CN101351216B - 包含igbpma的组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明概括地涉及用于治疗人和动物体内与IgE激活相关的病症的方法和材料,和能够调节所述激活的作用剂。本发明的作用剂包含源自蜱的IGBPMA多肽或与源自蜱的IGBPMA多肽相关。
Description
发明领域
本发明概括地涉及用于治疗与人和动物体内IgE激活有关的病症(condition)的方法和材料,和能够调节(modulate)所述激活的作用剂。
发明背景
IgE是涉及变态反应的一类抗体。当个体响应于无害抗原(innocuousantigen)产生了IgE抗体(变应原致敏),继而遭遇相同的变应原时,发生这些反应。变应原在曝露的组织中引发结合IgE的肥大细胞(mast cell)的激活,导致一系列应答,这些应答是变态反应的特征。
IgE是与I型超敏反应相关的免疫球蛋白,所述I型超敏反应包括哮喘、变应性鼻炎(‘花粉热’)、变应性结膜炎、荨麻疹和其它变态反应。这种抗体的过量表达是造成大量人疾病的原因,所述人疾病从轻度花粉热到威胁生命的病症例如严重哮喘、花生过敏和对药物例如青霉素的过敏性反应(anaphylacticreaction)。IgE的激活引发皮肤、眼、鼻和支气管树中的细胞例如肥大细胞的应答。
针对消除不期望的IgE激活效应的现行方法包括抗IgE疫苗和抗IgE单克隆抗体。前者主要是实验性的。抗IgE单克隆抗体方法更加成功,尽管目前在市场上仅存在一个实例(omalizumab,商标Xolair)。
因此可以看出IgE调节剂的新来源将对本技术作出贡献。
发明内容
本发明的发明人分析了蜱(具尾扇头蜱(Phipicephalus appendiculatus))唾液腺提取物和唾液的免疫球蛋白结合活性,并且令人惊讶地发现蜱唾液腺和唾液含有IgE结合活性。
已知宿主IgG、IgM和IgE以某种方式参与宿主抗蜱应答(Allen,Khalil &Graham,1979;Beaudouin et al.,1997;Christe,Rutti & Brossard,1999;Fivaz,1990;Matsuda et al.,1990;Mitchell,Brown & Askenase,1982;Ushio et al.,1993;Brown & Askenase,1985;Worms,Askenase & Brown,1988)。认为蜱通过进食血液摄食宿主免疫球蛋白,其中的一些传至血淋巴(haemolymph),在血淋巴中它们保持它们的生物活性(Ackerman et al.,1981;Chinzei & Minoura,1987;Tracey Patte,Kemp & Johnston,1987;Wang & Nuttall,1994)。因此,如果使蜱以先前曝露于该种类的宿主为食,则对于蜱抗原是特异性的抗体可进入蜱的血腔(haemocoel)。
为了对抗这种潜在威胁,认为具尾扇头蜱能够通过它们的唾液分泌将这些免疫球蛋白分泌回宿主中(Wang & Nuttall,1994)。此外,已经在蜱中发现了结合IgG的蛋白质(Wang & Nuttall,1995 a and b;Wang & Nuttall,1999;WO95/27056)。这些IgG结合蛋白包括IGBPMA、IGBPMB和IGBPMC。
出乎意料的是,本发明的发明人发现了本发明公开的IgE结合活性由蛋白IGBPMA提供。
这是令人惊讶的,因为在所述文献中未讨论对于蜱侵染(tick infestation)的抗IgE应答。在宿主应答中IgE的作用确实有些不清楚。例如,在具尾扇头蜱侵染之后,犬血清IgE水平显著增加,但是未检测到蜱抗唾液腺IgE的量的改变。作者们将此解释为相对于其它无关抗原而言,有利于IgE产生的免疫环境的非特异性诱因(Szabo,Aoki et al.2003)。IgE的产生还由卡延钝眼蜱(Amblyomma cajennense)在驴中侵染来诱导(Szabo,Castagnolli et al.2004)。在由微小牛蜱(Boophilus microplus)重复侵染之后,蜱易感性品种的牛减少了对于蜱唾液腺抗原的IgG抗体水平,但是增加了对于蜱唾液腺抗原的IgE抗体水平,这说明在蜱易感性牛中蜱唾液组分抑制了IgG应答,但诱导了IgE应答(Kashino,Resende et al.2005)。作者们得出结论,IgE抗体不是保护性的。这也与以下观察一致:蓖子硬蜱(Ixodes ricinus)侵染使Th2应答极化,使小鼠中总IgE逐渐增加(Christe,Rutti et al.1999;Christe,Rutti et al.2000)。
IgG结合蛋白的证据、蜱唾液腺中组氨酸结合蛋白的存在和IgE结合蛋白报道的缺乏组合在一起,意味着在本公开之前的文献中普遍持有的观点是:对于蜱侵染的宿主IgE应答不是保护性的,并且IgE抗体不太可能具有控制蜱浸染的作用。
因此蜱确实产生IgE结合分子的事实是相当意外的。根据本公开,看起来通过蜱将IgE结合活性(可能以可溶性IgE受体的形式)注入喂食位点(feeding site)可以抑制局部(local)IgE介导的对效应细胞例如肥大细胞和嗜碱细胞的激活,所述激活通过交联那些细胞的表面上的受体而发生(Brossard &Wikel,1997;Brown,Worms & Askenase,1983;Matsuda et al.,1990;Szabo &Bechara,1999;Ushio et al.,1993;Kinet,1999)。这可以促进蜱进食血液。
在文献中关于任何寄生物产生IgE结合活性仅有两个报导。在鼠科的寄生物穆氏锥虫(Trypanosoma musculi)中检测到对啮齿类Ig(IgG、IgM和IgE)的Fc部分的受体活性(Vincendeau & Daeron,1989),并且报导了鼠科的线虫寄生物单绕线虫(Heligmosomoides polygyrus)对于宿主IgE的非Fab结合活性(Enriquez,Boggavarapu & Bradley Dunlop,1992)。然而,未有IgE结合分子从这些生物分离。在恰氏利什曼原虫(Leishmania chagasi)中检测到可选择的机制,其中原生动物抑制B淋巴细胞和巨噬细胞的IgE低亲和受体(CD23)的表达(Noben,Wilson & Lynch,1994)。
因此本发明人提供IgE结合分子的新来源。他们进一步研究了IGBPMA的IgE结合活性,并且显示其在小鼠抗哮喘模型中有效,说明该蛋白可形成与IgE激活有关的病症(如变应性病症)的新疗法的基础。基于其它源自蜱的蛋白的结果,免疫原性也很可能是低的(例如EV131,来自Evolutec Group plc.UK-参见WO9744451)。
在多个方面中,除其它内容以外,本发明概括地涉及IGBPMA和与IGBPMA相关的多肽及其它作用剂的新医药用途,用于结合哺乳动物中的IgE,由此调节IgE的作用并且控制IgE的病理效果,例如用于与IgE激活有关的病症的治疗中。
现将更详细地讨论本发明的这些方面和其它方面。
医药用途
因此在一个方面,本发明提供多肽在制药中的用途,所述药物用于治疗与IgE激活有关的病症,其中所述多肽包含:
(i)图1中显示的氨基酸序列,
(ii)图1中显示的氨基酸序列的变体,该变体与图1中显示的氨基酸序列中的至少200、250、275、300、310个连续氨基酸共有至少50、60、70、80、90、95或99%同一性,或
(iii)图1中显示的氨基酸序列的片段,该片段具有图1中显示的氨基酸序列中显示的至少150、200、250、275、300、310个连续氨基酸序列,
其中在每种情况下,所述多肽能够结合IgE分子。
优选所述变体与图1中显示的全长氨基酸序列共有所述水平的同一性。
本发明的多肽能够结合IgE,特别是能够结合至IgE恒定区上的一个或多个结合位点(例如如上所述阻抑IgE-介导的效应细胞的激活),即所述结合不仅仅是抗原与IgE可变区的结合。
优选对IgE的结合等同于或强于对IgG的结合。
可以使用本领域技术人员已知的任何方法来确认结合活性,例如任何下述的方法(包括SPL,例如使用BIAcore仪器,或使用IgE亲和层析)。例如,可以从人、大鼠、小鼠、兔或任何其它产生IgE的动物来获得用于筛选结合亲和性的IgE分子。用于筛选活性的IgE分子的片段可包含全部或部分的Fc和/或F(ab′)2区(但将不仅仅由IgE可变区组成)。
如用于本文,术语“与IgE激活相关的病症”包括变应性病症。这些变应性病症可包括响应于特定抗原的IgE的产生。例如,这些变应性病症可以是I型超敏反应(hypersensitivity reaction)。I型超敏反应包括哮喘、湿疹(eczema)、变应性鼻炎、鼻漏(rhinorrhea)、结膜炎、胃肠炎、荨麻疹或过敏性(anaphylactic)反应。
在另一个方面,本发明提供编码如上所述的多肽的核酸分子在制造药物中的用途,所述药物用于治疗与IgE激活有关的病症,其中所述核酸包含:
(i)图1中显示的核苷酸序列,
(ii)图1中显示的编码核苷酸序列的变体,该变体与图1中显示的编码核苷酸序列中的至少600、750、825、900、930个连续核苷酸共有至少50、60、70、80、90、95或99%同一性,
(iii)图1中显示的核苷酸序列的片段,该片段具有图1中显示的编码核苷酸序列中的至少450、600、750、825、900、930个连续核苷酸。
优选所述变体与图1中显示的全长核苷酸序列共有所述水平的同一性。
现将更详细地讨论涉及变体的本发明的实施方式。
变体
本发明的变体IGBPMA分子(多肽和核苷酸)可以是:
(i)新的、天然存在的、同源IGBP分子,例如可以从外寄生物获得,例如其它种类的蜱或节肢动物寄生物,例如本文讨论的。还包括具尾扇头蜱IGBPMA的天然生物变体(例如等位变体或地理变异)。IGBP分子的优选来源是外寄生物,并且特别是(但不排除其它)食血昆虫(blood-feeding insect)和蜱螨寄生物(acarine parasite),例如咬蝇(biting flies)、牛蜱(cattle tick)和螨(mites)。可例举作为这些节肢动物寄生物的代表的是以下种类的蜱:牛蜱属(Boophilus)、钝眼蜱属(Amblyomma)、锐缘蜱属(Argas)、扇头蜱属(Rhipicephalus)、璃眼蜱属(Hyalomma)、纯缘蜱属(Ornithodorus)、革蜱属(Dermacentor)、硬蜱属(Ixodes);蝇,特别是蝇蛆病(myiasis)、吸和咬蝇,例如羊狂蝇(Oestrus ovis)、胃蝇属的种(Gasterophilus spp)、金蝇属的种(Chrysomyia spp)、丽蝇属的种(Calliphora spp)、皮蝇属的种(Hypoderma spp)、皮蝇属的种(Dermatobia spp)、锥蝇属的种(Cochliomyla spp)、厩螫蝇(Stomoxyscalcitrans)、扰齿股蝇(Hydrotaea irritans)、蚋属的种(Simulium spp)、扰角蝇(Lyperosia irritans)、黑角蝇属的种(Haematobia spp)、虻属的种(Tabanus spp)、白蛉属的种(Phlebotomus spp)和舌蝇属的种(Glossina spp);虱,例如牛血虱(Haematopinus eurysternus)、牛颚虱(Linognathus vituli)、水牛盲虱(Solenopotescapillatus)、Linoanathus ovillus和刺虱属的种(Menacanthus spp);螨例如耳螨属的种(Notoedres spp)、蠕形螨属的种(Demodex spp)、疥螨属的种(Sarcoptesspp)、皮螨属的种(Chorioptes spp)、疮螨属的种(Psoreraates spp)、皮刺螨属的种(Dermanyssus spp)、刺脂螨属的种(Ornithonyssus spp)、耳螨属的种(Otodectesspp)和耳螨属的种(Notoedres spp);蚤例如犬栉头蚤(Ctenocephalides canis)和猫栉头蚤(C.felis);羊蜱蝇(ked)例如羊蜱(Melophagus ovinus)和臭虫例如臭虫属的种(Cimex spp)。
(ii)人工IGBPMA分子衍生物,其可根据本发明由技术人员制备。例如,可以通过位点定向诱变或随机诱变,或通过直接合成来制备这些衍生物。优选(例如)直接或间接地(例如通过一个或多个扩增或复制步骤)从具有全部或部分的本文所示序列的原始核酸来产生变体核酸。
特别包括截短的变体,所述变体仅包括相应于本文序列的部分的特征性部分或片段(无论怎样产生的)——例如能够结合IgE的多肽的功能部分。
还包括在其末端用非天然的邻接序列(contiguous sequence)进行延伸的分子,即本发明的多肽还可包含额外的氨基酸、额外的域,或可以与额外的域或其它分子缀合。与所述多肽缀合的额外的氨基酸、域或分子可提供额外的功能,例如辅助多肽的纯化。可辅助多肽纯化的额外的域的实例是6-组氨酸标签和谷胱甘肽S-转移酶标签。多肽可以是融合蛋白,其与肽或其它蛋白例如标记融合,所述标记可以是例如生物活性的、放射活性的、酶的或荧光的。
术语‘变体’核酸用于本文包含全部这些可能性。当使用在多肽或蛋白的上下文中时,其表示变体核酸的编码的表达产物,反之亦然。
现将更详细地讨论本发明涉及变体的某些方面。
可通过视觉检验和数学计算来测定两个氨基酸或两个核酸序列的百分比同一性,或更优选地,通过使用计算机程序比较序列信息来进行所述比较。示例性优选计算机程序是Genetics Computer Group(GCG;Madison,Wis.)Wisconsin程序包版本10.0程序,`GAP`(Devereux et al.,1984,Nucl.Acids Res.12:387)。用于`GAP`程序的优选默认参数包括:(1)GCG执行的用于核苷酸的一元比较矩阵(包含数值1代表同一性和0代表非同一性),和Gribskov andBurgess,Nucl.Acids Res.14:6745,1986的加权的氨基酸比较矩阵,如由Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas of Polypeptide Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358,1979描述;或其它相当的比较矩阵;(2)每个缺口的罚分为30,且对于氨基酸序列的每个缺口中每个符号的额外罚分为1,而对于核苷酸序列的每个缺口中每个符号的额外罚分为3;(3)对于末端缺口无罚分;和(4)对于长缺口无最大罚分。
衍生物的产生
可以通过修饰本文公开的任何序列来产生衍生物。
本发明的多肽可以是截短的片段,例如N末端26个氨基酸截短的片段。可以以分离的形式提供这些片段,即不是其它氨基酸或多肽的部分,也未与其它氨基酸或多肽融合;或者这些片段可以包含在较大的多肽内,形成该多肽中的一部分或一个区。当包含在较大的多肽内时,本发明的片段最优选形成单一的连续区,具有一个或两个非天然的邻接序列与其融合。此外,在单一的较大多肽中可包含数个片段。
基于许多理由,改变核酸序列可能是期望的。例如,它们可引入或去除限制性内切核酸酶位点或改变密码子选择。或者,通过在核酸中对一个或多个核苷酸进行添加、插入、缺失或取代的一种或多种的方式改变序列可以产生衍生物,导致编码多肽中一个或多个氨基酸的添加、插入、缺失或取代。
这些改变可修饰翻译后修饰所需的位点,例如编码多肽中的切割位点;编码多肽中用于糖基化和硫辛酰化(lipoylation)的基序等。可以将前导序列或其它导向序列(targeting sequence)(例如膜或高尔基定位序列)添加至表达的蛋白以测定其表达之后的位置。
其它期望的突变可以是为了改变编码多肽的活性(例如特异性)或稳定性的随机或位点定向诱变。改变可以通过保守变异的方式,即用一个疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个疏水残基;或用一个极性残基取代另一个,例如用精氨酸取代赖氨酸,用谷氨酸取代天冬氨酸,或用谷氨酰胺取代天冬酰胺。如本领域技术人员所熟知的,通过保守取代改变多肽的一级结构可能不会显著改变所述肽的活性,因为插入该序列的氨基酸的侧链可能能够形成与已被取代的氨基酸的侧链相似的键和接触。甚至当所述取代位于决定肽构象的关键区中时也是如此。还包括具有非保守取代的变体。如本领域技术人员熟知的,对于决定肽构象非关键的肽的区域的取代可能不显著影响肽的活性,因为这些取代不显著改变肽的三维结构。在对于决定构象或活性关键的区中,这些改变可赋予多肽有利的性质。事实上,改变(例如上述那些)可赋予肽稍有利的性质,例如改变的稳定性或特异性。
也可通过化学修饰IGBPMA来产生本发明的变体和/或同源物(homologue)。化学修饰多肽的方法是本领域熟知的。
可以使用合适的载体和宿主生物通过表达编码所述多肽的核酸来获得本发明的多肽。合适的载体和宿主的实例是本领域熟知的(参见例如Sambrook,J.et al.(1989)in:Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.),Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York)。
也可以通过任何合适的方法使用化学合成来产生本发明的多肽,并且特别是片段,所述合适的方法例如专有固相技术(exclusively solid-phasetechnique),部分固相技术,片段缩合或标准的溶液偶联(classical solutioncoupling)。在常规溶液相肽合成中,可通过一系列偶联反应来制备肽链,在所述反应中将组分氨基酸添加至期望序列中的生长肽链。目前许多这样的方法对于本领域技术人员而言是普通的。
还可使用分子生物学技术,通过修饰编码IGBPMA的核酸或编码本发明的其它变体或同源物的核酸,来产生本发明的变体和/或同源物。分子生物学技术是本领域熟知的。
因此本发明提供产生调节IgE的多肽的方法,所述方法包括步骤:
(i)提供多肽或编码它们的核酸,所述多肽是IGBPMA或其变体,
(ii)修饰所述多肽序列或编码该多肽的核酸序列,和
(iii)测定经修饰的多肽(在核酸被修饰的情况下,此为经修饰的核酸的表达产物)的IgE结合性质。
在下文中为了简洁,将IGBPMA和变体多肽称作“IGBPMA多肽”。
鉴定同源物
可以使用IGBPMA多肽的抗体来筛选与本文特别例示的那些具有结构相似性的IgE结合化合物。合适的方法是本领域技术人员熟知的。
一旦鉴定了结合活性,从异源混合物纯化多肽的方法是本领域熟知的(例如选择性沉淀、蛋白水解、使用已知分子量截留的滤器的超滤、离子交换层析、凝胶过滤等)。常规方案示于“Protein Purification”-principles and practice(蛋白纯化——理论和实践)”Pub.Springer-Verlag,New York Inc(1982),和Harris & Angal(1989)“Protein purification methods-a practical approach(蛋白纯化方法——实用方法)”Pub.O.U.P.UK,或其中的参考文件。已知适合用于蛋白纯化的其它方法在“Methods in Enzymology Vol 182-Guide to ProteinPurification”Ed.M P Deutscher,Pub.Academic Press Inc中公开。
可以在数据库(例如EST或STS数据库)搜索中使用IGPBMA序列(AF001868)来寻找同源序列,例如可成为及时能够获得的那些同源序列,并且能够如本文所述测试其表达产物的活性。
或者可以通过标准Southern印迹技术来提供同源物。例如,可以从细胞提取DNA并且用不同的限制酶消化。然后可通过在琼脂糖凝胶上的电泳来分离限制片段,之后变性并转移至硝化纤维素(nitrocellulose)滤纸。可以将标记的探针与滤纸上的DNA片段杂交并且测定结合。用于探测的DNA可以从来自细胞的RNA制备物制备。探测可以任选地通过所谓的‘核酸芯片’来进行(综述参见Marshall & Hodgson(1998)Nature Biotechnology 16:27-31)。
可以创造核酸分子的文库,可以在所述文库中筛选编码能够结合IgE分子的多肽的核酸。可以使用编码IGBPMA的核酸分子来创造这些文库。可以将IGBPMA核酸分子序列突变,例如使用随机PCR诱变或基因改组技术进行。可将所得突变的核酸分子连接至载体中。可以通过在合适的宿主中表达所述核酸分子来产生多肽的文库。
本发明的核苷酸变体将优选为′杂交的序列(hybridising sequence)′,所述杂交的序列是在非严紧条件下(6 XSSC/50%甲酰胺于室温)结合,并且在低严紧性的条件下(2×SSC、室温,或2×SSC、42℃)洗涤,或更优选在较高严紧性的条件下(例如2×SSC、65℃)洗涤的那些(其中SSC=0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠,pH 7.2)。
可供选择的是,可以使用核酸扩增反应,特别是聚合酶链式反应(PCR)(参见″PCR protocols;A Guide to Methods and Applications″,Eds.Innis et al,Academic Press,New York,(1990))。可以通过使用GCG程序包中的BESTFIT将获得的序列与GenBank核苷酸序列中的IGBPMA参考序列(AF001868)进行比较。
在本文的实施例中,公开了在IGBPMA参考序列(GenBank,AF001868)的nt-648包含沉默突变(T-C)的变体序列。
如下文讨论的,本发明还提供IGBPMA模拟物(mimetics),或基于IGBPA-IgE相互作用来鉴定的其它作用剂。
除非上下文另有要求,在下文的内容中,可将任何前述的本发明的多肽、多核苷酸、所述多肽或多核苷酸的变体、模拟物或其它作用剂称作“本发明的治疗剂(therapeutic)”,并且有关这些治疗剂的内容单独地适用于这些物质中的每一种。在全部情况下,优选的本发明的治疗剂是前述方面中的多肽或多核苷酸(包括所述多肽或多核苷酸的变体或片段),并且特别是IGBPMA多肽(包括其变体或片段)。
公开了全部这些治疗剂在治疗与IgE激活有关的病症中的用途。(除了它们在制备用于这些治疗的药物中的用途之外)同样公开了它们的使用方法。
也可测试全部这些治疗剂在人或动物受试者中的安全性和/或毒性,在治疗与IgE激活相关的病症中的功效,并且可以与一种或多种运载体、稀释剂或作用剂配制用于治疗如上所述与IgE激活有关的病症。
因此在一个方面,本发明提供本发明的治疗剂在制备药物中的用途,所述药物用于治疗与IgE激活相关的病症。
本发明还提供例如在动物或人中治疗与IgE激活相关的病症的方法,其包括施用治疗有效量的本发明的治疗剂。
也可将本发明的治疗剂与先前用于治疗与IgE激活相关的病症的药物组合施用,所述药物例如吸入型糖皮质激素(inhaled corticosteroid)、抗IgE抗体(例如omalizumab)等。
通过结构-功能研究鉴定调节剂模拟物
IGBPMA可以是与其共有IgE结合性质的功能性模拟物的来源。这些模拟物的鉴定和使用形成本发明的另一个方面。
IGBPMA模拟物可不含IGBPMA氨基酸序列的活性部分,并且事实上可以完全不是肽,但是应保留结合IgE的必要生物活性。对于许多体内药物用途,非多肽“小分子”通常是优选的。
这些模拟物的实例包括化合物,所述化合物模拟IGBPMA多肽或其IgE结合位点的三维结构构建。
可通过本领域技术人员熟知的方法或使用下文讨论的方法来鉴定IGBPMA上的IgE结合位点。
设计已知有药物活性的化合物的模拟物是基于“先导”化合物(“lead”compound)来开发药物的公认方法。
在从具有给定目标性质的化合物设计模拟物时,通常采取几个步骤。首先,测定在决定目标性质中关键和/或重要的化合物的具体部分。在肽的情况下,这可通过系统地改变肽中的氨基酸残基,例如通过依次取代各个残基来进行。通常使用肽的丙氨酸扫描(alanine scan)来提炼(refine)这些肽基序。将构成所述化合物活性区的这些部分或残基(在此为IgE结合位点)称作它的“药效团”。
一旦找出药效团,使用来自各种来源的数据,例如分光镜技术、X射线衍射数据和NMR,根据药效团的物理性质来模拟它的结构,所述物理性质例如立体化学、成键、大小和/或电荷。
可以通过本领域技术人员熟知的方法来测定三维结构,例如由″Three-Dimensional Solution Structure of alpha-Conotoxin MII,an alpha3beta2Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptor-Targeted Ligand″,Shon,et al.(1997)Biochemistry,vol.36(50):15693-15700所示例的。
在这种建模过程中可使用计算分析、相似性作图(similarity mapping)(其模拟药效团的电荷和/或体积(volume)而不是模拟原子间的成键)和其它技术。
在这种方法的变形中,模拟配体(即IGBPMA多肽)及其结合配偶体(IgE的全部或部分)的三维结构。这在配体和/或结合配偶体改变结合的构象时特别有用,使得在设计模拟物时的模型能够将这点考虑在内。
然后选择在其上能够接枝模仿药效团的化学基团的模板分子。能够方便地选择模板分子和其上接枝的化学基团,从而简单地合成模拟物,该模拟物可能是可药用的,并且在体内不降解,同时保持先导化合物的生物活性。可供选择的是,当模拟物以肽为基础时,可通过将肽环化,增加其刚性来达到更进一步的稳定性。其后可筛选由这种方法发现的一种或多种模拟物以了解它们是否具有目标性质,或它们显示何种程度的目标性质。之后可进行进一步的优化或修饰来获得一种或多种最终模拟物用于体内或临床测试。
因此本发明提供一种提供(设计和/或产生)IgE结合剂或调节剂的方法,所述方法包括步骤:
(i)提供IGBPMA多肽,如上所述,
(ii)产生所述多肽的三维模型,所述模型纳入有关所述多肽的立体信息和电荷信息(例如与IgE的化学基团相互作用的多肽的化学基团的立体信息和电荷信息);和
(iii)基于所述立体和电荷信息来提供IgE结合剂(例如通过鉴定多肽的在(ii)中鉴定的化学基团的相对空间位置,和设计包含某些或全部在该空间位置的化学基团的分子模拟物)。
所述方法可包括合成和测试分子模拟物结合IgE分子的能力,例如使用SPL和/或IgE亲和层析。可以选择对于IgE分子具有结合亲和性的分子模拟物(其结合亲和性类似于或大于IGBPMA多肽的结合亲和性)作为分子模拟物用于上述方法中。
鉴定可选的IgE调节剂
众所周知以鉴定新药物为目的的药物研究在发现先导化合物之前和之后均可能涉及非常大量的候选物质的筛选。这是使药物研究非常昂贵并耗时的一个因素。在筛选过程中进行辅助的手段会具有可观的商业价值和效用。
在进一步的方面,本发明提供筛选结合或调节IgE的其它物质的方法,所述方法通常包括:在可比较的反应条件下,在存在和缺失测试化合物时,比较可检测的IGBPMA多肽与IgE上它的同源的(cognate)结合位点或分别的(respective)结合位点(通常由IgE或其全部或部分恒定区提供)的结合。可使用IGMPMA多肽以竞争形式或置换形式来筛选物质。
因此,在本发明进一步的方面,将如本文所提供的IGBPMA多肽使用在筛选物质的方法中,所述物质影响、抑制、调节或模拟IGBPMA多肽与IgE结合有关的活性或功能。
示例方法包括:
(i)使IGBPMA多肽及其IgE上的结合位点和推定的IgE调节作用剂在一起;和
(ii)观察或测量IGBPMA多肽与IgE上结合位点的结合亲和性,例如使用SPL或IgE亲和层析。当使用SPL来观察或测量结合亲和性时,可将多肽或IgE分子固定在传感芯片(sensor chip)上。
(iii)评估与缺失所述潜在作用剂时多肽对于IgE分子的结合亲和性相比,在所述作用剂存在下,IGBPMA多肽对于IgE上结合位点的结合亲和性是否减少。
对于使IGBPMA多肽对IgE分子的亲和性减少的作用剂,可进一步测试其结合于IgE分子的能力,例如使用SPL或IgE亲和层析。可以将作用剂对IgE分子的结合亲和性与由IGBPMA组成的多肽对IgE的结合亲和性进行比较。
鉴定结合或调节IgE分子的作用剂的另一种方法包括步骤:
(i)使推定的作用剂与IgE分子接触;和
(ii)观察或测量在存在和缺失IGBPMA多肽时所述作用剂对IgE分子的结合亲和性。例如,可以使用SPL或IgE亲和层析来观察或测量所述作用剂对IgE分子的结合亲和性。
(iii)评估所述潜在作用剂对IgE分子的结合亲和性是否类似于或大于多肽(例如由IGBPMA组成的多肽)对IgE分子的结合亲和性。
在此方面和其它方面,所述物质(推定的IgE调节剂)可作为例如组合文库的产物提供,例如目前本领域熟知的(参见例如Newton(1997)Expert OpinionTherapeutic Patents,7(10):1183-1194)。
因此,在置换形式中,本发明提供检测样品中推定的IgE调节剂的存在或量的方法,所述方法包括步骤:
(a)将样品曝露于复合物,所述复合物包含固定于其IgE上结合位点的可检测的(例如标记的)IGBPMA或其变体多肽,
(b)检测任何置换的IGBPMA或变体多肽。
在竞争形式中,使测定中的全部组分同时在一起,并且测定在推定的IgE结合剂存在下IGBPMA或变体多肽在结合上的减少。在一个实施方式中,通过饱和结合法(saturation binding method)来测定IGBPMA或变体多肽中对于IgE上结合位点的结合常数Kd,在所述方法中向IgE上的结合位点添加渐增量的经放射标记的肽,并且测定在各个浓度结合的标记材料的量。用数据拟合恰当的结合等式来计算Bmax(结合位点的浓度)和Kd(其大约是结合位点半饱和所需的配体浓度),所述等式将结合的配体的浓度描述为平衡中总配体的函数。
结合的可逆性是配体的特征,在平衡条件下,配体与它们各自的结合位点自由地结合和解离。在达到标记化合物的平衡结合之后,通过标记化合物被未标记化合物置换的能力来说明特定化合物的结合可逆性。
为了测定测试化合物对用于IGBPMA的IgE结合位点的结合常数,在标准浓度的IGBPMA或其变体存在下,向IgE制备物上的结合位点以渐增浓度添加所述测试化合物。其后将所述制备物迅速过滤、洗涤并且测试结合的放射标记。从计算机拟合的竞争结合曲线来测定测试化合物的结合常数(Ki)。
本质上,可以类似于高通量筛选或在高通量筛选之外来使用本发明的方法(所述高通量筛选例如本领域熟知的那些),并且以结合配偶体为基础——参见例如WO 200016231(Navicyte);WO 200014540(Tibotec);DE 19840545(Jerini Biotools);WO 200012755(Higher Council for Scientific Research);WO200012705(Pausch MH;Wess J);WO 200011216(Bristol-Myers Squibb);US6027873(Genencor Intl.);DE 19835071(Carl Zeiss;F Hoffman-La Roche);WO 200003805(CombiChem);WO 200002899(Biocept);WO 200002045(Euroscreen);US 6007690(Aclara Biosciences)。
对本发明的任何治疗剂的进一步优化可包含将所述治疗剂与以下组合:(i)其IgE上的结合位点(通常由IgE或其全部或部分恒定区提供);(ii)IgE受体,其在与IgE激活相关的条件下与所述IgE或全部或部分恒定区进行病理学的相互作用。其后评估对所述相互作用的调节程度,并且特别是抑制的程度。任选地重复该过程,其中改变治疗剂的结构,或提供近似结构的类似物或变体,在对其进行重新测试。
可将如上所述鉴定的作用剂(例如该作用剂以类似于或大于IGBPMA的结合亲和性的结合亲和性来结合IgE)选择为或制造为作用剂,用于如前述方面中所述的治疗与IgE激活有关的病症的方法中。
治疗组合物和施用模式
可将本发明的治疗剂配制成药物组合物用于本文所述的方法中。
这些组合物可在上述物质中的一种之外包含可药用赋形剂、运载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它材料。这些材料应该是无毒的,并且应不干扰活性成分的效力。运载体或其它材料的精确性质可依赖于施用的途径,例如口服、静脉内、皮肤或皮下、肌内、腹膜内途径——示例剂型在WO95/27056中讨论。
在本申请中特别感兴趣的是根据本领域已知方法的可吸入剂型,例如鼻吸入剂。这些治疗剂特别适合用于治疗与IgE激活有关的病症。
适合于吸入的多肽组合物是本领域熟知的——参见例如US6,632,456;WO96/32096;WO91/16038。将这些肺药递送组合物设计成如下递送:通过患者吸入药物分散剂(drug dispersion),从而使分散剂内的活性药物能够抵达肺部。已经发现递送至肺的特定药物被容易地吸收,通过肺泡区(alveolarregion)直接进入血液循环中。
肺药递送本身可通过不同的方法来实现,包括多种液体喷雾器、基于气溶胶的定量吸入器(MDI′s)和干粉分散装置。干粉分散装置适合用于递送可容易地配制成干粉的药物,特别是蛋白和多肽。优选的颗粒大小应在0.5-10μm的范围。
对于肺递送干粉药物特别有前景的方法采用手持装置,其带有用于提供加压气体来源的手泵。将加压气体通过粉末分散装置例如Venturi喷嘴突然释放,而分散的粉末使得患者能够吸入。
因此本发明提供可吸入形式的包含本发明的治疗剂(特别是IGBPMA或变体多肽)的组合物,所述可吸入形式例如颗粒大小为0.5-10μm,优选少于7μm,并且甚至更优选少于5μm的干粉的形式。
可将适合于通过吸入施用的本发明的药物组合物包括在试剂盒中,在所述试剂盒中还包括使该药物组合物能够作为喷雾施用的吸入装置。因此本发明还提供试剂盒,其包含本发明的治疗剂和用于通过吸入将治疗剂递送至需要该治疗剂的患者的递送工具。递送工具可以是本领域已知的任何递送工具——例如液体喷雾器;基于气溶胶的定量吸入器(MDI′s),或干粉分散装置。递送工具将通常包括:用于容纳治疗剂的储存器,加压气体的来源(例如气缸(cylinder)或泵),和喷嘴或用于鼻内递送治疗剂的其它出口。
药物组合物还可包括适合用于治疗与IgE激活相关的病症的其它药物,例如Omalizumab。
优选以“预防上有效的量”或“治疗上有效的量”来施用本发明的治疗剂(视情况而定,尽管可将预防看作为治疗),这足以使个体受益。施用的实际量,以及施用的速率和时程将依赖于所治疗的性质和严重性。治疗的处方,例如决定剂量等,在普通开业医师和其它医生(medical doctor)的职责之内,并且通常考虑所治疗的病症、患者个人的病症、递送的位置、施用的方法和开业医师了解的其它因素。上述技术和方案的实例可见于Remington’s PharmaceuticalSciences,16th edition,Osol,A.(ed),1980。可将本发明基于核酸的治疗剂与常规的基因治疗载体一起使用,例如本领域熟知的(参见例如WO0159142)。
产生方法
用于产生治疗剂的方法构成本发明进一步的方面,所述治疗剂适用于治疗与IgE激活相关的病症。
此外,优选当这些组合物包含重组产生的多肽时,它们基本上不含内毒素。例如,可以使用Polymyxin(多粘菌素)琼脂糖柱来实现这点。
现将通过以下非限制性附图和实施例来进一步描述本发明。本领域的技术人员将根据这些内容想到本发明的其它实施方式。
本文引用的全部参考文件的内容,由于可能被本领域技术人员用于实施本发明,所以特别通过交叉引用将其并入本文。
表格和附图
表1:显示对以下三种分析物的相对结合活性(RBA)的估计:雌性SGED6、雄性SGED6和雌性SalivaD7。
图1:IGBP-MA的氨基酸序列和DNA序列。
图2:由多巴胺刺激诱导的蜱唾液分泌(salivation)。
A.在DA刺激之后雄性(三角)和雌性(圆圈)的唾液分泌。X轴代表部分喂食的(partially fed)雌性和饱食的(engorged)雄性和雌性的体重平均值(mg)。Y轴代表由每只蜱分泌的唾液的平均体积(μl)。误差棒(Error bar)显示SEM(n=12-40)。
B.蜱唾液中的蛋白浓度。柱形分别显示雄性和雌性唾液中总蛋白浓度的平均值(mg/l)。误差棒代表蛋白浓度的范围。分别使用了两批和八批雄性和雌性唾液。
图3:在部分喂食(第6天)的雌性唾液腺提取物中的免疫球蛋白结合活性。线A-E分别代表与IgG、IgE、Fc、F(ab′)2的结合和基线。白色和黑色箭头分别指明分析物注入的起始和终止点。在分析物注入结束之后,用TBS洗涤流动池(flow cell)。
图4:在部分喂食(第6天)的雄性唾液腺提取物中的免疫球蛋白结合活性。线A-E分别代表与IgG、IgE、Fc、F(ab′)2的结合和基线。白色和黑色箭头分别指明分析物注入的起始和终止点。在分析物注入结束之后,用TBS洗涤流动池。
图5:在部分喂食(第7天)、多巴胺刺激的雌性唾液中的免疫球蛋白结合活性。线A-E分别代表与IgG、IgE、Fc、F(ab′)2的结合和基线。白色和黑色箭头分别指明分析物注入的起始和终止点。在分析物注入结束之后,用TBS洗涤流动池。
图6:雄性SEGD6中的IGBPMA结合于豚鼠IgG和大鼠IgE。
A.蛋白凝胶(SDS-PAGE,非还原性条件)显示雄性蜱SGED6中的总蛋白谱,并且IGBPMA(用箭头指明)是与IgG和IgE二者结合的主要蛋白。
泳道1:分子量(MW)标记(Mark-12,Invitrogen)
泳道2和8:加样前的蜱雄性SGED6
泳道3:运行通过Protein-L-IgG(蛋白-L-IgG)(豚鼠)柱的蜱雄性SGED6(样品经浓缩)
泳道7和9:运行通过Protein-L-IgE(大鼠)柱的蜱雄性SGED6(样品经浓缩)
泳道4:豚鼠IgG
泳道5和6:Protein-L-IgG(豚鼠)柱的洗脱物级分1和2
泳道10:大鼠IgE
泳道11和12:Protein-L-IgE(大鼠)柱的洗脱物级分1和2
B.使用抗IGBP血清的Western印迹
泳道1:雄性SGED6的总蛋白。从顶部起的条带为IGBPMA、-MB和-MC。
泳道2:Protein-L-IgE柱的洗脱物
图7:筛选rIGBPMA表达。
A.蛋白凝胶(SDS-PAGE,还原性条件)
B.使用抗IGBP血清的Western印迹
泳道1-12:诱导表达rIGBPMA的单株克隆的总大肠杆菌细胞裂解物。选择泳道3中代表的克隆(No.F6)用于以下全部实验。
泳道13:雄性蜱SGED6
泳道14:MW标记
图8:蛋白凝胶(SDS-PAGE,还原性条件)显示在重折叠之后的经纯化的可溶rIGBPMA
泳道1:MW标记
泳道2:在诱导rIGBPMA表达之后,大肠杆菌(克隆No.F6)细胞的不溶级分(6M尿素提取物)中的总蛋白
泳道3:TBS中经纯化的可溶rIGBPMA,箭头指明rIGBPMA。
图9:与人和大鼠IgE结合的可溶rIGBPMA
来自亲和柱(Protein-L-IgE)和对照柱(仅Protein-L)的样品的蛋白凝胶(SDS-PAGE,非还原性条件)
A.人-IgE
泳道3-7:亲和(Protein-L-IgE)柱
泳道8-12:对照(Protein-L)柱
泳道1:人IgE
泳道2:纯化的rIGBPMA(箭头指明)
泳道3和8:加样的rIGBPMA
泳道4和9:洗脱之前的最后洗涤级分
泳道5和10:第一次洗脱级分
泳道6和11:第二次洗脱级分
泳道7和12:第三次洗脱级分
M:MW标记
B.大鼠IgE
泳道1-5:对照(Protein-L)柱
泳道6-10:亲和(Protein-L-IgE)柱
泳道1和6:与BSA(虚线箭头)一起加样至柱上的纯化的rIGBPMA(实线箭头)
泳道2和7:洗脱之前的最后洗涤级分
泳道3和8:第一次洗脱级分
泳道4和9:第二次洗脱级分
泳道5和10:第三次洗脱级分
图10:与Fc片段结合的rIGBPMA的BIAcore 2000检测
箭头-1显示rIGBPMA注入的起始,而箭头-2显示rIGBPMA注入的完成。
曲线A:具有大约4000RU固定化Fc(人)片段的流动池4
曲线B:具有大约5000RU固定化BSA的流动池2
曲线C:具有大约5000RU固定化F(ab)2(兔)片段的流动池3
曲线:作为空白的无固定化配体的流动池1
图11:BALB/c小鼠中rIGBPMA对变应性哮喘的效果。
图12:比较rIGBPMA对IgE和IgG的结合
曲线A:IgE
曲线B:IgG
曲线C:BSA
实施例
材料和方法
蜱和豚鼠
通过在未接触过蜱()的Dunkin Hartly豚鼠剃过毛的背部喂食全部龄期来保持我们实验室的具尾扇头蜱群落(Jones等人,1988)。在喂食大约6天时,雌性饱食(female engorgement)经过缓慢进食阶段,其后转向快速阶段,在此期间雌性吸入全部血餐(bloodmeal)的大约90%(结果未显示)。在雌性喂食的大约第5天,发生交配和其后的雄-雌共同喂食(Wang,Henbest & Nuttall,1999)。对于Ig结合实验,使用的全部蜱均为蜕皮后超过三个月的成体。将二十对成体在3只豚鼠中的每只上喂食6天用于唾液腺解剖,而喂食7天用于唾液收集。
制备蜱唾液腺提取物和唾液
对于实施例1,将部分喂食的成蜱从它们的宿主上移除,在自来水中清洗三次,其后解剖唾液腺。在Tris-HCl缓冲的盐水中(TBS:50mM Tris、150mMNaCl、20mM CaCl2、20mM MgCl2和0.5%Triton-X100,pH 7.0),从50只蜱的成对的腺中制备唾液腺提取物(SGE),并且如先前所述贮藏(Wang &Nuttall,1995b)。将雄性和雌性SGE在TBS中分别稀释至蛋白浓度为1mg/ml和2mg/ml,如使用Bio-Rad蛋白测定试剂盒(Bio-Rad)所测定的。
为了收集蜱唾液,将多巴胺(DA)盐酸(Sigma)溶解在1.2%NaCl中至5mg/ml用于刺激蜱唾液分泌。使用与Hamilton注射器附接的30g注射针,将DA通过假头窝褶(camera-stomal fold)(覆盖口器和盾片之间的关节的膜)注入蜱(大约1μl每10mg蜱重)。该方法是从一种先前描述的方法(Kaufman,1978)修饰而来。在注射之后,将蜱背面朝下封固在双面胶带上,并且以下述方式将5μl或10μl毛细管置于口器之上,所述方式使触须向外张开并且将螯肢(chelicerae)和下口缘(hypostome)包含在毛细管中。为了实现与口器紧密的(但不是非常紧绷的)配合,将毛细管在本生灯上稍稍拉长,在选择的位点用金刚石笔切割并且烧边。
对于Ig结合试验,将9只雌性蜱(喂食了7天)分泌的唾液汇集在含有25μl蒸馏水的1.5ml微量离心管中,并且保存在冰上;添加这些初始等分的水使得毛细管能够被润洗,从而最小化唾液的损失。在使用之前将唾液样品贮藏在-70℃,在使用时测量样品的蛋白浓度并且通过添加5μl TBS稀释至0.1mg/ml(蛋白浓度)(未测定唾液样品的pH和离子强度)。
对于实施例2,将与雌性一起喂食6天的成体雄性蜱从它们的宿主上移除,在自来水中清洗三次,其后解剖唾液腺。从30只蜱的成对的腺制备唾液腺提取物(SGE),置于大约200μl Tris-HCl缓冲的盐水中(TBS:50mM Tris、150mM NaCl、20mM CaCl2、20mM MgCl2和0.5%Triton-X100,pH 7.0),然后用于亲和层析(Wang and Nuttall,1995b)。
将免疫球蛋白固定于BIAcore芯片
将纯化的免疫球蛋白(豚鼠IgG,Sigma;大鼠重组IgE,Serotech;人IgG Fc,ICN;和兔IgG F(ab′)2,ICN)以1mg/ml溶解在磷酸缓冲的盐水(PBS;20mM磷酸盐,130mM NaCl,pH 7.2)中。使用BIAcore2000(BIAcore AB)的嵌入式表面制备向导(built-in surface preparation wizard)将免疫球蛋白以10,000共振单位(RU)的目标水平固定在传感芯片CM5(用羧甲基葡聚糖涂覆的BIAcore AB芯片)上,其中使用在偶联pH 4.5(10mM乙酸盐)的标准胺偶联化学(如BIAcore2000Instument Handbook和BIAapplication Handbook中所述)。CM5芯片的葡聚糖层通过提供与生物传感器平面分离的亲水环境而有益于测量蛋白相互作用。在传感芯片中的4个流动池的每一个上固定下列之一:(A)豚鼠IgG,(B)大鼠IgE,(C)人Fc片段,或(D)图F(ab′)2片段。将流动池用100μl甘氨酸缓冲的盐水(GBS,100mM甘氨酸,150mM NaCl,pH 2.6)洗涤一次,其后用100μl TBS以5μl/min的流速洗涤并且在使用之前在4℃贮藏过夜。
免疫球蛋白结合活性的BIAcore2000检测
全部实验在室温(25℃)进行。用100μl蜱SGE(雌雄或雄性)或50μl雌性唾液以5μl/min的流速注入全部流动池。在每个实验之后,将流动池用25μlGBS(pH 2.6,见上)洗涤以去除结合的蜱材料(分析物)并且在流动池表面上再产生游离的免疫球蛋白,其后在测试下一个样品之前用200μl TBS(pH 7.0,见上)洗涤。
使用Protein-L亲和层析分离Ig结合蛋白
使用Protein-L连接的琼脂糖(Protein-L linked agarose)(Sigma)来制备0.1ml柱。将100微升豚鼠IgG(Sigma,1mg/ml于TBS中)或大鼠IgE(1mg/ml,Serotech)在该柱上预培养(pre-incubate)。使用多于10倍柱容积的TBS洗涤柱。将200μl雄性蜱SGE(D6)加样在柱上并且通过蠕动泵在28℃循环1小时。用1ml TBS将柱洗涤5次,其后用0.1GBS(100mM甘氨酸,150mM NaCl,pH 2.6)洗脱三次。将洗脱物中的蛋白以终浓度20%(重量/体积)在三氯乙酸中沉淀,用冷丙酮洗涤,再溶解在SDS样品缓冲液(非还原性,Invitrogen)中,煮沸2分钟,并且用SDS-PAGE(10%两性离子缓冲剂(Tricine)预制的凝胶体系,Invitrogen)检测。将所得凝胶用考马斯亮蓝染色或转移至硝化纤维素上用于Western印迹,如先前所述(Wang and Nuttall,1995a)。
IGBPMA的RT-PCR扩增、克隆和测序
使用Qiagen RNA提取试剂盒将30只喂食6天的雄性蜱的总RNA提取至0.1ml水中。使用引物(IGBPMA-1,nt 7-39nt,AF001868;和IGBPMA-R1,nt917-945的反向和互补,AF001868,5’AGTGCGGCCGCTCCCTTGACGTTACCGGACTTGAGGTCTA3’)通过RT-PCR扩增全长IGBPMA编码序列。将RT-PCR产物克隆至pGEM-T载体(Promega)中,并且通过ABI技术从两个方向整体测序。使用GCG程序包中的BESTFIT将获得的序列与GenBank中的IGBPMA参考序列(AF001868)比较。
表达重组IGBPMA
使用引物(IGBPMA-R1和IGBPMA-F1,5’AGTTCTAGACATATGAAATACGAAGTGTACACAGGGCGCGGGGT3’,nt 76-104,AF001868)从完整测序的新克隆扩增5’端截短的IGBPMA(在蜱SGE中检测的IGBPMA的成熟形式)编码序列。将具有C末端6组氨酸标签融合体的PCR产物符合读框地克隆至pET23载体(Novagen)中,并且用于转化BL21(DE3)大肠杆菌宿主细胞。在诱导之后,通过SDS-PAGE,其后是使用抗IGBP血清的Western印迹(Wang andNuttall,1995a),来检查12个克隆的全细胞裂解物的rIGBPMA表达。对于大规模生产,将单一菌落(克隆No F6)在100ml液体LB(Ampr)中在37℃培养过夜,伴随200rpm的摇动速度。将过夜培养物添加至1000ml新鲜预热的液体LB(Ampr),并且在与用于过夜培养相同的条件下培养4小时至OD6000.4-0.6。通过添加IPTG至终浓度0.4mM在37℃,200rpm诱导重组IGBPMA(rIGBPMA)的表达7小时。
rIGBPMA的重折叠和纯化
将HisBind试剂盒(Novagen)和推荐的方法(Novagen)用于rIGBPMA的纯化。在使用BugBuster溶液(Novagen)提取之后,用含有6M尿素的16mlHisBind Binding Buffer(HisBind结合缓冲液)从500ml培养液提取不溶性rIGBPMA,并且固定在负载1ml Ni2+的HisBind柱上,再用含有6M尿素的10×1ml HisBind Washing Buffer(His Bind洗涤缓冲液)洗涤。通过在室温用至少10×1ml HisBind Washing Buffer洗去尿素,在HisBind柱中进行rIGBPMA的重折叠。用3×1ml HisBind Elution Buffer(HisBind洗脱缓冲液)洗脱rIGBPMA的可溶级分。将洗脱物浓缩至50μl(Vivaspin 6,VivaScience),其后在TBS中稀释至5ml,再将所述过程重复3次以改变缓冲条件,其后贮藏在-70℃。
使用亲和层析测定rIGBPMA的免疫球蛋白结合活性
融化之后将rIGBPMA在13000rpm离心10分钟,并且检查上清的Ig结合活性。使用人-IgE连接的琼脂糖(Sigma)如先前所述测定IgG结合活性(Wangand Nuttall,1995a)。使用Protein-L亲和柱如上所述测定对人-IgE(Serotech)和大鼠-IgE(Serotech)的结合活性。使用不含IgE的Sepharose-6B(Sigma)和Protein-L琼脂糖分别作为对于IgG和IgE体系的对照柱。在将rIGBPMA加样至Protein-L-IgE柱之前,将来自高浓度(10mg/ml)原液的牛血清白蛋白(BSA)添加至纯化的可溶性rIGBPMA以检查rIGBPMA的柱特异性。用SDS-PAGE如上所述检查来自亲和柱的洗脱物。在加样至Protein-L-IgE亲和柱之前,为了去除非特异性结合/聚集,使rIGBPMA上清经过短Sepharose-6B(Sigma)柱,再经过Protein-L柱。
通过BIAcore2000测定rIGBPMA的Fc结合活性
方法如上所述,但是使用5,000共振单位(RU)的目标水平。在感应芯片中的4个流动池中的每一个上固定:池-1,空白;池-2,BSA(~5000RU);池-3,兔F(ab′)2片段(~5000RU);和池-4,人Fc片段(~4000RU)。在使用之前先用30μl 20mM HCl,再用至少100μl TBS洗涤流动池一次。将30μl rIGBPMA(1mg/ml,于TBS中)注入,从而以1-2-3-4的顺序、10μl/min的流速流过全部流动池。
实施例1蜱唾液腺提取物和唾液中的IgE结合活性
在30分钟收集期中,雌性分泌的唾液的体积与体重成正比,直到体重大约75mg的阈值,在75mg以上,分泌的唾液的体积保持在大约10μl每只蜱(图2A)。尽管来自雄性的唾液体积是雌性的1/10-1/100,雄性唾液的蛋白浓度显著高于雌性唾液的蛋白浓度(图2B)。
将三种蜱样本(雌性SGED6、雄性SGED6和雌性SalivaD7)用作比较分析物来筛选针对CM5芯片分开的流动池中固定的四种配体的结合(图3-5)。基线(E)表示各蜱样本灌流通过固定了配体的流动池之前的零点读数。各曲线的上升部分表示芯片表面上大分子中的变化(包括分析物与固定的配体的结合)。在用TBS洗去非特异性结合的样品材料之后(在图3-5中通过黑色箭头指示),将各条轨迹在基线之上的最终部分认为是分析物与配体的特异性结合。线的高度(最终读数)直接与结合的分析物的量相关。在第一个实验中,雌性SGED6显示了与IgG、IgE和Fc的结合,但是未与Fab结合(图3)。与Fab结合的明显缺失说明观察到的与IgG、IgE和Fc的结合是特异性的,并且不是因为分析物的聚集或沉淀。将生物传感芯片再生之后,使用雄性SGED6进行的第二个实验显示了与全部四种配体的结合(图4)。再次再生芯片之后,使用雌性SalivaD7的第三个实验显示了与全部四种配体的结合(图5)。与SGE样品(图3和4)相比,由唾液曲线(图5)的形状表示的结合动力学中的明显差异可能是由于与SGE样品(分析物的pH和离子强度未知)相比该唾液相对低的蛋白浓度(0.1mg/ml,参见材料和方法),和/或该唾液不同的缓冲条件。
表1显示对所述三种分析物,即雌性SGED、雄性SGED6和雌性SalivaD7的相对结合活性(RBA)的估计。将固定于各流动池的各种配体的应答单位(RU1)(使用BIAcore2000wizard测定)(与各自分子量成比例)与IgG比较,以测定相对摩尔量(relative molar amount;RMA)。根据经验测定对于每种分析物的应答单位(图3-5)。其后对每种分析物与每种配体的RBA进行定量比较。根据蛋白含量标准化的与IgG的结合的比较程度是:雌性SalivaD7>雄性SGED6>雌性SGED6(RBA/mg蛋白,表1)。对于所有样品,与IgE的结合相对强于与IgG的结合(RBAIgE/RBAIgG≈1.2,表1)。
定量分析确认了雌性SGED6不与F(ab′)2结合,而雌性SGED6与Fc成分(Fc component)的结合(RBAFc=1.1)类似于与IgG的结合(RBAIgG=1.0)(表1)。与雌性SGED6相反,雄性SGED6和雌性SalivaD7均与F(ab′)2成分结合;在两种情况下,与Fc和F(ab′)2的结合均具有相似的效价(potency)(RBAFc/RBAF(ab′)2≈1.1,表1)。对于雄性SGED6,IgG结合在一定程度上(marginally)少于Fc和F(ab′)2结合的总和(RBAFc=2.7,与RBAFc+F(ab′)2=4.6相比,表1)。检测的雌性SalivaD7的IgG结合活性(RBAFc=19.4,表1)接近于Fc和F(ab′)2结合的总和活性(RBAFc+F(ab′)2=15.7,表1)。
实施例2通过亲和层析测定rIGBPMA的免疫球蛋白结合活性
通过Protein-L-IgG(豚鼠)亲和柱以及Protein-L-IgE(大鼠)亲和柱将29kD蛋白作为主带从雄性SGED6分离(图6A)。通过Western印迹中针对IGBPMA产生的抗血清来识别主带(图6B)。未在IgE亲和柱的洗脱物中检出其它蜱IgG结合蛋白(即IGBPMB和IGBPMC)。
从喂食6天的雄性蜱的总RNA提取物测序IGBPMA的新克隆,所述蜱来自与IgE结合蛋白分离所用的相同的群组(cohort),测序仅显示了在IGBPMA参考序列(GenBank,AF001868)中nt-648的一个沉默突变(T-C)。
将N末端26个氨基酸截短的rIGBPMA在3个BL21(DE3)克隆中大量表达(express abundantly)(图7)。rIGBPMA含有C末端His标签(6),该标签能够用于使用His-Bind柱(Novagen)的纯化。然而,在不存在变性剂尿素时,rIGBPMA不溶于细胞裂解物。使用含有6M尿素的His-Bind Binding Buffer(Novagen)来溶解rIGBPMA并且将变性的蛋白固定在His-Bind柱(Novagen)上,从而能够通过使用含有6M尿素的His-Bind Washing Buffer(Novagen)洗去未结合的大肠杆菌蛋白,来将rIGBPMA从细胞裂解物分离。通过用不含尿素的His-Bind Washing Buffer洗涤来将尿素从His-Bind柱去除,此时变性的rIGBPMA的级分能够重折叠成可溶形式。用不含变性剂的标准His-BindElution Buffer (Novagen)来洗脱rIGBPMA的可溶形式,并且rIGBPMA的可溶形式具有高纯度(图8)。产率为每升诱导的培养物5-10mg rIGBPMA。
从His-Bind柱纯化的可溶性rIGBPMA对IgG(人)(结果未显示)和IgE(人,图9A;和大鼠,图9B)二者均含有结合活性,分别使用人IgG-琼脂糖(Sigma)和Protein-L-IgE(人,图9A;或大鼠,Fig.9B)亲和柱。在某些条件下重折叠的rIGBPMA也聚集(假设来自非天然形式)在对照柱中(图9A,Protein-L琼脂糖,Sigma)。然而,来自亲和柱的rIGBPMA的条带显著强于对照柱的条带,说明亲和柱中对Ig分子的结合活性。向亲和体系添加BSA(作为对照蛋白)不导致洗脱物中BSA的检出(图9B),说明rIGBPMA-IgG(E)结合活性是真实的(genuine)。在加样至Protein-L-IgE(大鼠)亲和体系之前,通过在相同条件下先运行经过Sepharose-6B柱,再经过Protein-L琼脂糖柱将rIGBPMA聚集物去除,此时将对照柱(Protein-L柱)中的非特异性结合(图9A)减少至检出值之外,同时在Protein-L-IgE柱中rIGBPMA对大鼠IgE的结合活性保持在可检出(图9B)。
使用BIAcore 2000,显示rIGBPMA对免疫球蛋白的结合活性是由于对Fc片段而非对Fab片段的结合亲和性(图10)。F(ab)2片段与rIGBPMA的非特异性结合(图10,曲线C)显示了对于BSA(图10,曲线B)相似的水平。与Fc片段的结合(图10,曲线A)比这种非特异性结合高两倍多。rIGBPMA的聚集也存在于空白流动池中(图10,曲线D)。Fc结合活性解释了rIGBPMA与IgG和IgE两种分子结合的原因,并且说明其可能结合至两种Ig类型间的保守区。如果是这种情况,rIGBPMA不可能结合至这些Ig分子的受体结合位点。因此除了血清中的游离免疫球蛋白之外,rIGBPMA还可能结合至细胞表面上IgG和IgE的束缚型(bound form)。假设哺乳动物IgG和IgE是从与禽类IgY类似的共同祖先进化而来,并且与其它哺乳动物免疫球蛋白是进化趋异的。
实施例3BALB/c小鼠中的活性
如上所述在大肠杆菌中产生源自蜱唾液腺的重组蛋白(rIGBPMA,GenBank登录号AF001868)。通过在rIGBPMA纯化期间的全部步骤中使用不含内毒素的水,能够将纯化的rIGBPMA中的内毒素水平降低至大约50EU/mg。当通过常规方法(参见例如Couillin et al.“Arthropod-DerivedHistamine-Binding Protein Prevents Murine Allergic Asthma”The Journal ofImmunology,2004,173:3281-3286)测试这种rIGBPMA对BALB/c小鼠中变应性哮喘的效果时,其以每只小鼠50μg和10μg的低剂量抑制了在卵清蛋白(OVA)致敏的(免疫的)小鼠中对乙酰甲胆碱(methacholine)的变应性气道应答(allergic airway response;AHR)(参见图11)。
然而,在高剂量(每只动物250μg),rIGBPMA对早期AHR的抑制与晚期相比较少。这可能是因为诱导AHR的细菌脂多糖(LPS)(内毒素)的存在。
实施例4rIGBPMA与IgE的结合优于与IgG的结合
通过在偶联pH 4.5(10M乙酸盐)使用标准胺偶联化学(如BIAcore2000Instument Handbook和BIAapplication Handbook中所述)的BIAcore2000(BIAcore AB)的Surface Preparation Wizard,以5,000共振单位(RU)的目标水平将纯化的人IgE(Serotech)、豚鼠IgG(Sigma)和BSA(Sigma)固定在传感芯片CM5(用羧甲基葡聚糖涂覆的BIAcore AB芯片)上。在传感芯片中4个流动池的每一个上固定:池-1,空白;池-2,BSA(4810RU);池-3,IgG(5004RU);和池-4,IgE(5780RU)。在使用之前用30μl 20mM HCl,然后是100μl TBS将流动池洗涤一次。将50μl rIGBPMA(1mg/ml,于TBS中,50mM Tris、20mM CaCl、20mM MgCl、100mM NaCl,pH 7.0)注入从而在全部流动池中以5μl/min的流速流动。
如先前所检测,rIGBPMA与BSA非特异性地结合(图12)。然而,在这个背景之上,rIGBPMA与IgG较好地结合,而与IgE最好地结合(图12)。尽管在芯片上固定的IgE多于IgG(IgE,5780 RU;IgG,5004RU),但是IgE具有的结合信号(~430RU)高于IgG的结合信号(~180RU)超过两倍。这说明rIGBPMA与IgE的结合优于与IgG的结合。
表1.免疫球蛋白固定化和结合活性
#从各种免疫球蛋白(0.5μg)在非还原性条件下在SDS-PAGE上的迁移率(mobility)来估计其MW。
*将固定在芯片上的配体的相对摩尔量(RMA)标准化至固定的IgG的相对摩尔量。因此,对于每种配体(x),
RMAx=(产率x/MWx)÷(产率IgG/MWIgG)
**在修正各配体(x)的RMA之后,将每种蜱样品(y)的相对结合活性(RBA)标准化至fSGED6对IgG的结合。因此,RBAy=(RUy/RMAx)÷(263/1)。
***本讨论组将数据进一步标准化成蛋白量(mg)与fSGED6中的蛋白量比较。因此,雄性SGED6的RBA加倍,而雌性SalivaD7的RBA乘以40。
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1.作用剂在药物制备中的用途,所述药物用于治疗哮喘或变应性鼻炎,其中所述作用剂是多肽,该多肽由缺乏图1中显示的N-末端的26个氨基酸的IGBPMA氨基酸序列的截短形式组成。
2.作用剂在药物制造中的用途,所述药物用于治疗哮喘或变应性鼻炎,其中所述作用剂是编码权利要求1的多肽的核酸。
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