CN101397583A

CN101397583A - 罗非鱼选育良种的scar标记检测技术

Info

Publication number: CN101397583A
Application number: CNA2007100464010A
Authority: CN
Inventors: 李思发; 蔡完其; 唐首杰
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-09-26
Filing date: 2007-09-26
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2027-09-26
Also published as: CN101397583B

Abstract

本发明属于遗传育种学和水产养殖学领域，公开了可特异性鉴定新吉富罗非鱼群的分子标记，本发明还公开了鉴定方法以及试剂盒。本发明的分子标记可有效地应用于判别和鉴定新吉富罗非鱼群，以及应用于新吉富罗非鱼选育世代的纵向追溯和不同罗非鱼品系的横向比较。

Description

罗非鱼选育良种的SCAR标记检测技术

技术领域

本发明属于遗传育种学和水产养殖学领域，更具体地，本发明涉及一种罗非鱼选育良种的鉴定方法以及遗传标记。

背景技术

中国大陆从引进尼罗罗非鱼起，罗非鱼养殖业有了迅速发展。1994年，上海水产大学从菲律宾国际水生生物资源管理中心(ICLARM)引进了吉富(GIFT)品系尼罗罗非鱼，它是由四个非洲原种群体和四个亚洲养殖品系经过混合选择产生的优良品系。经过在黄河、长江和珠江三个农业生态区二年半的评估试验，发现吉富品系的个体生长速度比国内主养品系(“78”、“88”、“美国”和“埃及”品系)快5-30％，单位面积产量高20-30％，池养三网起捕率高1-2倍。1997年经全国水产原、良种审定委员会确认为良种，登记号为GS03001-1997。

鉴于该引进种是尼罗罗非鱼种内8个群体间杂交、选育产生的第三代，遗传性尚不够稳定，并有进一步改良的潜力，为了进一步提高该品系尼罗罗非鱼养殖性能，提高其遗传稳定性，培育出适合中国罗非鱼产业发展需要的罗非鱼新品种，本发明人以该吉富尼罗罗非鱼为基础群体，进行了进一步的选育工作，从而获得新吉富罗非鱼(参见本发明人的专利申请CN200510029412.9)，新吉富罗非鱼的生长速度比基础群体提高30％以上，种质纯度达90％以上，经济性状优势十分明显。

尽管不同品系或不同世代的罗非鱼在外观上非常相似，然而它们在生长速度、规格、品质、肉质等方面有很大不同，因此有必要对各品系或世代的罗非鱼加以鉴定，以利良种选育的进行和新品种的保护。然而，目前现有技术中对于鱼类的鉴定方法许多还是停留在传统的形态学方法，如观察鱼的可量、可数性状。传统的方法准确性差，当样品量多时工作量极大；并且，传统的方法往往局限于区分亲缘关系远的、形态学特征差异大的鱼类的物种以上的研究，对于亲缘关系接近的、遗传相似度高的物种以下的类群则难以准确地区分。

因此，本领域需要找到可明确地鉴定新吉富罗非鱼的方法，以准确地将新吉富罗非鱼与其它罗非鱼种群加以区分，为罗非鱼种质的保存和良种的养殖提供技术保障，为在纵向上和横向上将新吉富罗非鱼和其它罗非鱼进行比较研究提供技术依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种罗非鱼良种选育的方法以及遗传标记。

在本发明的第一方面，提供一种用于鉴定新吉富罗非鱼群的DNA分子，所述的DNA分子具有：

(i)SEQ ID NO：2中14-566位所示的核苷酸序列；或

(ii)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或

(iii)SEQ ID NO：6中11-568位所示的核苷酸序列；或

(iv)SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

在本发明的第二方面，提供一种用于鉴定新吉富罗非鱼群的引物，所述引物的长度为8-35个核苷酸，并且所述的引物可扩增出具有选自下组的核苷酸序列的DNA分子：

(i)SEQ ID NO：2中14-566位所示的核苷酸序列；或

(ii)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或

(iii)SEQ ID NO：6中11-568位所示的核苷酸序列；或

(iv)SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述引物的长度为10-30个。

在另一优选例中，所述的引物构成引物对，所述引物对选自：

由具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的引物构成的引物对；或

由具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的引物构成的引物对。

在另一优选例中，所述的引物选自：

具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的引物；或

具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的引物。

在本发明的第三方面，提供一种从待测鱼群中鉴定新吉富罗非鱼的方法，所述方法包括：

(1)从待测鱼群随机选取10-100尾(优选20-50尾)鱼，检测它们的基因组DNA中是否存在具有SEQ ID NO：6中11-568位所示核苷酸序列的DNA分子；若存在所述DNA分子的鱼的频率高于80％(优选高于85％；更优选高于88％)，则该待测鱼群是吉富罗非鱼群；

(2)从步骤(1)获得的吉富罗非鱼群中随机选取10-100尾(优选20-50尾)鱼，检测它们的基因组DNA中是否存在具有SEQ ID NO：2中14-566位所示核苷酸序列的DNA分子；若存在所述DNA分子的鱼的频率高于80％(优选高于85％)，则该吉富罗非鱼群是新吉富罗非鱼群。

在另一优选例中，利用所述的引物检测待测鱼的基因组DNA。

在本发明的第四方面，提供一种用于鉴定新吉富罗非鱼的试剂盒，所述的试剂盒中含有：

容器，以及装于容器中的引物和/或探针，所述的引物和/或探针用于鉴定待测样品中是否存在选自下组的DNA分子：

(i)SEQ ID NO：2中14-566位所示的核苷酸序列；或

(ii)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或

(iii)SEQ ID NO：6中11-568位所示的核苷酸序列；或

(iv)SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

在本发明的第五方面，提供本发明所述的DNA分子的用途，用于鉴定新吉富罗非鱼。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了以S₃₀₄为引物，以F₀群体和F₁₀群体的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。其中，

泳道1-10：F₀的PCR扩增产物的电泳结果；

泳道11-20：F₁₀的PCR扩增产物的电泳结果；

泳道M：100bp DNA ladder。

图2显示了利用S₃₀₄ ^624bp基因片段的特异性引物(见表1)，以F₀群体和F₁₀群体的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，其中，

泳道1-10：F₀的PCR扩增产物的电泳结果；

泳道11-20：F₁₀的PCR扩增产物的电泳结果；

泳道M：100bp DNA ladder。

图3显示了以S₃₆为引物，以新吉富群体和其它7个群体的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。其中，

泳道1-7：新吉富群体(J)；

泳道8-10：海南吉诺玛(H)；

泳道11-13：厦门鹭业(L)；

泳道14-16：广西水产所埃及品系(E)；

泳道17-19：非洲尼罗罗非鱼(A)；

泳道20-22：泰国尼罗罗非鱼(T)；

泳道23-25：广东伟业尼罗罗非鱼(W)；

泳道26-28：广东珠海北极品尼罗罗非鱼(G)；

泳道M：500bp DNA ladder。

图4显示了利用S₃₆ ^568bp基因片段的特异性引物(见表2)，以新吉富群体和其它7个群体的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，其中，

泳道1-7：新吉富群体F₁₀(J)；

泳道8-10：海南吉诺玛尼罗罗非鱼(H)；

泳道11-13：厦门鹭业尼罗罗非鱼(L)；

泳道14-16：广西水产所尼罗罗非鱼埃及品系(E)；

泳道17-19：非洲尼罗罗非鱼(A)；

泳道20-22：泰国尼罗罗非鱼(T)；

泳道23-25：广东伟业尼罗罗非鱼(W)；

泳道26-28：广东珠海北极品尼罗罗非鱼(G)；

泳道M：100bp DNA ladder。

具体实施方式

本发明人经过长期而广泛的研究，首次揭示可特异性鉴定新吉富罗非鱼的分子标记，所述分子标记存在于新吉富罗非鱼的基因组DNA中，而在新吉富罗非鱼的选育基础群体(吉富品系罗非鱼)或多种其它品系尼罗罗非鱼的基因组DNA中不存在或者存在几率显著降低，因而所述分子标记可良好地应用于分离鉴定新吉富罗非鱼，以及应用于新吉富罗非鱼选育世代的纵向追溯和不同罗非鱼品系的横向比较。本发明还揭示了基于所述分子标记设计的引物和试剂盒。在此基础上完成了本发明。

基本原理

本发明的最主要理论基础是基于不同品系或者同一品系不同选育世代的罗非鱼之间基因组序列的多态性，以及随机扩增多态DNA(Random AmplifiedPolymorphic DNA，RAPD)、序列特异扩增区域(Sequence CharacterizedAmplified Regions，SCAR)分析方法。

RAPD是以聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)为基础，利用人工合成的大约10bp的随机序列寡核苷酸作为引物，以生物的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，产生不连续的DNA扩增产物，然后通过如琼脂糖凝胶电泳等技术来检测DNA序列的多态性。通常，随机引物的数量越多，所覆盖的基因组范围越大，其与基因组结合的位点更加密集，能够更全面的反映基因组之间的差异。对于同源性较高的样本来说，大量的引物是发现微小差异的前提。

SCAR标记一般是由RAPD、RFLP、AFLP等标记转换而来，是根据已获得的标记片段的序列信息，设计特异引物，然后通过普通的PCR手段来揭示多态性。本发明中，所述的SCAR标记是基于RAPD标记转换而来。SCAR是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点，非常适合于样品的大量分析。

分子标记及其应用

本发明人通过对大量的随机引物的分析筛选，获得了可将新吉富罗非鱼群体(F₁₀)及其基础群体(F₀)与其它品系的罗非鱼群体区分开来的DNA分子标记，所述的DNA分子标记具有SEQ ID NO：6中11-568位所示的核苷酸序列或SEQ IDNO：6所示的核苷酸序列。所述分子标记在新吉富罗非鱼群体的基因组DNA中出现的频率达到90％以上，在新吉富罗非鱼的基础群体的基因组DNA中出现的频率达到85％以上，而在其它品系的罗非鱼群体的基因组DNA中出现的频率在70％或以下。因而，利用该分子标记可方便地将新吉富罗非鱼群体及其基础群体与其它品系的罗非鱼群体区分开来。并且，该分子标记适用于新吉富罗非鱼群与其它品系罗非鱼群的横向比较。更特别的，还可利用所述的分子标记在新吉富罗非鱼群体与其基础群体之间出现频率的差异，来鉴别新吉富罗非鱼群体和新吉富罗非鱼的基础群体。

作为本发明的优选方式，本发明人还筛选获得了可将新吉富罗非鱼群体(F₁₀)与其基础群体(F₀)区分开来的DNA分子标记，所述的DNA分子标记具有SEQ IDNO：2中14-566位所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。所述的DNA分子标记在新吉富罗非鱼群体的基因组DNA中出现的频率为85％以上；而在新吉富罗非鱼的选育基础群体(F₀)的基因组DNA中出现的频率是20％以下。因而，利用该分子标记可方便地将新吉富罗非鱼群体与其基础群体区分开来。并且，该分子标记适用于新吉富罗非鱼选育世代的纵向追溯。

上述两种DNA分子标记的联合使用，可准确地从各种罗非鱼品系中选择出经选育的优良品种，从而为鉴别罗非鱼种质，选择优良品种，确保鱼类养殖业的持续发展提供有效支持。

本发明的分子标记的另一应用是进行遗传分析。可利用本发明的分子标记分析不同群体或不同个体的罗非鱼的遗传相似性以及各鱼或鱼群之间的遗传距离。若各鱼或鱼群之间遗传相似性较高(遗传相似系数较高)，表现出较高的同源性，则遗传距离较近；反之，若各鱼或鱼群之间遗传相似性较低(遗传相似系数较低)，则说明遗传距离较大，亲缘关系较远。

引物及其应用

本发明人利用许多种长度约10bp的寡核苷酸随机引物，通过对随机引物的筛选，获得可良好地将新吉富罗非鱼群体(F₁₀)及其基础群体(F₀)与其它品系的罗非鱼群体区分开来的引物。所述的引物具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。以新吉富罗非鱼群体中各鱼的基因组DNA为模板，利用所述的引物，扩增出长度约为568bp的DNA片段的频率为90％以上；以新吉富罗非鱼的基础群体中各鱼的基因组DNA为模板，利用所述的引物，扩增出长度约为568bp的DNA片段的频率为85％以上；而以其它品系的罗非鱼基因组DNA为模板，利用所述的引物，扩增出长度约为568bp的DNA片段的频率低于或等于70％。并且，以之作为引物，扩增产物多、谱带清晰、多次试验的重复性以及稳定性非常好。

根据利用SEQ ID NO：5所示的引物扩增出的DNA分子标记(具有SEQ IDNO：6所示的核苷酸序列)，可设计特异性扩增该DNA分子标记的引物对。引物的设计方法是本领域人员所熟知的。任何可特异性扩增该DNA分子标记或其片段的引物对均被包括在本发明中。作为本发明的优选方式，所述的引物对由具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的引物构成。

作为本发明的优选方式，本发明人通过对随机引物的筛选，还获得可良好的将新吉富罗非鱼群体(F₁₀)与其基础群体(F₀)区分开来的引物。所述的引物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。以新吉富罗非鱼群体中各鱼的基因组DNA为模板，利用所述的引物，扩增出长度约为624bp的DNA片段的频率为85％以上；以新吉富罗非鱼的基础群体中各鱼的基因组DNA为模板，利用所述的引物，扩增出长度约为624bp的DNA片段的频率为20％以下。并且，以之作为引物，扩增产物多、谱带清晰、多次试验的重复性以及稳定性好。

根据利用SEQ ID NO：1所示的引物扩增出的DNA分子标记(具有SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列)，可设计特异性扩增该DNA分子标记的引物对。引物的设计方法是本领域人员所熟知的。任何可特异性扩增该DNA分子标记或其片段的引物对均被包括在本发明中。作为本发明的优选方式，所述的引物对由具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的引物构成。

本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

利用本发明的引物，只需进行常规的PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应大小PCR产物的有无，就可以准确、快速地判断待测鱼或鱼群是否属于新吉富罗非鱼，而且所需的样品量很少。

鉴定方法

基于本发明所提供的适用于鉴定新吉富罗非鱼的分子标记，本发明还提供了一种鉴定新吉富罗非鱼的方法，所述方法包括：

(1)从待测鱼群随机选取一定数量(通常多于10条，数量越多，准确性越高)的鱼，检测它们的基因组DNA中是否存在具有SEQ ID NO：6中11-568位或有SEO ID NO：6所示核苷酸序列的DNA分子；若存在所述DNA分子的鱼的频率高于80％(优选高于85％；更优选高于88％)，则该待测鱼群是吉富罗非鱼；

(2)从步骤(1)获得的吉富罗非鱼群中一定数量的鱼，检测它们的基因组DNA中是否存在具有SEQ ID NO：2中14-566位所示核苷酸序列的DNA分子；若存在所述DNA分子的鱼的频率高于80％(优选高于85％)，则该吉富罗非鱼群是新吉富罗非鱼群。

从鱼群中随机选取的鱼的数量没有特别的限制，通常多于10条，数量越多，准确性越高。然而考虑到检测的工作量等因素，通常选择10-100条即可获得较为准确的结果。

鉴定待测鱼基因组中是否存在所述分子标记的方法是本领域技术人员所熟知的，本发明对此没有特别的限制。例如(但不限于)可通过设计特异性引物和/或探针来鉴定。

作为本发明的优选方式，通过可扩增出所述分子标记的随机引物或所述分子标记的特异性引物来检测待测鱼的基因组DNA。

更优选的，在步骤(1)中，采用具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的引物、以待测鱼基因组DNA为模板，进行PCR扩增，观察扩增产物中是否存在约568bp的条带；或者，采用由具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO：8所示核苷酸序列的引物构成的引物对、以待测鱼基因组DNA为模板，进行PCR扩增，观察扩增产物中是否存在约558bp的条带。

更优选的，在步骤(2)中，采用具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的引物、以待测鱼基因组DNA为模板，进行PCR扩增，观察扩增产物中是否存在624bp的条带；或者，采用由具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的引物和具有SEQ IDNO：4所示核苷酸序列的引物构成的引物对、以待测鱼基因组DNA为模板，进行PCR扩增，观察扩增产物中是否存在约553bp的条带。

制备待测鱼的基因组DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚-氯仿法。

PCR技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。

鉴定PCR扩增产物中是否存在特异性基因片段(分子标记)的技术是本领域技术人员所熟知的。最为常用的技术是琼脂糖凝胶电泳，其可将不同分子质量的DNA分离开来，还可显示扩增产物中相应的基因片段的多少，其具有操作简单，结果直观的特点。

试剂盒

本发明还涉及一种用于鉴定新吉富罗非鱼的试剂盒，所述试剂盒中含有：

(i)SEQ ID NO：2中14-566位所示的核苷酸序列；或

(ii)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或

(iii)SEQ ID NO：6中11-568位所示的核苷酸序列；或

(iv)SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

每种引物或探针均被置于独立的容器中。用于鉴定特定基因片段(分子标记)的引物或探针的设计方式是本领域人员熟知的技术。

此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定待测鱼所需的试剂，如(但不限于)：

(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或

(B)各种提取鱼类DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如(但不限于)：酚、氯仿等；或

(C)进行琼脂糖凝胶电泳所需的试剂，例如(但不限于)：琼脂糖粉、电泳缓冲液、溴化乙锭等。

此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定待测鱼的使用说明书，从而指导技术人员正确使用所述试剂盒。

所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测待测鱼的目的。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示可特异性鉴定新吉富罗非鱼的分子标记，所述分子标记存在于新吉富罗非鱼的基因组DNA中，而在新吉富罗非鱼的选育基础群体或多种其它品系尼罗罗非鱼的基因组DNA中存在几率显著降低或者不存在，因而可良好地应用于分离鉴定新吉富罗非鱼，以及应用于新吉富罗非鱼选育世代的纵向追溯和不同罗非鱼品系的横向比较。本发明克服了传统方法难以区分罗非鱼品系的遗传差异、尤其是不同品系或不同世代间的遗传差异、导致混杂的技术缺陷，为罗非鱼良种选育和新品种保护提供了有效途径。

(2)利用本发明揭示的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测待测鱼，从待测鱼中快速准确地鉴定出新吉富罗非鱼，所需样品量少，操作简单，准确性高，并且具有良好的再现性、结果稳定可靠。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.材料

用于本发明的吉富品系尼罗罗非鱼F₁₀群体(以下简称新吉富群体，或新吉富罗非鱼)35尾，取自上海水产大学南汇水产动物种质试验站；基础群体F₀(即用于选育新吉富群体的原始群体)30尾，取自青岛罗非鱼良种场；其余7群体为：海南吉诺玛吉富尼罗罗非鱼、厦门鹭业尼罗罗非鱼、广西淡水水产所尼罗罗非鱼埃及品系、广东伟业尼罗罗非鱼、广东珠海北极品尼罗罗非鱼，分别取自各冠名养殖场；非洲尼罗罗非鱼和泰国尼罗罗非鱼取自匈牙利Sjarvas养殖场。各随机取样20尾。

各种鱼分别剪取鳍条，95％酒精固定。

随机引物为10碱基引物，均为上海生工公司产品。

SCAR分析

除将PCR扩增条件调整为退火温度56.8℃和57℃、35个循环外，其他条件参数同RAPD分析。

II.具体实施例

实施例1S₃₀₄ ^553bpSCAR转化标记的建立

1. 基因组DNA的提取

基因组DNA提取采用常规的“酚-氯仿”方法进行。提取组织为鱼的尾鳍组织。

2. 基因组DNA的RAPD分析

PCR扩增反应在Eppendorf Mastercycler Gradient PCR仪上进行，每一样品的反应总体积25μL，含2.5μL 10×扩增缓冲液(含100mmol/L Tris-HCl，pH9.5，500mmol/L KCl，30mmol/L MgCl₂，0.001％明胶，最后调节pH值至9.0)。2μL dNTP混合液(每种dNTP的终浓度0.2mmol/L)，正、反向引物各1μL(终浓度0.2μmol/L)，2μL基因组DNA(约50～150ng)，0.5μL Taq DNA聚合酶(1.25单位)，16μL无菌重蒸水，加入30μL石腊油。

PCR的扩增程序为：94℃预变性5min，接下来进行45个循环，每个循环包括94℃ 45s，36℃ 45s，72℃ 90s；最后一次循环结束后在72℃延伸5min。

取10μL扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后照相显影。

3. PCR扩增结果

先用50个10碱基随机引物，对基础群体(F₀)和选育群体(F₁₀)基因组DNA各10个样品进行RAPD分析。在这50个引物中，能够重复稳定扩增且表现为多态的引物有23个。结果，两个群体间仅产生1个特异扩增带，约在624bp处，即S₃₀₄ ^624bp，此条带对应的基因片段为F₁₀所特有。引物S₃₀₄扩增的约624bp条带如图1所示。

引物S₃₀₄的碱基序列如下：

DCCGCTACCGA(SEQ ID NO：1)。

4.特异RAPD带克隆、测序及SCAR标记的建立

利用购自上海申能博彩生物科技有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒(3SSpin DNA Agarose Gel Purification Kit)，从2.0％的低熔点琼脂糖凝胶中回收纯化RAPD特异片段，纯化后的产物用pGEM-T载体(Invitrogen)连接，转化到大肠杆菌DH5 α上，PCR法鉴定后在ABI3700测序仪上测序。

采用上述方法回收S₃₀₄ ^624bp基因片段，并克隆、测序。S₃₀₄ ^624bp片段测序结果如下(SEQ TD NO：2)：

GTGTAAAGCCTGGGGTGCCTTTTGAATGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCCCTCAGCCCGCTTTCTA

GCAGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCCAGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGG

GCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCACTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCA

CTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCA

GCAAAAGGCCAGCAGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCA

CATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCACAGGCGTTTCCC

CCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGCAATACCTGTCCGCCTTTCTCCCT

TCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGCAGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAG

CTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCC

根据S₃₀₄ ^624bp基因片段的序列设计一对长度分别为20bp和21bp的正向引物和反向引物，由于需考虑引物中GC碱基的含量，部分引物的位置没有从片段的两个末端开始，而是向片段的中间靠拢了一部分。引物的序列、退火温度及扩增片段大小见表1。

表1

用表1所示的引物对分别在F₀群体和F₁₀群体中进行PCR扩增，仅在F₁₀群体中产生了553bp的扩增带，而F₀群体中未出现此扩增带，结果见图2。

本发明人进一步扩大检测样本，在F₁₀群体和F₀群体各30尾样本中，用表1所示的SCAR标记引物进行分析。结果发现，在F₁₀群体中出现该标记的频率高达86.7％(26/30)；而在F₀群体中出现该标记的频率仅为16.7％(5/30)。

因此，553bp标记(S₃₀₄ ^553bp)的高频率，可良好地作为鉴定新吉富罗非鱼的分子标记。

实施例2S₃₆ ^568bpSCAR转化标记的建立

先用80个10碱基随机引物，对新吉富群体和其它7群体(海南吉诺玛吉富尼罗罗非鱼、厦门鹭业尼罗罗非鱼、广西淡水水产所尼罗罗非鱼埃及品系、广东伟业尼罗罗非鱼、广东珠海北极品尼罗罗非鱼、非洲尼罗罗非鱼、泰国尼罗罗非鱼)基因组DNA各10个样品进行RAPD分析。基因组DNA的提取、PCR扩增方法、琼脂糖凝胶电泳及电泳条带的回收方法同实施例1。

结果发现，在这80个引物中，能够重复稳定扩增且表现为多态的引物有20个。8个群体间仅产生1个特异扩增条带，约在568bp处，即S₃₆ ^568bp，此条带对应的基因片段为新吉富群体所特有。引物S₃₆扩增的568bp条带如图3所示。

引物S₃₆的碱基序列如下：AGCCAGCGAA(SEQ ID NO：5)。

特异RAPD带克隆、测序及SCAR标记的建立方法同实施例1。S₃₆ ^568bp片段测序结果如下(SEQ ID NO：6)：

AGCCAGCGAATGGATGGATGGATTGATGGATTTATTTTCGTTTTTTCTGCAGTATATAAAAATTGGTGTATCTCAA

AAATAAAACTATGAAGACACTCAAAATAAATTTCCTGTTGTTGTAAACTATTTTTTGCAACTTTTCTATATTTAAA

GTTTTATATCTTAAATTTTTCTAAGTAGAAATATATGTAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAGATTTTCAATTTTTTT

GTAGTTTATTGCACTTTTTTGCAATTTATGTAGTTACTATGGACTTAATGCATACATATTATTAAACTTTGGGCTA

TAACAGTTGTATTGATTTATAGTTGAAATGCTCCCAAAAATGGCACTACAGCATGTAAAAATATAAAGTAAGCTTG

GTTCTATGGTAGGTCTTAAAGGGTTAAAAAGATAAATGGCTTCTCAGTAGACCCTCTGCTCAGATGCCTTGATGAA

ATAAGTGCCTGGATGGCTTTGAACTTTTTTACATTTTAATGAGCAGAAAACAGAAGTGATAGTTTTTGGTGGCGCT

TCTGAGACCACTTCTATAGATCTTGGTTCGCTGGCT

根据S₃₆ ^568bp基因片段的序列设计一对长度分别为20bp和21bp的正向引物和反向引物，引物对的序列、退火温度及扩增片段大小见表2。

表2

本发明人进一步扩大检测样本，用表2所示的引物对分别在F₁₀群体的35尾样本、F₀群体的26尾样本和其它7个群体各20尾样本中进行PCR扩增，在新吉富F₁₀群体和F₀群体中产生了558bp的扩增带，见图4，其中，在新吉富F₁₀群体中的出现频率高达91.4％，F₀群体中出现频率88.5％；在其它7群体中的出现频率依次为0％(广西水产研究所尼罗罗非鱼埃及品系)、30％(珠海北极品尼罗罗非鱼)、35％(厦门鹭业尼罗罗非鱼)、55％(广东伟业尼罗罗非鱼)、60％(泰国尼罗罗非鱼)、65％(海南吉诺玛吉富尼罗罗非鱼)、70％(非洲尼罗罗非鱼)。

因此，558bp标记在新吉富罗非鱼群体中的高出现频率，可作为检测该良种的依据。

综上，本发明人建立了2个SCAR扩增带。S₃₀₄ ^553bpSCAR转化标记的出现频率在F₁₀为86.7％，而在F₀仅16.7％，适用于新吉富选育世代的纵向追溯；S₃₆ ^558bpSCAR转化标记的出现频率在F₁₀为91.4％，在F₀为88.5％，而在7个国内外具有代表性的尼罗罗非鱼品系仅0～70％，适用于新吉富同其它尼罗罗非鱼的横向比较。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>李，思发

<120>罗非鱼选育良种的SCAR标记检测技术

<130>075327

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

<210>2

<211>624

<212>DNA

<213>罗非鱼(Oreochromis)

<400>2

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

<210>5

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

<210>6

<211>568

<212>DNA

<213>罗非鱼(Oreochromis)

<400>6

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

Claims

1.一种用于鉴定新吉富罗非鱼群的DNA分子，其特征在于，所述的DNA分子具有：

(i)SEQ ID NO：2中14-566位所示的核苷酸序列；或

(ii)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或

(iii)SEQ ID NO：6中11-568位所示的核苷酸序列；或

(iv)SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

2.一种用于鉴定新吉富罗非鱼群的引物，其特征在于，所述引物的长度为8-35个核苷酸，并且所述的引物可扩增出具有选自下组的核苷酸序列的DNA分子：

(i)SEQ ID NO：2中14-566位所示的核苷酸序列；或

(ii)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或

(iii)SEQ ID NO：6中11-568位所示的核苷酸序列；或

(iv)SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述引物的长度为10-30个。

4.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述的引物构成引物对，所述引物对选自：

5.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述的引物选自：

具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的引物；或

具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的引物。

6.一种从待测鱼群中鉴定新吉富罗非鱼的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)从待测鱼群随机选取10-100尾鱼，检测它们的基因组DNA中是否存在具有SEQ ID NO：6中11-568位所示核苷酸序列的DNA分子；若存在所述DNA分子的鱼的频率高于80％，则该待测鱼群是吉富罗非鱼群；

(2)从步骤(1)获得的吉富罗非鱼群中随机选取10-100尾鱼，检测它们的基因组DNA中是否存在具有SEQ ID NO：2中14-566位所示核苷酸序列的DNA分子；若存在所述DNA分子的鱼的频率高于80％，则该吉富罗非鱼群是新吉富罗非鱼群。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，利用权利要求2所述的引物检测待测鱼的基因组DNA。

8.一种用于鉴定新吉富罗非鱼的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有：

(i)SEQ ID NO：2中14-566位所示的核苷酸序列；或

(ii)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或

(iii)SEQ ID NO：6中11-568位所示的核苷酸序列；或

(iv)SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物是权利要求2所述的引物。

10.权利要求1所述的DNA分子的用途，其特征在于，用于鉴定新吉富罗非鱼。