WO2020122102A1 - 病変組織内への薬剤到達を予測する方法 - Google Patents

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WO2020122102A1
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哲暢 濱田
光博 林
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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting drug arrival in a diseased tissue.
  • biomarkers are diagnostic markers used for diagnosing disease, prognostic markers that predict the course of disease that does not depend on specific treatment, pharmacodynamic markers that check the mechanism of action of drugs, and predict the effects of specific treatment. Predictive markers, surrogate markers to replace the true endpoint of clinical trials, safety/toxicity markers to assess drug safety and toxicity, stratification to select patients expressing specific drug-related molecules There are markers, etc.
  • Patent Document 1 discloses that the presence or absence of depression in a subject is determined based on the expression profile of a depression marker gene, and then the type of depression is identified based on the expression profile of a stratified marker gene. Disclosure. Further, Patent Document 2 qualitatively and quantitatively selects a potential candidate protein/peptide biomarker from a proteome in a sample such as tissue, serum or plasma derived from a healthy or cancerous non-human mammal by a predetermined analysis.
  • the protein/peptide biomarker is selected from the affinity analysis of the selected candidate protein/peptide biomarker and the proteome in a sample such as a tissue derived from a healthy or cancerous human, serum, plasma, etc. It is disclosed that the peptide biomarker can be used to diagnose prostate cancer and stratify patients.
  • the effect may be weakened by the action of gastric acid or the like, or it may be metabolized by the liver or the like and the required amount may not reach the diseased tissue.
  • the barrier of affinity with the target cell affects the expression of the effect.
  • the drug that has reached the normal tissue is one of the causes of the side effect expression as an off-target.
  • non-target normal tissue
  • heart, brain, and lung are the cause of serious adverse effects, so the ratio of effective drug delivery to target and drug delivery to non-target is , Is considered to have important implications for optimal drug selection.
  • DDS drug delivery system
  • the present invention has been made in view of these circumstances, and provides a method of predicting the arrival of a drug at a target in a diseased tissue from information of a predetermined biomarker before administering the drug to a patient. It is an issue. Another object is to provide a method for screening a new drug that acts specifically on a lesion based on the prediction information.
  • Biomarker A which includes a step B of acquiring expression information of biomarker B derived from non-lesion cells adjacent to or in the vicinity of lesion cells in lesion tissue expressing biomarker A derived from lesion cells A method of predicting the arrival of a drug targeting erythrocyte into a diseased tissue.
  • a step A of obtaining expression information of a biomarker A derived from a diseased cell in a diseased tissue and a step B of obtaining expression information of a biomarker B derived from a non-lesioned cell adjacent to or in the vicinity of the diseased cell A method of predicting the arrival of a drug targeting the biomarker A into a diseased tissue, including the two expression information.
  • the biomarker A is at least one selected from the group consisting of an immune system protein expressed in cancer cells, a pathway system protein expressed in cancer cells, and a metastasis system protein expressed in cancer cells.
  • the biomarker B is a protein involved in Interferon signaling pathway, and at least one selected from the group consisting of BST2, OAS1, OAS2, OAS3, IFIT1, IFIT2, XAF1, clusterin, DCLK1 and MX1.
  • the biomarker according to any one of [1] to [6] which is based on the method for predicting the arrival of the drug targeting the biomarker A derived from the diseased cells in the diseased tissue into the diseased tissue. A method for screening a drug targeting A.
  • biomarker B derived from non-lesion cells adjacent to or in the vicinity of lesion cells.
  • a pharmaceutical composition comprising a drug targeting a biomarker A derived from a diseased cell in a diseased tissue, and the activity regulator according to [8].
  • the drug it is possible to predict that the drug reaches a target in the diseased tissue by acquiring and analyzing the expression information of the biomarker of the diseased tissue of the patient before administering the drug, and The therapeutic effect can be predicted. Further, the drug can be screened from the information that predicts the arrival of the drug. Moreover, by adjusting the activity of the biomarker B, the therapeutic effect of the drug can be enhanced.
  • FIG. 1 is an image photograph of a fluorescence image when a drug dynamics in a microenvironment of a living tissue is analyzed by micro-pharmacokinetics (PK).
  • FIG. 2A shows a PDX (patient differentiated xenograft) sample sample (No. 5), which was stained with hematoxylin and eosin (H&E) and stained with an anti-trastuzumab antibody labeled with high-intensity fluorescent nanoparticles (trastuzumab fluorescent nanoparticle staining).
  • H&E hematoxylin and eosin
  • 1 is a representative micrograph of No. 1 and No. 2).
  • FIG. 1 is an image photograph of a fluorescence image when a drug dynamics in a microenvironment of a living tissue is analyzed by micro-pharmacokinetics (PK).
  • FIG. 2A shows a PDX (patient differentiated xenograft) sample sample sample sample (No. 5), which was stained with
  • FIG. 2B is a graph showing the number of bright spots of high-brightness fluorescent nanoparticles per 100 ⁇ m 2 of the specimen labeled with the anti-trastuzumab antibody in the cancer cell region and the connective tissue region of each of the two specimen samples.
  • FIG. 3 shows the expression in the non-lesioned tissue adjacent to the region where the number of bright spots of the particles that reached the lesioned tissue in trastuzumab fluorescent nanoparticle staining in the trastuzumab-administered PDX sample sample (No. 2) was small (trastuzumab low-reaching region). It is the graph which showed the result of GO Term after GO analysis of the gene which is doing.
  • FIG. 3 shows the expression in the non-lesioned tissue adjacent to the region where the number of bright spots of the particles that reached the lesioned tissue in trastuzumab fluorescent nanoparticle staining in the trastuzumab-administered PDX sample sample (No
  • FIG. 4 is a graph showing the expression levels of major genes for the two GO Term in FIG.
  • FIG. 5 shows two types of CDX (Cell line-derivatized xenograft) sample samples (trastuzumab antibody labeled with high-intensity fluorescent nanoparticles (trastuzumab), anti-HER2 antibody (HER2) and anti-BST2 antibody (BST2), which were treated with two types of CDX (Cell line-derivated xenograft).
  • 1 is a representative photomicrograph of BT474 and HCC1954) and two PDX specimen samples (NO.1 and NO.2) when immunohistological observation was performed.
  • FIG. 6A and B are representative micrographs showing the relationship between trastuzumab arrival differences and BST2 expression differences.
  • FIG. 7A is a representative immunohistological observation of tumor tissue prepared from BST2 knockout cells and HCC1954 treated with anti-HER2 antibody, anti-BST2 antibody and anti-trastuzumab antibody labeled with high-intensity fluorescent nanoparticles. It is a micrograph.
  • FIG. 7B is a graph showing a quantitative value of trastuzumab arrival in the cells.
  • FIG. 8 is a graph showing the recurrence-free survival rate (%) of breast cancer patients depending on the difference in BST2 expression. The upper line shows the recurrence-free survival rate of patients with low BST2 expression, and the lower line shows the recurrence-free survival rate of patients with high BST2 expression.
  • the present invention includes a step B of obtaining expression information of a biomarker B derived from a non-lesion cell adjacent to or in the vicinity of a lesion cell in a lesion tissue in which the biomarker A derived from a lesion cell is expressed.
  • a method of predicting arrival of a drug targeting biomarker A to a target in a diseased tissue which comprises:
  • the “lesion tissue” is a tissue that generally changes with the onset or progression of a disease, and may include not only lesion cells but also normal cells such as interstitial cells.
  • the diseased tissue includes, for example, tumor tissue.
  • Tumor usually refers to malignant tumor, which is a malignant tumor that originates from epithelial cells such as skin, stomach, and intestinal mucosa (in cancer, cancer or carcinoma); muscle, fiber, bone, fat, blood vessel, nerve "Sarcoma” (sarcoma in English), which is a malignant tumor generated from non-epithelial cells; and includes leukemia and malignant lymphoma generated from hematopoietic organs.
  • tumors examples include cell tumors, melanomas, sarcomas, brain tumors, head and neck cancers, stomach cancers, lung cancers, breast cancers, liver cancers, colon cancers, cervical cancers, prostate cancers, bladder cancers, and the like. Includes cancer, leukemia, lymphoma, and multiple myeloma.
  • the biomarker A derived from diseased cells in diseased tissue is a biological substance such as a protein or nucleic acid that is specifically expressed in diseased cells in diseased tissue collected from a patient.
  • the biomarker A can be identified based on the mutation information of the gene analysis by performing a gene analysis of the lesion cell. Further, the biomarker A is not particularly limited as long as it is expressed in the diseased cells, and one kind of biomaterial may be selected to be the biomarker A, or two or more kinds of biomaterials may be selected. Alternatively, the biomarker A may be used.
  • the biomarker A is a nucleic acid
  • it is preferably various RNAs such as mRNA, tRNA, siRNA, non-cording-RNA derived from the genome of diseased cells or stroma, and miR21, miR34a, miR197, miR200, miR513.
  • miR-133a, miR-143, exosome micro-RNA (miR-181c, miR-27b), let-7a, miR-122, and iR4717 are preferred.
  • the biomarker A is preferably a cancer-related protein.
  • cancer-related proteins include immune system proteins expressed in cancer cells, pathway proteins expressed in cancer cells, and metastatic proteins expressed in cancer cells.
  • Various proteins are known as these cancer-related proteins, and an appropriate one can be selected according to the purpose of diagnosis or treatment, the action mechanism of the drug to be used, etc., and is not particularly limited.
  • the proteins encoded by the genes of the immune system (Immune) gene panel, the pathway system (Pathway) gene panel, and the metastasis system (Progression) gene panel included in the cancer-related gene expression panel provided by nCounter are respectively It corresponds to immune system proteins, pathway proteins, and metastasis proteins expressed in cancer cells.
  • mutant proteins corresponding to mutant genes of these genes can also be included in immune system proteins, pathway proteins, and transfer proteins.
  • immune system proteins expressed in cancer cells include immune checkpoint proteins CD40, TL1A, GITR-L, 4-188-L, CX4D-L, CD70, HHLA2, ICOS-L, CD85, CD86, CD80, MHC-II, PDL1, PDL2, VISTA, BTNL2, B7-H3, B7-H4, CD48, HVEM, CD40L, TNFRSF25, GITR, 4-188, OX40, CD27, TMIGD2, ICOS, CD28, TCR, LAG3, Examples thereof include CTLA4, PD1, CD244, TIM3, BTLA, CD160, LIGHT and the like.
  • pathway proteins expressed in cancer cells include cancer cell growth factor or cancer cell growth factor receptor EGFR (HER1), HER2, HER3, HER4, IGFR, HGFR; cell surface antigen, blood vessel growth Factor or vascular growth factor receptor VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-R, PlGF-1, PlGF-2; cytokine or cytokine receptor interferon, Interleukins, G-CSF, M-CSF, EPO, SCF, EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, TGF and the like can be mentioned.
  • metastasis proteins expressed in cancer cells include cancer metastasis markers ACTG2, ALDOA, APC, BRMS1, CADM1, CAMK2A, CAMK2B, CAMK2D, CCL5, CD82, CDKN1A, CDKN2A, CHD4, CNN1, CST7, CTSL, CXCR2, YBB, DCC, DENR, DLC1, EGLN2, EGLN3, EIF4E2, EIF4EBP1, ENO1, ENO2, ENO3, ETV4, FGFR4, GSN, HK2, HK3, HKDC1, HLA-DPB1, KSKIL, HUNKIL1.
  • LIFR LIFR, MED23, MET, MGAT5, MAP2K4, MT3, MTA1, MTBP, MTOR, MYCL, MYH11, NDRG1, NF2, NFKB1, NME1, NME4, NOS2, NR4A3, PDK1, PEBP4, PFKFB1, RPGK1, APFK4, PFKFB1, APFK4 RB1, RORB, SET, SLC2A1, SNRPF, SSTR2, TCEB1, TCEB2, TCF20, TF, TLR4, TNFSF10, TP53, TSHR, MMP, MMP2, MMP10, HIF1 and the like can be mentioned.
  • the biomarker B is a biological substance such as a protein or nucleic acid expressed in a non-lesion cell, which is adjacent to or in the vicinity of the lesion cell in the lesion tissue expressing the biomarker A, which is collected from a patient.
  • the “non-lesional cell adjacent to the lesion cell” means a non-lesion cell existing in direct contact with the lesion cell in the lesion tissue.
  • non-lesional cells in the vicinity of diseased cells means that in the pathogenic tissue, interstitial cells such as collagen fibers and reticulum fibers may be sandwiched between non-lesional cells and diseased cells.
  • the non-lesion cells include, for example, connective tissue, blood vessels, fibroblasts that form interstitium such as nerves, reticulum cells, histiocytes, plasma cells, endothelial cells, leukocytes (lymphocytes, monocytes, neutrophils, Eosinophils, basophils), adipocytes, mast cells and the like.
  • the biomarker B is not particularly limited as long as it is derived from non-lesion cells, and one kind of biomaterial may be selected to be the biomarker B, or two or more kinds of biomaterial may be selected. Alternatively, the biomarker B may be used.
  • the biomarker B is one of the ones showing the interaction with the non-lesioned tissue existing around the diseased tissue, which means that the influence around the diseased tissue is indirectly affected by the change of the diseased tissue. ..
  • the interaction is known, for example, a region having a large amount of biomarker A or a region having a small amount of biomarker A in the diseased tissue is identified from the result of detection of biomarker A by fluorescent nanoparticles, and biomarker B is extracted from the region. be able to.
  • the biomarker B when the biomarker B is involved in the signal transduction pathway, it affects the delivery of the drug targeting the biomarker A into the diseased tissue, and therefore the biomarker B is selected from the difference in the drug distribution in the diseased tissue. can do. That is, a region having a large amount of drug or a small amount of a drug targeting the biomarker A can be specified from the result of drug detection by fluorescent nanoparticles, and the biomarker B existing in the region can be extracted.
  • the method of extracting and identifying the biomarker B can be carried out by a method that suits the purpose. For example, tissue sections are obtained from diseased tissue by cryotome sectioning, multiple cells are isolated, and biomarkers A and B present in each cell and the administered drug are comprehensively quantified, followed by quantification of each cell. By reconstructing the values on the tissue, the biomarkers A and B on the tissue and the distribution of the drug can be obtained as an image image.
  • PK micro-pharmacokinetics
  • the biomarker B can be identified by, for example, identification based on mutation information in gene analysis. That is, it can be identified based on the mutation information of gene analysis using a sequencer or the like.
  • biomarkers B Approximately 80 types of biomarkers B derived from non-lesional cells identified in this way. As the biomarker B, a biomarker involved in Interferon signaling pathway is preferable, and BST2, OAS1, OAS2, OAS3, IFIT1, IFIT2, XAF1, clusterin, DCLK1 and MX1 are more preferable. Any of these can be selected and used for the purposes of the present invention.
  • BST2 (Bone marrow stromal antigen 2), also called CD317 (Tetherin), is a lipid raft-related protein expressed in bone marrow stromal cells. Upon detection of a virus or the like, the signal pathway is activated and its expression is increased. Virologically, BST2 is a human cellular protein that inhibits viral infection by preventing the spread of viral particles from infected cells. It is also said to be involved in cell-cell interactions such as cell adhesion and cell migration. From this, it also functions as a protein that stabilizes the lipid raft structure. OAS1, OAS2 and OAS3 are oligoadenylate synthases, which are induced by interferon.
  • IFIT1 and IFIT2 are induced by interferon and are involved in transport of mature mRNA and the like.
  • XAF1 is a protein that binds to an apoptosis inhibitor and suppresses the inhibitory effect.
  • Clusterin is a protein involved in apoptosis inhibition, lipid transport, hormone transport and the like.
  • DCLK1 is one of serine/threonine kinases and is considered to be involved in the calcium signal transduction pathway.
  • MX1 is a protein induced by interferon during viral infection.
  • Stromal cells are known as non-lesion cells contained in lesion tissue. Examples of proteins contained in stromal cells include stromal cell markers such as the following membrane proteins. Below, the specific example and main distribution of a stromal marker are described.
  • CD106 VCAM-1, INCAM-110)... Activated vascular endothelial cells, dendritic cells; CD109 (Platelet activation factor, 8A3, E123).
  • CD109 Platinum activation factor, 8A3, E123.
  • Activated T cell platelet, vascular endothelium, megakaryocyte, CD34+ progenitor cell subset; CD140a (PDGF-R, PDGFR2).
  • Fibroblasts megakaryocytes, monocytes, erythrocytes, myeloid progenitor cells, endothelial cells; CD140b (PDGF-R, PDGFR1)... Endothelial cells, stromal cells; CD141 (Thrombomodulin)...
  • Vascular endothelium myeloid cells, platelets, smooth muscle; CD142 (Tissue Factor (TF), Thromboblastin).
  • TF tissue Factor
  • Thromboblastin Epithelial cells, activated monocytes, activated vascular endothelium; CD143 (ACE: angiotensin converting enzyme).
  • vascular endothelium epithelial cells, activated macrophages; CD144 (VE-Cadherin, Cadherin-5)... vascular endothelium; CD145 (7E9, P7A5)... Endothelial cells; CD146 (MUC18, s-endo, Mel-CAM)...
  • Vascular endothelium activated T cells, melanoma; CD147 (Basigin, M6, EMMRRIN)... white blood cells, red blood cells, vascular endothelium, platelets; CD201 (EPCR: vascular endothelial cell protein C receptor)... vascular endothelium; CD202 (TIE2, TEK)... Vascular endothelium, hematopoietic stem cell subset; CD280 (Endo180, TEM22, uPARRAP (uPAR-associated protein))...
  • bone marrow progenitor cells fibroblasts, endothelial cell subsets, macrophage subsets; CD299 (DC-SIGN-related, L-SIGN (Liver/Lympho node specific ICAM3-grabbing nonintegrin)).
  • CD299 DC-SIGN-related, L-SIGN (Liver/Lympho node specific ICAM3-grabbing nonintegrin)).
  • CD309 Vascular endothermic growth factor receptor2 (Vascular endothermic growth factor receptor2), KDR).
  • Endothelial cells megakaryocytes, platelets, stem cell subsets
  • CD317 BST2, HM1.24)... Lipid raft CD322 (JAM2 (Junctional adhesion molecule 2)).
  • Endothelial cells monocytes, B cells, T cell subsets; CD331 (FGFR1 (Fibroblast growr receptor receptor 1)).
  • Fibroblasts epithelial cells
  • CD332 FGFR2, Keratinocyte growth factor receptor
  • Epithelial cells CD333 (FGFR3, JTK4)... Fibroblasts, epithelial cells; CD334 (FGFR4, JTK2, TKF).
  • Fibroblasts epithelial cells
  • CD339 Jagged-1, JAG1)... Stroma cells, epithelial cells.
  • the biomarker B is a nucleic acid
  • it is preferably various RNAs such as mRNA, tRNA, siRNA, non-coding-RNA derived from the genome in the stroma of the diseased tissue, and miR21, miR34a, miR197, miR200, miR513,
  • the miRNAs such as miR-133a, miR-143, exosome micro-RNA (miR-181c, miR-27b), let-7a, miR-122, and iR4717 are preferable.
  • the drug is not particularly limited, but a drug having an antitumor effect, cytotoxicity, antiangiogenic effect, or anti-inflammatory therapeutic activity is preferable, a molecular target drug is preferable, and a molecular target drug for cancer is particularly preferable. Is preferred. Among them, antibody drugs are particularly preferable.
  • Examples of the molecular targeting drug for cancer include, for example, afatinib, erlotinib, gefitinib, cetuximaz, which is an EGFR inhibitor, crizotinib which is an ALK inhibitor, labatinib which is an EGFR/HER2 inhibitor, and trastuzumab which is a HER2 inhibitor, Trastuzumab emtansine, bevatuzumab; angiogenesis inhibitors axitinib, sunitinib, sorafenib, vazovanib, regorafenib; mTOR inhibitors everolimus, temsirolimus; BCR-ABL inhibitors imatinib, membrane-differentiating drug, dasinib, nitinib, nitinib, nitinib Ibritumomab tiuxetan, ofatumumab, rituximab, brentuximab
  • the method for obtaining the expression information of the biomarker A is not particularly limited, but examples thereof include immunohistological analysis, gene analysis such as PCR, Northern blotting, DNA microarray, protein analysis such as ELISA, Western blotting, LC/MS and the like. Can be obtained by.
  • serial sections are cut from frozen or paraffin-embedded samples of diseased tissue obtained from the specimen, and a part of them is subjected to hematoxylin-eosin staining and Masson trichrome staining for morphological observation.
  • a sample is prepared, and a part of the sample is immunostained for biomarker A to prepare a specimen sample.
  • the DAB staining method utilizing the reaction between peroxidase and diaminobenzidine (DAB) is particularly preferable because it has excellent staining properties.
  • the biomarker A is labeled with an enzyme (peroxidase) and then the substrate, diaminobenzidine (DAB), is reacted to produce a dye, whereby the periphery of the biomarker A is stained brown. ..
  • the fluorescence imaging-drug analysis method is used to precisely analyze the drug distribution in the lesioned tissue expressing the biomarker A, and from the difference, the biomarker B in the non-lesioned tissue is detected.
  • the biomarker B can be discovered by applying it to a method for identifying.
  • Step B Acquisition of biomarker B expression information> (1)
  • the expression information of the biomarker B is obtained by the method for obtaining the expression information of the biomarker A described above. It is obtained by the same operation.
  • the diseased tissue is treated with a drug that targets biomarker A, and the difference in distribution due to the drug reaching the tissue is evaluated in detail.
  • a drug labeled with a fluorescent substance or the like it is preferable to treat the sample sample with a drug labeled with a fluorescent substance or the like, because the distribution of the drug reaching the tissue can be easily grasped by microscopic observation.
  • the fluorescent substance examples include rhodamine-based dye molecules, squarylium-based dye molecules, cyanine-based dye molecules, aromatic ring-based dye molecules, oxazine-based dye molecules, carbopyrronine-based dye molecules, pyrromethene-based dye molecules, Alexa Fluor (registered trademark, Invitrogen Dyestuff molecules, BODIPY (registered trademark, manufactured by Invitrogen) dyestuff molecules, Cy (registered trademark, manufactured by GE Healthcare) dyestuff molecules, DY dyestuff molecules (registered trademark, made by DYOMICS), HiLyte ( DyeLight (registered trademark, manufactured by Thermospec Scientific Co., Ltd.) type dye molecule, ATTO (registered trademark, manufactured by ATTO-TEC) type dye molecule, MFP (registered trademark, Mobitec) (Manufactured by K.K.) based fluorescent dyes such as dye molecules, fluorescent nanoparticles, and the like
  • a known method can be used for labeling the drug with the fluorescent substance. Further, in order to identify a region where non-lesion cells adjacent to or near the lesion tissue exist, the serial section used when preparing the sample sample of the drug distribution is subjected to, for example, hematoxylin-eosin staining. Of the regions in which the distribution region of the drug labeled with the fluorescent substance and the region where non-lesional cells are present are common, the region where the drug reaches relatively high is the drug high arrival region and the region where the drug is relatively low is the drug low region. The reach area.
  • the region is cut out from the specimen sample by a method such as microdissection, and the gene information expressed in the region is obtained using, for example, a DNA microarray or mRNA microarray.
  • GO Term roughly estimates the function of a gene expressed by GO analysis or the like.
  • the top two or three upregulated GO Term (hereinafter referred to as “high GO Term”) are selected, and the genes with a high expression rate are examined from each.
  • Genes that are highly expressed in common in each GO Term are designated as candidate biomarker B.
  • an effective amount of the drug is administered to a model animal or the like that forms the lesion tissue, and the lesion tissue is examined after a predetermined period.
  • a serial section cut out from the frozen sample of the diseased tissue collected is prepared, and the gene expressed in the drug high reaching region is analyzed in the same manner as described above.
  • the expression level of candidate biomarker B was affected by the drug administration targeting biomarker A. Is supposed to be.
  • biomarker A and candidate biomarker B In order to investigate the relationship between biomarker A and candidate biomarker B, for example, a specimen sample prepared from serial sections prepared by administering a drug to the above model animal is subjected to immunostaining for biomarker A and candidate biomarker B. .. Then, if the positive or negative correlation between the expression of the biomarker A and the expression of the candidate biomarker B can be confirmed by observing the same region with a microscope, the candidate biomarker B can be the target biomarker B. .. Further, the presence or absence of the relationship between the biomarker A and the candidate biomarker B can be examined by quantitatively measuring the expression levels of genes of both biomarkers, for example, mRNA.
  • the biomarker B is identified from the expression information of the biomarker B obtained by the method of step B. It is possible to predict in advance the arrival of the drug targeting the biomarker A into the tissue depending on whether it is strongly expressed or weakly expressed. Therefore, the expression information of the biomarker B can be obtained by, for example, gene polymorphism analysis or immune system. It is possible to obtain the prediction information of the in-tissue arrival of the drug targeting the biomarker A only by biological observation and obtaining the expression level of mRNA.
  • the expression information of the biomarker A by the step A is acquired to obtain the biomarker A. Identify the targeted drug.
  • the expression information of biomarker B obtained in step B is acquired, and the correlation between the arrival of the drug in the tissue and the expression of biomarker B is examined. Then, according to the correlation, it is possible to acquire the prediction information of the arrival of the drug targeting the biomarker A into the tissue from the strength of the expression of the biomarker B.
  • the strength level of the correlation of the level of the drug reaching the tissue in the involvement of the biomarker B is not particularly limited.
  • the biomarker B involved in the signal transduction pathway affects the delivery of the drug targeting the biomarker A into the diseased tissue. Therefore, in a diseased tissue in which a biomarker A derived from a diseased cell is expressed, a drug targeting the biomarker A by obtaining expression information of the biomarker B derived from a non-lesioned cell adjacent to or in the vicinity of the diseased cell described above. Based on the information that predicts the arrival of the biomarker in the diseased tissue, a drug targeting the biomarker A can be screened.
  • ⁇ Activity modifier and pharmaceutical composition> Another aspect of the present invention is an activity regulator that suppresses or promotes the activity of biomarker B involved in drug delivery in a pharmaceutical composition targeting biomarker A.
  • Another aspect of the present invention is a pharmaceutical composition containing the activity modifier.
  • the pharmaceutical composition can be in the form of various processed formulations. Examples include parenteral preparations such as drops, nasal drops, and injections. Further, the pharmaceutical composition may contain additives conventionally used in the pharmaceutical field. Such additives include, for example, antioxidants, coloring agents, suspending agents, etc., and can be added as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • Each cultured cancer cell line was trypsinized and then dispersed in PBS buffer, and an equal amount of Matrigel (registered trademark) (product number: 356231, manufactured by Corning) was added and stirred to obtain a cell suspension. ..
  • a part of the cell suspension was set aside and adjusted to 1.0 ⁇ 10 7 cells/100 ⁇ L to prepare a suspension for transplantation, which was used as a 4-week-old female immunodeficient mouse (SCID-Beige: CB17.Cg-PrkdcscidLystbg-J/CrlCrlj, purchased from Charles River Japan KK) was inoculated on the left flank.
  • trastuzumab (1 mg/kg or 10 mg/kg) or trastuzumab emtansine (10.2 mg/kg) was intraperitoneally administered when the inoculated cancer cells reached a size of 150-200 mm 3 . After a lapse of a predetermined time from the administration, the mouse was euthanized, and the cancer cells were collected and used as CDX samples of BT474 and HCC1954, respectively.
  • a cancer tissue (PDX) derived from a breast cancer patient is cut into fragments of 1 mm 3 or less, which are transplanted into a mammary fat pad of a 4-week-old female immunodeficient mouse (SCID-Beige). did.
  • the mouse was used as a first-generation transplanted mouse, and after the cancer tissue transplanted in the first-generation transplanted mouse increased to a predetermined size, this was transplanted into another immunodeficient mouse. This mouse was used as a second generation transplant mouse, and this transplant operation was repeated to produce a fourth generation transplant mouse.
  • Trastuzumab (1 mg/kg or 10 mg/kg) was intraperitoneally administered when the cancer cells inoculated into the fourth generation transplanted mice reached a size of 150 to 200 mm 3 . After a lapse of a predetermined time from the administration, the mouse was euthanized, the cancer cells were collected, and each mouse was given a No. 1 and No. Two animal model samples were used.
  • Example 1 ⁇ Acquisition of intra-organizational information of trastuzumab> (1) Fluorescent Staining Treatment with High-Brightness Fluorescent Nanoparticles
  • the specimen slides of the two PDXs (No. 1 and No. 2) prepared in Preparation Example 1 were each washed with PBS buffer to obtain high-intensity anti-trastuzumab antibody binding.
  • the connective tissue region that is, the non-lesioned tissue adjacent to the cancer cell region (FIG. 2A). It was shown that a large number of bright spots of trastuzumab fluorescent nanoparticles were observed in the "connective tissue region" therein (Fig. 2B).
  • the region of the sample containing a small amount of trastuzumab fluorescent nanoparticles was defined as a “trastuzumab low reaching region” and the region containing a large amount of trastuzumab fluorescent nanoparticles was defined as a “trastuzumab high reaching region”.
  • Example 2 ⁇ Acquisition of expression information of biomarker B> (1) Laser Microdissection In the PDX (NO. 2) sample prepared in Example 1, the portions of the trastuzumab high reaching region and the trastuzumab low reaching region were laser microdissection devices (trade name: LMD6500, Leica Microsystems). (Manufactured by Mitsui Chemicals Co., Ltd.) was used to cut out a high-attainment region section of trastuzumab and a low-attainment region of trastuzumab, and put it in a recovery microtube containing an RLT buffer solution attached to an RNA extraction kit to be described later for recovery.
  • RNA extraction kit “RNeasy (registered trademark) Micro Kit” (manufactured by QIAGEN) according to the instructions attached to the kit.
  • FIG. 4 shows the results of examining the expression level of mRNA in Type I interferon signalling and Response to virus, which were the most abundant among GO Term in FIG. The expression of BST2 mRNA was highest in all GO Term.
  • tissue section was permeabilized by incubating at room temperature for 1 hour with a permeabilizing solution (0.1% Triton (registered trademark) X and 5% goat serum in Tris-Buffer Saline (TBS) buffer). The tissue section was reacted overnight at 4° C. with an anti-HER2 rabbit monoclonal antibody (product number: 4290, manufactured by Cell Signaling Technology), which is a primary antibody diluted 100-fold with a diluent included with the product.
  • a permeabilizing solution 0.1% Triton (registered trademark) X and 5% goat serum in Tris-Buffer Saline (TBS) buffer.
  • TBS Tris-Buffer Saline
  • BZ-X710 (manufactured by Keyence Corporation) was used for observing the specimen sample for observation of HER2 and BST2, and NanoZoomer S60 (manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) was used for taking a fluorescent immunostaining image and a staining image for morphological observation. It was done using.
  • the sample sample for trastuzumab observation was observed in the same manner as in Example 1. The results are shown in Fig. 5. In FIG. 5, BST2 expression was very low in the BT474 sample, whereas HER2 expression was strong. On the other hand, in the PDX(NO.2) sample, BST2 expression was very strong, whereas HER2 expression was high.
  • biomarker B such as BST2 expressed in non-lesioned tissue was affected by the tumor tissue around the tumor tissue and showed a negative correlation with the expression of biomarker A such as HER2. Can be considered. It was also observed that the variation in the number of bright spots of trastuzumab in the tissue showed a negative correlation with the expression of BST2.
  • Example 4 ⁇ Trend of HER2 expression by BST2 knockout tumor cell-transplanted mouse> 100 nM OnTarget (registered trademark) siRNA designed to target BST2 or control siRNA (manufactured by Horizon Discovery) was introduced into HCC-1954-luciferase cells and cultured in RPMI-1640 medium. After culturing, the cells were treated with trypsin according to a conventional method and suspended in PBS buffer. Then, 1/10 amount of Matrigel (registered trademark) and 100 nM Accell (registered trademark) siRNA designed with BST2 as a target or control siRNA (manufactured by Horizon Discovery) was added to each to prepare a cell suspension. A cell suspension of 1.7 ⁇ 10 7 cells/100 ⁇ L was subcutaneously inoculated into the left flank of a 4-week-old female immunodeficient mouse (SCID-Beige).
  • SCID-Beige 4-week-old female immunodeficient mouse
  • trastuzumab (1 mg/kg or 10 mg/kg) was intraperitoneally administered when the cancer cells reached a size of 150 to 200 mm 3 . Mice were euthanized a predetermined time after administration, the cancer cells were collected, and a BST2 knockout tumor transplant model was prepared.
  • the PDX was used in the same manner as in Example 3 to prepare an observation sample sample for expressing HER2, and the morphology was observed. The results are shown in Fig. 7.
  • BST2KD BST2 knockout tumor transplant model
  • HCC1954 wild HCC1954 wild
  • the number of bright spots showing trastuzumab per cell was significantly larger than that of the control PDX (“Wild” in FIG. 7B). That is, it was shown that BST2 is involved in reaching trastuzumab into the cancer tissue.
  • trastuzumab becomes difficult to reach into the cancer tissue when the expression of BST2 is strong, regardless of the expression of HER2 which is one of biomarkers A. On the contrary, when the expression of BST2 was weak, it was shown that trastuzumab could easily reach the cancer tissue. Therefore, by examining the expression information of BST2, it is possible to predict the arrival of trastuzumab, whose target molecule is HER2, in the cancer tissue.
  • BST2 The recurrence-free survival rate due to the difference in BST2 expression was determined by the Kaplan-Meier method from the genome-wide microarray of 1809 breast cancer patients and survivor information obtained from Gene Expression Omnibus, and is shown in FIG. As a result, it was found that the stronger the expression of BST2 (lower graph in FIG. 8), the lower the survival rate, as compared with the case where BST2 expression was weak (upper graph in FIG. 8). From this fact and the results of Examples 1 to 4, BST2 can be used as a biomarker for estimating the treatment efficiency using trastuzumab, and the relationship between the tumor resistance mechanism and drug delivery can be clarified. It can be used for medicine.
  • the present invention has been completed from the analysis method of micro-PK analysis, which elucidates the quantification of biomarkers A and B existing in the diseased tissue and the molecular target drugs targeting biomarker A and their distribution. .. If the example of the analysis result shown in this specification is further considered, the result of the quantification and distribution analysis of the biomarker B will give the suggestion that the state of the lesion and the biomarker B are greatly related, Drugs that act to enhance or limit the function of biomarker B include the possibility of becoming drugs with effective drug efficacy.

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Abstract

薬剤を患者に投与する前に、薬剤の病変組織内への到達を予測する方法を提供する。　本発明は、病変細胞由来のバイオマーカーＡが発現している病変組織において、　病変細胞に隣接するもしくは近傍にある非病変細胞由来のバイオマーカーＢの発現情報を取得する工程Ｂを含む、バイオマーカーＡをターゲットとする薬剤の病変組織内への到達を予測する方法を含む。

Description

病変組織内への薬剤到達を予測する方法
　本発明は、病変組織内への薬剤到達を予測する方法に関する。
　従来の医療では、一般的な問診、身体所見および生化学検査などの診療情報に基づいて病名が確定すると、その病名に応じた治療薬が提供される。しかしながら、その際、患者個々の体質および遺伝的な相違により、患者に対して薬が有効の場合もあれば無効の場合もあり、ときには副作用が現れることもある。また、同じ病名であっても、疾患の状態は個々によって様々であるため、患者の体質に合わせた治療薬を適用することが好ましい。
　そんな中、医薬品の効果における個人差を考慮し、最適な医療を提供する個別化医療が普及しており、一般的な診断情報に加え、患者の遺伝的背景、生理的状態、疾患の状態などをバイオマーカーによって把握し、患者個々に適切な治療法が提供されつつある。
　バイオマーカーには目的に応じて、疾患の診断に用いる診断マーカー、特定の治療によらない疾患の経過を予測する予後マーカー、薬剤の作用機序をみる薬力学マーカー、特定の治療による効果を予測する予測マーカー、臨床試験の真のエンドポイントを代替する代替マーカー、薬剤の安全性や毒性を評価する安全性／毒性マーカー、薬剤に関連した特定の分子を発現している患者を選別する層別マーカーなどが存在している。
　標的分子が明確な場合、標的分子に対する層別マーカーを用いて患者を層別することができる。例えば、特許文献１は、うつ病マーカー遺伝子の発現プロファイルに基づいて被験者のうつ病に対する罹患の有無を判断し、その後層別マーカー遺伝子の発現プロファイルに基づいて、うつ病のタイプを同定することを開示している。また、特許文献２は、健康または癌の非ヒト哺乳類由来の組織、血清、血漿などのサンプル中のプロテオームから、所定の分析によって潜在的な候補タンパク質／ペプチドバイオマーカーを定性的、定量的に選択し、選択された候補タンパク質／ペプチドバイオマーカーと、健康または癌のヒト由来の組織、血清、血漿などのサンプル中プロテオームとの親和性解析などから、タンパク質／ペプチドバイオマーカーを選択し、該タンパク質／ペプチドバイオマーカーを用いて前立腺癌の診断や患者層別などを行えることを開示している。
　一方、病変組織に対する化学療法において、その効果が発揮される投与の条件として、感受性の高い薬剤を選択して該組織に十分に到達させることが必要である。しかし、薬の成分によっては、胃酸などの作用で効果が弱まり、または肝臓などで代謝されて必要な量が病変組織に届ない場合がある。その他、薬剤が吸収され全身循環後に標的組織に到達したとしても、標的細胞との親和性の障壁が効果発現に影響する。また、正常組織に到達した薬剤は、オフターゲットとしての副作用発現の原因のひとつである。
　オフターゲット（非標的）と言われる正常組織である心臓、脳、肺などにおける薬剤分布が重篤な有害作用の原因であるため、標的における効率的な薬剤デリバリーと非標的における薬剤デリバリーの比率が、最適な薬剤選択の上で重要な意味を示すと考えられる。
　これを解消するために、薬剤を病変組織へ効率よく送達させる技術が研究され、様々なドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）製剤が開発されている。しかし、例えば、膵がんやスキルス胃がんなどの難治がんに対しては、多くのＤＤＳ製剤は理想的な治療効果が得られていない。その一つの理由として、がん組織の周辺に正常組織由来の細胞が障壁となっており、特徴的に厚い間質組織・線維芽細胞などが形成されていることが挙げられる。多くのＤＤＳはこの間質を突破できず、がん組織周辺の血管近傍に留まり、がん組織内に送達できないことが明らかになっている（非特許文献１）。
特開２００５－３１２４３５号公報 特表２０１１－５２１２１５号公報
Ｎａｔｕｒｅ　Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．　２０１１（１２）：ｐｐ８１５－８２３．
　上述したように、疾患の治療に有効な薬剤や製剤を患者に投与しても、それらが標的の病変組織内部まで到達しないため、適切な効果が得られないことがある。そのため、適切な治療効果が得るため、薬剤の投与量を増やす、または別の薬剤に変更もしくは併用するなど、試行錯誤を重ねる必要があり、薬剤の副作用による身体的負担や長期間の治療継続などを患者に強いることなっている。そのため、予め病変組織内への薬剤到達を評価し、予測する方法としてバイオマーカーの利用が求められている。
　本発明は、こうした現状を鑑みてなされたものであり、薬剤を患者に投与する前に、所定のバイオマーカーの情報から薬剤の病変組織内の標的への到達を予測する方法を提供することを課題とする。また、該予測情報から病変に特異的に作用する新たな薬剤をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
　本発明は、上記課題を解決するため、以下の［１］～［８］の発明を含む。
［１］病変細胞由来のバイオマーカーＡが発現している病変組織において、病変細胞に隣接するもしくは近傍にある非病変細胞由来のバイオマーカーＢの発現情報を取得する工程Ｂを含む、バイオマーカーＡをターゲットとする薬剤の病変組織内への到達を予測する方法。
［２］病変組織における病変細胞由来のバイオマーカーＡの発現情報を取得する工程Ａと、病変細胞に隣接するもしくは近傍にある非病変細胞由来のバイオマーカーＢの発現情報を取得する工程Ｂとを含み、２つの発現情報から、バイオマーカーＡをターゲットとする薬剤の病変組織内への到達を予測する方法。
［３］前記病変組織ががん組織であり、病変細胞ががん細胞である［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記バイオマーカーＡが、がん細胞に発現する免疫系タンパク質、がん細胞に発現するパスウェイ系タンパク質およびがん細胞に発現する転移系タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記バイオマーカーＢが、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙに関与しているタンパク質であり、ＢＳＴ２、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＸＡＦ１、クラステリン、ＤＣＬＫ１およびＭＸ１からなる群より選択される少なくとも１つである、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記薬剤が分子標的薬である、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］［１］～［６］のいずれかに記載の、病変組織における病変細胞由来のバイオマーカーＡをターゲットとする薬剤の前記病変組織内への到達を予測する方法に基づき、前記バイオマーカーＡをターゲットとする薬剤をスクリーニングする方法。
［８］病変細胞に隣接するもしくは近傍にある非病変細胞由来のバイオマーカーＢの活性調整剤。
［９］病変組織における病変細胞由来のバイオマーカーＡをターゲットとする薬剤、および［８］に記載の活性調整剤を含む医薬組成物。
　本発明により、薬剤を投与する前に、患者の病変組織のバイオマーカーの発現情報を取得して解析することにより、該薬剤が該病変組織内の標的に到達することが予測できること、および薬剤の治療効果を予測することができる。また、該薬剤の到達を予測する情報から、該薬剤のスクリーニングを行うことができる。また、バイオマーカーＢの活性を調整することで、薬剤の治療効果を高めることができる。
図１は、ミクロ－ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ（ＰＫ）による生体組織の微小環境における薬剤動態を解析したときの蛍光画像のイメージ写真である。 図２Ａは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）、ならびに高輝度蛍光ナノ粒子で標識した抗トラスツズマブ抗体での染色（トラスツズマブ蛍光ナノ粒子染色）を行った、ＰＤＸ（ｐａｔｉｅｎｔ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）標本サンプル（Ｎｏ．１およびＮｏ．２）の代表的な顕微鏡写真である。図２Ｂは、各２つの標本サンプルの癌細胞領域および結合組織領域における上記抗トラスツズマブ抗体を標識した標本１００μｍ2当たりの高輝度蛍光ナノ粒子の輝点数を示したグラフである。 図３は、トラスツズマブ投与のＰＤＸ標本サンプル（Ｎｏ．２）の、トラスツズマブ蛍光ナノ粒子染色における病変組織内に到達した粒子の輝点数が少ない領域（トラスツズマブ低到達領域）に隣接する非病変組織において発現している遺伝子のＧＯ解析後のＧＯ　Ｔｅｒｍの結果を示したグラフである。 図４は、図３における２つのＧＯ　Ｔｅｒｍについて、主な遺伝子の発現度を示すグラフである。 図５は、高輝度蛍光ナノ粒子で標識した抗トラスツズマブ抗体（トラスツズマブ）、抗ＨＥＲ２抗体（ＨＥＲ２）および抗ＢＳＴ２抗体（ＢＳＴ２）で処理した、２種のＣＤＸ（Ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）標本サンプル（ＢＴ４７４およびＨＣＣ１９５４）ならびに２種のＰＤＸ標本サンプル（ＮＯ．１およびＮＯ．２）の、免疫組織学的観察を行ったときの代表的な顕微鏡写真である。 図６ＡおよびＢは、トラスツズマブ到達の差とＢＳＴ２発現の差との関係を示した代表的な顕微鏡写真である。 図７Ａは、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＢＳＴ２抗体および高輝度蛍光ナノ粒子で標識した抗トラスツズマブ抗体で処理した、ＢＳＴ２ノックアウト細胞およびＨＣＣ１９５４から作製した腫瘍組織の免疫組織学的観察を行ったときの代表的な顕微鏡写真である。図７Ｂは該細胞内へのトラスツズマブ到達の定量値を示すグラフである。 図８は、ＢＳＴ２の発現の違いによる乳がん患者の無再発生存率（％）を示したグラフである。上の線はＢＳＴ２の発現量が小さい患者の、下の線はＢＳＴ２の発現量が大きい患者の、それぞれ無再発生存率を示している。
　以下に、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、上述したように、病変細胞由来のバイオマーカーＡが発現している病変組織において、病変細胞に隣接するもしくは近傍にある非病変細胞由来のバイオマーカーＢの発現情報を取得する工程Ｂを含む、バイオマーカーＡをターゲットとする薬剤の病変組織内の標的への到達予測の方法の発明である。
　＜病変組織＞
　本発明において「病変組織」とは、一般的に疾患の発症や進行に伴い変化する組織であり、病変細胞だけでなく、その周辺の間質などの正常細胞も含まれ得ることもある。病変組織には、例えば、腫瘍組織が含まれる。腫瘍は、通常は悪性腫瘍を指し、皮膚や胃、腸の粘膜など上皮性細胞から発生した悪性腫瘍である「癌」（英語ではｃａｎｃｅｒまたはｃａｒｃｉｎｏｍａ）；筋肉、線維、骨、脂肪、血管、神経など非上皮性細胞から発生した悪性腫瘍である「肉腫」（英語ではｓａｒｃｏｍａ）；造血臓器から発生した白血病や悪性リンパ腫などを包含する。
　腫瘍としては、例えば、細胞腫瘍、黒色腫、肉腫、脳腫瘍、頭頸部がん、胃がん、肺がん、乳がん、肝がん、大腸がん、子宮頸がん、前立腺がん、膀胱がんなどの固形がん、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫などが挙げられる。
　＜バイオマーカー＞
　（バイオマーカーＡ）
　病変組織における病変細胞由来のバイオマーカーＡは、患者から採取した病変組織中の病変細胞に特異的に発現しているタンパク質や核酸などの生体物質である。バイオマーカーＡは該病変細胞の遺伝子解析を行い、遺伝子解析の変異情報に基づいて特定することが出来る。また、バイオマーカーＡは、病変細胞で発現しているものであれば特に限定されるものではなく、１種類の生体物質を選択してバイオマーカーＡとよいし、２種類以上の生体物質を選択してバイオマーカーＡとしてもよい。
　前記バイオマーカーＡが核酸である場合、病変細胞または間質中のゲノム由来のｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｎｏｎ－ｃｏｒｄｉｎｇ－ＲＮＡなどの各種ＲＮＡであることが好ましく、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ３４ａ、ｍｉＲ１９７、ｍｉＲ２００、ｍｉＲ５１３、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１４３、ｅｘｏｓｏｍａｌ　ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ（ｍｉＲ－１８１ｃ、ｍｉＲ－２７ｂ）、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－１２２、ｉＲ４７１７などのｍｉＲＮＡであることが好ましい。
　病変組織ががん組織である場合、バイオマーカーＡはがん関連タンパク質であることが好ましい。がん関連タンパク質としては、例えば、がん細胞に発現する免疫系タンパク質、がん細胞に発現するパスウェイ系タンパク質、がん細胞に発現する転移系タンパク質が挙げられる。これらがん関連タンパク質には様々なタンパク質が知られており、診断もしくは治療の目的、または使用する薬剤の作用機序などに応じて、適切なものを選択することができ、特に限定されない。例えば、ｎＣｏｕｎｔｅｒが提供するがん関連遺伝子発現パネルに含まれる、免疫系（Ｉｍｍｕｎｅ）遺伝子パネル、パスウェイ系（Ｐａｔｈｗａｙ）遺伝子パネル、転移系（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）遺伝子パネルの遺伝子がコードしているタンパク質が、それぞれがん細胞に発現する免疫系タンパク質、パスウェイ系タンパク質、転移系タンパク質に該当する。また、これらの遺伝子の変異遺伝子に対応する変異タンパク質も、免疫系タンパク質、パスウェイ系タンパク質、転移系タンパク質に含むことができる。
　がん細胞に発現する免疫系タンパク質としては、例えば、免疫チェックポイントタンパク質であるＣＤ４０、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲ－Ｌ、４－１８８－Ｌ、ＣＸ４Ｄ－Ｌ、ＣＤ７０、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＭＨＣ－ＩＩ、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＮＬ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ４８、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ、４－１８８、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＴＭＩＧＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、ＴＣＲ、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＣＤ２４４、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＬＩＧＨＴなどが挙げられる。
　がん細胞に発現するパスウェイ系タンパク質としては、例えば、がん細胞増殖因子あるいはがん細胞増殖因子受容体であるＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＧＦＲ、ＨＧＦＲ；細胞表面抗原、血管増殖因子あるいは血管増殖因子受容体であるＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＶＥＧＦ－Ｒ、ＰｌＧＦ－１、ＰｌＧＦ－２；サイトカインあるいはサイトカイン受容体であるインターフェロン、インターロイキン、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＳＣＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦなどが挙げられる。
　がん細胞に発現する転移系タンパク質としては、例えば、がん転移マーカーであるＡＣＴＧ２、ＡＬＤＯＡ、ＡＰＣ、ＢＲＭＳ１、ＣＡＤＭ１、ＣＡＭＫ２Ａ、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＣＡＭＫ２Ｄ、ＣＣＬ５、ＣＤ８２、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＨＤ４、ＣＮＮ１、ＣＳＴ７、ＣＴＳＬ、ＣＸＣＲ２、ＹＢＢ、ＤＣＣ、ＤＥＮＲ、ＤＬＣ１、ＥＧＬＮ２、ＥＧＬＮ３、ＥＩＦ４Ｅ２、ＥＩＦ４ＥＢＰ１、ＥＮＯ１、ＥＮＯ２、ＥＮＯ３、ＥＴＶ４、ＦＧＦＲ４、ＧＳＮ、ＨＫ２、ＨＫ３、ＨＫＤＣ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＵＮＫＩＬ１１、ＫＤＭ１Ａ、ＫＩＳＳ１、ＬＤＨＡ、ＬＩＦＲ、ＭＥＤ２３、ＭＥＴ、ＭＧＡＴ５、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＴ３、ＭＴＡ１、ＭＴＢＰ、ＭＴＯＲ、ＭＹＣＬ、ＭＹＨ１１、ＮＤＲＧ１、ＮＦ２、ＮＦＫＢ１、ＮＭＥ１、ＮＭＥ４、ＮＯＳ２、ＮＲ４Ａ３、ＰＤＫ１、ＰＥＢＰ４、ＰＦＫＦＢ１、ＰＦＫＦＢ４、ＰＧＫ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＴＧ１、ＲＢ１、ＲＯＲＢ、ＳＥＴ、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＮＲＰＦ、ＳＳＴＲ２、ＴＣＥＢ１、ＴＣＥＢ２、ＴＣＦ２０、ＴＦ、ＴＬＲ４、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＰ５３、ＴＳＨＲ、ＭＭＰ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ１０、ＨＩＦ１などが挙げられる。
　（バイオマーカーＢ）
　バイオマーカーＢは、患者から採取した上記バイオマーカーＡが発現している病変組織中の病変細胞に隣接するもしくは近傍にある、非病変細胞に発現しているタンパク質や核酸などの生体物質である。本発明において、「病変細胞に隣接する非病変細胞」とは、病変組織内において病変細胞と直接接触して存在する非病変細胞を意味する。また、「病変細胞の近傍にある非病変細胞」とは病原組織内で、非病変細胞と病変細胞との間に膠原線維や細網線維などの細胞間質を挟んでいてもよいことを意味し、例えば、病変細胞から１００μｍ以内に存在する非病変細胞を意味する。非病変細胞としては、例えば、結合組織、血管、神経などの間質を構成する線維芽細胞、細網細胞、組織球、形質細胞、内皮細胞、白血球（リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球）、脂肪細胞、肥満細胞などが挙げられる。またバイオマーカーＢは、非病変細胞に由来しているものであれば特に限定されるものではなく、１種類の生体物質を選択してバイオマーカーＢとよいし、２種類以上の生体物質を選択してバイオマーカーＢとしてもよい。
　バイオマーカーＢは、病変組織周辺に存在する非病変組織との相互作用を示すものの一つであり、このことは病変組織の変化に伴う病変組織周辺への影響を間接的に被ることを意味する。相互作用が既知の場合には、例えば、病変組織中のバイオマーカーＡの多い領域あるいは少ない領域を、蛍光ナノ粒子によるバイオマーカーＡの検出の結果から特定し、その領域からバイオマーカーＢを抽出することができる。
　また、バイオマーカーＢがシグナル伝達経路に関与する場合は、上記バイオマーカーＡを標的とする薬剤の病変組織中のデリバリーに影響することから、バイオマーカーＢは病変組織中の薬剤分布の違いから選択することができる。すなわち、バイオマーカーＡを標的とする薬剤の多い領域あるいは少ない領域を、蛍光ナノ粒子による薬剤検出の結果から特定し、その領域に存在するバイオマーカーＢを抽出できる。
　このようなバイオマーカーＢの抽出・同定方法は、目的にかなう方法で実施することができる。たとえば病変組織からＣｒｙｏｔｏｍｅ　Ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇによって組織切片を得て、複数の細胞を単離し、それぞれの細胞に存在するバイオマーカーＡおよびＢ、ならびに投与された薬剤を網羅的に定量し、ついで各々の細胞の定量値を組織上へ再構成していくことで、組織上のバイオマーカーＡおよびＢ、ならびに薬剤の分布をイメージ画像として得ることができる。
　このような目的にかなう方法としては、例えば、ミクロ－ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ（ＰＫ）と呼ばれる解析方法があり、マクロ－ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓでは解析できない目的物の組織中の微小環境における薬物動態を詳細に知ることができる有用な手法である。（図１参照）。
　バイオマーカーＢの同定は、例えば遺伝子解析の変異情報に基づく特定により可能である。すなわちシーケンサーなどを用いて、遺伝子解析の変異情報に基づいて同定することが出来る。
　このようにして特定された、非病変細胞に由来するバイオマーカーＢは約８０種類に及ぶ。バイオマーカーＢとしては、Iｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙに関与するバイオマーカーが好ましく、ＢＳＴ２、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＸＡＦ１、クラステリン、ＤＣＬＫ１およびＭＸ１がより好ましい。これらのいずれかを選択して、本発明の目的に使用することができる。
　ＢＳＴ２（Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｒｏｍａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ　２）は、ＣＤ３１７（Ｔｅｔｈｅｒｉｎ）とも呼ばれ骨髄間質細胞に発現している脂質ラフト関連タンパク質である。ウィルスなどの検出により、シグナル経路が活性化されて発現上昇が認められる。ウィルス学的には、ＢＳＴ２は、感染細胞からウィルス粒子の拡散を防止することから、ウィルス感染を阻害するヒト細胞タンパク質である。また、細胞接着および細胞移動などの細胞間相互作用に関与すると言われている。このことから、脂質ラフト構造を安定化させるタンパク質としても機能している。ＯＡＳ１、ＯＡＳ２およびＯＡＳ３は、オリゴアデニル酸合成酵素であり、インターフェロンによって誘導される。ＩＦＩＴ１およびＩＦＩＴ２は、インターフェロンによって誘導され、成熟ｍＲＮＡなどの輸送に関与している。ＸＡＦ１はアポトーシス阻害剤に結合し、阻害効果を抑制するタンパク質である。クラステリンは、アポトーシスの阻害、脂質輸送、ホルモン輸送などに関与しているタンパク質である。ＤＣＬＫ１はセリン／スレオニンキナーゼの一つで、カルシウムシグナル伝達経路に関与していると考えられている。ＭＸ１は、ウィルス感染時にインターフェロンによって誘導されるタンパク質である。
　病変組織中に含まれる非病変細胞としては、間質細胞が知られている。間質細胞に含まれるタンパク質としては、例えば、間質細胞マーカーである、以下に示すような膜タンパク質が挙げられる。以下に、間質マーカーの具体例および主な分布について記載する。
　ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ－１、ＩＮＣＡＭ－１１０）…活性化血管内皮細胞、樹状細胞；
　ＣＤ１０９（Ｐｌａｔｅｌｅｔ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ、　８Ａ３、　Ｅ１２３）…活性化Ｔ細胞、血小板、血管内皮、巨核球、ＣＤ３４＋前駆細胞サブセット；
　ＣＤ１４０ａ（ＰＤＧＦ－Ｒ、　ＰＤＧＦＲ２）…線維芽細胞、巨核球、単球、赤血球、骨髄系前駆細胞、内皮細胞；
　ＣＤ１４０ｂ（ＰＤＧＦ－Ｒ、　ＰＤＧＦＲ１）…内皮細胞、ストローマ細胞；
　ＣＤ１４１（Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）…血管内皮、骨髄系細胞、血小板、平滑筋；
　ＣＤ１４２（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ（ＴＦ）、　Ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ）…上皮細胞、活性化単球、活性化血管内皮；
　ＣＤ１４３（ＡＣＥ：　アンジオテンシン転換酵素）…血管内皮、上皮細胞、活性化マクロファージ；
　ＣＤ１４４（ＶＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、　Ｃａｄｈｅｒｉｎ－５）…血管内皮；
　ＣＤ１４５（７Ｅ９、　Ｐ７Ａ５）…内皮細胞；
　ＣＤ１４６（ＭＵＣ１８、　ｓ－ｅｎｄｏ、Ｍｅｌ－ＣＡＭ）…血管内皮、活性化Ｔ細胞、黒色腫；
　ＣＤ１４７（Ｂａｓｉｇｉｎ、　Ｍ６、　ＥＭＭＲＲＩＮ）…白血球、赤血球、血管内皮、血小板；
　ＣＤ２０１（ＥＰＣＲ：血管内皮細胞プロテインＣレセプター）…血管内皮；
　ＣＤ２０２（ＴＩＥ２、ＴＥＫ）…血管内皮、造血幹細胞サブセット；
　ＣＤ２８０（Ｅｎｄｏ１８０、ＴＥＭ２２、ｕＰＡＲＡＰ（ｕＰＡＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ））…骨髄前駆細胞、線維芽細胞、内皮細胞サブセット、マクロファージサブセット；
　ＣＤ２９９（ＤＣ－ＳＩＧＮ－ｒｅｌａｔｅｄ、　Ｌ－ＳＩＧＮ（Ｌｉｖｅｒ／Ｌｙｍｐｈｏ　ｎｏｄｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＩＣＡＭ３－ｇｒａｂｂｉｎｇ　ｎｏｎｉｎｔｅｇｒｉｎ））…内皮細胞；
　ＣＤ３０９（ＶＥＧＦＲ２（　Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ２）、　ＫＤＲ）…内皮細胞、巨核球、血小板、幹細胞サブセット；
　ＣＤ３１７（ＢＳＴ２、ＨＭ１．２４）…脂質ラフト
　ＣＤ３２２（ＪＡＭ２（Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　２））…内皮細胞、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞サブセット；
　ＣＤ３３１（ＦＧＦＲ１（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ１））…線維芽細胞、上皮細胞；
　ＣＤ３３２（ＦＧＦＲ２、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）…上皮細胞；
　ＣＤ３３３（ＦＧＦＲ３、　ＪＴＫ４）…線維芽細胞、上皮細胞；
　ＣＤ３３４（ＦＧＦＲ４、ＪＴＫ２、　ＴＫＦ）…線維芽細胞、上皮細胞；
　ＣＤ３３９（Ｊａｇｇｅｄ－１、　ＪＡＧ１）…ストローマ細胞、上皮細胞。
　バイオマーカーＢが核酸である場合、病変組織の間質中のゲノム由来のｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｎｏｎ－ｃｏｒｄｉｎｇ－ＲＮＡなどの各種ＲＮＡであることが好ましく、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ３４ａ、ｍｉＲ１９７、ｍｉＲ２００、ｍｉＲ５１３、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１４３、ｅｘｏｓｏｍａｌ　ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ（ｍｉＲ－１８１ｃ、ｍｉＲ－２７ｂ）、ｌｅｔ－７ａ、ｍｉＲ－１２２、ｉＲ４７１７などのｍｉＲＮＡであることが好ましい。
　＜薬剤＞
　薬剤は、特に限定されるものではないが、抗腫瘍効果、細胞傷害性能、抗血管形成効果、または抗炎症治療活性を有する薬剤が好ましく、分子標的薬が好ましく、特にがん用の分子標的薬であることが好ましい。その中でも、抗体医薬がとくに好ましい。
　がん用の分子標的薬としては、例えば、ＥＧＦＲ阻害剤であるアファチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、セツキシマズ、バニツムマズ；ＡＬＫ阻害剤であるクリゾチニブ；ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２阻害剤であるラバチニブ；ＨＥＲ２阻害剤であるトラスツズマブ、トラスツズマブ　エムタンシン、ベバツズマブ；血管新生阻害剤であるアキシチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、バゾバニブ、レゴラフェニブ；ｍＴＯＲ阻害剤であるエベロリムス、テムシロリムス；ＢＣＲ－ＡＢＬ阻害剤であるイマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ；膜状分化抗原標的薬であるイブリツモマブチウキセタン、オファツムマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ　ベドチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、モガムリズマブ；ヒト化ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（ハーセプチン）に細胞毒性物質エムタンシンを結合させたトラスツズマブ　エムタンシン（商品名；カドサイラ（Ｋａｄｏｃｙｌａ））、抗ＣＤ３０モノクローナル（マウスヒトキメラ）抗体に微小管阻害薬のモノメチルアウリスタチンＥが結合したブレンツキシマブ　ベドチン（商品名；アドセトリス（Ａｄｃｅｔｒｉｓ））、ゲムツズマブオゾガマイシン（商品名；マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）である抗体－薬物複合体などが挙げられる。また、抗体に結合される薬剤は、上記に限定されない。
　＜工程Ａ：バイオマーカーＡの発現情報の取得方法＞
　バイオマーカーＡの発現情報の取得方法は、特に制限されないが、例えば、免疫組織学的解析や、ＰＣＲ、ノーザンブロッテイング、ＤＮＡマイクロアレイなどの遺伝子解析、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、ＬＣ／ＭＳなどのタンパク質解析によって取得することができる。
　免疫組織学的解析法では、検体から所得した病変組織の凍結サンプルまたはパラフィン包埋サンプルなどから連続切片を切り出し、一部をヘマトキシリン－エオシン染色およびマッソントリクローム染色などを行って形態観察用の標本サンプルを作製し、一部をバイオマーカーＡに対する免疫染色を行った標本サンプルを作製する。２つの標本サンプルの顕微鏡観察を比較し、病変組織の病変細胞由来のバイオマーカーＡの発現の強弱を取得することができる。
　免疫染色を行う場合、ペルオキシダーゼとジアミノベンジジン（ＤＡＢ）との反応を利用するＤＡＢ染色法は、染色性に優れるため特に好ましい。ＤＡＢ染色法を用いる場合、バイオマーカーＡを酵素（ペルオキシダーゼ）で標識した後、基質であるジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を反応させて色素を生じさせることにより、バイオマーカーＡの周辺は褐色に染色される。
　従来の免疫組織学的解析法では、バイオマーカーＡを標的とする薬剤の組織内への到達は、ミクロレベルの解析が必要であるため、予測するのが困難である。しかし、本発明の方法により、蛍光イメージング－薬剤解析手法を利用して、バイオマーカーＡが発現している病変組織での薬剤分布を精密に解析し、その違いから非病変組織におけるバイオマーカーＢを見出すことができる。すなわち、従来の病変組織ならびに非病変組織の相互解析では半定量のレベルであった生物学的な特性を、本発明の方法では、薬剤投与後の薬剤分布の観察から、さらに病変組織の多様性を識別する手法に応用することでバイオマーカーＢを発見することができる。
　＜工程Ｂ：バイオマーカーＢの発現情報の取得＞
　（１）バイオマーカーＡを標的とする薬剤の組織内への到達とバイオマーカーＢの発現との相関関係が既知の場合
　バイオマーカーＢの発現情報は、上記バイオマーカーＡの発現情報の取得方法と同様の操作によって取得する。
　（２）バイオマーカーＡを標的とする薬剤の組織内への到達とバイオマーカーＢの発現との相関関係が未知の場合
　前記バイオマーカーＡを標的とする薬剤の組織内への到達と相関関係があるバイオマーカーＢを後述のようにしてスクリーニングしたあとに、上記（１）同様に発現情報を取得する。
　バイオマーカーＢのスクリーニングは、まず、バイオマーカーＡを標的とする薬剤で病変組織を処理し、薬剤の組織内への到達による分布の違いを詳細に評価する。該評価には、標本サンプルを蛍光物質などで標識した薬剤で処理することが、薬剤の組織内への到達による分布を顕微鏡観察で容易に把握できる点で好ましい。蛍光物質としては、例えば、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＤＹ系色素分子（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ－ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子などの蛍光色素、または蛍光ナノ粒子などが挙げられ、特に蛍光ナノ粒子が高輝度の点で好ましい。薬剤を該蛍光物質で標識する方法は、公知の手法を用いることができる。また、病変組織と隣接するもしくは近傍する非病変細胞が存在する領域を特定するため、上記薬剤分布の標本サンプル作製時に使用した連続切片を、例えば、ヘマトキシリン－エオシン染色を行う。上記蛍光物質で標識した薬剤の分布領域と、非病変細胞が存在する領域とが共通する領域のうち、薬剤の到達が相対的に高い領域を薬剤高到達領域、相対的に少ない領域を薬剤低到達領域とする。
　次いで、該領域をマイクロダイセクションなど手法により該標本サンプルから切り出し、当該領域中に発現している遺伝子情報を、例えば、ＤＮＡマイクロアレイやｍＲＮＡマイクロアレイなどを用いて取得する。取得した遺伝子情報から、例えば、ＧＯ解析などによってどのような機能を持った遺伝子が発現しているかを、ＧＯ　Ｔｅｒｍによって大まかに推測する。このうち、ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅされた上位の２、３のＧＯ　Ｔｅｒｍ（以下、「高ＧＯ　Ｔｅｒｍ」という）を選択し、その中から発現の割合が高い遺伝子をそれぞれ調べる。各ＧＯ　Ｔｅｒｍで共通して高く発現している遺伝子を、候補バイオマーカーＢとする。
　続いて、候補バイオマーカーＢと、バイオマーカーＡをターゲットとする薬剤との関連性を調べるため、該病変組織を形成するモデル動物などに該薬剤を有効量投与し、所定の期間後に該病変組織を採取する。採取した病変組織の凍結サンプルから切り出した連続切片を作製し、前記同様に、薬剤高到達領域に発現している遺伝子を解析する。その結果、先の高ＧＯ　Ｔｅｒｍと、今回の高ＧＯ　Ｔｅｒｍでｐ－Ｖａｌｕｅが増減した場合には、候補バイオマーカーＢは、バイオマーカーＡをターゲットとする薬剤投与によって発現量が影響を受けたものであると推測される。
　バイオマーカーＡと候補バイオマーカーＢとの関連性を調べるため、例えば、上記モデル動物に薬剤投与して調製した連続切片から作製した標本サンプルを、バイオマーカーＡおよび候補バイオマーカーＢに対する免疫染色を行う。その後、顕微鏡により同領域を観察し、バイオマーカーＡの発現と候補バイオマーカーＢの発現に正負いずれかの相関関係が確認できた場合、候補バイオマーカーＢを目的のバイオマーカーＢとすることができる。また、バイオマーカーＡと候補バイオマーカーＢとの関連性の有無は、両バイオマーカーの遺伝子、例えば、ｍＲＮＡの発現量を定量的に測定することで調べることができる。
　＜薬剤到達の予測情報の取得＞
　バイオマーカーＡを標的とする薬剤の組織内への到達とバイオマーカーＢの発現との相関関係が既知の場合は、工程Ｂの方法により得られたバイオマーカーＢの発現情報から、バイオマーカーＢが強く発現した場合または弱く発現した場合のいずれかによって、バイオマーカーＡを標的とする薬剤の組織内への到達予測が予めできるため、バイオマーカーＢの発現情報を例えば、遺伝子多型解析、免疫組織学的観察、ｍＲＮＡの発現量を取得するだけで、バイオマーカーＡを標的とする薬剤の組織内到達の予測情報を取得することができる。
　また、バイオマーカーＡを標的とする薬剤の組織内への到達とバイオマーカーＢの発現との相関関係が未知の場合は、まず、工程ＡによるバイオマーカーＡの発現情報を取得しバイオマーカーＡを標的とする薬剤を特定する。次に、工程ＢによるバイオマーカーＢの発現情報を取得し、該薬剤の組織内への到達とバイオマーカーＢの発現との相関関係を調べる。その後、該相関関係に従って、バイオマーカーＢの発現の強弱からバイオマーカーＡを標的とする薬剤の組織内への到達予測情報を取得することができる。なお、バイオマーカーＡを標的とする薬剤であっても、バイオマーカーＢの関与において薬剤の組織内への到達レベルの相関関係の強弱レベルは、特に制限されない。
　＜薬剤のスクリーニング＞
　上述したように、シグナル伝達経路に関与するバイオマーカーＢは、バイオマーカーＡを標的とする薬剤の病変組織中のデリバリーに影響を与える。そのため、病変細胞由来のバイオマーカーＡが発現している病変組織において、上述した病変細胞に隣接または近傍する非病変細胞由来のバイオマーカーＢの発現情報を取得し、バイオマーカーＡをターゲットとする薬剤の前記病変組織内への到達を予測する情報に戻づいて、バイオマーカーＡをターゲットとする薬剤をスクリーニングすることができる。
　＜活性調整剤および医薬組成物＞
　本発明の別の態様は、バイオマーカーＡをターゲットとする医薬組成物における薬物送達に関与するバイオマーカーＢの活性を抑制または促進する活性調整剤である。また、本発明の別の態様は、該活性調整剤を含む医薬組成物である。医薬組成物は、種々の加工製剤の形態とすることができる。例えば、点滴剤、点鼻剤および注射剤などの非経口投与製剤が挙げられる。さらに、該医薬組成物は、医薬分野において慣用の添加剤を含んでいてもよい。そのような添加剤には、例えば、抗酸化剤、着色剤、懸濁化剤などがあり、本発明の効果を損なわない限り配合することができる。
　本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
　［作製例１］
　＜病変組織モデルサンプルの調製＞
　（１）ＣＤＸサンプルの調製
　ヒト乳がん細胞株のＢＴ－４７４、ＨＣＣ１９５４はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。ＢＴ４７４とＨＣＣ１９５４は、１０％Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）と１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて培養した。
　培養した各がん細胞株をトリプシン処理した後にＰＢＳバッファーに分散し、ここに等量のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（製品番号：３５６２３１、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を加えて撹拌して細胞懸濁液とした。該細胞懸濁液の一部を取り分け、１．０×１０7個／１００μＬとなるように調製して移植用懸濁液とし、これを４週齢のメスの免疫不全マウス（ＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅ：ＣＢ１７．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＬｙｓｔｂｇ－Ｊ／ＣｒｌＣｒｌｊ、日本チャールズ・リバー株式会社より購入）の左わき腹に接種した。接種したがん細胞が１５０～２００ｍｍ3の大きさに達したときにトラスツズマブ（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）またはトラスツズマブ　エムタンシン（１０．２ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。投与して所定の時間経過後に、マウスを安楽死させ、該がん細胞を採取して、それぞれＢＴ４７４およびＨＣＣ１９５４のＣＤＸサンプルとした。
　（２）動物モデルサンプルの調製
　乳がん患者由来のがん組織（ＰＤＸ）を１ｍｍ3以下の断片に切り分け、これを４週齢のメスの免疫不全マウス（ＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅ）の乳房脂肪パッド中に移植した。該マウスを第一世代移植マウスとし、第一世代移植マウスに移植したがん組織が所定の大きさに増大した後、これを別の免疫不全マウスに移植した。該マウスを第二世代移植マウスとし、この移植操作を繰り返して第四世代移植マウスを作製した。第四世代移植マウスに接種したがん細胞が１５０～２００ｍｍ3の大きさに達したときにトラスツズマブ（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。投与して所定の時間経過後にマウスを安楽死させ、該がん細胞を採取して、それぞれＮｏ．１およびＮｏ．２の動物モデルサンプルとした。
　（３）標本スライドの作製
　上記で作製した、２種のＣＤＸサンプルＢＴ４７４およびＨＣＣ１９５４、ならびに２種のＰＤＸサンプル（Ｎｏ．１およびＮｏ．２）それぞれを凍結組織包埋剤で包埋し、液体窒素／ｎ－ヘキサンで凍結させ、各凍結ブロックを作製した、各凍結ブロックを、クライオミクロトーム（製品コード：ＣＭ１９５０、Ｌｅｉｃａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、厚さ８μｍにスライスした凍結連続切片をそれぞれ作製し、スライドグラスに貼り付けた。この切片を４％パラホルムアルデヒドの固定液に３分間浸して固定した後、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅの氷冷水に１分間浸してＯＣＴコンパウンドを除去した。その後、ＴＢＳに溶解させた０．３％過酸化水素を用いて内在性ペルオキシダーゼのブロッキングを行い、各標本スライドを作製した。
　［実施例１］
　＜トラスツズマブの組織内到達情報の取得＞
　（１）高輝度蛍光ナノ粒子による蛍光染色処理
　作製例１で作製した２種のＰＤＸ（Ｎｏ．１およびＮｏ．２）の標本スライドをそれぞれＰＢＳバッファーで洗浄し、抗トラスツズマブ抗体が結合した高輝度蛍光ナノ粒子（コニカミノルタ株式会社製、以下「トラスツズマブ蛍光ナノ粒子」という）を、希釈液（カゼイン：ＢＳＡ＝５％）を用いて０．０２ｎＭに希釈したものを滴下し、中性のｐＨ環境下（ｐＨ６．９～７．４）において室温で３時間反応させ、トラスツズマブ蛍光ナノ粒子染色処理を行った。
　（２）形態観察用染色
　蛍光染色処理を行った標本スライドを、常法に従いヘマトキシリン液（富士フィルム和光純薬工業株式会社製）およびエオシン液（富士フィルム和光純薬工業株式会社製）を用いて５分間染色してヘマトキシリン－エオシン染色を行ったあと、４５℃の流水で３分間洗浄した。
　（３）封入処理
　染色を終えた標本スライドに対して、純エタノールに５分間浸漬する操作を４回行う固定化・脱水処理を行った。続いて、キシレンに５分間浸漬する操作を４回行う透徹処理を行った。その後、標本に封入剤「エンテランニュー」（メルク社製）を載せて、カバーガラスを被せて封入処理を行い、観察用標本とした。
　（４）観察および撮影
　蛍光観察および画像撮影には、ＢＸ６３蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社製）を用いた。まず、トラスツズマブ蛍光ナノ粒子に含まれるテキサスレッドに対応する励起光を観察用標本に照射して蛍光を発光させ、その状態で免疫染色像を撮影した。この際、励起光は励起光用光学フィルターを用いて５７５～６００ｎｍに設定し、観察する波長は、蛍光用光学フィルターを用いて６１２～６９２ｎｍに設定した。結果を図２に示した。図２より、いずれの標本においても、がん細胞領域すなわち病変組織内（図２Ａ中の「癌細胞領域」）に比べ、結合組織領域すなわちがん細胞領域に隣接する非病変組織内（図２Ａ中の「結合組織領域」）にトラスツズマブ蛍光ナノ粒子の輝点が数多く観察されることが示された（図２Ｂ）。標本におけるトラスツズマブ蛍光ナノ粒子が少ない領域を「トラスツズマブ低到達領域」とし、トラスツズマブ蛍光ナノ粒子が多い領域を「トラスツズマブ高到達領域」とした。
　［実施例２］
　＜バイオマーカーＢの発現情報の取得＞
　（１）レーザーマイクロダイセクション
　実施例１で調製したＰＤＸ（ＮＯ．２）の標本において、トラスツズマブ高到達領域とトラスツズマブ低到達領域の部分を、レーザーマイクロダイセクション装置（商品名：ＬＭＤ６５００、Ｌｅｉｃａ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、トラスツズマブ高到達領域切片およびトラスツズマブ低到達領域切片を切り出し、後述するＲＮＡ抽出キット付属のＲＬＴ緩衝液が入った回収用マイクロチューブに入れて回収した。
　（２）ｍＲＮＡの抽出
　切り出した各切片のｍＲＮＡを、ＲＮＡ抽出キット「ＲＮｅａｓｙ（登録商標）　Ｍｉｃｒｏキット」（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてキット付属の説明書に従って行った。
　（３）マイクロアレイおよびＧＯ解析
　抽出したｍＲＮＡは、ヒト遺伝子発現量マイクロアレイチップ「ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ　Ｇ３　Ｈｕｍａｎ　ＧＥ　マイクロアレイ　８ｘ６０Ｋ」（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに委託してマイクロアレイ解析を行った。データ解析は、Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ　ｓｏｆｔｗｅｒｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて行い、データマイニング（アノテーション）はＤａｔａｂａｓｅ　ｆｏｒ　Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ、　Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　（ＤＡＶＩＤ）　ｖ６．８を用いて行った。その後、トラスツズマブ高到達領域において、トラスツズマブ低到達領域に比べて１．５倍多いまたは０．６７倍小さく発現していた４４２個の遺伝子について、遺伝子オントロジー解析（ＧＯ解析）を行った。結果を図３に示す。図３のＧＯ　Ｔｅｒｍの中で最も多かった、Ｔｙｐｅ　Ｉ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇおよびＲｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｖｉｒｕｓにおけるｍＲＮＡの発現度を調べた結果を図４に示す。いずれのＧＯ　Ｔｅｒｍにおいても、ＢＳＴ２のｍＲＮＡの発現が一番多かった。
　［実施例３］
　ＨＥＲ２およびＢＳＴ２の発現、ならびにトラスツズマブの組織内到達情報との関係性を検討すべく、以下のようにして各情報を取得した。
　＜ＨＥＲ２の発現情報の取得＞
　（１）一次抗体処理
　上記作製例１で作製した２種のＣＤＸサンプルＢＴ４７４、ＨＣＣ１９５４、および２種のＰＤＸサンプル（Ｎｏ．１およびＮｏ．２）の各標本スライドの各組織切片を、以下のようにして免疫染色を行った。
　各組織切片を、透過処理液（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘおよび５％ヤギ血清　ｉｎ　Ｔｒｉｓ－Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）バッファー）を用いて室温で１時間インキュベートして透過処理した。組織切片を、製品付属の希釈液で１００倍希釈した一次抗体である抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（製品番号：４２９０、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と４℃で一晩反応させた。
　（２）二次抗体処理
　反応させた組織切片をＴＢＳバッファーで洗浄した後、二次抗体（製品番号：８１１４、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と組織切片を室温で反応させた。組織切片をＴＢＳバッファーで洗浄した後、組織切片にＤＡＢ基質（製品番号：８０５９、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を加えて発色させた。
　（３）封入処理
　上記染色を終えた標本スライドを、常法に従いエタノールを用いて脱水処理を行った。その後、標本スライドをキシレンに浸漬させて透徹処理を行った。最後に、封入剤「エンテランニュー」を載せて、カバーガラスを被せる封入処理を行い、観察用標本サンプルとした。
　＜ＢＳＴ２発現情報の取得＞
　各観察用標本サンプルの組織切片を、上記ＨＥＲ２の免疫染色と同様にして、抗ＢＳＴ２マウスモノクローナル抗体（製品番号：５５７３５５、ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて一次染色を行った。その後、上記と同様にして二次抗体処理および封入処理を行い、観察用標本サンプルとした。
　＜トラスツズマブの組織内到達情報の取得＞
　実施例１と同様にして、各観察用標本サンプルの組織切片をトラスツズマブ蛍光ナノ粒子によって染色、封入処理を行った。
　＜観察および撮影＞
　上記ＨＥＲ２とＢＳＴ２の観察用標本サンプルの観察には、ＢＺ－Ｘ７１０（株式会社キーエンス製）を用い、蛍光免疫染色像および形態観察用染色像の撮影にはＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ　Ｓ６０（浜松ホトニクス株式会社製）を用いて行った。トラスツズマブ観察用標本サンプルは実施例１と同様にして観察を行った。結果を図５に示した。図５中、ＢＴ４７４標本サンプルでは、ＢＳＴ２の発現は非常に低いのに対しＨＥＲ２の発現は強く、一方、ＰＤＸ（ＮＯ．２）標本サンプルでは、ＢＳＴ２の発現は非常に強いのに対し、ＨＥＲ２の発現は弱い傾向が見られた。このことは、非病変組織中に発現するＢＳＴ２のようなバイオマーカーＢが、腫瘍組織周辺にあって腫瘍組織の影響を受け、ＨＥＲ２のようなバイオマーカーＡの発現と負の相関性を示したと考察できる。また、組織内のトラスツズマブの輝点数の変動が、ＢＳＴ２の発現と負の相関を示すことが観察された。
　さらに図１に示すコンセプトで、ｍｉｃｒｏ　ｉｍａｇｉｎｇを実施した。その結果、ＰＤＸ（ＮＯ．１）の標本サンプルから、ＢＳＴ２の発現が相対的に強い領域（図６Ａ）ではどの領域においても、トラスツズマブの組織内への到達度が低く（輝点数が少なく）、ＢＳＴの発現が相対的に低い領域（図６Ｂ）ではどの領域においても、トラスツズマブの組織内への到達度が高い（輝点数が多い）ことが確認された。ところで、ｍｉｃｒｏ　ｉｍａｇｉｎｇにおいて、ＰＤＸ（ＮＯ．１）の標本サンプルとＰＤＸ（ＮＯ．２）の標本サンプルにおいてＨＥＲ２の発現をいくつかの領域で観察したところ、トラスツズマブの組織内への到達度と明確な相関がみられないことが確認された。このことは、本発明を達成する過程でｍｉｃｒｏ　ｉｍａｇｉｎｇが必須になる可能性を示唆している。
　［実施例４］
　＜ＢＳＴ２ノックアウト腫瘍細胞移植マウスによるＨＥＲ２発現の動向＞
　ＢＳＴ２をターゲットにデザインされた１００ｎＭのＯｎＴａｒｇｅｔ（登録商標）ｓｉＲＮＡまたはコントロールのｓｉＲＮＡ（Ｈｏｒｉｚｏｎ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ製）をＨＣＣ－１９５４－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞に遺伝子導入し、ＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて培養した。培養後、該細胞を常法に従ってトリプシン処理しＰＢＳバッファー中に懸濁した。その後、１／１０量のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）とＢＳＴ２をターゲットにデザインされた１００ｎＭのＡｃｃｅｌｌ（登録商標）ｓｉＲＮＡまたはコントロールのｓｉＲＮＡ（Ｈｏｒｉｚｏｎ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ製）をそれぞれ加えて細胞懸濁液を調製した。１．７×１０7個／１００μＬの細胞懸濁液を、４週齢のメスの免疫不全マウス（ＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅ）の左わき腹の皮下へ接種した。
　接種して約１週間経過後、がん細胞が１５０～２００ｍｍ3の大きさに達したときに、トラスツズマブ（１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。投与して所定の時間経過後に、マウスを安楽死させ、該がん細胞を採取して、ＢＳＴ２ノックアウト腫瘍移植モデルを作製した。
　該ＰＤＸを実施例３と同様にしてＨＥＲ２発現用の観察用標本サンプルを調製し、形態観察を行った。結果を図７に示す。ＢＳＴ２ノックアウト腫瘍移植モデル（図７中、「ＢＳＴ２ＫＤ」）では、ＢＳＴ２の発現が抑制されてＨＥＲ２の強い発現は変化しないことが観察されたのに対して、コントロールＰＤＸ（図７Ａ中、「ＨＣＣ１９５４ｗｉｌｄ」）では、ＢＳＴ２の発現が減少し、抗ＨＥＲ２薬であるトラスツズマブの組織内送達が抑制されていることが観察された。また、ＢＳＴ２ノックアウト腫瘍移植モデルでは、コントロールＰＤＸ（図７Ｂ中、「Ｗｉｌｄ」）に比べて、細胞１個当たりのトラスツズマブを示す輝点数が有意に大きかった。すなわち、ＢＳＴ２がトラスツズマブのがん組織内への到達に関与していることが示された。
　以上の実施例１～４の結果から、ＢＳＴ２の発現が強い場合、バイオマーカーＡの一つであるＨＥＲ２の発現に関わらず、トラスツズマブはがん組織内へ到達しにくくなることが示された。反対に、ＢＳＴ２の発現が弱い場合、トラスツズマブはがん組織内へ到達しやすくなることが示された。従って、ＢＳＴ２の発現情報を調べることで、ＨＥＲ２を標的分子とするトラスツズマブのがん組織内への到達を予測することができる。
　［参考例］
　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｏｍｎｉｂｕｓから得られた１８０９人の乳がん患者のゲノムワイドマイクロアレイおよび生存者情報から、ＢＳＴ２の発現の違いよる無再発生存率をカプランマイヤー法によって求め、図８に示した。その結果、ＢＳＴ２の発現が弱い場合（図８の上グラフ）に比べ、ＢＳＴ２の発現が強い程（図８の下グラフ）生存率が低くなることを見出した。このことと、実施例１～４の結果から、ＢＳＴ２はトラスツズマブを用いた治療効率を見積もるバイオマーカーとして利用でき、また、腫瘍耐性機構と薬物送達の関係を明らかにすることができ、新たな創薬の場面に利用することが出来る。
　また、本発明は、病変組織内に存在するバイオマーカーＡおよびＢ、ならびにバイオマーカーＡを標的とする分子標的薬の定量とそれらの分布を解明する、ｍｉｃｒｏ－ＰＫ　ａｎａｌｙｓｉｓの解析手法などから完成した。本明細書に示した解析結果の一例についてさらに考察するならば、バイオマーカーＢの定量および分布解析の結果は、病変の状態とバイオマーカーＢとが大きく関わっていることの示唆を与えており、バイオマーカーＢの機能を強化あるいは制限するように働く薬剤は有効な薬効を有する医薬品となりうる可能性を含んでいる。

Claims (9)

  1. 　病変細胞由来のバイオマーカーＡが発現している病変組織において、
    　病変細胞に隣接するもしくは近傍にある非病変細胞由来のバイオマーカーＢの発現情報を取得する工程Ｂを含む、バイオマーカーＡをターゲットとする薬剤の病変組織内への到達を予測する方法。
  2. 　病変組織における病変細胞由来のバイオマーカーＡの発現情報を取得する工程Ａと、病変細胞に隣接するもしくは近傍にある非病変細胞由来のバイオマーカーＢの発現情報を取得する工程Ｂとを含み、２つの発現情報から、バイオマーカーＡをターゲットとする薬剤の病変組織内への到達を予測する方法。
  3. 　前記病変組織ががん組織であり、病変細胞ががん細胞である請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記バイオマーカーＡが、がん細胞に発現する免疫系タンパク質、がん細胞に発現するパスウェイ系タンパク質およびがん細胞に発現する転移系タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記バイオマーカーＢが、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙに関与しているタンパク質であり、ＢＳＴ２、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＸＡＦ１、クラステリン、ＤＣＬＫ１およびＭＸ１からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記薬剤が分子標的薬である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の、病変組織における病変細胞由来のバイオマーカーＡをターゲットとする薬剤の前記病変組織内への到達を予測する方法に基づき、前記バイオマーカーＡをターゲットとする薬剤をスクリーニングする方法。
  8. 　病変細胞に隣接するもしくは近傍にある非病変細胞由来のバイオマーカーＢの活性調整剤。
  9. 　病変組織における病変細胞由来のバイオマーカーＡをターゲットとする薬剤、および請求項８に記載の活性調整剤を含む医薬組成物。
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