CN101328215A - 一种双酚a类药物通用人工抗原的合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种双酚A类药物通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以双酚酸BHPVA为半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白牛血清蛋白BSA偶联，即得双酚A类药物通用人工抗原双酚酸－牛血清蛋白；用紫外扫描仪测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了BHPVA的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对其研究的需要。
Description
技术领域
一种双酚A类药物通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
双酚酸，英文名称：4，4-Bis(4-hydroxyphenyl)valeric acid(BHPVA)，CAS号126-00-1，分子式为C17H18O4，是双酚A的类似物。双酚A(Bisphenol A，BPA)是近几年从食品包装材料中新发现的一种“破坏内分泌化学物质(EndocrineDisrupting Chemicals，ECD)”，具有某些雌激素特性。BPA的发现引起了各国对食品及包装材料的广泛关注，已相继有从蔬菜罐头、婴儿用调制液、食品罐等检出BPA的报道。BPA是生产PC树脂及环氧(EP)树脂的主要原料，又用于酚醛树脂、可塑性聚酯、抗氧剂及聚氯乙烯(PVC)稳定剂等。因此，在食品包装材料、容器内壁涂料等方面有着重要的用途。在职业生产和日常生活中，BPA可通过皮肤、呼吸道、消化道等途径进入人体，BPA对皮肤、呼吸道、消化道和角膜均有中等强度刺激性。人类主要通过食用含有BPA材料包装的食物，使用婴儿奶瓶，牙科填充物和密封罐等摄入BPA。双酚A是一种弱雌性激素，对雄性生殖系统有一定的损害，具有内分泌干扰物作用，可能会引起性早熟，对胚胎也会有一定影响。BPA在低剂量时即具有DNA氧化损伤作用。BPA能诱导染色体异常，并能影响宿主的非特异性免疫防御系统。因此其在食品包装材料中的残留也越来越引起了国内外的重视。现有的仪器检测法虽然有灵敏度高、适用范围广等优点，但是样品前处理复杂，所需的仪器昂贵，成本高，检测时间长，因此有必要研究特异性强，灵敏度高同时价格低廉，能快速简便的免疫检测技术。这就需要合成能产生簇特异性抗体的免疫原。目前为止，国内尚没有更好的针对双酚结构多残留的免疫检测方法的报道，为此设计合成了以双酚A的类似物双酚酸为半抗原的用于双酚A结构检测的完全抗原。
发明内容
本发明的目的是提供一种双酚A类药物通用人工抗原的合成方法。所制备的产品用于双酚A结构得免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了更好的必需的人工抗原。
本发明的技术方案：一种双酚A类药物通用人工抗原的合成方法，以双酚酸BHPVA为半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白牛血清蛋白BSA偶联，用紫外扫描仪测定偶联物的偶联比；
(1)人工抗原的合成：双酚酸、碳二亚胺、牛血清蛋白以摩尔比为36∶43∶1的比例反应；首先将双酚酸溶于二甲基亚砜溶液中，充分溶解后先后加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺室温搅拌反应3h，为A液；牛血清蛋白溶于NaHCO3溶液中后逐滴加入上述A液，室温下搅拌反应3h，即得人工抗原混合液；
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：双酚酸-牛血清蛋白；
(2)人工抗原的鉴定：双酚酸-牛血清蛋白采用紫外扫描仪(UNICO，UV-2802pcs)测定其偶联比，将偶联产物双酚酸-牛血清蛋白用超纯水稀释到150μg·mL-1，测231nm、278nm波长处的吸光值，测出的吸光值为A1，A2，计算偶联比。则偶联比率r＝(A1×εB278-A2×εB231)/(A2×εA231-A1×εA278)，式中εA为双酚酸的摩尔吸光系数，εA231为231nm处的摩尔吸光系数，εA278为278nm处的摩尔吸光系数，εA231＝3622L·mol-1、εA278＝3006L·mol-1；εB为牛血清蛋白的摩尔吸光系数，εB231为231nm处的摩尔吸光系数，εB278为278nm处的摩尔吸光系数，εB278＝41059L·mol-1、εB231＝251656L·mol-1。
偶联比测定是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的.分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
双酚酸的摩尔吸光系数εA：配制双酚酸(BHPVA)浓度为0，10，20，30μg·mL-1的超纯水溶液，通过紫外扫描可知双酚酸的最大吸收波长为231nm，牛血清白蛋白的最大吸收波长为278nm，分别在231nm、278nm处测其吸光值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为：εA＝吸光值/摩尔浓度。本实验计算得εA231＝3622L·mol-1、εA278＝3006L·mol-1。
牛血清蛋白的摩尔吸收系数εB：配制浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·mL-1的牛血清蛋白(BSA)超纯水溶液，通过紫外扫描可知BSA的最大吸收波长为278nm，分别在278nm、231nm测吸光值，每个浓度做平行样。本实验计算得摩尔吸光系数分别为：εB278＝41059L·mol-1、εB231＝251656L·mol-1。
偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg·mL-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制牛血清蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将偶联物溶液按一定比例稀释，在595nm处测定偶联物溶液的吸光值，从曲线上得到偶联物溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得偶联物溶液的蛋白浓度为5.6253mg·mL-1。
偶联比测定：将偶联产物用超纯水稀释到150μg·mL-1，测231nm、278nm波长处的吸光值，以超纯水作空白对照作基准，测出的吸光值为A1，A2，则偶联比率r＝Ca/Cb＝(A1×εB278-A2×εB231)/(A2×εA231-A1×εA278)，计算得r≈16。
本发明的有益效果：本发明成功合成了BHPVA的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
附图说明
图1BHPVA、BSA及其偶联物的紫外扫描组合图。
具体实施方式
实施例1
(1)人工抗原的制备
7.2mg(0.025mmol)双酚酸溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)溶液中，充分溶解后分别加入6.7μL(0.029mmol)碳二亚胺(EDC)和3.5mg(0.029mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)室温搅拌反应3h，为A液；45mg(0.00068mmol)牛血清蛋白溶于4mL NaHCO3(pH 7.0，0.1mol/L)溶液中后逐滴加入上述A液，室温下搅拌反应3h，即得人工抗原混合液。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的PBS溶液和2×2L的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：BHPVA-牛血清蛋白。
(2)双酚酸人工抗原的鉴定
偶联物蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg·mL-1的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将偶联物溶液按一定比例稀释，在595nm处测定BHPVA-牛血清蛋白抗原溶液的吸光值，从曲线上得到偶联物溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得偶联物溶液的蛋白浓度为5.6253mg·mL-1。
偶联比测定：将偶联产物BHPVA-牛血清蛋白用超纯水稀释到150μg·mL-1，测231nm、278nm波长处的吸光值，以超纯水作空白对照定基准，测出的吸光值为A1，A2，则偶联比率r＝Ca/Cb为：r＝Ca/Cb＝(A1×εB278-A2×εB231)/(A2×εA231-A1×εA278)，本实验计算得r≈16。
Claims (1)
1.一种双酚A类药物通用人工抗原的合成方法，其特征是以双酚酸BHPVA为半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白牛血清蛋白BSA偶联，用紫外扫描仪测定偶联物的偶联比；
(1)人工抗原的合成：双酚酸、碳二亚胺、牛血清蛋白以摩尔比为36∶43∶1的比例反应；首先将双酚酸溶于二甲基亚砜溶液中，充分溶解后先后加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺室温搅拌反应3h，为A液；牛血清蛋白溶于NaHCO3溶液中后逐滴加入上述A液中，室温下搅拌反应3h，即得人工抗原混合液；
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：双酚酸-牛血清蛋白；
(2)人工抗原的鉴定：双酚酸-牛血清蛋白采用紫外扫描测定其偶联比，将偶联产物双酚酸-牛血清蛋白用超纯水稀释到150μg·mL-1，测231nm、278nm波长处的吸光值，测出的吸光值为A1，A2，计算偶联比。
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| CN103848899A (zh) * | 2014-02-17 | 2014-06-11 | 南昌大学 | 双酚A的抗原模拟表位Ph15及其应用 |
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