲に限定されるものではない。

光学センサ１２として、マトリックス状に並んだ複数のセンサ素子を備える市販の光学センサを使用してもよく、例えば、公知の何れかのＣＭＯＳセンサを使用することも可能である。

試料収容部１１は、光学センサ１２のセンサ面１８ａ上に配置され、センサ面１８ａと底部１３とが対向している。センサ面１８ａと底部１３との間には間隙が設けられてもよく、センサ面１８ａと底部１３との間の距離は、例えば、０～１００μｍとすることが好ましい。

本細胞培養検出デバイス１０を用いて培養工程、検出工程及び計数工程を行う場合、まず、試料収容部１１に培地１６と、脂質粒子１と接触させた細胞群１５とを収容する。次に細胞培養検出デバイス１０を所望の培養条件に設定したインキュベータ等に入れて細胞群１５を培養する（培養工程）。

検出工程及び計数工程は、例えば、図１４に示すように光照射装置２５により細胞群１５に光を照射して行う。

光照射装置２５に備えられた光源２６は、例えば、赤色光、緑色光、青色光、白色光などの可視光、紫外光及び赤外光、並びにこれらの中から選択される２つ以上の組み合わせなどの光を発する光源である。光源２６は、例えば、有機ＥＬ、ＬＥＤ又はレーザーなどである。

光照射装置２５は、細胞培養検出デバイス１０に固定されていてもよいし、固定されず別体として用意されてもよい。

光源２６から照射する光の種類は、レポータータンパク質の種類に応じて選択される。例えば、レポータータンパク質が蛍光タンパク質である場合、光は、それ自体から生じる蛍光の励起光である。レポータータンパク質が発光酵素タンパク質である場合、発光酵素タンパク質の代謝物から生じる蛍光の励起光である。又は、光は明視野観察を行うための光であってもよい。

光は、例えば、図１４に示すように底部１３と平行な向きで照射することが好ましい。その結果、光は壁部１４を介して細胞群１５に照射され、細胞群１５に当たって散乱する。生じた散乱光のうち、下方に散乱した光を光学センサ１２で検出する。このような照射によれば、試料収容部１１の上部等から光を照射した場合と比較してノイズとなる光が生じにくく、高感度な検出が可能である。

光学センサ１２は、複数のセンサ素子１８によって試料収容部１１に収容された細胞群１５からの光学的情報を二次元的な位置情報と結びつけて得ることができる。例えば、信号が得られたセンサ素子１８の位置及び数から、所望の細胞の数を計測することができる。例えば、全てのセンサ素子１８から得られた検出結果から画像又は映像を作成してもよい。

例えば、光学的信号が蛍光である場合は、明視野条件において検出を行って細胞群１５に含まれる全細胞数を計測し、次に暗視野条件で励起光を照射して光学的信号を検出し、信号発生細胞の数を計測する。レポーター遺伝子６が発光酵素タンパク質遺伝子である場合、検出工程に先立ち試料収容部１１に酵素の基質を添加する工程を更に含む。或いは、レポーター遺伝子６が薬剤耐性遺伝子である場合は、まず明視野条件における検出を行って細胞群１５に含まれる全細胞数を計測し、対応する薬剤を試料収容部１１に添加して、明視野条件で検出を行って残った細胞の数を計測する。

検出工程及び計数工程は培養後に行ってもよいが、細胞培養検出デバイス１０によれば試料収容部１１で細胞を培養しながら簡単に経時的な検出を行うことができる。

以上に説明した細胞培養検出デバイス１０を用いれば、培養工程中の経時的検出を簡単に行うことができ、また細胞の生存に適切な環境で細胞を維持しながら信号を検出することができるため、腫瘍細胞の特性をより正確に決定することが可能である。

更なる実施形態において、光学センサ１２は、複数種類のセンサ素子１８を含んでもよい。複数種類のセンサ素子１８は、例えば、図１５に示すセンサ素子１８のような第１センサ素子、表面又は内部に所望の波長の光を検出するためのフィルターを更に備える第２センサ素子、及び／又は第２センサ素子とは異なる波長の光を検出するためのフィルターを備える第３センサ素子等である。このような種類の異なるセンサ素子１８を１種ずつ含むセンサ素子の集まりを含む１つの基本ブロックが二次元領域にマトリックス状に並んだ光学センサを用いてもよい。

また更なる実施形態において、試料収容部１１は底部１３を備えなくともよい。この例においては、光学センサ１２のセンサ面１８ａ上に直接細胞群１５を収容し、細胞群１５が培養され得る。このような細胞培養検出デバイス１０は、センサ面１８ａ上から立設する壁部１４を備え得る。

この場合、センサ面１８ａと細胞群１５とが接触しているため、光学的信号を検出するセンサ素子の他に細胞群１５由来の電気的信号を検出する電気センサ素子又は細胞群１５由来の化学物質やｐＨ等の化学的信号を検出する化学センサ素子等を更に含む上記基本ブロックを備える光学センサ１２を用いてもよい。このような光学センサ１２を用いることにより、例えば、レポータータンパク質からの電気的信号や化学的信号が得られた信号発生細胞の個数を計測することが可能である。

（キット）
更なる実施形態によれば、腫瘍細胞の特性を決定するためのキットが提供される。キットは、例えば、細胞培養検出デバイス１０と脂質粒子１とを含む。

細胞培養検出デバイス１０は、上記の何れかのものであればよい。

脂質粒子１は、上記の何れかのものであり、腫瘍細胞の特性を決定するための試薬として提供される。脂質粒子１は、例えば、適切な溶媒とともに容器に収容されて提供される。

当該試薬は、脂質粒子１の他に保管安定性を向上させる物質を更に含んでもよい。保管安定性を向上させる物質は、限定されるものではないが、例えば、アルブミン、リポタンパク、アポリポタンパク、グロブリン等の糖タンパク等：ｐＨ調整剤、緩衝化剤、張度調整剤等；フリーラジカルによるダメージを抑制する、α－トコフェロールのような脂肪親和性フリーラジカルクエンチャー；脂質の過酸化損傷を抑制し、貯蔵安定性を改良するためのフェリオキサミンのような水溶性キレーター等の脂質保護剤等である。

試薬は、一般的な方法によって滅菌されていてもよい。また、試薬は、液体として提供されてもよいし、それを乾燥した粉末として提供されてもよい。粉末の試薬は、例えば、適切な液体に溶解することにより使用可能となる。

試薬中に含まれる脂質粒子１の濃度は、限定されるものではないが、０．０１～３０質量％、好ましくは０．０５～１０質量％であることが好ましい。濃度は、目的に応じて適切に選択される。

キットは、更に、レポータータンパク質からの信号を検出するための試薬を含んでもよい。例えば、当該試薬は、前記発光酵素タンパク質の基質又は薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤等を含む。

（細胞特性決定システム）
更なる実施形態において、細胞特性決定システムが提供される。図１６に示すように、細胞特性決定システム１００は、例えば、細胞培養検出デバイス１０と、光照射装置２５と、処理装置１０１とを備える。処理装置１０１は、入力部１０３と、記憶部４０と、プロセッサ５０と、表示部６０と、出力部７０とを備える。入力部１０３と、記憶部４０と、プロセッサ５０と、表示部６０と、出力部７０とは、バス１０２を介して電気的に接続されている。

細胞培養検出デバイス１０は、上に説明した通りである。細胞培養検出デバイス１０は、細胞特性決定システム１００に取り外し可能に取り付けることができる。細胞特性決定システム１００に取り付けられると、光学センサ１２が入力部１０３と電気的に接続される。例えば、細胞培養検出デバイス１０は光学センサ１２の各センサ素子１８と接続された図示しない複数のパッドを備え、各パッドと入力部１０３とが電気的に接続される。

光照射装置２５は、上に説明した通りである。光照射装置２５に備えられた光源２６は、試料収容部１１に光を照射するように配置されている。

入力部１０３は、光学センサ１２と電気的に接続しており、光学センサ１２から測定データを受信する。

記憶部４０には、光学センサ１２から得られた明視野測定データ４１及び蛍光測定データ４２、明視野測定データ４１及び蛍光測定データ４２から全細胞数及び信号発生細胞数の個数をそれぞれ計測するための個数演算式４３、全粒子個数データ４４、信号発生細胞個数データ４５、各個数データから信号発生細胞の存在率を算出するための存在率演算式４６、信号発生細胞の存在率４７、存在率４７から細胞特性を決定するための特性決定演算式４８、特性決定結果４９及び／又はプログラムＰ等が格納される。

プログラムＰには、光学センサ１２で得られた明視野測定データ４１及び蛍光測定データ４２から所望の特性を有する腫瘍細胞の個数を計測し、腫瘍細胞の特性を評価する機能等を実現するためのプログラムが含まれる。プログラムＰは、更に、光源２６からの光のオンオフを制御するためのプログラム等を含んでもよい。

プロセッサ５０は、データ管理部５１、個数演算部５２、存在率演算部５３、評価部５４及び光照射管理部５５等を備える。データ管理部５１は、入力部１０３経由で受信した測定データを記憶部４０に格納する。個数演算部５２は、例えば、プログラムＰに基づいて個数演算式４３を用いて明視野測定データ４１から全粒子の個数を計測し、蛍光測定データ４２から信号発生細胞の個数を計測する。存在率演算部５３は、例えば、プログラムＰに基づいて存在率演算式４６を用いて全粒子個数データ４４及び信号発生細胞の個数データ４５から信号発生細胞の存在率を算出する。評価部５３は、例えば、プログラムＰに基づいて特性決定演算式４８を用いて存在率４７から細胞特性を決定する。光照射管理部５５は、プログラムＰに基づいて出力部７０を介して光照射装置２５の光源２６のオンオフを制御する。プロセッサ５０は、例えばＣＰＵである。

表示部６０は、ディスプレイ又はプリンター等を備え得る。

出力部７０は、光照射装置２５と電気的に接続されており、光照射管理部５５からの命令を光照射装置２５に出力する。

また細胞特性決定システム１００は、細胞特性決定システム１００の各操作の開始又は停止、及びパラメーターを入力するボタン、キーボード及びタッチパネル等を備えてもよい。これらは、例えば入力部１０３と電気的に接続されている。

また、細胞特性決定システム１００は、図示しない培養部を備えてもよい。培養部は、チャンバを備える。この場合、チャンバには、環境条件、例えば、温度、光条件、二酸化炭素濃度及び酸素濃度等を測定する各種環境センサと、チャンバ内のこれらの環境条件を調節するヒーター、照明及びガスボンベ等の設備が設けられている。プロセッサ５０は環境センサの測定結果から、プログラムに基づいてチャンバ内の環境条件が培養工程に適切となるように出力部を介して上記各設備を制御する条件変更部を含み得る。例えば、細胞培養検出デバイス１０をチャンバ内に取り付けると、チャンバ内で培養工程を行うことができ、また光学センサ１２と入力部１０３とが電気的に接続され得る。また、その場合光源２６はチャンバ内に備えられ、試料収容部１１に所望の方向から光を照射するように配置されてもよい。

次に、細胞特性決定システム１００を用いた方法について説明する。

まず、試料収容部１１に培地１６と細胞群１５を収容し、培養工程を行う。培養工程後の細胞培養検出デバイス１０を細胞特性決定システム１００に取り付ける。細胞特性決定システム１００が培養部を含む場合は、細胞群１５及び培地１６を収容した細胞培養検出デバイス１０を培養部に取り付けて培養工程を行ってもよい。

次に、光照射管理部５５が出力部７０を介して光源２６のスイッチオンを命令し、光源２６から試料収容部１１に光が照射される。そして、光学センサ１２によって検出が行われ、明視野測定データ４１及び蛍光測定データ４２が得られる。各データは、データ管理部５１によって入力部１０３を介して記憶部４０に格納される。この時、全てのセンサ素子１８の位置情報と結びつけられた各測定データが記憶部４０に格納される。

次に、プロセッサ５０の個数演算部５２において、記憶部４０から明視野測定データ４１及び個数演算式４３が取り出され個数演算式４３に基づいて全脂質粒子の個数が算出される。全粒子個数データ４４は記憶部４０に格納される。また、記憶部４０から蛍光測定データ４２及び個数演算式４３が取り出され、個数演算式４３に基づいて信号発生細胞の個数が算出される。信号発生細胞個数データ４５は記憶部４０に格納される。

次に、プロセッサ５０の存在率演算部５３において、記憶部４０から全粒子個数データ４４、信号発生細胞の個数データ４５及び存在率演算式４６が取り出され、信号発生細胞の存在率４７が算出される。存在率４７は、記憶部４０に格納される。例えば、表示部６０に存在率４７が表示されてもよい。

次に、プロセッサ５０の評価部５３において、記憶部から存在率４７及び特性決定演算式４８が取り出され、細胞特性が決定される。その結果は、特性決定結果４９として記憶部４０に格納され、また表示部６０に表示される。

例えば、特性決定演算式は、細胞の種類、マーカー遺伝子の種類、決定したい細胞特性によって異なり、これらの何れかの組み合わせに対応した複数の演算式が記憶部４０に格納されていてもよい。例えば、入力部から操作者により入力された細胞の種類、マーカー遺伝子の種類、及び／又は決定したい細胞特性に基づいて、特性決定演算式が選択され、それに基づいて細胞特性が決定されてもよい。

上記各手順は、プログラムＰにより自動的に行われてもよいし、本装置の操作者の入力等に従って行われてもよい。

本システムによる方法の実行が終了した後、細胞培養検出デバイス１０は細胞特性決定システム１００から取り外され得る。

本システムは、必ずしも細胞培養検出デバイス１０を含む必要はなく、備え付けの試料収容部及び／又は光学センサを含む構成としてもよい。

実施形態の細胞特性決定システムによれば、正確に腫瘍細胞の特性を決定することが可能である。

［例］
例１．レポーターベクターの作製
アンピシリン耐性遺伝子配列、ＣｏｌＥ１ ｏｒｉｇｉｎ配列、ＳＶ４０ ｏｒｉｇｉｎ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、ＮａｎｏＬｕｃ遺伝子、ＢＧＨポリＡ配列を含む基礎ベクターを用意した。基礎ベクターのＮａｎｏＬｕｃ遺伝子の上流にあるＳａｃＩサイト及びＸｈｏＩサイトで制限酵素処理を行って直線化し、０．８％アガロース電気泳動を行い、精製した。

Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を鋳型としてＳＴＣ２遺伝子のプロモーター配列を増幅するためのプライマーセット（表３に示す配列番号７、８）及びＴＯＰ２Ａ遺伝子のプロモーター配列を増幅するためのプライマーセット（表３に示す配列番号９、１０）を用いてＰＣＲ法（表４の条件）によってそれぞれ増幅した。増幅により、ＳＴＣ２プロモーター配列（表１に示す配列番号１）及びＴＯＰ２Ａプロモーター配列（表２に示す配列番号２）がそれぞれ得られた。これらの増幅産物を０．８％アガロース電気泳動によって精製した。

ＩｎＦｕｓｉｏｎ（ＴａＫａＲａ社）を用いて、上記の直線化した基礎ベクターのＳｃａＩ／ＸｈｏＩサイトに精製したプロモーター配列をそれぞれ連結し、ＳＴＣ２レポーターベクター（図１７）及びＴＯＰ２Ａレポーターベクター（図１８）を得た。

例２．レポーターベクターを内包する脂質粒子の調製
ＳＴＣ２レポーターベクターを含むＤＮＡ溶液、及びＴＯＰ２Ａレポーターベクターを含むＤＮＡ溶液にカチオン性ペプチドをそれぞれ加え、ＤＮＡ－ペプチド凝縮体を形成した。

エタノール溶解脂質溶液（ＦＦＴ１０／ＳＳＴ０４／ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧ＝３７／１５／１０．５／１０．５／３０／２ｍｏｌ）を調製し、それに上記ＤＮＡ－ペプチド凝集体をそれぞれ添加した。更に１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、ＳＴＣ２レポーターベクター内包脂質粒子及びＴＯＰ２Ａレポーターベクター内包脂質粒子を得た。各脂質粒子のＤＮＡ内包量は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）で測定した。

例３．レポーターベクターの細胞株への導入
・ヒト乳腺腫瘍由来細胞株への導入
タモキシフェン感受性のヒト乳腺腫瘍由来細胞株（ＭＣＦ－７）、及びドキソルビシン感受性のヒト乳腺腫瘍由来細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）を、カルチャーフラスコにおいて１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加した培地（ＭＣＦ－７：ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１：ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ））を用いて３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で付着培養した。

培養後、培地を取り除き、ＰＢＳで洗浄した後、０．２５％のＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ処理により細胞を剥がした後、１０％ＦＢＳを添加した培地に細胞を懸濁し、Ｔｒｙｐｓｉｎを不活性化した。遠心で細胞を回収した後、２．０×１０^５細胞／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳを添加した培地に細胞を懸濁して、９６ウェル培養ディッシュ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）に、４．０×１０^４細胞／ウェルとなるように、細胞縣濁液を２００μＬずつ加えた。この９６ウェル培養ディッシュを２つ用意し、例２で作製した各レポーターベクター内包脂質粒子を、ＤＮＡが０．２μｇ／ウェルとなるようにそれぞれウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で培養した。

・ヒト正常乳腺上皮細胞への導入
ヒト正常乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）を、カルチャーフラスコで、Ｍａｍｍａｒｙ Ｌｉｆｅ（Ｌｉｆｅｌｉｎｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で付着培養した。培養後、培地を取り除き、ＰＢＳで洗浄した後、０．２５％のＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ処理により細胞を剥がした後、Ｍａｍｍａｒｙ Ｌｉｆｅに細胞を懸濁し、Ｔｒｙｐｓｉｎを不活性化した。遠心で細胞を回収した後、２．０×１０^５細胞／ｍＬとなるようにＭａｍｍａｒｙ Ｌｉｆｅに細胞を懸濁して、９６ウェル培養ディッシュ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）に、４．０×１０^４細胞／ウェルとなるように、細胞縣濁液を２００μＬずつ加えた。この９６ウェル培養ディッシュを２つ用意し、例２で作製した各レポーターベクター内包脂質粒子を、ＤＮＡが０．２μｇ／ウェルとなるようにそれぞれウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で培養した。

・ＮａｎｏＬｕｃ発現量の測定（ＮａｎｏＬｕｃ発光アッセイ）
プロモーターベクター内包脂質粒子と乳がん細胞とを混合してから２４時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、培地を取り除いた後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｇｌｏ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加えて、－８０℃で３０分間凍結させた。室温で融解させた後、細胞溶解液を１．５ｍＬ遠心チューブに回収した。１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞残渣を沈殿させ、上清２５μＬを９６ウェルプレート（Ｂｌａｃｋ、Ｎｕｎｃ）に分注した。ここにルシフェラーゼ基質溶液（Ｎａｎｏ Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ, Ｐｒｏｍｅｇａ社）を２５μＬ添加し、混合した後、ルミノメーター（Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）を用いて、０．１秒当たりの１ウェルのあたりの発光量を測定した。

・プロモーター活性の比較結果
図１９に、ＳＴＣ２プロモーターベクター内包脂質粒子を導入した各乳がん細胞のＮａｎｏＬｕｃ発光強度（ＲＬＵ）の測定結果を示す。タモキシフェン感受性乳がん細胞株であるＭＣＦ－７の発光強度は約２７×１０^５ＲＬＵであり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（約０．５×１０^５ＲＬＵ）及びＨＭＥＣ（約１×１０^５ＲＬＵ）と比較して明らかに高かった。この結果からＳＴＣ２プロモーターベクター内包粒子により、乳がん細胞のタモキシフェンへの感受性を決定できることが明らかとなった。

図２０に、ＴＯＰ２Ａプロモーターベクター内包脂質粒子を導入した各乳がん細胞のＮａｎｏＬｕｃ発光強度の測定結果を示す。ドキソルビシン感受性乳がん細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１の発光強度は約７．０×１０^５ＲＬＵであり、ＭＣＦ－７（約３．５×１０^５ＲＬＵ）及びＨＭＥＣ（約０．６×１０^５ＲＬＵ）と比較して明らかに高かった。この結果からＴＯＰ２Ａプロモーターベクター内包粒子により、乳がん細胞のドキソルビシンへの感受性を決定できることが明らかとなった。

例４．レポーターベクターの患者乳がん検体細胞への導入
・検体細胞の調製及びDNA内包脂質粒子による核酸の導入
乳がんに罹患したヒトから外科的手術によって取り出された腫瘍の一部を乳がん検体として用いた（検体は、倫理委員会の承認を受けた臨床研究の実験計画に基づき、同意を得られた患者から摘出された手術検体の一部であり、適切な管理下で実験に使用した）。検体は、タモキシフェンへの感受性のある乳がん検体Ａ、ドキソルビシンへの感受性のある乳がん検体Ｂ、タモキシフェン及びドキソルビシンのどちらにも感受性の無い検体Ｃであった。採取された後、ＭＡＣＳ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を入れたサンプル瓶中に保管し、４℃で運搬した。検体の細胞分散には、ＭＡＣＳ Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いた。１％のＢＳＡを含むＲＰＭＩ４．８ｍｌに対し、Ｋｉｔに付属している酵素Ｈを１００μＬ（Ｋｉｔプロトコルの１／２量）、酵素Ｒを２０μＬ（Ｋｉｔプロトコルの１／５量）加え、ｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳ Ｃ Ｔｕｂｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）に検体とともに入れ、検体をはさみで細切した。これをｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳ－Ｏｃｔ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ ｗｉｔｈ ｈｅａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）にセットし、乳がん検体用に設定したプログラム（表５）を用いて細胞を分散した。

処理終了後の検体細胞分散液をセルストレイナー（ポアサイズ７０μｍのナイロンフィルター、商品名：ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（登録商標））に通して遠心チューブに回収し、遠心した（３００ｇ、５分、４℃）。上清を取り除いた後、赤血球を取り除くために溶血処理を行った。溶血処理は、５ｍｌの溶血バッファー（ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを滅菌水で１／１０希釈したもの）に細胞を懸濁し、３７℃で２分間処理することによって行った。次いで再び遠心し（３００ｇ、５分、４℃）、細胞を回収した。沈殿物をＭａｍｍａｒｙ Ｌｉｆｅ（Ｌｉｆｅｌｉｎｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）に懸濁して、細胞数を計測した。細胞数の計測は、１０μＬの細胞液と０．４ｗ/ｖ％のＴｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（和光純薬工業製、販売元コード：２０７－１７０８１）を１：１で混合し、自動細胞計測装置Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で計測し、細胞径５～６０μｍの生細胞数が５０００細胞／ウェル（１５μＬ／ウェル）となるようにＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに播種した。

ＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈには、ＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ Ｄｉｓｈ ＭＳパターン高接着、３５ｍｍ（ＮＣＤ－ＨＳ３５－５、ＯＲＧＡＮＯ ＧＥＮＩＸ社）をコーティングしたもの用いた。コーディングは、ＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈに、３ｍｍΦ、厚み２ｍｍのガスケットを置き、ＰＢＳでｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ニッピ製、製品コード：８９２０１１）を１／６０希釈した溶液、及びＡｄｈｅｓａｍｉｎｅ（和光純薬工業製、販売元コード：０１０－２３２０１）を１／１０希釈した溶液を１５μＬ入れ、３７℃で１時間静置することによって行った。各ウェルへの細胞の播種は、コーティング溶液を取り除いた後に行い、次いで３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養した。この細胞培養物を２つ作成した。１５分後、例２で作製した各プロモーターベクター内包脂質粒子をＤＮＡが０．１４μｇ／ウェルとなるようにウェルにそれぞれ添加して、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気で培養した。

・ＮａｎｏＬｕｃ発現量の測定（ＮａｎｏＬｕｃ発光アッセイ）
レポーターベクター内包脂質粒子添加の２４時間後、ＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈをインキュベータから取り出し、発光基質（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１／１０００希釈となるように培地に加え、高感度冷却ＣＣＤカメラ（ＩｍａｇｅＭ ＥＸ、浜松ホトニクス製）を装着した発光顕微鏡（ＬｕｍｉｎｏＶｉｅｗ ＬＶ２００、Ｏｌｙｍｐｕｓ製）を用いて細胞を観察し、明視野と暗視野の写真を撮影した。画像処理は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて行った。

・検体細胞におけるＳＴＣ２／ＴＯＰ２Ａプロモーターの活性評価
図２１、図２２に示す通り、ＳＴＣ２プロモーターベクター内包脂質粒子によるＮａｎｏＬｕｃ発光細胞の写真では、タモキシフェン感受性のある検体Ａで発光細胞が明らかに多く、例えば図２１、図２２に示す視野中では肉眼で約６０個観察された。一方、検体Ｂでは発光細胞が２個、検体Ｃでは３個観察され、明らかに少なかった。図２１及び図２２は、それぞれＪＰＥＧ形式及びビットマップ形式の同一の写真である。

ＴＯＰ２Ａプロモーターベクター内包脂質粒子によるＮａｎｏＬｕｃ発光細胞の写真においては、ドキソルビシン感受性の検体Ｂでは発光細胞数が明らかに多く、例えば図２１、図２２に示す視野中には肉眼で約７０個観察された。一方で検体Ａでは発光細胞２個、検体Ｃでは４個観察され、明らかに少なかった。

以上の結果から、ＳＴＣ２プロモーターベクター内包脂質粒子及びＴＯＰ２Ａプロモーターベクター内包脂質粒子を用いることによって生きた乳がん細胞で薬剤の感受性を測定することが可能であることが明らかとなった。

例５．リアルタイムＰＣＲ法との比較
・プロモーターベクター内包脂質粒子使用した薬剤感受性の決定
例４の検体Ａ、Ｂ、Ｃとは別の乳がん検体Ｄ、Ｅを用いて、例４と同様の方法によってＳＴＣ２プロモーターベクター内包脂質粒子を細胞に導入し、明視野及び暗視野での写真を撮影した。写真の画像処理を行うことによって発光が観察された細胞数を計測した。画像処理は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて行った。次いで発光細胞の存在率をＳＴＣ２陽性細胞数／ＣＭＶ陽性細胞数として算出した。

・リアルタイムＰＣＲ法を用いた薬剤感受性の決定
例４で使用した細胞から、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）で行い、操作は添付のマニュアルに従った。抽出されたＲＮＡ溶液は、分光光度計で２６０ｎｍの吸光度を測定してＲＮＡ量を算出した。次いで、Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して逆転写ＰＣＲを行った。操作は添付のマニュアルに従って行った。各サンプルの全ＲＮＡが１００ｎｇになるように調製しｃＤＮＡを合成した。

ｃＤＮＡから、Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ （Ａｐｐｉｌｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）とＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ Ｈｓ０１０６３２１５＿ｍ１を用いて、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ装置（Ａｐｐｉｌｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）でＳＴＣ２の発現を検出した。ＰＣＲの増幅条件は、５０℃２分間、９５℃１０分間の後、９５℃１５秒間、６０℃１分間を１サイクルとして、２２サイクルまで測定し、増幅の有無を濁度によって測定した。

・結果の比較
表６にプロモーターベクター内包脂質粒子使用した方法における発光細胞の存在率と、リアルタイムＰＣＲ法におけるＳＴＣ２の増幅産物の有無とを示す。

検体Ｄ、検体Ｅともにプロモーターベクター内包脂質粒子使用した方法ではＳＴＣ２遺伝子の発現を検出できたが、ＰＣＲ法では検体ＥのＳＴＣ２増幅産物が検出されたが、検体Ｄでは発現が検出されなかった。

以上の結果から、実施形態に従うプロモーターベクター内包脂質粒子使用した方法ではＰＣＲ法を用いるよりも正確に乳がん細胞の薬剤感受性についての情報が得られることが示された。

本発明の幾つかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これらの実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。以下に、本願発明の実施態様を付記する。
［１］ 腫瘍細胞群の特性を決定する方法であって、
脂質膜と、前記脂質膜に内包された第１核酸とを含む脂質粒子を前記腫瘍細胞群に接触させる接触工程（前記第１核酸は、前記特性を決定するためのマーカー遺伝子のプロモーター配列と、前記プロモーター配列の下流に機能可能に連結されたレポーター遺伝子とを有する）、
前記腫瘍細胞群を培養する培養工程、
前記腫瘍細胞群に含まれる各腫瘍細胞の、前記レポーター遺伝子から発現するレポータータンパク質からの信号の有無又は量を検出する検出工程、
前記検出工程の結果から、前記特性を有する前記腫瘍細胞の数を計測する計数工程
を含む方法。
［２］ 前記計数工程の結果から、前記腫瘍細胞群の前記特性の有無又は程度を決定する第１決定工程を更に含む、［１］に記載の方法。
［３］ 前記腫瘍細胞群は、対象の体内の腫瘍から採取されたものであり、
前記計数工程の結果から、前記対象の体内における前記腫瘍の前記特性の有無又は程度を決定する第２決定工程を更に含む、［１］に記載の方法。
［４］ 前記腫瘍細胞群は、対象の体内の腫瘍から採取されたものであり、
前記第１決定工程の結果から、前記対象の体内における前記腫瘍の前記特性の有無又は程度を決定する第２決定工程を更に含む、［２］に記載の方法。
［５］ 前記第１決定工程の結果及び／又は前記第２決定工程の結果に基づいて、前記対象に投与するための薬剤を選択する第３決定工程を更に含む、［４］に記載の方法。
［６］ 前記計数工程は、前記腫瘍細胞群に含まれる全腫瘍細胞の数を計測することを更に含み、
前記第１決定工程は、前記全腫瘍細胞の数及び前記特性を有する前記腫瘍細胞の数から前記特性を有する前記腫瘍細胞の存在率を算出し、前記存在率から、前記腫瘍細胞群の特性の有無又は程度を決定することを含む、
［２］、［４］又は［５］の何れか１項に記載の方法。
［７］ 前記第１核酸は、前記特性を決定するための第１～第ｎのマーカー遺伝子の各プロモーター配列（以下、「前記第１～第ｎのプロモーター配列」と称する）と、前記第１～第ｎのプロモーター配列の下流にそれぞれ機能可能に連結された第１～第ｎのレポーター遺伝子とを有し、前記第１～第ｎのプロモーター配列は互いに異なり、前記第１～第ｎのレポーター遺伝子は互いに異なり、前記ｎは２以上の自然数であり、
前記検出工程は、前記第１～第ｎのレポーター遺伝子からそれぞれ発現する第１～第ｎのレポータータンパク質からの第１～第ｎの信号をそれぞれ検出することを含み、
前記計数工程は、前記特性を有する前記腫瘍細胞の数を第１～第ｎの信号毎に個別に計測することを含む、
［１］～［６］の何れか１項に記載の方法。
［８］ 前記特性は、薬剤への感受性、予後、転移性又は浸潤性である、［１］～［７］の何れか１項に記載の方法。
［９］ 前記腫瘍細胞は乳がん細胞であり、前記特性は薬剤への感受性である、［８］に記載の方法。
［１０］ 前記薬剤はアントラサイクリン系薬剤、微小管作用薬、アルキル化薬、代謝拮抗薬、白金錯体、アロマターゼ阻害剤、ＬＨ－ＲＨアゴニスト製剤、抗エストロゲン薬、黄体ホルモン薬又は分子標的薬である、［９］に記載の方法。
［１１］ 前記薬剤はアントラサイクリン系薬剤であり、前記マーカー遺伝子はＴＯＰ２Ａ、ＲＡＲＡ、ＣＤＣ６、ＴＨＲＡ、ＧＳＤＭ１、ＰＳＭＤ３、ＣＳＦ３、ＭＥＤ２４、ＳＮＯＲＤ１２４、ＮＲ１Ｄ１、ＴＲＮＡＳＴＯＰ－ＵＣＡ、ＭＳＬ－１、ＣＡＳＣ３、ＲＡＰＧＥＦＬ１、ＷＩＰＦ２、ＬＯＣ１００１３１８２１、ＧＪＤ３、ＬＯＣ３９０７９１、ＬＯＣ７２８２０７、ＩＧＦＢＰ４、ＴＮＳ４、ＣＣＲ７又はＳＭＡＲＣＥ１である、［１０］に記載の方法。
［１２］ 前記薬剤はアロマターゼ阻害剤であり、前記マーカー遺伝子はＳＴＣ２、ＳＬＣ３９Ａ６、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、ＫＣＮＥ４、ＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２又はＴＲＩＭ２である、［１０］に記載の方法。
［１３］ 前記脂質膜は、式（Ｉ）の脂質：

及び／又は
式（ＩＩ）の脂質：

を含む、［９］～［１２］の何れか１項に記載の方法。
［１４］ 前記検出工程における信号の検出は経時的に行われる、［１］～［１３］の何れか１項に記載の方法。
［１５］ 少なくとも前記検出工程は、細胞培養検出デバイスを用いて行われ、
前記細胞培養検出デバイスは、二次元領域にマトリックス状に並ぶ複数のセンサ素子と、前記複数のセンサ素子と対向する光透過性の底部を有する試料収容部とを備える、
［１］～［１４］の何れか１項に記載の方法。
［１６］ 腫瘍細胞群の特性を決定するためのキットであって、
脂質膜と、前記脂質膜に内包された第１核酸とを含む脂質粒子（前記第１核酸は、前記特性を決定するためのマーカー遺伝子のプロモーター配列と、前記プロモーター配列の下流に機能可能に連結されたレポーター遺伝子とを有する）、及び
二次元領域にマトリックス状に並ぶ複数のセンサ素子と、前記複数のセンサ素子と対向する光透過性の底部を有する試料収容部とを備える細胞培養検出デバイスと、
を含むキット。
［１７］ 前記レポーター遺伝子から発現するレポータータンパク質からの信号を検出するための試薬を更に含む［１６］に記載のキット。
［１８］ 前記第１核酸は、前記特性を決定するための第１～第ｎのマーカー遺伝子の各プロモーター配列（以下、「前記第１～第ｎのプロモーター配列」と称する）と、前記第１～第ｎのプロモーター配列の下流にそれぞれ機能可能に連結された第１～第ｎのレポーター遺伝子とを有し、前記第１～第ｎのプロモーター配列は互いに異なり、前記第１～第ｎのレポーター遺伝子は互いに異なり、前記ｎは２以上の自然数である、
［１６］又は［１７］に記載のキット。
［１９］ 前記特性は、薬剤への感受性、予後、転移性又は浸潤性である、［１６］～［１８］の何れか１項に記載のキット。
［２０］ 前記腫瘍細胞は乳がん細胞であり、前記特性は薬剤への感受性である、［１９］に記載のキット。
［２１］ 前記薬剤はアントラサイクリン系薬剤、微小管作用薬、アルキル化薬、代謝拮抗薬、白金錯体、アロマターゼ阻害剤、ＬＨ－ＲＨアゴニスト製剤、抗エストロゲン薬、黄体ホルモン薬又は分子標的薬である、［２０］に記載のキット。
［２２］ 前記薬剤はアントラサイクリン系薬剤であり、前記マーカー遺伝子はＴＯＰ２Ａ、ＲＡＲＡ、ＣＤＣ６、ＴＨＲＡ、ＧＳＤＭ１、ＰＳＭＤ３、ＣＳＦ３、ＭＥＤ２４、ＳＮＯＲＤ１２４、ＮＲ１Ｄ１、ＴＲＮＡＳＴＯＰ－ＵＣＡ、ＭＳＬ－１、ＣＡＳＣ３、ＲＡＰＧＥＦＬ１、ＷＩＰＦ２、ＬＯＣ１００１３１８２１、ＧＪＤ３、ＬＯＣ３９０７９１、ＬＯＣ７２８２０７、ＩＧＦＢＰ４、ＴＮＳ４、ＣＣＲ７又はＳＭＡＲＣＥ１である、［２１］に記載のキット。
［２３］ 前記薬剤はアロマターゼ阻害剤であり、前記マーカー遺伝子はＳＴＣ２、ＳＬＣ３９Ａ６、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、ＫＣＮＥ４、ＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２又はＴＲＩＭ２である、［２１］に記載のキット。
［２４］ 前記脂質膜は、式（Ｉ）の脂質：

及び／又は
式（ＩＩ）の脂質：

を含む、［２０］～［２３］の何れか１項に記載のキット。
［２５］ ［１６］に記載のキットを用いて得られた、腫瘍細胞群に含まれる各腫瘍細胞の前記レポーター遺伝子から発現するレポータータンパク質からの信号の有無又は量から、前記特性を有する前記腫瘍細胞を計数し、前記計数の結果から前記腫瘍細胞の前記特性を決定する機能を実現するためのプログラム。
［２６］ 前記腫瘍細胞は乳がん細胞であり、前記特性は薬剤への感受性である、［２５］に記載のプログラム。

１…脂質粒子、２…脂質膜、３…第１核酸、５…プロモーター配列、
６…レポーター遺伝子、９…信号発生細胞、１０…細胞培養検出デバイス、
１１…試料収容部、１２…光学センサ、１３…底部、１５…細胞群、
１７…基板、１８…センサ素子、１９…センシング部、
３０…第１核酸、３１…第１プロモーター配列、３２…第１レポーター遺伝子、
３３…第１転写終結配列、３４…第２プロモーター配列、３５…第２レポーター遺伝子
３６…第２転写終結配列

Claims (21)

1. 乳がん細胞群の薬剤への感受性を決定する方法であって、
   脂質膜と、前記脂質膜に内包された第１核酸とを含む脂質粒子を前記乳がん細胞群に接触させる接触工程（前記第１核酸は、前記薬剤への感受性を決定するためのマーカー遺伝子のプロモーター配列と、前記プロモーター配列の下流に機能可能に連結されたレポーター遺伝子とを有する）、
   前記乳がん細胞群を培養する培養工程、
   前記乳がん細胞群に含まれる各乳がん細胞の、前記レポーター遺伝子から発現するレポータータンパク質からの信号の有無又は量を検出する検出工程、
   前記検出工程の結果から、前記薬剤への感受性を有する前記乳がん細胞の数を計測する計数工程
   を含む方法。
2. 前記計数工程の結果から、前記乳がん細胞群の前記薬剤への感受性の有無又は程度を決定する第１決定工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 脂質膜と、前記脂質膜に内包された第１核酸とを含む脂質粒子を、対象の体内の乳がんから採取された乳がん細胞群に接触させる接触工程（前記第１核酸は、前記薬剤への感受性を決定するためのマーカー遺伝子のプロモーター配列と、前記プロモーター配列の下流に機能可能に連結されたレポーター遺伝子とを有する）、
   前記乳がん細胞群を培養する培養工程、
   前記乳がん細胞群に含まれる各乳がん細胞の、前記レポーター遺伝子から発現するレポータータンパク質からの信号の有無又は量を検出する検出工程、
   前記検出工程の結果から、前記薬剤への感受性を有する前記乳がん細胞の数を計測する計数工程
   前記計数工程の結果と、予め定めた閾値、演算式及び／又は対応付けとに基づいて、プロセッサが、前記対象の体内における前記乳がんの前記薬剤への感受性の有無又は程度を決定する第２決定工程
   を含む、対象の体内に存在する乳がんの薬剤への感受性の決定を補助する情報を提供する方法。
4. 脂質膜と、前記脂質膜に内包された第１核酸とを含む脂質粒子を、対象の体内の乳がんから採取された乳がん細胞群に接触させる接触工程（前記第１核酸は、前記薬剤への感受性を決定するためのマーカー遺伝子のプロモーター配列と、前記プロモーター配列の下流に機能可能に連結されたレポーター遺伝子とを有する）、
   前記乳がん細胞群を培養する培養工程、
   前記乳がん細胞群に含まれる各乳がん細胞の、前記レポーター遺伝子から発現するレポータータンパク質からの信号の有無又は量を検出する検出工程、
   前記検出工程の結果から、前記薬剤への感受性を有する前記乳がん細胞の数を計測する計数工程、
   前記計数工程の結果と、予め定めた閾値、演算式及び／又は対応付けとに基づいて、プロセッサが、前記乳がん細胞群の前記薬剤への感受性の有無又は程度を決定する第１決定工程
   前記第１決定工程の結果と、予め定めた閾値、演算式及び／又は対応付けとに基づいて、プロセッサが、前記対象の体内における前記乳がんの前記薬剤への感受性の有無又は程度を決定する第２決定工程
   を含む、対象の体内に存在する乳がんの薬剤への感受性の決定を補助する情報を提供する方法。
5. 脂質膜と、前記脂質膜に内包された第１核酸とを含む脂質粒子を、対象の体内の乳がんから採取された乳がん細胞群に接触させる接触工程（前記第１核酸は、前記薬剤への感受性を決定するためのマーカー遺伝子のプロモーター配列と、前記プロモーター配列の下流に機能可能に連結されたレポーター遺伝子とを有する）と、
   前記乳がん細胞群を培養する培養工程と、
   前記乳がん細胞群に含まれる各乳がん細胞の、前記レポーター遺伝子から発現するレポータータンパク質からの信号の有無又は量を検出する検出工程と、
   前記検出工程の結果から、前記薬剤への感受性を有する前記乳がん細胞の数を計測する計数工程と、
   前記計数工程の結果と、予め定めた閾値、演算式及び／又は対応付けとに基づいて、プロセッサが、前記乳がん細胞群の前記薬剤への感受性の有無又は程度を決定する第１決定工程の結果、及び／又は前記乳がん細胞群からセンサにより得られた信号と、予め定めた閾値、演算式及び／又は対応付けとに基づいて、当該プロセッサが、前記対象の体内における前記乳がんの前記薬剤への感受性の有無又は程度を決定する第２決定工程の結果と、予め定めた閾値、演算式及び／又は対応付けとに基づいて、当該プロセッサが、前記対象に投与するための薬剤候補を選択する第３決定工程、
   を含む、対象に投与するための薬剤を選択することを補助する情報の提供する方法。
6. 前記計数工程は、前記乳がん細胞群に含まれる全乳がん細胞の数を計測することを更に含み、
   前記第１決定工程は、前記全乳がん細胞の数及び前記薬剤への感受性を有する前記乳がん細胞の数から前記薬剤への感受性を有する前記乳がん細胞の存在率を算出し、前記存在率から、前記乳がん細胞群の薬剤への感受性の有無又は程度を決定することを含む、
   請求項２、４又は５の何れか１項に記載の方法。
7. 前記第１核酸は、前記薬剤への感受性を決定するための第１～第ｎのマーカー遺伝子の各プロモーター配列（以下、「前記第１～第ｎのプロモーター配列」と称する）と、前記第１～第ｎのプロモーター配列の下流にそれぞれ機能可能に連結された第１～第ｎのレポーター遺伝子とを有し、前記第１～第ｎのプロモーター配列は互いに異なり、前記第１～第ｎのレポーター遺伝子は互いに異なり、前記ｎは２以上の自然数であり、
   前記検出工程は、前記第１～第ｎのレポーター遺伝子からそれぞれ発現する第１～第ｎのレポータータンパク質からの第１～第ｎの信号をそれぞれ検出することを含み、
   前記計数工程は、前記薬剤への感受性を有する前記乳がん細胞の数を第１～第ｎの信号毎に個別に計測することを含む、
   請求項１～６の何れか１項に記載の方法。
8. 前記薬剤はアントラサイクリン系薬剤、微小管作用薬、アルキル化薬、代謝拮抗薬、白金錯体、アロマターゼ阻害剤、ＬＨ－ＲＨアゴニスト製剤、抗エストロゲン薬、黄体ホルモン薬又は分子標的薬である、請求項１～７に記載の方法。
9. 前記薬剤はアントラサイクリン系薬剤であり、前記マーカー遺伝子はＴＯＰ２Ａ、ＲＡＲＡ、ＣＤＣ６、ＴＨＲＡ、ＧＳＤＭ１、ＰＳＭＤ３、ＣＳＦ３、ＭＥＤ２４、ＳＮＯＲＤ１２４、ＮＲ１Ｄ１、ＴＲＮＡＳＴＯＰ－ＵＣＡ、ＭＳＬ－１、ＣＡＳＣ３、ＲＡＰＧＥＦＬ１、ＷＩＰＦ２、ＬＯＣ１００１３１８２１、ＧＪＤ３、ＬＯＣ３９０７９１、ＬＯＣ７２８２０７、ＩＧＦＢＰ４、ＴＮＳ４、ＣＣＲ７又はＳＭＡＲＣＥ１である、請求項８に記載の方法。
10. 前記薬剤はアロマターゼ阻害剤であり、前記マーカー遺伝子はＳＴＣ２、ＳＬＣ３９Ａ６、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、ＫＣＮＥ４、ＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２又はＴＲＩＭ２である、請求項８に記載の方法。
11. 前記脂質膜は、式（Ｉ）の脂質：
    

    

    及び／又は
    式（ＩＩ）の脂質：
    

    

    を含む、請求項９～１２の何れか１項に記載の方法。
12. 前記検出工程における信号の検出は経時的に行われる、請求項１～１１の何れか１項に記載の方法。
13. 少なくとも前記検出工程は、細胞培養検出デバイスを用いて行われ、
    前記細胞培養検出デバイスは、二次元領域にマトリックス状に並ぶ複数のセンサ素子と、前記複数のセンサ素子と対向する光透過性の底部を有する試料収容部とを備える、
    請求項１～１２の何れか１項に記載の方法。
14. 乳がん細胞群の薬剤への感受性を決定するためのキットであって、
    脂質分子が非共有結合で配列して中空体を形成している脂質膜と、前記脂質膜に内包された第１核酸とを含む脂質粒子（前記第１核酸は、前記薬剤への感受性を決定するためのマーカー遺伝子のプロモーター配列と、前記プロモーター配列の下流に機能可能に連結されたレポーター遺伝子とを有する）、及び
    二次元領域にマトリックス状に並ぶ複数のセンサ素子と、前記複数のセンサ素子と対向する光透過性の底部を有する試料収容部とを備える細胞培養検出デバイスと、
    を含むキット。
15. 前記レポーター遺伝子から発現するレポータータンパク質からの信号を検出するための試薬を更に含む請求項１４に記載のキット。
16. 前記第１核酸は、前記薬剤への感受性を決定するための第１～第ｎのマーカー遺伝子の各プロモーター配列（以下、「前記第１～第ｎのプロモーター配列」と称する）と、前記第１～第ｎのプロモーター配列の下流にそれぞれ機能可能に連結された第１～第ｎのレポーター遺伝子とを有し、前記第１～第ｎのプロモーター配列は互いに異なり、前記第１～第ｎのレポーター遺伝子は互いに異なり、前記ｎは２以上の自然数である、
    請求項１４又は１５に記載のキット。
17. 前記薬剤はアントラサイクリン系薬剤、微小管作用薬、アルキル化薬、代謝拮抗薬、白金錯体、アロマターゼ阻害剤、ＬＨ－ＲＨアゴニスト製剤、抗エストロゲン薬、黄体ホルモン薬又は分子標的薬である、請求項１４～１６の何れか１項に記載のキット。
18. 前記薬剤はアントラサイクリン系薬剤であり、前記マーカー遺伝子はＴＯＰ２Ａ、ＲＡＲＡ、ＣＤＣ６、ＴＨＲＡ、ＧＳＤＭ１、ＰＳＭＤ３、ＣＳＦ３、ＭＥＤ２４、ＳＮＯＲＤ１２４、ＮＲ１Ｄ１、ＴＲＮＡＳＴＯＰ－ＵＣＡ、ＭＳＬ－１、ＣＡＳＣ３、ＲＡＰＧＥＦＬ１、ＷＩＰＦ２、ＬＯＣ１００１３１８２１、ＧＪＤ３、ＬＯＣ３９０７９１、ＬＯＣ７２８２０７、ＩＧＦＢＰ４、ＴＮＳ４、ＣＣＲ７又はＳＭＡＲＣＥ１である、請求項１７に記載のキット。
19. 前記薬剤はアロマターゼ阻害剤であり、前記マーカー遺伝子はＳＴＣ２、ＳＬＣ３９Ａ６、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、ＫＣＮＥ４、ＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２又はＴＲＩＭ２である、請求項１７に記載のキット。
20. 前記脂質膜は、式（Ｉ）の脂質：
    

    

    及び／又は
    式（ＩＩ）の脂質：
    

    

    を含む、請求項１４～１９の何れか１項に記載のキット。
21. 請求項１６に記載のキットを用いて得られた、乳がん細胞群に含まれる各乳がん細胞の前記レポーター遺伝子から発現するレポータータンパク質からの信号を光学センサに検知させ、
    前記光学センサからの信号の有無又は量から、前記薬剤への感受性を有する前記乳がん細胞を個数演算部に計数させ、
    前記計数の結果から前記乳がん細胞の前記薬剤への感受性をプロセッサに決定させる、
    ことを含む機能を実現して、前記乳がん細胞の前記薬剤への感受性を決定するプログラム。

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