CN101402682A - 一种氟乙酸钠毒物人工抗原的合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种氟乙酸钠毒物人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以氟乙酸钠为半抗原，用碳二亚胺法将其与载体蛋白BSA偶联，用电泳测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了氟乙酸钠毒物的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对其研究的需要。
Description
技术领域
一种氟乙酸钠毒物人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
氟乙酸钠，英文名称：sodium fluoroacetate，CAS号62-74-8，分子式为C2H2FNaO2，分子量：100.020，是由氯乙酰胺与氟化钾作用，生成氟乙酰胺，再加烧碱水解而制得。曾用作杀鼠剂。其为白色粉末，熔点200℃(分解)，易溶于水和有机溶剂，化学性能稳定。其对人畜极毒，急性口服LD50(mg/kg)：0.22(褐家鼠)，8.0(小家鼠)，0.65(长爪沙鼠)，0.06(狗)，毒饵使用浓度0.1％～0.3％。由于其对人和动物毒性太强、药力发作快，又具有二次毒性，中国已明令禁产和禁用。但由于其生产工艺简单、价格低廉、灭鼠效果直观，一些不法分子仍将其制成各种杀鼠药在市场上销售，致使透毒、自杀及误服中毒时有发生。近年来国内外对其检测的方法报道较多，从较为简单的化学显色法、薄层色谱法到后来发展的气相色谱法、液相色谱法等等，但是这些检测方法很难实现对毒物进行快速、准确的检测；有必要研究快速、便携的免疫检测技术——ELISA。这就需要合成能产生簇特异性抗体的免疫原，设计合成以氟乙酸钠为半抗原的用于氟乙酸钠毒物检测的完全抗原。
发明内容
本发明的目的是提供一种氟乙酸钠毒物人工抗原的合成方法。所制备的产品用于氟乙酸钠毒物的免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。
本发明的技术方案：一种氟乙酸钠毒物的人工抗原的合成方法，以氟乙酸钠为半抗原，用碳二亚胺(EDC)法将其与载体蛋白BSA偶联，用SDS-PAGE电泳测定偶联物的偶联比。其反应方程式为：
(1)人工抗原的合成：氟乙酸钠、碳二亚胺、牛血清蛋白以摩尔比为100∶10∶2的比例反应，首先让氟乙酸钠、牛血清蛋白室温下反应10min，充分溶解后逐滴加入碳二亚胺室温下搅拌反应3h，即得人工抗原混合液；
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的pH 7.4、0.01M的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：氟乙酸钠-牛血清蛋白；
(2)人工抗原的鉴定：氟乙酸钠-牛血清蛋白采用电泳测定其偶联比，凝胶电泳法是依据合成的人工抗原的分子量比载体蛋白分子量的增加来确定偶联比。
本发明的有益效果：本发明成功合成了氟乙酸钠人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
附图说明
图1氟乙酸钠、BSA及其偶联物的红外扫描组合图。
图2BSA及其偶联物的电泳图。1、低分子量标准蛋白Mark，2、BSA，3、人工抗原。
具体实施方式
实施例1
(1)人工抗原的制备
氟乙酸钠(0.1mmol)，牛血清白蛋白(0.002mmol)溶于4mL PBS(0.01mol/L)溶液中，充分溶解后逐滴加入150μL(0.01mmol)的DEC，室温下搅拌反应3h，即得人工抗原混合液。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的PBS溶液和2×2L的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：氟乙酸钠-牛血清蛋白。
(2)氟乙酸钠人工抗原的鉴定
偶联成功的初步定性：从氟乙酸钠、BSA及其偶联物的红外扫描组合图中3条曲线对比可以看出：原化合物氟乙酸钠在1340.13cm-1有明显的吸收峰，而单独的牛血清蛋白在该区域无吸收，当二者偶联上后，人工抗原在1346.09cm-1出现吸收峰，因此证明其偶联是成功的。(见图1)
偶联比测定：是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的.凝胶电泳法是依据合成的人工抗原的分子量比载体蛋白分子量的增加来确定偶联比的。本发明利用FR980生物电泳凝胶成像系统得出偶联比为31，完全符合免疫要求。(见图2)
偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg·mL-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制牛血清蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得抗原溶液的蛋白浓度为3.5438mg·mL-1。
Claims (1)
1、一种氟乙酸钠毒物人工抗原的合成方法，其特征是以氟乙酸钠为半抗原，用碳二亚胺法将其与载体蛋白牛血清蛋白BSA偶联，用电泳测定偶联物的偶联比；
(1)人工抗原的合成：氟乙酸钠、碳二亚胺、牛血清蛋白以摩尔比为100∶10∶2的比例反应，首先让氟乙酸钠、牛血清蛋白室温下反应10min，充分溶解后逐滴加入碳二亚胺室温下搅拌反应3h，即得人工抗原混合液；
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的pH 7.4、0.01M的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：氟乙酸钠-牛血清蛋白；
(2)人工抗原的鉴定：氟乙酸钠-牛血清蛋白采用电泳测定其偶联比，凝胶电泳法是依据合成的人工抗原的分子量比载体蛋白分子量的增加来确定偶联比。
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2008
- 2008-10-15 CN CNA2008101955122A patent/CN101402682A/zh active Pending
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